DK171969B1 - Tetrapeptid, dets fremstilling og anvendelse - Google Patents

Description

DK 171969 B1

Opfindelsen angår et hidtil ukendt tetrapeptid, der virker som inhibitor for indgreb i udviklingen af bloddannende stamceller, samt visse derivater deraf.

Opfindelsen angår ligeledes en fremgangsmåde til 5 udvinding af dette tetrapeptid ud fra biologiske materialer, især kalvefoster-knoglemarv, og en fremgangsmåde til syntetisering af peptidet samt dets substitutionsderivater ad kemisk vej.

Opfindelsen angår desuden anvendelsen af dette peptid 10 og dets substitutionsderivater til fremstilling af specifikke antistoffer, samt lægemidler indeholdende peptidet eller dets derivater.

Anvendelsen af medikamenter ved behandling af cancer er begrænset af deres toksiske virkninger på sunde væv og 15 især bloddannende væv. Gentagen anvendelse af disse medikamenter medfører i et stort antal tilfælde enten letal medul-lær aplasi eller en sekundær leukæmi eller mindre alvorlige hæmatologiske følgesygdomme.

Da størstedelen af medikamenter mod cancer kun virker 20 på prolifererende celler, har man forestillet sig, at det var muligt at forebygge hæmatologiske skader ved at beskytte de multipotente stamceller med proliferationsinhibitorer.

Arbejde, som er udført af ansøgerne og er publiceret tidligere (jf. især E. Frindel og M. Guigon, Exp. Hemat., 5 25 (1977), 74-76, M. Guigon og E. Frindel, Bull. Cancer 68(2) .

(1981), 150-153, M. Guignon, J.Y. Mary, J. Enouf og E. Frindel, Cancer Res. 42 (1982) 638, J. Wdzieczak-Bakala, M.

Lenfant og M. Guigon, IRCS Med. Sci., 12. (1984), 868-869, J. Wdzieczak-Bakala, M. Guigon, M. Lenfant og E. Frindel, 30 Biomed. Pharm., 37. (1983), 467-471 og M. Guigon, J. Wdzieczak-Bakala, J.Y. Mary og M. Lenfant, Cell Tissue Kinet. 17 (1984), 49-55) har vist, at det er muligt ved indgivelse af en specifik inhibitor til beskyttelse af stamceller at opnå en væsentlig nedsættelse af den dødelighed, der observeres 35 hos dyr under behandling med cytosin-arabinosid (Ara-C), et medikament, som er gængst anvendt ved kemoterapi af cancer, 2 DK 171969 B1 og hvis anvendelse er begrænset af dets skadelige virkning på knoglemarven. Denne specifikke inhibitor, som udvindes af visse biologiske materialer, især knoglemarv eller kalve-fosterlever, beskytter stamcellerne, som er udgangspunktet 5 for alle blodceller.

Således viser gennemførte biologiske undersøgelser, at den observerede forøgelse af overlevelsen kan tilskrives en beskyttelse af bloddannende stamceller, CFU-S (Colony Forming Units in the Spleen, kolonidannende enheder i milt), 10 dvs. multipotente stamceller, der kan danne kloner i milten hos mus, der er bestrålet med en dødelig dosis, idet denne beskyttelse skyldes, at de nævnte celler holdes udenfor den cellulære cyclus af inhibitoren.

De publicerede artikler beskriver metoder, der gør 15 det muligt at fremstille mere eller mindre rensede ekstrakter indeholdende den specifikke inhibitor, men i alle tilfælde er det fremkomne slutprodukt ikke ensartet, og udbytterne er lidet tilfredsstillende. Det har altså hidtil ikke været muligt at isolere det aktive princip og bestemme dets struk-20 tur.

Der er nu tilvejebragt en særlig udvindingsfremgangsmåde, der gør det muligt at opnå en homogen aktiv fraktion i form af det hidtil ukendte tetrapeptid Ser(N-Ac)-Asp-Lys--Pro-OH ud fra et biologisk materiale, især kalvefoster-25 knoglemarv, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved at omfatte følgende trin: formaling af udgangsmaterialet og om fornødent deli-pidering af dette, suspendering af det fremkomne produkt i en puffer 3 0 ved en pH-værdi nær 7 i nærværelse af en svovlholdig reducerende reaktant, især dithioerythritol eller fortrinsvis mercaptoethanol, centrifugering af homogenisatet ved ca. 15.000 g i mindst 1 time, 3 5 ultrafiltrering af den ovenstående væske på en membran med en udelukkelsesgrænse nær 10.000 dalton, 3 DK 171969 B1 chroraatografering af det fremkomne ultrafiltrat på en molekylsigte af polyacrylamidgel-typen, med eluering med en fortyndet eddikesyreopløsning, fraktionering af den opsamlede aktive fraktion på en 5 invers fase bærer af siliciumdioxid podet med aliphatiske grupper, især C18-grupper, idet dette trin fortrinsvis gentages mindst en gang, og højtryksvæskechromatografering af den opsamlede nye aktive fraktion på en invers fase søjle af siliciumdioxid 10 podet med aliphatiske grupper, især C^g-grupper, til opnåelse af en homogen aktiv fraktion.

De fem første trin gennemføres fordelagtigt ved +4°C.

Den "aktive fraktion" identificeres ved biologiske prøver, især som beskrevet i den nedenfor følgende eksperi-15 menteile del.

Et detaljeret eksempel på anvendelsen af denne udvindingsfremgangsmåde er anført i den eksperimentelle del nedenfor.

En kombination af forskellige analysemetoder, især 20 NMR, massespektrometri og analyse af indholdet af indholdet af aminosyrer ved højtryksvæskechromatografi (HPLC) har gjort det muligt at bestemme strukturen af det således isolerede homogene produkt. Dette produkt er et acetyleret tetra-peptid med en molekylvægt på 487, der har formlen: 25

Ser(N-Ac)-Asp-Lys-Pro-OH

eller N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-prolin.

De tidligere beskrevne resultater har ikke gjort det 30 muligt at forestille sig, at den observerede aktivitet af de fremstillede, mere eller mindre rensede ekstrakter kunne skyldes et tetrapeptid af den ovenfor anførte type.

Der er således især blevet konstateret en beskyttende virkning af mercaptoethanol på den inhiberende fraktion, 35 som syntes at skyldes tilstedeværelsen af thiolgrupper i inhibitormolekylet, idet tilstedeværelsen af sådanne grupper 4 DK 171969 B1 er blevet konstateret i den ovenfor fremstillede, relativt rensede, inhiberende fraktion, jf. IRCS Med. Sci. 12, (1984), 868-869.

Ligeledes har man forestillet sig, idet der er blevet 5 påvist sukkerrester, at det aktive princip kunne være af glycopeptidtypen, og denne antagelse er blevet understøttet af den kendsgerning, at den omhandlede inhibitor kan klassificeres blandt chaloner eller antihormoner, og at størstedelen af forbindelserne af denne type er glycosylerede.

10 Opfindelsen angår altså tetrapeptidet

Ser-Asp-Lys-Pro-OH

og dets derivater fremkommet ved substitution med en eller 15 flere ens eller forskellige peptidbeskyttelsesgrupper, der er almindeligt anvendte inden for peptidkemien til biologisk anvendelse. Disse grupper vælges fordelagtigt blandt acetyl, benzyl, methyl og phenyl. Derivatet, som er monoacetyleret ved det endestillede nitrogenatom, er særlig foretrukket.

20 Opfindelsen angår ligeledes farmaceutisk acceptable salte af disse forbindelser.

Tetrapeptidet Ser-Asp-Lys-Pro-OH kan fås ved ekstraktion af biologisk materiale, især ud fra kalvefosterlever eller -knoglemarv.

25 Tetrapeptidet kan især fås ved fremgangsmåden, der er beskrevet generelt ovenfor og beskrives mere detaljeret i den eksperimentelle del. Det er da i den acetylerede form (i den N-terminale position) og kan anvendes som sådant eller kan deacetyleres ved metoder, der er klassiske indenfor 30 peptidkemien.

Peptidet ifølge opfindelsen og dets substitutionsderivater kan ligeledes fremstilles ved peptidsyntese, især i væskefase.

Peptidsyntesen i væskefase er ejendommelig ved, at 35 den i det væsentlige består i successiv tilføjelse i flydende fase ud fra den C-terminale ende af passende aminosyregrup- 5 DK 171969 B1 per, der er substitueret eller beskyttet på passende måde ved deres reaktive grupper, og, når det er nødvendigt, fjernelse af beskyttelsesgrupperne.

Inhibitoren fremstillet ifølge opfindelsen synes 5 ikke at udvise nogen artsspecificitet (ved de her beskrevne forsøg udvindes den fra kalvefosterknoglemarv og er aktiv hos mus). Det kan derfor forudses, at inhibitoren og dens substitutionsderivater samt deres farmaceutisk acceptable salte kan anvendes til adskillige medicinske og biologiske 10 formål hos mennesker og dyr.

Forbindelserne kan anvendes til beskyttelse af knoglemarv under behandlinger mod cancer ved hjælp af kemoterapi.

I dette tilfælde formuleres de fordelagtigt i form af pulvere og indgives, i nærværelse af sædvanlige hjælpe-15 stoffer og/eller ekscipienser, ad intravenøs eller subkutan vej under den kemoterapeutiske behandling. Indgivelsernes hyppighed og mængden af indgiven forbindelse afhænger i det væsentlige af stamcellernes kinetik, der kan variere afhængigt af det terapeutiske middel, dets dosering og den måde, 20 hvorpå det anvendes.

Opfindelsen angår således også et lægemiddel, især til beskyttelse af knoglemarv under behandlinger mod cancer ved kemoterapi, hvilket lægemiddel er ejendommeligt ved, at det foreligger i form af et pulver, der er beregnet til 25 intravenøs eller subkutan indgivelse, i nærværelse af sædvanlige hjælpestoffer og/eller ekscipienser, og at det som aktiv bestanddel indeholder mindst én forbindelse ifølge opfindelsen.

Man kan forestille sig andre "indgivelsesmåder", 30 f.eks. en sådan, der består i at lade inhibitoren producere i patientens organisme ved anvendelse af genetiske metoder, f.eks. ved hjælp af bakterier.

Tetrapeptidet og dets substitutionsderivater ifølge opfindelsen kan desuden anvendes til tilvejebringelse af 35 specifikke antistoffer til bestemmelse af mængden af inhibitor, der cirkulerer hos patienterne, og til bestemmelse 6 DK 171969 B1 af dets rolle ved visse sygdomme i det bloddannende system samt ved knoglemarvstransplantationer.

En anvendelse af disse antistoffer i tilfælde, hvor der sker en overproduktion af inhibitor knyttet til patholo-5 giske tilstande, kan ligeledes forudses.

I. Udvinding af peptidet N-acetvl-servl-aspartvl-lvsvl-oro-lin.

Udgangsmaterialet udgøres af kalvefosterknoglemarv, 10 der har været opbevaret i frosset tilstand. I hvert af de nedenfor beskrevne trin sættes der mercaptoethanol i en slutkoncentration på 10'^ m til de isolerede fraktioner.

5 kg væv findeles ved hjælp af en homogenisator af Waring-blender-typen (3 gange, 60 sekunder) i 40 liter 0,01 15 M phosphatpuffer, pH-værdi 7,2, i nærværelse af 0,01 M mercaptoethanol ved 4°C. Suspensionen centrifugeres ved 15.000 g i 1 time og 30 minutter.

Den opsamlede ovenstående væske ultrafiltreres på en membran af typen Sartorius 121 36, der gør det muligt at 20 adskille molekylerne efter deres molekylvægt, og hvis udelukkelsesgrænse er 10.000 dalton.

Ultrafiltratet koncentreres 20 gange ved inddampning under vakuum ved hjælp af en fordamper af flashfordampertypen (LUWA). Koncentratet frysetørres derefter. Udbyttet er 16,5 25 g/kg, og fraktionen er aktiv hos mus i en dosis på ca. 2 0 mg/mus (aktivitet bestemt ifølge en af de nedenfor beskrevne procedurer). Det frysetørrede pulver (50 g) genopløses derefter i 200 ml af en 0,01 M eddikesyreopløsning (pH-værdi 3), hvorefter der centrifugeres i 10 minutter ved 15.000 g.

30 Den ovenstående væske chromatograferes på en søjle af mole-kylsigte af typen "Biogel P-2", der har en "maskevidde" på 0,07-0,04 mm (200-400 mesh) (BIO-RAD), med dimensionerne 12,5 x 100 cm, idet der elueres med 20 liter 0,01 M eddikesyre (strøm: 400 ml/time).

35 Den aktive fraktion elueres ved et forhold Ve/Vo på 1,2-1,8, hvor Ve er elueringsvolumenet, og Vo er søjlens 7 DK 171969 B1 tomrumsvoluraen. Udbyttet er 250 mg/kg udgangsmateriale, og fraktionen er aktiv hos mus i en dosis på ca. 5 μg/mus.

Den aktive fraktion (10 mg) opløses derefter i 1 ml vand og fraktioneres derefter successivt på to søjler med 5 invers fase bærer af siliciumdioxid podet med C18-alipha-tiske grupper af typen "Sep-pak C-18" (WATERS). Søjlerne elueres successivt med 2 ml vand, 2 ml af en blanding af vand og methanol i forholdet 50:50 og 2 ml methanol.

Den aktive fraktion, der elueres med blandingen af 10 vand og methanol i forholdet 50:50, koncentreres derefter under vakuum ved en temperatur på ca. 20°C på et apparat af typen "Speed Vac", hvorefter den frysetørres.

Rensningen efterfølges af en høj tryksvæskechromatogra-fi på en analytisk invers fase søjle af octadecyl-silicium-15 dioxid af typen "ODS-Hypersil C-18", (250 x 4,6 mm) 5 μπι (SFCC). Elueringen gennemføres med blandingen H20,CF3C00H 0,1%-MeOH (80-20) eller blandingen H20,CF3COOH 0,1%-CH3CN (95-5) med en hastighed på 1 ml/minut. Fraktionerne påvises ved måling af absorptionen ved 215 nm.

20 Der opnås følgende resultater: 1. Opløsningsmiddel: (H20, CF3COOH 0,1%)/CH3OH, [80/20] strøm: 1 ml/minut, retentionstid: 6 minutter, 1 homogen top.

2. Opløsningsmiddel: H20,CF3C00H 0,1% CH3CN, [95/5], strøm: 1 ml/minut, retentionstid: 18 minutter, l homogen top.

25 Det konstateres, at der ved denne fremgangsmåde kan fås et ensartet produkt, hvis struktur bestemmes som beskrevet nedenfor.

Det samlede udbytte er 60 μg/kg udgangsmateriale.

Fraktionen er aktiv hos mus i en dosis på ca. 100 30 ng/mus.

II. Bestemmelse af strukturen af den aktive bestanddel: 1. Aminosvreanalvse

Efter sur hydrolyse viser HPLC-analyse af derivaterne 35 dannet ved omsætning med orthophthaldialdehyd tilstedeværelse af lysin, asparaginsyre og serin. En analyse af produktet 8 DK 171969 B1 ved hjælp af en aminosyreanalysator efter sur hydrolyse og oxidation med natriumhypochlorit viser tilstedeværelse af prolin og bekræfter tilstedeværelsen af asparaginsyre, serin og lysin.

5 2. NMR-Soektroskopi NMR i en og to dimensioner (H2O og D2O) viser tilstedeværelsen af fire aminosyrer (prolin, lysin, asparaginsyre, serin) og en acetylgruppe. Aminogruppen i sidekæden af lysin og hydroxylgruppen af serin er frie, og aminogrup-10 perne af aminosyredelene af serin, lysin og asparaginsyre er substituerede en gang. Den sandsynlige struktur er strukturen af et peptid, der er acetyleret ved den terminale aminogruppe.

3. Massesoektrometri 15 Massespektrometrimetoder (MS) med FAB (Fast Atom

Bombardment) har vist, at dette peptid har en molekylvægt (M + 1) på 488.

En undersøgelse af aminosyresekvensen ved en variant af massespektrometri, nemlig den såkaldte MS-MS-teknik, har 20 vist, at den fuldstændige primære struktur af peptidet er følgende:

Ser(N-Ac)-Asp-Lys-Pro-OH

25 III. Beskrivelse af biologiske forsøg.

Den biologiske aktivitet af fraktionerne måles ved forsøg in vivo med inhibering af differentiering af CFU-S fremkaldt af en injektion af Ara-C.

CFU-S fra mus, der normalt er hvilende, differentierer 30 efter en injektion af Ara-C. Det har vist sig, at når inhibitoren injiceres 6 timer efter medikamentet, forhindrer den, at CFU-S påbegynder DNA-syntese (S-fase).

Antallet af CFU-S bestemmes ved metoden ifølge J.E. Till og E.A. McCulloch, Radiat, Res., 14., (1961), 213-222, 35 hvis princip hviler på evnen af CFU-S til at danne makroskopiske kolonier i milten. Disse kolonier er kloner af en 9 DK 171969 B1 CFU-S.

Andelen af CFU-S i S-fase bestemmes ved metoden ifølge A.J. Becker et al., Blood, 26, (1965), 296-308, der er base ret på et celle-"selvmords"-princip. Inkubering af cellerne 5 med en opløsning af tritieret thymidin (forstadium for DNA) fører til selektiv død af celler, der er i DNA-syntesefase, ved inkorporering af en lethal dosis radioaktivitet (tritium) i DNA-molekylet.

Forsøgene er gennemført med SPF-mus (specifikt patho-10 genfri mus) af stammen Balb/C eller CBA med en alder på 2-3 måneder.

1. Sammenligningsgrupperne modtager intraperitonealt følgende behandling: tidspunktet 0: Ara-C (10 mg ved procedure I eller 20 mg ved 15 procedure II) opløst i 0,2 ml fysiologisk serum.

Tidspunktet 6 timer: 0,2 ml fysiologisk serum.

Tidspunktet 8 timer: aflivning (procedure I).

Tidspunktet 12 timer: aflivning (procedure II).

2. Behandlingsgrupperne modtager intraperitonealt: 20 Tidspunktet 0: Ara-C (10 mg ved procedure I eller 20 mg ved procedure II) opløst i 0,2 ml fysiologisk serum.

Tidspunktet 6 timer: fraktionen, der skal undersøges, opløst i 0,2 ml fysiologisk serum.

Tidspunktet 8 timer: aflivning (procedure I).

25 Tidspunktet 12 timer: aflivning (procedure II).

Procedure I Procedure II

^ I

0 6 8 12 30 timer I-1-1-I— f t \ /

Ara-C Inhibitor /

Bestemmelse af

35 antallet af CFU-S

i cyclus.

10 DK 171969 B1

For hver af grupperne opsamles dyrenes knoglemarv og suspenderes i 2 ml medium 199 (EUROBIO). Efter optælling og passende fortynding inkuberes to portioner på 5 x 106 celler med kerne i 20 minutter ved 37°C med enten 1 ml medium 199 5 (forsøg A) eller med 1 ml tritieret thymidin (200 μΟχ) (forsøg B). 0,2 ml cellesuspension indeholdende 8 x 104 til 1,2 x 105 celler med kerne injiceres intravenøst i den retro-orbitale sinus af bestrålede modtagerdyr (9 Gy, 8 mus pr. målepunkt). 9 dage senere aflives modtagermusene, deres 10 milt fjernes, og den fikseres i Bouin's væske (1% picrinsyre: 720 g, formol: 240 g, 4 g eddikesyre til 1 liter væske).

Efter nogle timers fiksering optælles antallet af synlige noduler makroskopisk.

Idet N og Ν' er middelantallene af noduler i milte 15 fra modtagerdyr, der har modtaget celler hidrørende fra forsøg A hhv. B, er andelen af CFU-S i DNA-syntesefase følgende : 20 % CFU-S i S-fase = -N.:T--'— x 100

N

Resultater: 1. Inhiberinq af indgang i cvclus af CFU-S 25 I hvert rensningstrin isoleres en fraktion, der er aktiv ved denne prøve. Imidlertid observeres der en særlig interessant aktivitet med den homogene fraktion, der fås ifølge opfindelsen, således som det fremgår af den følgende tabel.

30 Inhibering af indgang i cyclus af CFU-S ved injektion af 100 ng pr. mus af den homogene fraktion, der fås ifølge opfindelsen ved procedure II.

35 11 DK 171969 B1

TABEL I

% CFU-S i DNA-

Behandling -syntesefase 5 ---

Ara-C (20 mg) 43±9

Ara-C (20 mg) + inhibitor (100 ng) 7±4 10

2. Aktivitet med hensvn til overlevelse af dvr behandlet med letale doser af Ara-C

Dyrene modtager deldoser af Ara-C (4 x 925 mg/kg) på tidspunkterne 0, 7, 24 og 30 timer. Den undersøgte fraktion 15 indgives på en gang 26 timer efter den første injektion af Ara-C. Dyrenes overlevelse vurderes 15-30 dage efter behandlingen. Ved denne procedure, der omfatter gentagne dødelige injektioner af Ara-C, er det påvist, at samtidig indgivelse af inhibitor bevirker definitiv overlevelse af et 20 stort antal dyr. Resultaterne er sammenlignelige med de resultater, der observeres, når der foretages en isogen knoglemarvstransplantation af behandlede dyr i stedet for at anvende inhibitor.

25 Procedure: 0 7 24 26 30 timer 1 -1-1-1-1 t t t t t

30 Ara-C Ara-C Ara-C Ara-C

Inhibitor 3. Fraværelse af aktivitet af den inhiberende fraktion på tilbagegangen af EMT6-tumorer.

35 Behandling af dyr, der bærer tumoren EMT6, med fire successive injektioner af Ara-C på tidspunkterne 0, 7, 24 12 DK 171969 B1 og 30 timer efterfulgt af en injektion af inhibitor 26 timer efter den første injektion af Ara-C hindrer ikke den terapeutiske virkning af Ara-C overfor tumorceller og muliggør en overlevelse af de behandlede dyr, der er sammenlignelig med 5 de resultater, der opnås efter en knoglemarvstransplantation.

4. Toksicitet

Den inhiberende fraktion har ingen toksicitet overfor CFU-S og medfører ingen dødelighed hos de behandlede mus i 10 de anvendte doser.

IV. Syntese i væskefase af NAc-Ser-Asp-Lvs-Pro-OH. som ifølge sædvanlig forkortet skrivemåde betegnes AcSDKP.

a) Syntese af Boc-K(Z)-P-OH (I): 15 Til en opløsning af Boc-K(Z)-OSu (4,19 mmol) i di methyl formamid sættes en vandig opløsning af P (8,38 mmol), hvortil der er sat 1,15 ml triethylamin (8,38 mmol). Blandingen omrøres natten over ved omgivelsestemperatur.

Efter afdampning af opløsningsmidlet opløses remanen-20 sen i ethylacetat. Opløsningen vaskes successivt med 5%'s citronsyre, 5%'s natriumcarbonatopløsning og med vand og tørres over magnesiumsulfat. Efter afdampning af opløsningsmidlet har det således fremstillede produkt følgende karakteristika : 25 gullig olie, 3,98 mmol, udbytte: 95%.

[a]D = -38° (C = 1,0; Me OH)

Rf : 0,5 (MeOH/CHCI3 : 1/9) ; 0,24 (EtOAc/MeOH : 8/1) Rf-værdierne bestemmes ved tyndtlagschromatografi på sili-ciumdioxid.

30 NMR-spektret i opløsning i CDC13 stemmer overens med den forventede struktur.

Boc = tert.butyloxycarbonyl, Z = benzyloxycarbonyl,

Su = sulfonamid, 35 DMF = dimethylformamid.

13 DK 171969 B1 b) Syntese af Boc-D(OBzl)-K(Z)-P-OH (II):

Til en opløsning af Boc-D(OBzl)-OSu (3,31 mmol) i dimethylformamid sættes en opløsning af TFA.K(Z)-P-OH (3,15 mmol) i dimethylformamid indeholdende 915 μΐ triethylamin, 5 dvs. 6,62 mmol. Opløsningen af TFA.K(Z)-P-OH fås ved behandling af produktet (I) med en opløsning af TFA (10 ækvivalenter) og anisol (1 ækvivalent) i 1 time ved 0°C. Der vaskes med hexan og derefter med ether, før produktet anvendes i det efterfølgende trin. Den således fremkomne blanding om-10 røres natten over ved omgivelsestemperatur. Efter afdampning af opløsningsmidlet opløses remanensen i ethylacetat og vaskes som under a), før den karakteriseres, olie, 2,17 mmol, udbytte: 70%.

[a]D = 20° (C = 1,2, MeOH) 15 Rf : 0,23 (MeOH/CHCl3 : 1/9), NMR-spektret i opløsning i CDCI3 stemmer overens med den forventede struktur.

TFA = trifluoreddikesyre,

Bzl = benzyl.

20 c) Syntese af Boc-S(Bzl)-D(OBzl)-K(Z)-P-OH (III): I samme rækkefølge som under b) sættes 1,47 mmol Boc-S(Bzl)-Osu til 1,47 mmol TFA.D(OBzl)-K(Z)-P-OH.

Det fremkomne produkt har følgende karakteristika: olie, 1,31 mmol, udbytte: 89%.

25 [a]D = -27° (C = 1,0, MeOH)

Rf : 0,29 (MeOH/CHCI3 : 1/9), NMR-spektret i CDCI3 tilsat en lille mængde Me OD for at forbedre opløseligheden og opløsningen af spektrene stemmer overens med den forventede struktur.

30 d) Syntese af AcS(Bzl)-D(OBzl)-K(Z)-P-OH (IV):

Efter fjernelse af den endestillede Boc-gruppe fra produktet (III) tilføjes den nye blokerende gruppe i et enkelt trin. Det færdige produkt udviser efter vaskning følgende karakteristika, når der anvendes l mmol 35 TFA.S(Bzl)D(OBzl)K(Z)POH: olie, 0,77 mmol, udbytte: 77%.

14 DK 171969 B1 [a]D = -22° (C = 1,0, MeOH)

Rf : 0,12 (CHCl3/MeOH : 9/1) , 0,54 (EtOAc/MeOH/CH3COOH, 16/3/1) NMR-spektret i opløsning i CDC13 tilsat MeOD stemmer overens 5 med den forventede struktur.

e) Fremstilling af Ac-S-D-K-P-QH (V):

Produktet (IV) i opløsning i methanol underkastes efter tilsætning af palladium på carbon en hydrogenolyse. Efter endt omsætning afdampes methanolen, og remanensen 10 karakteriseres.

Dette slutprodukt, som efter frysetørring foreligger i form af et hvidt fast stof, karakteriseres ved de samme fysisk-kemiske metoder som det naturlige peptid, nemlig: aminosyreanalyse, 15 højtryksvæskechromatografi, NMR i opløsning i D20 og FAB-massespektrometri og FAB-(MS-MS).

Ved alle disse metoder konstateres der en god overensstemmelse mellem resultaterne opnået med det syntetiske 20 produkt V og resultaterne opnået med det naturlige produkt.

Især følger proton-NMR-spektrene af det naturlige peptid og det syntetiske peptid fuldstændig hinanden ligesom massespektrene.

En analyse af dette syntetiske tetrapeptid ved HPLC 25 i invers fase på en analytisk søjle af "ODS-Hypersil C 18" under isokratiske betingelser med en blanding af acetonitril og vand med 0,1% TFA (4,5:95,5) med detektion ved 215 nm viser, at toppen ved 18 minutter ved 25°C har en svag skulder, som viser sig tydeligere i den første del af toppen 30 ved 24 minutter ved 15°C. Denne top ved 24 minutter ved 15°C kan opdeles i en top med ringe styrke ved 22 minutter, der svarer til den ovennævnte skulder, og en top ved 24 minutter. Produktet svarende til denne top har de biologiske egenskaber af det naturlige peptid.

35 Det underkastes de prøver, der er beskrevet ovenfor i sammenhæng med den naturlige inhibitor, der er udvundet 15 DK 171969 B1 ifølge opfindelsen.

Procentdelene af CFU-S i DNA-syntesefase er sammenfattet i tabel II nedenfor.

5 TABEL II

Dosis af syntetisk Sammen- Ara-C Ara-C + syntetisk tetrapeptid/mus ligning tetrapeptid 10 1. 100 ng 20 44 12 2. 100 ng 10 30 1 3. 100 ng - 55 17 4. 100 ng 0 26 6 5. 50 ng - 35 13 15 6. 25 ng 0 48 19 7. 100 ng 0 36 10 8. 100 ng 0 36 6 middelværdi 5 38,7 10,5 20

Forsøgene 1, 2 og 3 er gennemført med tetrapeptidet fremstillet ved en første syntese. Forsøgene 4, 5, 6, 7 og 8 er gennemført med tetrapeptidet fremstillet ved en anden syntese.

25 De opnåede resultater skal sammenlignes med resul taterne opnået med det naturlige produkt, der er anført i dels tabel I og dels tabel III.

De sidstnævnte resultater er opnået med naturligt produkt udvundet fra to forskellige portioner A og B af 30 knoglemarv.

TABEL III

Dosis/ Sammen- Ara-C Ara-C + 35 Knoglemarv mus ligning naturligt peptid A (5 forsøg) 100 ng 6,5±13,9 40,7±9,3 12,6±14,8 B (2 forsøg) 100 ng 11,9±16,3 47,4±9 2,99±13 40 middelværdi 9,2 44,1 7,8 16 DK 171969 B1

En sammenligning af dels tabellerne I og III og dels tabel II viser, at det syntetiske peptids aktivitet fuldstændig ligner aktiviteten opnået med det naturlige peptid.

De opnåede resultater er vist skematisk på tegningen.

5

Claims (8)

17 DK 171969 B1

1. Tetrapeptid med formlen: Ser-Asp-Lys-Pro-OH 5 og dets derivater fremkommet ved substitution med en eller flere ens eller forskellige peptidbeskyttelsesgrupper, der er almindeligt anvendte inden for peptidkemien til biologisk anvendelse, samt deres farmaceutisk acceptable salte.

2. Tetrapeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at substituentgrupperne er valgt blandt acetyl, benzyl, methyl og phenyl.

3. Tetrapeptid med formlen:

15 Ser(N-Ac)-Asp-Lys-Pro-OH samt farmaceutisk acceptable salte deraf.

4. Fremgangsmåde til udvinding af tetrapeptidet ifølge krav 3 fra biologiske materialer, især kalvefosterlever 20 eller kalvefosterknoglemarv, kendetegnet ved, at den omfatter følgende trin: formaling af udgangsmaterialet, om fornødent med delipide-ring, suspendering af det fremkomne produkt i en puffer ved en 25 pH-værdi nær 7 i nærværelse af en svovlholdig reducerende reaktant, især dithioerythritol eller fortrinsvis mercapto-ethanol, centrifugering af homogenisatet ved ca. 15.000 g i mindst 1 time, 30 ultrafiltrering af den ovenstående væske på en membran med en udelukkelsesgrænse nær 10.000 dalton, chromatografering af det fremkomne ultrafiltrat på en mole-kylsigte af polyacrylamidgel-typen, med eluering med en fortyndet eddikesyreopløsning, 35 fraktionering af den opsamlede aktive fraktion på en invers fase bærer af siliciumdioxid podet med aliphatiske grup- 18 DK 171969 B1 per, især C^g-grupper, idet dette trin fortrinsvis gentages mindst 1 gang, og højtryksvæskechromatografering af den fremkomne aktive fraktion på en invers fase søjle af siliciumdioxid podet med 5 aliphatiske grupper, især C1g-grupper, til tilvejebringelse af en ensartet aktiv fraktion.

5. Fremgangsmåde til syntese af tetrapeptidet ifølge et af kravene 1-3, kendetegnet ved, at den i det væsentlige består i successiv tilføjelse i flydende fase ud 10 fra den C-terminale ende af passende aminosyregrupper, der er substituerede eller beskyttede på passende måde ved deres reaktionsdygtige grupper, og, når det er nødvendigt, fjernelse af beskyttelsesgrupperne.

6. Lægemiddel, kendetegnet ved, at det 15 som aktiv bestanddel omfatter mindst en forbindelse ifølge et af kravene 1-3.

7. Lægemiddel, især til beskyttelse af knoglemarv under behandlinger mod cancer ved kemoterapi, kendetegnet ved, at det foreligger i form af et pulver, 20 der er beregnet til intravenøs eller subkutan indgivelse, i nærværelse af sædvanlige hjælpestoffer og/eller ekscipienser, og at det som aktiv bestanddel indeholder mindst en forbindelse ifølge et af kravene 1-3.

8. Anvendelse af forbindelser ifølge et af kravene 25 1-3 til fremstilling af specifikke antistoffer.