DK173932B1 - SDK-peptider, fremgangsmåde til deres fremstilling og terapeutisk præparat indeholdende disse - Google Patents

Description

i DK 173932 B1

Den foreliggende opfindelse angår SDK-peptider, en fremgangsmåde til deres fremstilling og terapeutiske præparater indeholdende disse.

5 Forkortelserne, der anvendes i denne beskrivelse følger "1983 Recommendations on Nomenclature on Symbolism for Amino Acids Peptides of the IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature", Eur. J. Biochem. 138, 9-37 (1984). For at lette forståelsen er visse af disse for-10 korteiser gengivet nedenfor:

Asp eller D asparaginsyre

Ser eller S serin

Lys eller K lysin 15 Pro eller P prolin

Thr eller T threonin Z benzyloxycarbonyl

Boc t-butoxycarbonyl OBzl benzyloxy 20 Ac acetyl

Andre anvendte forkortelser omfatter: DMF dimethylformamid 25 DCM dichlormethan NMM N-methylmorpholin TFA trifluoreddikesyre TLC tyndlagskromatografi FAB hurtigt atombombardement 30

Opfindelsen angår peptider med den almene formel I

H2N - W - Ser - Asp - Lys - X - OH I

35 hvori X repræsenterer en Pro- eller Lys-gruppe eller en valensbinding, og W repræsenterer en Thr- eller Pro-gruppe eller en valensbinding, med den forudsætning, at hvis 2 DK 173932 B1 X repræsenterer en Pro-gruppe repræsenteres W ligeledes en Pro-gruppe.

Peptiderne, der er omfattet af den almene formel I, kan 5 angives som følger:

Ser-Asp-Lys (i)

Ser-Asp-Lys-Lys (ii)

Pro-Ser-Asp-Lys-Lys (iii) 10 Thr-Ser-Asp-Lys-Lys (iv)

Pro-Ser-Asp-Lys (v)

Thr-Ser-Asp-Lys (vi)

Pro-Ser-Asp-Lys-Pro (vii) 15 Opfindelsen angår ligeledes farmaceutisk acceptable salte af peptiderne med den almene formel I.

Tripeptidet (i), på hvilket de øvrige peptider ifølge opfindelsen er baseret, forekommer ikke at have været iso-20 leret eller fremstillet tidligere. Disse aminosyresekven-ser er blevet fundet i forskellige levende proteiner f.eks. Ser-Asp-Lys i lymphocyt-T-membranprotein, hvor dets virkning forekommer, når en del af en lymphocytmar-kør såsom lymphocyt CD2 såvel som a- eller r-underenheder 25 af en T-receptor, som omfatter den specifikke sekvens, der indtager en position med hensyn til visse specifikke receptorer af lymphocytten, kan disse aminosyresekvenser ligeledes findes i forskellige proteiner såsom proteiner fra vira og ligeledes i visse proteiner af komplementet 30 eller o tumor-necrosisfaktor.

Som følge heraf var det særligt interessant at undersøge aktiviteten af de specifikke aminosyresekvenser og, det har ifølge opfindelsen vist sig, at de spiller en aktiv 35 rolle inden for immun-modulationsområdet som bekræftet ved de immunologiske rapporter.

3 DK 173932 B1

Denne opfindelse angår ligeledes en fremgangsmåde til fremstilling af·disse peptider, hvilken udføres ad sædvanlige veje gennem det følgende reaktionsskema:.

5 I Boc K(Z) - X( ) - OH

II Boc D(OBzl) - K(Z) - X( ) - OH

III Boc S(Bzl) - D(OBzl) - K(Z) - X( ) - OH

IV Boc W( ) - S(Bzl) - D(OBzl) - K(Z) - X( ) - OH

10 med den regel: a) at parenteserne efter W eller X er tomme, når W og X står for Pro, at parenteserne efter W indeholder Bzl, når W står for Thr og, at parenteserne efter X indeholder Z, 15 når X står for Lys, og b) de tilsvarende trin undgås, når W og/eller X står for en valensbinding.

20 Når et terapeutisk acceptabelt salt fremstilles, f.eks. acetyl, skal saltdannelsen udføres før det endelige afbeskyttelsestrin .

Opløsningsmidlerne, der anvendes i denne forbindelse, er 25 af Purex-kvalitet. DMF er lagret på 3 og 4 Å-molekylsig-te.

TLC udføres på kommercielle analytiske plader. Pladerne har været undersøgt ved 254 nm og gjort synlige med en 30 ninhydrinopløsning ifølge Pataki. Følgende opløsningsmidler blev anvendt: A: DCM/methanol (8:2 volumdele) B: n-butanol/AcOH/vand (4:1:1 volumdele) og 35 C: n-butanol/AcOH/vand/pyridin (1:1:1:1 volum dele) 4 DK 173932 B1

Mellemprodukter oprensedes på en silicakolonne, når dette var nødvendigt,·dvs. silica 60 A (40-60 a) SDS, de karakteriseredes ved deres massespektrum, molekyltop eller MH+ ved hurtig atombombardement (FAB).

5

Slutprodukterne oprensedes isokratisk eller med gradient ved HPLC med en semipræparativ kolonne, 7,2 mm x 250 mm, C^gODS Hypersil 10 μ SFCC.

10 Analyse af aminosyrer udførtes efter syrehydrolyse af peptidet med 6N HC1 ved 110 °C i 12 timer på et HPLC-ap-paratur.

Opfindelsen angår endelig terapeutiske præparater, i 15 hvilke den aktive ingrediens er en tilstrækkelig mængde af nævnte peptider, som er forbundet til bærere, der er egnede til den udvalgte administrationsvej.

Opfindelsen vil bedre kunne forstås fra beskrivelsen af 20 fremstillingen af Ser-Asp-Lys (i).

Syntese af peptider

Syntese har været udført trin for trin ved den * blandede 25 anhydridmetode under anvendelse af isobutylchlorformat eller ved de aktive esteresmetode, ved hvilken esteren af N-hydroxysuccinimid anvendes. Beskyttede aminosyrer er kommercielle.

30 Afbeskyttelse

Boc-gruppen spaltes ved acidolyse ved anvendelse af TFA, idet peptidet behandles med 10-30 ækvivalent blanding af 1:1 volumdele DCM/TFA i 1-2 timer ved stuetemperatur.

ZBzl- eller OBzl-grupper hydrogenolyseres. Peptidet, der er i opløsning med en blanding af 9:1 volumdele metha- 35 5 DK 173932 B1 nol/vand hydrogenolyseres i tilstedeværelse af Pd/C ved 10 %.

Acetylering 5

Acetylering udførtes ved at reagere acetylimidazol med trifluoracetat af aminen, der neutraliseredes med tri-ethylamin i DMF.

10 Fremstilling af Boc D(OBzl) K(z), _1 1 mol N-hydroxysuccinimidester af Boc D(OBzl) opløses i 2,5 ml DMF. 1,1 ækvivalent K(Z) i supension tilsættes til opløsningen, sættes på et isbad og 1,1 ækvivalenter tri-15 ethylamin tilsættes under omrøring. Omrøringen opretholdes i 24 timer. Reaktionsblandingen afdampes under reduceret tryk. Resten behandles dernæst med ethylacetat og en opløsning af 0,5 N HC1. Den organiske fase vaskes med vand, dernæst med en mættet opløsning af natriumchlorid, 20 tørres på natriumsulfat og afdampes endelig under reduceret tryk. Resten kromatograferes på en silicagelkolonne og elueres med en blanding af 95:5 volumdele DMC/metha-nol. Den homogene fraktion fra TLC indsamles. Et udbytte på 0,540 g blev opnået.

25

Fremstilling af Boc S(Bzl) D(OBzl) K(Z), 2 3 0,5 mM 1 behandles med 20 ækvivalent blanding af 1,4 cm 1:1 volumdele TFA/DCM. Efter 60 min ved stuetemperatur 30 afdampes opløsningsmidlerne under reduceret tryk. Resten behandles to gange med DCM og tørres under reduceret tryk i tilstedeværelse af KOH.

1,2 ækvivalent af N-hydroxysuccinimidester af Boc S(Bzl) 35 og det tidligere opnået trifluoracetat opløses i 1,3 ml DMF. 1 ækvivalent triethylamin tilsættes under magnetisk omrøring. Omrøringen opretholdes i 24 timer. Reaktions- 6 DK 173932 B1 blandingen behandles som for 1. Resten kromatograferes på silicagel og det resulterende produkt elueres med en blanding af 8:2 volumdele diethylether/methanol. De homogene fraktioner fra TLC indsamles. Et udbytte på 0,318 g, 5 83 %, blev opnået. 0,27 g fast stof opnås ved triturering med pentan. Massespektrometri (MS) (FAB) MH+: 763; blev beregnet, 763 og 763,100 blev fundet (MH+ - Boc).

Fremstilling af NAc S(Bzl) D(OBzl) K(Z), 3 10

Derivatet 2 af beskyttes ved 20 ækvivalent 3,1 N HCl-op-løsning i tetrahydrofuran. Opløsningen omrøres ved stuetemperatur i 6,5 time. Reaktionsblandingen afdampes og tørres under reduceret tryk natten over i tilstedeværelse 15 af KOH.

Det resulterende chlorhydrat og 1,1 ækvivalent acetylimi-dazol opløses i 1 ml DMF. pH af denne opløsning bringes til 7,5 med triethylamin. Blandingen omrøres i 22 timer.

20 Reaktionsblandingen afdampes dernæst og resten behandles med ethylacetat og en 0,5 N HCI-opløsning. Den organiske fase vaskes med vand og en mættet opløsning af natrium-chlorid og tørres dernæst på natriumsulfat.

25 MS: FAB MH+: 705 blev beregnet og 705 observeret.

Fremstilling af NAc SDK 4 0,140 g (0,2 mM) opløst i 3 ml methanol og 1 ml vand hy-30 drogenolyseres i 22 timer i tilstedeværelse af 10 % Pd/C. Katalysatoren filtreres væk på en celitbakke og opløsningsmidlet afdampes under reduceret tryk. Et udbytte på 0,079 g blev opnået. TLC viste to pletter, der var følsomme over for ninhydrin.

Produktet oprenses ved isokratisk, HPLC, 0,1 % TFA: vand som eluent og strømningshastighed 4 ml/rain; t = 8 min.

35 7 DK 173932 B1

Aminosyreanalyse: S: 0,9 (1), D: 1,3 (1), K: 1,3 (1).

MS: FAB MH+ 391 blev beregnet og 391 observeret.

5 Fremstilling af SDK 5

Tripeptidet 2 behandles indledningsvis med en blanding af 1:1 volumdele TFA/DCM i 1,5 time. Opløsningsmidlerne af-dampes under reduceret tryk og resten behandles med tolu-10 en, opløsningsmidlet afdampes og resten hydrogenolyseres i en opløsning af 3 ml methanol og 0,3 ml vand i 20 timer ved stuetemperatur og i tilstedeværelse af 0,030 g Pd/C. Katalysatoren filtreres på en celitbakke og opløsningsmidlet afdampes under reduceret tryk. Et udbytte på 0,090 15 g blev opnået.

MS MH+: 349 blev observeret og 349 beregnet.

5 oprenses ved isokratisk, HPLC, med 0,1 % TFA i vand som 20 eluent og strømningshastighed 2 ml/min, t = 6 min.

Aminosyreanalyse: S: 1(1), D: 0,8(1), K: 1,3(1)

De øvrige peptider ifølge opfindelsen fremstilles ved 25 samme teknik som SDK.

Omfanget af opfindelsen vil blive yderligere eksemplificeret ved følgende immunologiske rapporter.

30 35 8 DK 173932 B1

Rosettes protekol I - Fremstilling af røde blodceller fra får 5 De røde blodceller (RBC) vaskes tre gange i RPMI 1640 eller RBS eller Hanks + antibiotiske lægemidler. Centrifugering i 7 min ved 3000 rpm.

Cellesaften overføres i en suspension, der tælles, og

O

10 suspensionen bringes til 2 x 10 RBC/ml i en opløsning af RPMI med 20 % fetalt kalveserum (FCS), hvoraf 4 ml tidligere er adsorberet på 1 ml RBC saft, har været 30 min på isbad, har været centrifugeret i 7 min ved 3000 rpm og er blevet genudvundet under sterile betingelser.

15 II - Fremstilling af Jurkat-T-celler

En prøve af Jurkat-T-celler bringes i en kultur. En vitalitetstest udføres med trypanblåt.

20

Det nødvendige cellevolumen til praktisk arbejde udtages dernæst. Cellerne vaskes tre gange i RPMI 1640 eller PBS eller Hanks + antibiotiske lægemidler. Der centrifugeres i 7 min ved 900 rpm.

25

Cellesaften bringes i suspension, der tælles, og suspen- g sionen bringes til 2 x 10 Jurkat-T-celler/ml opløsning RPMI med 20 % adsorberet FCS.

30 III - Fremstilling af peptidet 7

Inhibitoropløsning = 2 x 10 mol SDK.

Peptider, som skal evalueres, opløses i RPMI 1640 ved 35 passende koncentrationer.

9 DK 173932 B1 IV - Afprøvning 200 al inhibitoropløsning + 100 nl Jurkat-T-celler og 2 x 106 M i RMPI + 20 % FCS tilsættes et reagensglas, og hen-5 stilles i 10 min på et isbad, hvorefter 100 ul RBC, 2 x 108 M i RPMI + 20 % FCS, tilsættes.

Der centrifugeres i 5 min ved 500 rpm, hvorefter opløsningen henstilles natten over ved 4 °C.

10 V - Tælling af rosetter

Indstil mikroskopet: okular: x 6, og objektiv: x 7.

15 Før omhyggeligt cellerne tilbage i suspension ved aftapning. Lad suspensionen hvile et stykke tid.

Tilsæt 30 μΐ 1 % toluidinblåt for at farve lymphocytterne i reagensglasset. Aftap omhyggeligt.

20

Aflæs 3 Malassex hemocytometer pr. eksperimentalpunkt.

Resultater er rapporteret i den følgende tabel.

25 30 35 10 DK 173932 B1 % Rosetter (% Hæmning)

Peptid SDK PSDKP

Kontrol 63 — 4 59 — 4 5 ----;--7- 10 4 M 38-3 (-40%) * 37-7 (-37%) ** ---;--+- 10 M 45-4 (-28%) *** 33-3 (-44%) * 10"6 M 50-2 (-22%) *** 27-5 (-54%) * 10'7 M 49-2 (-22%) * 45-6 (-24%) *** 10'β M 40—2 (-36%) * 48-2 (-19%) *** 10’’ M 43—1 (-32%) * 48-4 (-19%) *** 10-1°M 43-3 (-32%) * 52-5 (NS) 15 10-1,M 40—1 (-36%) * 10_14M 44-3 (-30%) * 10_laM 51-7 (-19%) *** 10_1“M 55-2 (-14%) *** 20 10“1BM 63 - 4 (NS) ( ) % Hæmning *: a < 0,001 ** : a < 0,01 *** : a < 0,05 25 11 DK 173932 B1

Adskillelse af humane perifere mononukleare celller 5 I - Adskillelse af (nPMN)

Fortynd blod til 1/2 i PBS. Til 15 ml Ficoll-Hypaque tilsættes 35 ml fortyndet blod. Der centrifugeres i 30 min ved 1800 rpm ved stuetemperatur. Ringen, der svarer til 10 de mononukleare celler (MNC) føres tilbage med en Pastuer pipette. Vask to gange i PBS og centrifuger i 10 min ved 1800 rpm. Fortyndingen bringes til 2,10* celler/ml med RPMI 1640 "komplette" medium + 10 % SVF.

15 II - Reaktive produkter PHA-M: En 5 ml flaske med 5 ml frysetørret "komplette" medium reconstitueres. 100 % opløsningen fortyndes til en 0,4 % opløsning.

20

Peptider: SDK: Reagensglas med 10* mol + 4,35 ml "komplette" medi--4 um. 2,3 x 10 M opløsning, der fortyndes successivt med 25 450 μΐ "medium" + 50 ul fortynding.

III - Protokol I steriliserede æsker med 96 brønde, NUNC tilsættes: 30 100 μΐ MNC med 2,10* celler/ml (2,10® celler) 50 μΐ PHA 0,4 % (0,01 % slutkoncentration) 50 al medium 30 μΐ peptid (3,10-5 M)

Der inkuberes i 3 dage ved 37 °C i en 95/5 luft/C02-at-mosfære. Under de sidste 24 timer tilsættes ΙμΟΙ [*H]thy- 35 12 DK 173932 B1 j midin pr. brønd. Indholdet i brøndene opsamles på filtre og tælles med en tæller.

Reslutater er rapporteret i den følgende tabel.

5

Stimulering af T-lymphocytvækst ved Ser-Asp-Lys (SDK) og Pro-Ser-Asp-Lys-Pro (PSDKP) 10 --

DNA syntese induceret i MNC og PBL med stimuleret af 0,1% PHA

0,1% PHA

cpm x 103/2,10ε % stimulation celler

Kontrol (RPMI 1640) 35-2 + Autologe BBC 44-5 + 26% ** + SDK 3,10"° M 56-5 + 60% *

Kontrol 20 (RPMI 1640).n 40-3 + SDK 3,10 M 52-5 + 30% ***

Kontrol (RPMI 1640) 38 i 3 42% *** + PSDKP 3,10 M 54 — 4 * * : a < 0,001 ** : a < 0,02 *** : a < 0,01 MNC : Mononukleare celler 13 DK 173932 B1

Humoral respons 6-til-8 uger gamle mus af B6D2F1 stammen gøres følsomme på dag 0 med 0,2 ml suspension af røde blodceller fra 5 får, dvs. 10® celler, i Hanks’ saltvandsopløsning.

3 Mg/kg Ser-Aps-Lys og Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-peptider blev injiceret som opløsning i 0,2 ml physiologisk serum ad IP-vejen til et bestemt tidspunkt.

10 På dag + 4 blev dyrene dræbt og antallet af B-lymphocyt-ter, som udskiller IgM-imunglobuliner, blev talt ved hemolyse plaque-teknikken ifølge Jerne’s metode.

15 8 mus pr. batch, 4 bestemmelser pr. dyr, og 2 genudførte eksperimenter pr. punkt blev udført.

Resultater er rapporteret i den følgende tabel.

20 14 DK 173932 B1

Stimulering af det humorale respons hos mus overfor røde blodceller fra får, et T-afhængigt antigen af Ser-Asp-Lys og Pro-Ser-Asp-Lys-Pro peptider, 5 (Antal P.F.C./106 celler)

Injektions- Injicerede substanser perioden ----

Saltvand Ser-Asp-Lys Pro-Ser-Asp-Lys-Pro - 24 h 444 - 44 644 - 170 630 - 142 10 (+ 45) * (+ 42) * 0 h 459 —103 903 - 133 915 - 140 (+ 97) * (+ 99) * + 24 h 407 - 66 459 ^03 475 - 82 (NS) (NS) 15 + 48 h 407 - 66 673 -110 589 - 101 (+ 65) * (+ 45) * + 72 h 459 -103 1073 ±348 543 - 112 (+ 134) * (NS) 20 * : a < 0,001 ** : α < 0,01 ( ) % stimulering

Peptidkoncentration : 3 ug/kg

Toxicitet 25 Ingen toxicitet blev bemærket for nogen af peptiderne ifølge opfindelsen, når disse blev administreret per os ved det maksimale indgiftsdoser til rotter og mus. Ad IP-vejen blev ingen dødstilfælde noteret ved 1 g /kg for de 30 15 DK 173932 B1 samme dyr.

Præsentation - Posologi 5 Kun Ser-Asp-Lys-peptider kan administreres oralt og nå deres target uden væsentlig nedbrydning. Tabletter eller gelatinekapsler med dosisenheder indeholdende 10 mg Ser-Asp-Lys er egnede. Ad denne administrationsvej kræver højere peptider beskyttede former og højere enhedsdosis 10 (20 mg). Daglige doser kan variere fra 10 til 100 mg (SDK) eller fra 20 til 200 mg for højere peptider. Ad IP-vejen er daglige doser fra 1 til 10 mg for mellemvirkning, men kontrolleret frigørelsesformer, d.v.s. mikro-kapsler, mikrosphere eller lignende, kan indeholde op til 15 300 mg for langtidsfrigørelse.

Claims (9)

1. Peptider, kendetegnet ved, at de har den 5 almene formel H2N - W - Ser - Asp - Lys - X - OH hvori X repræsenterer en Pro- eller en Lys-gruppe eller 10 en valensbinding, og W repræsenterer en Thr- eller Pro-gruppe eller en valensbinding, med den forudsætning, at hvis X repræsenterer en Pro-gruppe, så repræsenterer W ligeledes en Pro-gruppe, og terapeutiske salte deraf.

2. Peptider ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de omfatter Ser-Asp-Lys,

20 Ser-Asp-Lys-Lys, Pro-Ser-Asp-Lys-Lys, Thr-Ser-Asp-Lys-Lys, 25 Pro-Ser-Asp-Lys, Thr-Ser-Asp-Lys, og 30 Pro-Ser-Asp-Lys-Pro

3. Fremgangsmåde til fremstilling af peptider ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den følgende reaktionssekvens udføres ved sædvanlige metoder: 35 DK 173932 B1 17 j I Boc K(Z) - X( ) - OH IX Boc D(OBzl) - K(Z) - X( ) - OH

5 III Boc S(Bzl) - D(OBzl) - K(Z) - X( ) - OH IV BOC W( ) - S(Bzl) - D(OBzl) - K(Z) - X( ) - OH med den regel: 10 a) at parenteserne efter W eller X er tomme, når w og X står for Pro, at parenteserne efter W indeholder Bzl, når W står for Thr og at parenteserne efter X indeholder Z, når X står for Lys, og 15 b) det tilsvarende trin undlades, når W og/eller X står for en valensbinding.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet 20 ved, at isobutylchlorforman anvendes, når fremgangsmåden udføres ved den blandede anhydridmetode.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at estere af N-hydroxysuccinimid anvendes, når frem- 25 gangsmåden udføres ved de aktive esteres metode.

6. Terapeutisk præparat med immunmodulerende aktivitet, kendetegnet ved, at det indeholder fra 1 til 300 mg peptid ifølge krav 1 til 2 som en aktiv ingredi- 30 ens, der er forbundet med passende bærere for den udvalgte administrationsvej. 1 Præparat ifølge krav 6 til oraladministration, kendetegnet ved, at det indeholder fra 10 til 200 mg 35 aktiv ingrediens. DK 173932 B1

8. Præparat ifølge krav 6 til IP-administration, kendetegnet ved, at det indeholder fra 1 til 300 mg aktiv ingrediens. SDK-peptider, fremgangsmåde til deres fremstilling og terapeutisk præparat indeholdende disse