DK172212B1 - Somatostatinforbindelse - Google Patents

Description

i DK 172212 B1

Den foreliggende opfindelse angår terapeutiske peptider.

En række somatostatinanaloge, der udviser GH-frigørelses-inhiberende aktivitet, er blevet beskrevet i litteraturen, herunder analoge indeholdende færre end de 14 amino-5 syrer, der forekommer i naturligt somatostatin. F.eks. beskriver Coy et al. i US patentskrift nr. 4.485.101, hvortil der henvises, dodecapeptider med en N-terminal acetylgruppe, en C-terminal NH2, D-Trp i stilling 6 og p-Cl-Phe i stilling 4. (Når der her ikke findes nogen angi-10 velse om konfiguration, menes den L-isomere).

US patentskrift nr. 4.282.143 beskriver polypeptider med en phenylgruppe ved N-terminalen, hvilke peptider har GH-inhiberende virkning. Det har nu overraskende vist sig, at anvendelse af naphthylalaningrupper i stedet for phe-15 nylalaningrupper i lignende forbindelser giver en uventet forøget virkning.

Den foreliggende opfindelse angår et octapeptid med formlen: A h

Jx i 3 n -CH-CO-Cys-A^-D-Trp-Lys-A^-Cys- NH2, 20 A2 hvori hver A1 og A2 uafhængigt er alkyl med 1-12 carbon-atomer, phenylalkyl med 7-10 carbonatomer, RjCO (hvori Rx er alkyl med 1-20 carbonatomer, alkenyl med 3-20 carbonatomer, alkinyl med 3-20 carbonatomer, phenyl, naphthyl 25 eller phenylalkyl med 7-10 carbonatomer), eller R2OCO (hvor R2 er alkyl med 1-10 carbonatomer eller phenylalkyl med 7-10 carbonatomer), idet, når en af grupperne Ax eller A2 er RjCO eller R20C0, skal den anden være H; A3 er CH2-A6 (hvor A6 er pentaf luorphenyl eller naphthyl), A4 er 30 o-, m- eller p-substitueret X-Phe (hvor X er halogen, H, N02, OH, NH2 eller alkyl med 1-3 carbonatomer), penta- DK 172212 B1 2 fluor-Phe eller Ο-β-naphthylalanin (ϋ-β-Nal), β-Nal og A5 er Thr, Ser, Phe eller Val, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

I den i det foregående angivne formel er konfigurationen 5 for molekylet ved det carbonatom, hvortil A3 er knyttet, ikke givet, hvilket indikerer, at aminosyreresten, hvoraf A3 er en substituent, kan have D- eller L-konfiguration.

Foretrukne forbindelser ifølge opfindelsen omfatter D-β-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2, pentafluor-D-Phe-10 Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2, N-Ac-D^-Nal-Cys-Tyr- D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 og Ο-β-Nal-Cys-pentafluor-Phe-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2.

En farmaceutisk effektiv mængde af den terapeutiske forbindelse og et farmaceutisk acceptabelt bærerstof, f.eks.

15 magnesiumcarbonat, laktose eller et phospholipid, med hvilket den terapeutiske forbindelse kan danne en micelle, danner sammen et terapeutisk præparat, f.eks. en pille, tablet, kapsel eller væske til oral administrering til et menneske, en creme, der kan udspredes, en gel, lo-20 tion eller salve til påføring på huden af et menneske med behov for forbindelsen, en væske, der kan administreres nasalt som dråber eller spray, eller en væske, der kan administreres intravenøst, parenteralt, subkutant eller intraperitonealt. Pillen, tabletten eller kapslen kan væ-25 re overtrukket med et stof, der er i stand til at beskytte præparatet mod mavesyre i patientens mave i et tidsrum tilstrækkeligt langt til at tillade passage af præparatet usønderdelt til patientens tyndtarm. Det terapeutiske præparat kan også være i form af et bionedbrydeligt præ-30 parat med forsinket afgivelse til intramuskulær administrering. Til maximal effektivitet ønskes 0.-ordens frigørelse. 0.-ordens frigørelse kan opnås under anvendelse af en implanterbar eller ydre pumpe, f.eks. en "infu" DK 172212 B1 3 soid™"-pumpe til administrering af det terapeutiske præparat .

Forbindelserne ifølge opfindelsen er aktive til inhibe-ring af sekretionen af GH, insulin og glucagon. Endvidere 5 kan den aromatiske lipophile N-terminale ende give langvarig aktivitet in vivo.

Andre træk og fordele ved opfindelsen vil fremgå af følgende beskrivelse af de foretrukne udførelsesformer deraf og af kravene.

10 Forbindelserne ifølge opfindelsen har den i det foregående angivne formel. De er alle octapeptidanaloge af somatostatin, som har D-Trp i stilling 4, og eventuelt modifikationer i stilling 3 (A4), 6 (As) og 8 (A7). Det har vist sig, at D-p-naphthylalanin i stilling 1, Tyr i stil-15 ling 3 og Val i stilling 6 er modifikationer, som særligt forøger aktiviteten.

Forbindelserne kan tilvejebringes i form af farmaceutisk acceptable salte. Eksempler på fortrukne salte er salte af terapeutisk acceptable organiske syrer, f.eks. eddike-20 syre, mælkesyre, maleinsyre, citronsyre, æblesyre, ascor-binsyre, ravsyre, benzoesyre, salicylsyre, methansulfon-syre, toluensulfonsyre eller pamosyre, såvel som polymere syrer, såsom garvesyre eller carboxymethylcellulose, og salte med uorganiske syrer, såsom halogenhydrogenidsyrer, 25 f.eks. saltsyre, svovlsyre eller phosphorsyre.

Syntesen af et octapeptid forklares nærmere i det følgende. Andre octapeptider ifølge opfindelsen kan fremstilles ved at foretage passende modifikationer af følgende syntesemetode, hvilket er muligt for fagmanden på området.

30 Det første trin ved fremstillingen af Ο-β-naphthylalanin-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 var fremstillingen af DK 172212 B1 4 mellemproduktet tert-butyloxycarbonyl-D-p-naphthylalanin-S-methylbenzyl-Cys-Tyr-D-Trp-NE-benzy loxycarbonyl-Lys-Val -S-methylbenzyl-Cys-O-benzyl-Thr-benzhydrylamin-har-piks som følger.

5 Benzhydrylamin/polystyren-harpiks (Vega Biochemicals, Inc.) på chloridion-formen blev anbragt i reaktionsbeholderen af et Beckman 990B peptidsynteseapparat programmeret til at foretage følgende reaktionscyklus: (a) methy-lenchlorid, (b) 33% trifluoreddikesyre i methylenchlorid 10 (2 gange i 1 og 25 minutter hver gang), (c) methylenchlo rid, (d) ethanol, (e) methylenchlorid, (f) 10% triethyl-amin i chloroform.

Den neutraliserede harpiks blev omrørt med Boc-O-benzyl-threonin og diisopropylcarbodiimid (1,5 mmol af hver) i 15 methylenchlorid i 1 time, og den resulterende aminosyre-harpiks blev derpå udsat for cyklus via trin (a) til (g) i ovennævnte vaskeprogram. Følgende aminosyrer (1,5 mmol) blev derpå koblet successivt ved samme procedure:

Boc-S-methylbenzyl-Cys, Boc-Val, Boc-Ne-benzyloxycarbo-20 nyl-lysin, Boc-D-Trp, Boc-Tyr, Boc-S-methylbenzyl-Cys, Boc-D-p-naphthylalanin.

Harpiksen blev vasket og tørret og derpå blandet med 4 ml anisol og 36 ml vandfrit hydrogenfluorid ved 0 °C og omrørt i 45 minutter. Overskud af hydrogenfluorid blev af-25 dampet hurtigt under en strøm af tør nitrogen, og frit peptid udfældedes og blev vasket med ether. Det rå peptid blev derpå opløst i 800 ml 90%'s eddikesyre, hvortil der blev sat I2 i methanol, indtil der forekom en permanent brun farve. Opløsningen blev derpå omrørt i en time før 30 fjernelse af opløsningsmidlet i vakuum. Den resulterende olie blev opløst i et minimalt volumen 50%'s eddikesyre og elueret på en "Sephardex G-25" søjle (2,5 x 100 mm). Fraktioner indeholdende en hovedkomponent ifølge UV- DK 172212 B1 5 absorption og tyndtlagschromatografi blev derpå samlet, inddampet til et lille volumen og påført en "Whatman LRP-1" octadecylsilan (15-20 μπι) søjle (2,5 x 50 cm).

Søjlen blev elueret med en lineær gradient af 10-50%'s 5 acetonitril i 0,1%'s trifluoreddikesyre i vand. Fraktioner blev undersøgt ved tyndtlagschromatografi og analytisk HPLC og samlet til opnåelse af maximal renhed, og om ønsket blev et andet salt fremstillet, f.eks. acetat og phosphat. Gentagen lyophilisering af opløsningen fra vand 10 gav 170 mg af produktet som et hvidt, fnugget pulver.

Produktet vist sig at være homogent ifølge HPLC og TLC. Aminosyreanalyse af et syrehydrolysat bekræftede octapep-tidets sammensætningen.

Octapeptiderne ifølge opfindelsen med formlerne penta-15 fluor-D-Phe-Cys-Tyr-D-Lys-val-Cys-Thr-NH2, N-Ac-D-P-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 og Ό-β-Cys-pentafluor-Phe-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 blev fremstillet efter metoder analoge med de i det foregående beskrevne.

Ved administrering til pattedyr, især mennesker, (f.eks.

20 oralt, topisk, intravenøst, parenteralt med forsinket afgivelse, på nedbrydelig form, nasalt eller som supposito-rie) kan forbindelsen effektivt inhibere GH-frigørelse samt inhibere udskillelse af insulin, glucagon og pankre-atisk eksokrin, samt terapeutisk påvirke det centrale 25 nervesystem.

Forbindelserne kan administreres til et pattedyr, f.eks. et menneske, i doser anvendt for somatostatin eller på grund af den højere styrke i mindre doser. Forbindelserne ifølge opfindelsen kan anvendes til behandling af cancer, 30 især væksthormonafhængig cancer (f.eks. cancer i knogler, brusk, pankreas (indokrin og eksokrin), prostata eller bryst), acromegali og beslægtede hypersekretoriske indo- DK 172212 B1 6 krin-tilstande, eller af blødende sår ved nødhjælp til patienter og patienter, der lider af pankreatitis eller diarré. Forbindelserne kan også anvendes ved behandlingen af diabetes og til at beskytte leveren hos patienter, der 5 lider af cirrhosis eller hepatitis. Forbindelserne kan også anvendes til at behandle Alzheimer's sygdom, som analgetika til at behandle smerte ved at virke specifikt på visse opiatreceptorer og som gastriske cytobeskyttende forbindelser til mavesårsterapi. Forbindelserne kan des-10 uden anvendes til visse typer svampeforgiftning.

Forbindelserne kan endvidere anvendes til behandling af diabetesrelateret retinopati. Anti-canceraktiviteten af forbindelserne er muligvis forbundet med deres evne til at antagonisere cancerrelaterede vækstfaktorer, såsom 15 epidermal vækstfaktor.

Forbindelserne kan administreres til pattedyr, f.eks. et menneske, i en dosis på 0,01 til 1000 μg/kg/dag, fore-trukkent 0,1 til 100 μg/kg/dag.

Claims (10)

1. Octapeptid med formlen Al A-. \ I ^ β -CH-CO-Cy s-A4-D-Trp-Ly s-A5-Cy s- NHj, h2 5 hvori hver og A2 uafhængigt er alkyl med 1-12 carbon-atomer, phenylalkyl med 7-10 carbonatomer, RjCO (hvori er alkyl med 1-20 carbonatomer, alkenyl med 3-20 carbonatomer, alkinyl med 3-20 carbonatomer, phenyl, naphthyl eller phenylalkyl med 7-10 carbonatomer), eller R2OCO 10 (hvor R2 er alkyl med 1-10 carbonatomer eller phenylalkyl med 7-10 carbonatomer), idet, når en af grupperne Ax eller A2 er RiCO eller R20C0, skal den anden være H; A3 er CH2-A6 (hvor A6 er pentafluorphenyl eller naphthyl), A4 er o-, m- eller p-substitueret X-Phe (hvor X er halogen, H,

15 N02, OH, NH2 eller alkyl med 1-3 carbonatomer), penta- fluor-Phe eller Ο-β-naphthylalanin (ϋ-β-Nal), β-Nal og As er Thr, Ser, Phe eller Val, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

2. Octapeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, 20 at iÆUo er Ο-β-naphthylalanin.

3. Octapeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at A6 er naphthyl.

4. Octapeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Rx er CH3 eller C2H5.

5. Octapeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at A6 er pentafluorphenyl. DK 172212 Bl

6. Octapeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har formlen D-P-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 eller er et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

7. Octapeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, 5 at det har formlen N-Ac-D-p-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val- Cys-Thr-NH2 eller er et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

8. Octapeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har formlen D-p-Nal-Cys-pentafluor-Phe-D-Trp-Lys-

10 Val-Cys-Thr-NH2 eller er et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

9. Octapeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har formlen D-p-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-Nal-Thr-NH2 eller er et farmaceutisk acceptabelt salt 15 deraf.

10. Octapeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har formlen D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-P-Nal-Thr-NH2 eller er et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.