JP2542407B2 - 新規テトラペプチド、その製法ならびにその用途 - Google Patents

新規テトラペプチド、その製法ならびにその用途

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は造血幹細胞のサイクルへのエントリーの阻止
剤として作用する新規テトラペプチドおよび生物活性を
有するペプチドの分野におけるその通常の誘導体に関す
る。
本発明はまた生物物質からの、特に牛の胎児の骨髄か
らのこのテトラペプチドの抽出、ならびにその置換誘導
体を含めての化学的経路によりその合成法に関する。
本発明はまた生物学および医学における、とくに化学
療法による制がん治療中の骨髄の保護に際しての此のペ
プチドと其の置換誘導体の用途に関するものである。
がんの治療に際して薬剤の使用は健全な組織、とくに
造血組織に及ぼす毒作用によって制約される。これらの
薬剤の反復使用は多くの場合、致命的な骨髄の形成不
全、二次的な白血病、又は重度ではないが血液学的な後
遺症をひきおこすのである。
大多数の制がん剤は増殖中の細胞にだけ作用するので
あるから、われわれは増殖抑制剤を用いて多能性幹細胞
を保護することにより血液の損傷を防ぐことが可能であ
ろうと考えたのである。
われわれの研究および既に発表された研究（とくに次
の報告を参照して下さい。E.Frindel＆M.Guigon,Exp.He
mat.,5（1977）,74−76。M.Guigon＆E.Frindel,Bull,Ca
ncer 68（２），（1981）,150−153,J.Wdzieczak−Baka
la,M.Lenfant＆M.Guigon,IRCS Med.Sci.12（1984）,868
−869,J.Wdzieczak−Bakala,M.Guigon,M.Lenfant＆E.Fr
indel,Biomed.Pharm.37（1983）,467−471＆M.Guigon,
J.Wdzieczak−Bakala,J.Y.Mary＆M.Lenfant,Cell Tissu
e Kinet,17（1984）,49−55）は次のことを明らかにし
ている。すなわち、幹細胞の特定の抑制剤を投与するこ
とによって骨髄に及ぼす有害な影響のために其の使用が
制限されている、がんの化学的治療のために現在使用さ
れている薬剤シトシンアラビノサイド（Cytosinearabin
oside）（Ara−Ｃ）による治療中に実験動物において死
亡率を著しく低下させることが可能である。或る生物物
質とくに牛の胎児の骨髄又は牛の胎児の肝臓から抽出さ
れた其の特定の抑制剤はあらゆる血液系統の起源である
幹細胞を保護する。
事実、生物研究の結果次のことが明らかにされてい
る。みとめられた生存者の増加は雑血幹細胞の保護によ
るものである。CFU−Ｓ（脾臓中のコロニー生成単
位）、これは致死量に達するまで放射能を照射されたマ
ウスの脾臓中にクローンを生成させることができる多様
性をもった幹細胞のことであるが、この保護作用は阻止
剤による細胞環の外側にある前記の細胞の維持によるも
のである。既に発表された報告によれば、特定の阻止剤
を含む多少純化された抽出物を得る技術が存在してい
る。しかし、どの場合も最終的に得られた製品は同質な
ものではなく、収率は不満足なものであった。其故に、
今日に至るまで活性の本体を単離し、その構造を確立す
るには至っていない。
今やわれわれは、生物物質から、とくに牛の胎児の骨
髄から均質な活性画分を得る新しい抽出法を開発した。
この抽出法は本質的に次の段階から成っている。
必要があれば最初の材料を擦りつぶして脱脂する。
硫黄を含んだ還元剤、とくにジチオエリスリトール、
でなければメルカプトエタノールを用いてpHが７に近い
緩衝液の中で得た生産物を懸濁させる。
均質化したものを約15,000gで少なくとも１時間遠心
分離する。
上澄みを10,000ダルトンに近い除外限界をもった膜上
で限外濾過する。
得られた限外濾過液をポリアクリルアミドゲルタイプ
の分子ふるい上でクロマト分離し、酢酸の希釈液を用い
て溶離する。
集めた活性画分を脂肪族残基、特に18Cのものをグラ
フトさせたシリカの逆相支持体上で分別する。好ましく
はこのステップを少なくとも１回繰返す。
集めたその新しい活性画分を脂肪族残基、特に18Cの
ものをグラフトさせたシリカの逆相カラム上の高圧液体
クロマトグラフィにかけて均質な活性画分を得る。
こうして出来た活性画分は生物テストによって同定す
る。詳しいことは次の実験法の部に記載されている。
この抽出工程の実際の詳細な実例は、制約的ではな
く、この発明明細書の実験の部に記載されている。
様々な分析技術の組み合わせ、とくに核磁気共鳴、質
量分光測定法と高圧液体クロマトグラフ（HPLC）による
アミノ酸組成分析はこのようにして単離された均質な製
品の構造決定を可能にした。この製品は分子量487のア
セチルテトラペプチドであり、次の実験式に相当する。
Ser（Ｎ−Ac）−Asp−Lys−Pro−OHまたは Ｎ−acetyl−seryl−aspartyl−lysyl−proline. 前に記載のものからは、得られた多少純化された抽出
物について観察された活性は以上に単離されたタイプの
テトラペプチドに起因し得ると考えることを許さなかっ
た。
事実、抑制剤の分子内にチオール群が存在するため
に、このような群の存在が前に得られた比較的純化され
た抑制剤の画分中に確立されたように思われる抑制的な
画分に及ぼすメルカプトエタノールの保護的な作用が特
に観察された。（IRCS Med.Sci.12（1984）,868−869を
見よ。） 同様な方法で糖の残基が検出された。活性の本体はグ
リコペプチドタイプのものと考えられた。この推測は関
与している抑制剤はカローン（chalones）またはアンソ
ルモン（anthormones）に分類さるべきであり、しかも
此のタイプの物質の中で大多数のものはグリコシル化さ
れているという事実によって支持されている。
従って、本発明はテトラペプチドSer−Asp−Lys−Pro
−OHならびに生物学的用途のためのペプチドの化学分野
に於いて現在用いられている、一つまたはそれ以上の同
一または異なる基によるその置換誘導体に関する。有利
にはこれらの置換基はアセチル、ベンジル、メチルおよ
びフェニルよりなる群から選択される。末端の窒素原子
上でモノアセチル化された誘導体が最も好ましい。
本発明はまた薬学的に容認できるこれらの化合物の塩
類に関係がある。
テトラペプチドSer−Asp−Lys−Pro−OHは生物物質と
くに牛の胎児の肝臓または骨髄からの抽出によって得る
ことができる。
このテトラペプチドは特に上記で一般的に記述した方
法で得られるが、更に詳しくは実験の部に記載してあ
る。得られたテトラペプチドは末端の窒素原子のところ
でアセチル置換された形のものであり、この型のまま使
用するかまたはペプチド化学における通常のテクニック
によって脱アセチル化することができる。
本発明によるペプチドおよびその置換誘導体はペプチ
ド合成とくに液相において得ることができる。
液相ペプチド合成は炭素原子の末端部から適切なアミ
ノ酸グループを逐次的に追加することにより巧い具合に
実施され、適切にはそれらアミノ酸の反応性基は置換な
いしは保護されており、必要に応じてその保護基はあと
で除去される。
本発明によって得られた抑制剤は特異性をもつとは思
われない（ここで記載されている試験ではペプチドは牛
の胎児の骨髄から抽出され、マウスについて活性を示
す）。従って人間でも動物においても数多くの医学的お
よび生物学的応用において、本発明のテトラペプチド、
その置換誘導体、同様にしてそれらの薬学的に容認でき
る塩類の使用を企画し得るのである。
これらの化合物は化学療法による制がん剤処理中の骨
髄の保護に使用することができる。
この場合、ペプチドは通常の補助剤または賦形剤を用
いて化学療法中に化学療法において、静脈に対して、又
は皮下に粉状に製剤して投与するが、その投与の回数と
投与量は本質的には治療剤と薬量と使用法によって変わ
り得る幹細胞の動態によって左右される。
その他の投与法も考えられ得る。例えば遺伝子工学の
テクニックニ訴えることにより患者の体内に生成される
抑制剤を構成する。例えばバクテリアを用いるとか。
テトラペプチドと其の置換誘導体は本発明によれば、
更に患者の体を循環している阻止剤のレベルを決定する
ための特定の抗体を得るために使用することができる。
また骨髄移植の工程におけると同様の造血組織の或る病
気における其の役割を決定するためにも使用することが
できる。
病理学に関連した阻止剤の過剰産出の場合にも此等の
抗体の使用法が考えられるであろう。
I.ペプチドＮ−acetyl−seryl−aspartyl−lysyl−prol
ineの抽出 原料は冷凍された牛の胎児の骨髄である。下記の各段
階において単離された留分ははメルカプトエタノールの
最終濃度10-2モルに補われる。
５グラムの組織を60秒で３回、ホモジェナイザー（Wa
ring Blenderタイプ）で40リットルの10-2モル燐酸塩緩
衝液中において４℃で10-2モルのメルカプトエタノール
を用いてpH7.2で擦り潰す。その懸濁液を１時間30分、1
5,000gで遠心分離する。
上澄液を集めてSartorius121−36タイプの膜上で限外
濾過する。
この濾過器は分子の分離を分子量にしたがって104ダ
ルトンの除外限度で分離することができる。
この限外濾過物はFlash Evaporator（LUVA）タイプの
蒸発器で真空蒸発することにより20倍に濃縮される。こ
の濃縮されたものを凍結乾燥した。
得られたものは16.5g/kgあり、マウスに対して活性が
あった。投与レベルは20mgであり、活性は以下に記載さ
れている実験計画書の中の何れかによって決定した。凍
結乾燥粉（50g）はそれから10-2モルの酢酸溶液（pH3）
の200mlに再び溶解し、15,000gで10分間遠心分離した。
上澄液はBiogel P−２タイプの分子ふるい、この分子ふ
るいは0.07〜0.04mmのメッシュの間隙（200〜400メッシ
ュ）（BIORAD）で12.5cm×100cmのコラム上でクロマト
分離し、10-2モルの酢酸20リットル（流速400ml/hour）
で溶離した。
活性画分は溶出率Ve/Vo1.2〜1.8で溶離した。ここでV
eは溶出量、Voはコラム空隙量である。生成物は初期物
質の1kgに対して250mgであり、留分はマウス１頭につき
５μｇの投与レベルで活性があった。
活性留分（10mg）は1mlの水で溶解し、Seppak C−18
タイプ（WATERS）の18Cを用いて脂肪族化合物の残基と
融合した二酸化珪素の逆相支持による二つのカートリッ
ジへの分別に成功した。カートリッジは次のものも用い
て溶離した。H2O 2ml、H2OとCH3OHの等量混合物2ml、CH
3OH 2ml. H2OとCH3OHの等量混合物を用いて溶離した。活性画分
は、それから真空状態でSpeed Vacタイプの装置で約20
℃で濃縮し、凍結乾燥した。
純化は高圧液体クロマトグラフのODS−Hypersil C−1
8タイプ［（250×4.6mm）５μ（SFCC）］のオクタデシ
ルシリカを有する逆相分析コラム上で続行された。溶離
は0.1％ののCF3COOH−MeOH（80−20）水溶液または0.1
％のCF3COOH−CH3CN（95−５）水溶液を用い流出率1ml/
分で行なわれた。留分の検出は215nmにおける吸収率の
測定によってなされた。
得られた結果は次のとおりである。
1.溶媒：（H2O,0.1％ CF3COOH）/CH3OH（80/20） 流出率:1ml/分，保持時間６分，均質ピーク１ 2.溶媒：（H2O,0.1％ CF3COOH）/CH3CN（95/5） 流出率:1ml/分，保持時間18分，均質ピーク１ この工程が、その構造が以下に示されるとおりに決定
される均質な製品を得ることも可能にすることがみとめ
られた。
総生成量は当初の原料1kgに対して60μｇである。
その留分はマウスにおいて約100ngで活性がある。
II.活性本体の構造の決定 1.アミノ酸の分析 酸の加水分解後、オルトフタルジアルデヒドを用いた
反応によって生じた誘導体の高圧液相クロマトグラフィ
（HPLC）による分析はリジン、アスパラギン酸およびセ
リンの存在の観察も可能にする。アミノ酸分析器による
製品の分析は、酸の加水分解と次亜塩素酸ナトリウムを
使用しての酸化の後に、プロリンの存在の観察を可能に
し、アスパラギン酸、セリン、リジンの存在の確認を可
能にする。
2.校磁気共鳴分光法 一次元および二次元のNMR（H2OおよびD2O）は４種類
のアミノ酸（プロリン，リジン，アスパラギン酸，セリ
ン）およびアセチル基の存在を示す。リジンの側鎖のNH
2とセリンのOHは遊離している。セリン，リジンおよび
アスパラギン酸のアミノ酸部分のNH2は置換されたもの
である。推定構造では終端部のNH2においてアセチル化
されたペプチドの構造である。
3.質量分光測定法（MS） FAB（急速原子衝撃）における質量分光測定技術によ
りこのペプチドが488という分子量（Ｍ＋１）をもって
いることが分った。
質量分光測定法の変法によるアミノ酸の連鎖の研究、
すなわちいわゆるMS−MSテクニックではペプチドの完全
な一次構造はSer（Ｎ−Ac）−Asp−Lys−Pro−OHである
と決定した。
III.生物試験の記述 画分の生物活性は（Ara−Ｃ）の注射により誘発され
るCFU−Ｓ（脾臓中にコロニーを形成する単位）の環へ
の侵入のインビボにおける阻止テストにより測定され
る。
マウスのCFU−Ｓは、通常は静止性（quiescent）であ
るが、Ara−Ｃの注射後に環にはいる。われわれは薬剤
投与の６時間後に阻止剤が注射されたときに阻止剤がCF
U−ＳがDNAの合成（Ｓ相）に入ってくるのを阻むことを
証明した。
CFU−Ｓの数は、J.E.Till＆E.A.McCulloch.Radiat。R
es.14（1961）,213−222のテクニックによって決定され
る。その法則は脾臓中に肉眼で見えるコロニーを生成す
るCFU−Ｓの能力に基づいている。これらのコロニーは
一つのCFU−Ｓの系統を引くクローンである。
Ｓ相におけるCFU−Ｓの割合は細胞自滅の原理に基づ
いた。A.J,Becker et al.,Blood,26（1965）,296−308
の方法によって決定される。チミジントリチウム（DNA
の先駆物質）溶液中の細胞の潜伏はDNA分子への放射能
（トリチウム）致死量の吸収によるDNA合成の相におけ
る細胞の選択死へと通ずる。
試験は、２〜３カ月のBalb/c系統またはCBA系統のSPF
（特定の病原をもたないマウス）について行われる。
1.対照無処理群は腹腔投与で次の処理を受ける。
頭 初:Ara−Ｃ（実験計画Ｉでは10mg、IIでは20mg） 生理的食塩水0.2mlに溶解 ６時間後:0.2mlの生理的食塩水 ８時間後：屠殺（実験計画Ｉ） 12時間後：屠殺（実験計画II） 2.処理群は次の通り腹腔投与を受けた。
頭 初:Ara−Ｃ（実験計画Ｉでは10mg、IIでは20mg） 0.2mlの生理的食塩水に溶解 ６時間後：画分を0.2mlの生理的食塩水に溶解 ８時間後：屠殺（実験計画Ｉ） 12時間後：屠殺（実験計画II） 群中の各個体について実験動物の骨髄を採取して2ml
の媒体199（EURBIO）中で懸濁液をつくった。番号をつ
けて適切な濃度に稀釈してから２等分した５×106個の
凝集した細胞はテストＡでは1mlのMedium199と、テスト
Ｂでは1mlのシミジントリチウム（200μCi）とともに37
℃で20分間暖めた。８×104〜1.2×105の凝集した細胞
を含む0.2mlの細胞懸濁液は照射された実験動物（9Gy.1
実験区につき８頭のマウス）逆軌道（retro−orbital）
の静脈洞に注射された。９日後に注射されたマウスは屠
殺された。その脾臓は取り出されてBouin fluid（１％
ピクリン酸720g,フォルモール240g,酢酸4gをfluid1リッ
トル中に含む）中で固定した。固定後数時間してから肉
眼で見える小結節の数をかぞえた。
ＮおよびＮ′をテストＡおよびテストＢからくる細胞
を処理動物の脾臓において得られた結節数の平均値であ
るならばDNA合成と同調しているCFU−Ｓの割合は次の公
式で計算される。
結 果 1.CFU−Ｓのサイクルへの侵入の阻止 各純化の段階で此の試験に関して活性のある画分が単
離された。しかしながら、次表に示したようにとくに興
味深い作用が本発明によって得られた同質の画分につい
て観察された。
実験計画IIによって行なった本発明によって得られた
同質の画分をマウスに100ng注射することによるCFU−Ｓ
のサイクルへの侵入阻止 2.Ara−Ｃの致死量にて処理した動物の生存率に対する
作用 実験動物はAra−Ｃの分別された量（４×925mg/1kg）
を直後、７時間後、24時間後および30時間後に投与され
た。試験用の画分はAra−Ｃの最初の注射の26時間後に
１回投与された。
実験動物の生存率は処理後15日から30日までの間に調
査した。Ara−Ｃの致死量、反復注射を含む此の実験計
画では阻止剤の付随的な投与が多数の実験動物の決定的
な生存を可能ならしめたことを示している。得られた結
果は阻止剤を用いる代りに実験動物に同種異系の骨髄を
移植したときにみられる結果と比較することができる。
3.EMT6腫瘍の退化について阻止的な画分の活性の缺除 Ara−Ｃの最初の注射の後に７時間後、24時間後およ
び30時間後の合計４回の連続注射に続いて26時間後に阻
止剤の注射を行なったEMT6腫瘍をもった実験動物の治療
は腫瘍細胞に関してはAra−Ｃの治療作用を阻止し得な
いし、骨髄移植に続いて得られた結果と比較し得る処理
動物の生存を許している。
4.毒性 この阻止的な画分はCFU−Ｓに関しては毒性を欠いて
いて、供試した投与量では処理したマウスに如何なる致
死性をももたらさなかった。
IV.慣習的にAcSDKPと略記されるNac−Ser−Asp−Lys−P
ro−OHの液相合成 ａ）Boc−Ｋ（Ｚ）−Ｐ−OHの合成（Ｉ） Boc−Ｋ（Ｚ）−Osu（4.19ミリモル）のDMF溶液に1.1
5mlのトリエチルアミン（8.38ミリモル）を入れたＰ
（8.38ミリモル）の水溶液が加えられた。この混合物は
室温で一晩中撹拌された。
溶媒を蒸発させてから残留物は酢酸エチルに溶解され
た。５％の枸櫞酸液、５％の炭酸ナトリウム溶液および
水でうまく洗滌された溶液は硫酸マグネシウム上で乾燥
させた。溶媒を蒸発させてから、この製品の特性を調査
した。黄色がかった油、3.98ミリモル、生成率95％ ［α］Ｄ＝−38（Ｃ＝1.0,MeOH） Rf:0.5（MeOH/CHCl3:1/9）,0.24（EtOAc/MeOH,8/1） Rfsは薄層クロマトグラフによって測定される。
CDCl3溶液中で核磁気共鳴（NMR）を行なった：一致し
た。
註）次のことを参照して下さい。
Boc＝tert−butyloxycarbonyl Ｚ＝benzyloxycarbonyl Su＝Sulfonamide DMF＝dimethylforamide ｂ）Boc−Ｄ（OBzl）−Ｋ（Ｚ）−Ｐ−OHの合成（II） 915μのトリエチルアミンを含むジメチルホルムア
ミドに溶解した3.15ミリモルのTFA.K（Ｚ）−Ｐ−OH
を、ジメチルホルムアミドに溶解した3.31モリモルのBo
c−Ｄ（OBzl）−OSu液に加えて6.62ミリモルにした。10
当量（equivalent）のTFA液と１当量のアニソールとを
用いて０℃で１時間製品（Ｉ）を処理してTFA.K（Ｚ）
−Ｐ−OHの溶液が得られた。次の段階で使用するに先立
って、この生産物を先ずヘキサンで次いでエーテルで洗
滌する。このようにして作った混合物は室温で一晩中撹
拌した。溶媒を蒸発させてから残留物を酢酸エチルで溶
解し易いようにしてからａ）の実験と同様な方法で洗滌
し、特性を調査した。
油:2.17ミリモル、生成率70％ ［α］Ｄ＝20（Ｃ＝1.2,MeOH） Rf:0.23（MeOH/CHCl3,1/9） CDCl3溶液中で核磁気共鳴を行なった：一致した。
註）次のことを参照して下さい。
TFA＝trifluoroacetic acid Bzl＝benzyl ｃ）Boc−Ｓ（Bzl）−Ｄ（OBzl）−Ｋ（Ｚ）−Ｐ−OHの
合成（III） ｂ）における同じ順序で1.47ミリモルのBoc−Ｓ−（B
zl）−Osuを1.47ミリモルのTFA.D（OBzl）−Ｋ（Ｚ）−
Ｐ−OHに加えた。
得られた製品の特性は次のとおりである。
油:1.31ミリモル：生成率89％ ［α］Ｄ＝−26.7（Ｃ＝1.0,MeOH） Rf:0.29（MeOH/CHCl3,1/9） 溶解性を増すために少量のMeODを付加したCDCl3溶液中
において核磁気共鳴を行ない、次にスペクトル分析を行
なった。：一致した。
ｄ）Acs（Bzl）−Ｄ（OBzl）−Ｋ（Ｚ）−Ｐ−OHの合成
（IV） 製品（III）からＮ−terminal Bocをとり除いて新し
い保護基を１回の操作で付加した。最終製品は洗滌後、
１ミリモルのTFA.S（Bzl）Ｄ−（OBzl）Ｋ（Ｚ）POHを
使用して次のような特性が明らかになった。
油:0.77ミリモル：生成率77％ ［α］Ｄ＝−22.0（Ｃ＝1.0,MeOH） Rf:0.12（CHCl3/MeOH,9/1） 0.54（EtOAc/MeOH/CH3COOH,16/3/1）、MeODを付加したC
DCl3溶液中において核磁気共鳴を行なった：一致した。
ｅ）Ac−Ｓ−Ｄ−Ｋ−Ｐ−OHの取得（Ｖ） メタノールに溶解した製品（IV）にパラジウム炭素を
追加して水素添加分解した。反応が完了してからメタノ
ールを蒸発させて残留物の特性を調査した。
凍結乾燥後白色固体になった此の最終製品は天然のペ
プチドと同じ物理化学的テクニックを用いて特性を調査
した。すなわち、アミノ酸の分析高性能液体クロマ
トグラフD2O溶液中における核磁気共鳴FABおよびFA
B（MS−MS）の質量分光測定法 これらの全部のテクニックにおいて合成製品（Ｖ）に
ついて得られた結果と天然品について得られた結果とに
おいて見事な一致がみとめられた。
詳しく言えば、天然のペプチドと合成ペプチドの陽子
の核磁気共鳴スペクトルは質量スペクトルと同様に完全
に重ね合わせることができる。イソクラティックな（is
ocratic）条件下でCH3CN/H2Oと0.1％のTFA（4.5/95.5）
混合物を使用して215nmにおける検出の場合にODS−Hype
rsil C18分析コラム上の逆相高圧液体クロマトグラフに
よる此の合成ペプチドの分析は25℃で18分間のピークの
観察を可能にして、15℃で24分間のピークの最初の部分
においてより明確にあらわれるほっそりした肩の部分を
含む。15℃で24分のところのピークは22分のところの軽
度のピークに分割することができる。先に現われるピー
クと24分間のところのピークとに、このピークに相当す
る生産物は天然ペプチドの生物学的性質を有している。
それは本発明にしたがって抽出された天然の阻止剤に関
する前記の試験に従っていた。
DNA合成に対応して得られたCFU−Ｓのパーセンテイジ
は次の第２表に示した。
テスト1,テスト２およびテスト３は最初の合成によっ
て得られたテトラペプチドを供試して行なわれた。テス
ト4,テスト5,テスト6,テスト７およびテスト８は第２回
目の合成によって得られたテトラペプチドを供試して行
なわれた。
得られた結果は天然の製品を供試して得られた結果と
比較すべきである。一方、は第１表に、他方は第３表に
記載されている。
後者の結果は骨髄のＡ群およびＢ群から天然の製品を
供試して得られたものである。
一方は第１表および第３表、他方は第２表の比較研究
は、合成ペプチドは天然ペプチドを供試して得られた作
用と全く同様な作用をしたことを報告している。
得られた結果は添付した図表に示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ランフアン，マリーズ フランス国 91190 ジフ シュール イベツト リュ デ シヤテネール 18 (72)発明者 ギイゴン，マルテイーヌ フランス国 92000 ヌイリ リュ ド セズイ 37 (72)発明者 バカラ，ヨハンナ フランス国 75012 パリ アヴニユ サン‐マンデ ９

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式がSer−Asp−Lys−Pro−OHであるテ
    トラペプチド若しくは該ペプチドを保護する一つまたは
    それ以上の同一または異なる基によるその置換誘導体で
    あって、該置換基がアセチル、ベンジル、メチルおよび
    フェニル基よりなる群から選択されたものである誘導
    体、又はこれらの薬学的に容認できる塩。
  2. 【請求項２】特許請求の範囲第１項記載のテトラペプチ
    ドであって、それが式Ser（Ｎ−Ac）−Asp−Lys−Pro−
    OHをもつもの又はその薬学的に容認できる塩。
  3. 【請求項３】生体材料、とくに牛の胎児の肝臓または骨
    髄から式Ser（Ｎ−Ac）−Asp−Lys−Pro−OHのテトラペ
    プチドを抽出する方法であって、該方法が本質的に次の
    ステップによって構成されていることを特徴とする方
    法。 必要があれば最初の材料を擦り潰して脱脂する。 pH7に近い緩衝液の中に硫黄を含む還元剤の存在下
    に得られた生産物を懸濁させる。還元剤は、とくにジチ
    オエリスリトルまたは、できるならばメルカプトエタノ
    ールが好ましい。 均質化されたものを約15,000gで少なくとも１時間
    遠心分離する。 上澄み液を10,000ダルトンに近い除外限度をもつ膜
    上で限外濾過する。 得られた限外濾過液をポリアクリルアミドゲルタイ
    プの分子ふるい上でクロマト分離し、酢酸の希釈液を用
    いて溶離する。 集めた活性画分を脂肪族残基、特に18Cのものをグ
    ラフトさせたシリカの逆相支持体上で分別する。好まし
    くはこのステップを少なくとも１回繰返す。 集めたその新しい活性画分を脂肪族残基、特に18C
    のものをグラフトさせたシリカの逆相カラム上の高圧液
    体クロマトグラフィにかけて均質な活性画分を得る。
  4. 【請求項４】本質的にはその炭素原子の末端部から液相
    に於て適切なアミノ酸グループを逐次的に追加してゆく
    ことからなっており、適切にはそれらアミノ酸の反応性
    基は置換ないしは保護されており、そしてもしそれが必
    要なときはその保護基をとり除くことからなることを特
    徴とする一般式がSer−Asp−Lys−Pro−OHであるテトラ
    ペプチド若しくは該ペプチドを保護する一つまたはそれ
    以上の同一または異なる基によるその置換誘導体であっ
    て、該置換基がアセチル、ベンジル、メチルおよびフェ
    ニル基よりなる群から選択されたものである誘導体、又
    はこれらの薬学的に容認できる塩の合成法。
  5. 【請求項５】前記テトラペプチドが式Ser（Ｎ−Ac）−A
    sp−Lys−Pro−OHをもつもの又はその薬学的に容認でき
    る塩である特許請求の範囲第４項記載の合成法。
  6. 【請求項６】活性要素として一般式がSer−Asp−Lys−P
    ro−OHであるテトラペプチド若しくは該ペプチドを保護
    する一つまたはそれ以上の同一または異なる基によるそ
    の置換誘導体であって、該置換基がアセチル、ベンジ
    ル、メチルおよびフェニル基よりなる群から選択された
    ものである誘導体、又はこれらの薬学的に容認できる塩
    の少なくとも１つを含有する化学的療法による制がん治
    療中の骨髄の保護用医薬。
  7. 【請求項７】前記テトラペプチドが式Ser（Ｎ−Ac）−A
    sp−Lys−Pro−OHをもつもの又はその薬学的に容認でき
    る塩である特許請求の範囲第６項記載の医薬。
  8. 【請求項８】通常のアジュバントおよび／または賦形剤
    の存在下に静脈内または皮下投与を目的とする粉末の形
    態の特許請求の範囲第６または７項記載の医薬。
  9. 【請求項９】活性要素として一般式がSer−Asp−Lys−P
    ro−OHであるテトラペプチド若しくは該ペプチドを保護
    する一つまたはそれ以上の同一または異なる基によるそ
    の置換誘導体であって、該置換基がアセチル、ベンジ
    ル、メチルおよびフェニル基よりなる群から選択された
    ものである誘導体、又はこれらの薬学的に容認できる塩
    の少なくとも１つを含有する致命的骨髄形成不全の治療
    用医薬。
  10. 【請求項１０】前記テトラペプチドが式Ser（Ｎ−Ac）
    −Asp−Lys−Pro−OHをもつもの又はその薬学的容認で
    きる塩である特許請求の範囲第９項記載の医薬。
  11. 【請求項１１】活性要素として一般式がSer−Asp−Lys
    −Pro−OHであるテトラペプチド若しくは該ペプチドを
    保護する一つまたはそれ以上の同一または異なる基によ
    るその置換誘導体であって、該置換基がアセチル、ベン
    ジル、メチルおよびフェニル基よりなる群から選択され
    たものである誘導体、又はこれらの薬学的に容認できる
    塩の少なくとも一つを含有する二次的白血病の治療用医
    薬。
  12. 【請求項１２】前記テトラペプチドが式Ser（Ｎ−Ac）
    −Asp−Lys−Pro−OHをもつもの又はその薬学的に容認
    できる塩である特許請求の範囲第11項記載の医薬。
  13. 【請求項１３】活性要素として一般式がSer−Asp−Lys
    −Pro−OHであるテトラペプチド若しくは該ペプチドを
    保護する一つまたはそれ以上の同一または異なる基によ
    るその置換誘導体であって、該置換基がアセチル、ベン
    ジル、メチルおよびフェニル基よりなる群から選択され
    たものである誘導体、又はこれらの薬学的に容認できる
    塩の少なくとも１つを含有する血液病の後遺症の治療用
    医薬。
  14. 【請求項１４】前記テトラペプチドが式Ser（Ｎ−Ac）
    −Asp−Lys−Pro−OHをもつもの又はその薬学的に容認
    できる塩である特許請求の範囲第13項記載の医薬。
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