NO173655B

NO173655B - Fremgangsmaate for ekstrahering av et tetrapeptid fra biologisk materiale

Info

Publication number: NO173655B
Application number: NO88880186A
Authority: NO
Inventors: Emilia Findel; Maryse Lenfant; Martine Guigon; Johanna Bakala
Original assignee: Inst Nat Sante Rech Med; Roussy Inst Gustave
Priority date: 1986-07-18
Filing date: 1988-01-18
Publication date: 1993-10-04
Also published as: AU1026188A; AU598897B2; EP0316322B1; NO173655C; JP2542407B2; FR2601678B1; EP0316322A1; FR2601678A1; JPH02500269A; NO880186L; NO880186D0; WO1988000594A1; US5114926A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for ekstrahering av et tetrapeptid fra biologisk materiale og nærmere bestemt en fremgangsmåte for ekstrahering av tetrapeptidet Ser-(N-Ac)-Asp-Lys-Pro-OH fra biologisk materiale og spesielt fra lever eller benmarg av kalvefoster.

Anvendelsen av medikamenter ved behandling av kreft er begrenset på grunn av deres toksiske virkning på det friske vev og spesielt på det bloddannende vev. Gjentatt anvendelse av disse medikamenter medfører i et stort antall tilfeller enten en medulær letal aplasi, en sekundær leukemi eller litt mindre alvorlige hematologiske problemer.

Da de fleste antikreftmidler ikke virker annet enn på prolyfereringscellene har foreliggende oppfinnere tenkt at det skulle være mulig å forebygge hematologiske skader ved å benytte de pluripotente cellestammer med prolyfererings-inhibitorer.

Forsøk gjennomført av foreliggende søkere og tidligere publisert (se spesielt E. Frindel og M. Guigon, "Exp. Hemat", 5 (1977), 74-76, M. Guigon og E. Frindel, "Bull. Cancer" 68( 2), 1981 ), 150-153, J. Wdzieczak-Bakala, M. Lenfant og M. Guigon, "IRCS Med. Sei.", 12 (1984), 868-869, J. Wdzieczak-Bakala, M. Guigon, M. Lenfant og E. Frindel, "Biomed. Pharm", 37, (1983), 467-471, og M. Guigon, J. Wdzieczak-Bakala, J.Y. Mary og M. Lenfant, "Cell Tissue Kinet" 17 (1984), 49-55) på signifikant måte er mulig, ved å administrere en spesifikk inhibitor for cellestammene, å redusere den observerte letalitet hos dyr under behandling med cytosin arabionsid, Ara-C, et medikament som hyppig benyttes ved kreft-kjemoterapi, der anvendelsen er begrenset på grunn av den skadelige virkning på benmargen. Denne spesifikke inhibitor som er en ekstrakt av visse biologiske stoffer, spesielt benmarg eller kalvefetallever, beskytter cellestammene som er opprinnelsen for alle blodlinjene.

Således har "biologiske studier effektivt vist at økningen av overlevelse som observeres kan skyldes en beskyttelse av de hemopoietiske cellestammer, CFU-S (Colony Forming IJnits in the Spleen: enheter som danner kolonier i milten), det vil si pluripotente cellestammer som er i stand til å gi opphavet til kloner i milten hos mus bestrålet med letal dose, idet denne beskyttelse skyldes opprettholdelse av cellene utenfor den cellulære cyklus ved hjelp av inhibitoren.

Disse publiserte dokumenter beskriver teknikker som tillater å oppnå mer eller mindre rensede ekstrakter inneholdende den spesifikke inhibitor, men i alle disse tilfelle er det oppnådde sluttprodukt ikke homogent og utbyttene er lite tilfredsstillende. Det har således til i dag ikke vært mulig å isolere den aktive bestanddel og å fastslå dennes struktur.

Derfor har foreliggende oppfinnere nu benyttet en ny ekstraheringsprosess som tillater å oppnå en homogen aktiv fraksjon fra et biologisk materiale, spesielt marg fra kalvefoster.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte av den innledningsvis nevnte art og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at den omfatter følgende trinn: å male opp utgangsstoffer med delipidering hvis nødvendig, - å bringe det oppnådde produkt i suspensjon i en buljong ved en pH-verdi nær 7 i nærvær av et svovelholdig reduk-sjonsmiddel spesielt ditioerytritol eller fortrinnsvis merkaptoetanol til en sluttkonsentrasjon på 10~<2>M,

å sentrifugere homogenatet ved ca. 15.000 x g i minst en time,

å underkaste supernatanten en ultrafiltrering på et

membran med sperregrense nær 10.000 Da,

å underkaste det oppnådde ultrafiltrat kromotografi på en molekylsikt av polyakrylamidgeltypen med eluering med en 10~<2>m eddiksyreoppløsning,

å underkaste den aktive fraksjon som utvinnes fraksjo-nering på en inversfasebærer av silisium, podet med alifatiske rester og spesielt C-^g, og eluering med H2O, H20:CH30H (50:50) og CH3OH, og fortrinnsvis å gjenta dette trinn minst en gang, og

å underkaste den nye aktive fraksjon som gjenvinnes en høytrykks-væskekromatografi på en iversfasekolonne av silisiumdioksyd, podet med alifatiske rester og spesielt c18> f°r å oppnå en aktiv homogen fraksjon, med eluering med en blanding av EtøO, CF3COOH og MeOE eller en blanding av H2O, CF3COOH og CH3CN, og detektering av fraksjonene ved måling av absorbsjonen ved 215 nm.

De fem trinn gjennomføres fortrinnsvis ved ca. +4°C.

Den "aktive fraksjon" identifiseres ved biologiske prøver, spesielt som beskrevet i den eksprimentelle del nedenfor.

Et ikke begrensende detaljert eksempel for gjennomføring for ekstraheringsprosessen er gitt i den eksprimentelle del.

Kombinasjonen av de forskjellige analyseteknikker,"" spesielt NMR, massespektrometri og kontinuerlig analyse av aminosyre-innholdet ved HPLC, har tillatt å bestemme strukturen til det således oppnådde homogene produkt. Produktet er et acetylert tetrapeptid med molekylmasse 487 og tilsvarer formelen:

eller

N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-prolin.

De tidligere beskrevne resultater tillater ikke å tenke på at den observerte aktivitet for de mer eller mindre rensede ekstrakter kan skyldes et tetrapeptid av den ovenfor angitte type. Således har man spesielt fastslått en beskyttende virkning for merkaptoetanol på den inhiberende fraksjon som synes å skyldes nærværet av tiolgrupper i inhibitormolekylet, idet nærværet av slike grupper er fastslått i den tidligere relativt rene oppnådde inhiberende fraksjon (se IRCS "Med. Sei." 12, (1984), 868-869).

På samme måte, da sukkerrester er oppdaget, har man tenkt at den aktive bestanddel kan være av typen glykopeptid idet dette forslag ble forsterket av det faktum at den angjeldende inhibitor kan plasseres blant.chalonene eller anthormonene og at mesteparten av stoffene av denne type er glykosilerte.

Det ekstraherte tetrapeptid

og dets derivater ved substitusjon med en eller flere grupper, like eller forskjellige, blir hyppig benyttet i peptidkjemien. Fordelaktig velges substituentgruppene blant acetyl-, benzyl-, metyl- og fenylgrupper. Det monoacetylerte derivat på nitrogenterminalen er helt spesielt foretrukket.

Tetrapeptidet Ser-Asp-Lys-Pro-OH kan oppnås ved ekstrahering fra biologisk materiale, spesielt ut fra lever eller marg fra kalvefoster.

Dette kan spesielt oppnås ved den fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor og i større detalj i den eksprimentelle del av søknaden. Det er videre i acetylert form (i N-terminal-posisjon) og kan benyttes som sådant eller deacetyleres i henhold til klassiske teknikker i peptidkjemien.

Peptidet som oppnås ifølge oppfinnelsen, og dettes substitusjonsderivater, kan likeledes oppnås ved peptidsyntese, spesielt i væskefase, slik det beskrives i NO-PS 930799, (O.nr.C43527).

Inhibitoren som oppnås ifølge oppfinnelsen synes ikke å oppvise den artsspesifisitet (i de prøver som her beskrives er den ekstrahert fra kalvefostermarg og aktive mot mus); det er således tilrådelig å benytte den samt substitusjonsderivater på samme måte som de farmasøytisk akseptable salter i tallrike medisinske og biologiske anvendelsesområder på mennesker og dyr.

Disse forbindelser kan benyttes for beskyttelse av benmarg under antikreftbehandling med kjemoterapi.

I dette tilfellet er det fordelaktig å formulere preparatet som et pulver og administrere det i nærvær av hjelpestoffer og/eller vanlige drøyemidler på intravenøs eller subkutan måte under kjemoterapibehandlingen. Administreringsfrekven-sen og mengde produkt som administreres avhenger i det vesentlige av kinetikken til cellestammen som kan variere alt efter det terapeutiske middel, posologien og anvendelses-protokollen.

Andre "administrerings" måter kan benyttes, for eksempel den som består av å produsere inhibitoren i pasientens organisme ved å ty til genetiske konstruksjonsteknikker, for eksempel ved hjelp av bakterier. Tetrapeptidet og dettes substitu-sjonsderivat kan videre benyttes for å oppnå spesifikke antistoffer for dosering av inhibitormengden som sirkulerer hos pasienten og bestemmelse av denne rolle ved visse stoffer i det bloddannende system, samt ved margpoding.

Anvendelsen av disse antistoffer ved hyperproduksjon av inhibitor forbundet med patologi kan likeledes være en mulighet.

EKSEMPEL

I. Ekstrahering av peptidet N- acetyl- seryl- aspartyl- lysyl-prolin.

Utgangsmaterialet består av benmarg fra kalvefoster, oppbe-vart frosset. I hvert av trinnene som beskrives nedenfor blir det til de isolerte fraksjoner tilsatt merkaptoetanol til en sluttkonsentrasjon på 10~2M. 5 kg vev males opp ved hjelp av en homogenisator av Waring-typen (3 ganger, 60 sek.) i 40 1 av en 10~<2> M fosfatvæske med pE 7,2 i nærvær av IO-<2> M merkaptoetanol ved -4°C. Suspen-sjonen sentrifugeres ved 15.000 x g i 1 1/2 time.

Den gjenvundne supernatant ultrafilteres på et membran av typen Sartorius 121 36 som tillater å separere molekyler som en funksjon av deres molekylvekt og der sperregrensen er 10^ dalton.

Ultrafiltratet konsentreres 20 ganger ved fordamping under undertrykk ved hjelp av en fordamper av "flash"typen (LUWA). Konsentratet blir derefter lyofilisert. Utbyttet er 16,5 g/kg og fraksjonen er aktiv på mus i en mengde av ca. 20 mg/mus (aktiviteten bestemt i henhold til en eller annen av de senere beskrevne protokoller). Lyofiliserte pulver i en mengde av 50 g blir derefter gjenoppløst i 20 ml av en IO"<2> M eddiksyreoppløsning av pH 3 og derefter sentrifugert i 10 min. ved 15.000 x g. Supernatanten kromatograferes på en kolonne av molekylarsikter av typen Biogel P-2 med en 0,07 til 0,04 mm "åpning" (200-400 mesh) (BIO-RAD), med dimen-sjonene 12,5 cm x 100 cm, og elueres med 20 1 IO-<2> M eddiksyre i en mengde av 400 ml/time.

Den aktive fraksjon elueres med et Ve/Vo forhold på 1,2-1,8 idet Ve er elueringsvolumet og Vo er dødvolumet i kolonnen. Utbyttet er 250 mg/kg utgangsmateriale og fraksjonen er aktive på mus i en mengde av ca. 5 jjg/mus.

Den aktive fraksjon, 10 mg, blir derefter oppløst i 1 ml vann og så fraksjonert suksessivt på 2 bærerpatroner for inversfase på silisiumdioksydet podet med alifatiske C-^g-rester av typen Sep-pak C-18. Patronene elueres i rekkefølge med:

2 ml H20

2 ml av en blanding av H20:CH30H(50:50 )

2 ml CH30H

Den aktive fraksjon som elueres med blandingen H2O/CH3OH (50/50) blir derefter konsentrert under undertrykk ved en temperatur på ca. 20° C i en apparatur av typen Speed Vac og derefter lyofilisert.

Rensingen følges opp ved høytrykks væskekromatografi på en inversfase analytisk kolonne med oktadecyl-silisiumdioksyd av typen ODS-Hypersil C-18 (250 x 4,6 mm) 5p (SFCC). Elueringen gjennomføres med blandingen H20/CF3C00H 0,1 #:MeOH (80:20) eller blandingen H20/CF3C00H, 0,1 ^:CH3CN (95:5) i en mengde av 1 ml/min. Detektering av fraksjonene gjennomføres ved måling av absorbsjonen ved 215 nm.

De oppnådde resultater er som følger:

1. Oppløsningsmiddel (H20/CF3C00H 0,1 5é):CH3OH, [80:20] mengde 1 ml/min.; retensjonstid 6 min., 1 homogen topp. 2. Oppløsningsmiddel H20/CF3C00H 0,1 #:CH3CN, [95:5] mengde 1 ml/min., retensjonstid 18 min., 1 homogen topp.

Man fastslår at fremgangsmåten tillater å oppnå et homogent produkt der strukturen bestemmes som antydet nedenfor.

Det totale utbyttet er 60 jjg/kg utgangsmateriale.

Fraksjonen er aktiv mot mus i mengder på ca. 100 nanogram/- mus.

II. Bestemmelse av den prinsippielle aktive struktur:

1. Analyse av aminosyrene:

Efter sur hydrolyse tillater en analyse ved HPLC av derivat-ene dannet ved omsetning med ortoftaldialdehyd å fastslå nærværet av lycin, aspartinsyre og serin. Analyse av produktet ved hjelp av en aminosyreanalysator tillater efter sur hydrolyse og oksydasjon med natriumhypoklorit å fastslå nærværet av prolin og å bekrefte nærværet av aspartinsyre, serin og lysin.

2. NMR- spektroskopi:

NMR-spektroskopi med H20 og D20 viser nærværet av fire aminosyrer, nemlig prolin, lysin, aspartinsyre og serin, og en acetylgruppe. NH2 i den laterale kjeden i lysin og OH i serinet er frie, NH2 i aminosyredelen til serin, lysin og aspartinsyre er substituert en gang. Den sannsynlige struktur er den til et peptid som er acetylert på NH2 terminalen.

3. Massespektroskopi:

Massespektroskopiteknikkene med FAB (Fast Atom Bombardment) viser at peptidet har en molekylmasse (M + 1) på 488.

Et studium av aminosyresekvensen ved en variant av massespek-troskopien, nemlig den teknikk som kalles MS-MS, har tillatt å fastslå at den totale primærstruktur for peptidet er:

III. Beskrivelse av de biologiske prøver:

Den biologiske aktivitet av fraksjonen måles ved en analyse in vivo av inhiberingen av inntredenen i cyklen til CFU-S som induseres ved en injeksjon av Ara-C.

CFTJ-S hos mus som vanligvis er beroliget, trer inn i cyklen efter en injeksjon av Ara-C. Søkerne har vist at når inhibitoren injiseres 6 t før medikamentet forhindres inntrengen av CFU-S i ADN syntesens fase S.

Antallet CFU-S bestemmes ved teknikken i henhold til J.E. Till og E.A. McCulloch, "Radiat. Res,", 14, (1961), 213-222, der prinsippet hviler på evnen til CFU-S til å danne makro-skopiske kolonier i milten. Disse kolonier er klonene som stammer fra et CFU-S.

Andelen CFU-S i fase S bestemmes ved metoden i henhold til A.J. Becker "Blood", 26, (1965), 296-308, basert på prinsippet om cellulæravlivning. Inkuberingen av cellene med en oppløsning av tritiert tymidin (forløper til ADN) fører til selektiv død av celler i syntesefasen av ADN ved integrering av en letal dose av radioaktivitet (tritium) i ADN molekylet.

Prøvene gjennomføres på SPF (Spcific Pathogen Free) mus av stammen Balb/C eller CBA med en alder på 2 til 3 måneder.

Sammenligningsgruppene mottar på intraperitoneal måte en behandling som følger: Tid 0: Ara-C (10 mg - protokoll 1 eller 20 mg- protokoll II) oppløst i 0,2 ml

fysiologisk serum;

Tid 6t: Fysiologisk serum 0,2 ml;

Tid 8t: avlivet (protokoll I);

Tid 12 t: avlivet (protokoll II).

2. Gruppene som ble behandlet mottok på intraperitoneal

måte:

Tid 0: Ara-C (10 mg-protokoll I eller 20 mg- protokoll II) oppløst i 0,2 ml fysiologisk

serum;

Tid 6t: Fraksjonen som skal behandles, oppløses i 0,2 ml fysiologisk serum.

Tid 8t: avlivet (protokoll I);

Tid 12t: avlivet (protokoll II).

For hver av gruppene ble benmarg fra dyrene samlet og bragt i suspensjon i 2 ml medium 199. Efter nummerering og fortynn-ing ble to mengder av 5 x 10^ nukleerte celler inkubert ved 37°C i 20 minutter eller med 1 ml medium 199 (Prøve A), eller med 1 ml tritiert tymidin (200 jiCi) (Prøve B). En cellulær suspensjon på 0,2 ml inneholdende 8 x 10^ til 1,2 x IO<5 >nukleerte celler injiseres på intravenøs måte til sinus-retro-orbitalen til de strålingsmottagende dyr (9 Gy, 8 mus/forsøkspunkt). 9 dager senere ble de mottagende mus avlivet og deres milt fjernet og fiksert i Bouinvæske (720 g 1% picrinsyre; 240 g formol; 4 g eddiksyyre/1 væske). Efter noen fikseringstimer ble de synlige noduler makroskopisk tellet.

Hvis N og N' er det midlere antall noduler som oppnås for miltene av mottagerne som mottok cellene fra prøvene A henholdsvis B er andelen CFU-S ved syntesefasen av ADN beregnet ved formelen:

Resultater:

1. Inhibering av inntrengning i cyklen for CFU- S.

Under hvert rensetrinn isoleres en fraksjon som er aktiv vis a vis denne prøve. Ikke desto mindre blir en spesielt interessant aktivitet observert med en fraksjon som er homogen, oppnådd ifølge oppfinnelsen slik følgende tabell viser: Inhibering av inntrengning i cyklen av CFU-S ved injisering av 100 ng pr. mus av den homogene fraksjon som er oppnådd ifølge oppfinnelsen i henhold til protokoll II. 2. Aktivitet på virkning av overlevelsen av dyr behandlet med letale doser Ara- C.

Dyrene mottok de fraksjonerte Ara-C doser (4 x 925 mg/kg) på tidspunktene 0, 7, 24 og 30 timer. Den prøvede fraksjon administreres en gang 26 timer før den første Ara-C injeksjon. Dyrenes overlevelse bedømmes 15 - 30 dager efter behandlingen. I den protokoll som omfatter repeterte injeksjoner, letal Ara-C, er det vist at konkomitant admini-strering av inhibitoren tillater en definitiv overlevelse hos et stort antall av dyrene. De oppnådde resultater er sammenlignbare med de som observeres når man går frem med en poding av isoallogenisk marg i forbindelse med de behandlede dyr istedet for å benytte inhibitoren. 3. Fravær av aktivitet av den inhiberende fraksjon på regresjon av EMT6 tumorer.

Behandlingen av dyr som er bærere av tumoren EMT6 med 4 suksessive injeksjoner av Ara-C på tidspunktene 0, 7, 24 og 30 timer fulgt av en inhibitorinjeksjon 26 timer efter den første Ara-C injeksjon, forhindrer ikke den terapeutiske virkning av Ara-C vis a vis de tumorale celler og tillater overlevelse for dyret som behandles på en måte sammenlignbar med de resultater som oppnås efter en margpoding.

4. Toksisitet.

Den inhiberende fraksjon er ikke toksisk i forhold til CFU-S og medfører ingen letalitet hos de behandlede mus ved de benyttede doser.

Claims

Fremgangsmåte for ekstrahering av tetrapeptidet Ser-(N-Ac)-Asp-Lys-Pro-OH fra biologisk materiale og spesielt fra lever eller benmarg av kalvefoster, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: å male opp utgangsstoffer med delipidering hvis nødvendig, å bringe det oppnådde produkt i suspensjon i en buljong

ved en pH-verdi nær 7 i nærvær av et svovelholdig reduk-sjonsmiddel spesielt ditioerytritol eller fortrinnsvis merkaptoetanol til en sluttkonsentrasjon på 10_<2>M, å sentrifugere homogenatet ved ca. 15.000 x g i minst en

time, å underkaste supernatanten en ultrafiltrering på et

membran med sperregrense nær 10.000 Da, å underkaste det oppnådde ultrafiltrat kromotografi på en

molekylsikt av polyakrylamidgeltypen med eluering med en 10_<2>M eddiksyreoppløsning, å underkaste den aktive fraksjon som utvinnes fraksjo-

nering på en inversfasebærer av silisium, podet med alifatiske rester og spesielt C^g, og eluering med H2O, H20:CH30H (50:50) og CE3OH, og fortrinnsvis å gjenta dette trinn minst en gang, og å underkaste den nye aktive fraksjon som gjenvinnes en

høytrykks-væskekromatografi på en inversfasekolonne av silisiumdioksyd, podet med alifatiske rester og spesielt C^g, for å oppnå en aktiv homogen fraksjon, med eluering med en blanding av H2O, CF3COOH og MeOH eller en blanding av H2O, CF3COOH og CH3CN, og detektering av fraksjonene ved måling av absorbsjonen ved 215 nm.