CH680666A5

CH680666A5 - PEPTIDES SDK, LEUR PROCEDE DE PREPARATION AINSI QUE DES COMPOSITIONS Thérapeutiques EN contenant.

Info

Publication number: CH680666A5
Application number: CH757/90A
Authority: CH
Inventors: Maryse Lenfant; Josiane Thierry
Original assignee: Scras
Priority date: 1989-03-11
Filing date: 1990-03-08
Publication date: 1992-10-15
Also published as: FI901196A0; FR2644065A1; HK95392A; DE4007605A1; NL9000551A; IT9019630A0; AU631197B2; GB9005069D0; NO901129L; NO901129D0; NZ232815A; IE900850L; AR245139A1; CA2011874C; AU5117590A; IT1240933B; US5112811A; GR1000344B; GR900100164A; OA09197A

Description

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Description

La présente invention concerne des peptides SDK, leur procédé de préparation ainsi que des compositions thérapeutiques en contenant.

Les abréviations utilisées dans ce texte sont conformes aux réglementations de 1983 sur la nomenclature et les symboles à utiliser pour les peptides des amino-acides, de la Commission Mixte IUPAC-IUB sur la Nomenclature Biochimique (Eur. J. Biochem. 138. 9-37 (1984)). Toutefois, pour des facilités de compréhension, certaines de ces abréviations sont détaillées ci-dessous:

Asp ou D: acide aspartique Ser ou S: sérine Lys ou K: lysine Pro ou P: proline Thr ouT:thréonine Z: benzyloxycarbonyle Boc: t-butoxycarbonyle OBzl: benzyloxy Ac: acétyle

Les autres abréviations utilisées sont:

ATF: acide trifluoroacétique

BAR: bombardement atomique rapide

CCM: Chromatographie en couche mince

CLHP: Chromatographie liquide haute pression

DCM: dichlorométhane

DMF: diméthylformamide

NMM: N-méthylmorpholine

L'invention concerne des peptides répondant à la formule générale I

HaN-W-Ser-Asp-Lys-X-OH I

dans laquelle X représente un résidu Pro ou Lys ou une liaison de valence et W représente un résidu Thr ou Pro ou une liaison de valence avec la convention que, si X représente un résidu Pro, alors W représente également un résidu Pro.

Les peptides compris dans la formule générale I peuvent être énumérés comme suit :

L'invention concerne également des sels pharmaceutiquement acceptables des peptides de formule générale I.

Ce tripeptide (i), sur lequel sont basés d'autres peptides de l'invention, ne semble pas, à ce jour, avoir été isolé ou préparé. Toutefois, ces séquences d'aminoacides ont été trouvées dans diverses protéines vivantes, par exemple, Ser-Asp-Lys, dans la protéine de la membrane du lymphocyte T, où son action apparaît lorsqu'une partie d'un marqueur lymphocytaire tel que le lymphocyte CD2 ou les sous-ensembles a ou y du récepteur T, qui comportent cette séquence spécifique, prend position en regard de certains récepteurs spécifiques du lymphocyte; on peut également trouver ces séquences d'aminoacides dans diverses protéines telles que les protéines des virus et également dans certaines protéines du complément ou du facteur a de nécrose des tumeurs.

En conséquence, il était particulièrement intéressant d'étudier l'activité de séquences spécifiques d'aminoacides et, selon l'invention, on a trouvé que celles-ci jouaient des rôles actifs dans le domaine de l'immunomodulation, comme cela a été démontré par les rapports immunologiques.

Pro-S er-Asp-Lys-Lys Thr-Ser-Asp-Lys-Lys Pro-S er-Asp-Lys

Thr-S er-Asp-Lys Pro-Ser-Asp-Lys-Pro

Ser-Asp-Lys Ser-Asp-Lys-Lys

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La présente invention concerne également un procédé de préparation de ces peptides, effectué par les voies de synthèse habituelles, selon la séquence réactionnelle suivante:

I Boc K(Z)-X( )-OH

II Boc D(OBzl)-K(Z)-X( )-OH

III Boc S(Bzl)-D(OBzl)-K(Z)-X( )-OH

IV Boc W( )-S(Bzl)-D(OBzl)-K(Z)-X( )-OH

avec la convention que:

a) les parenthèses qui suivent W ou X sont vides lorsque W et X représentent Pro, que les parenthèses qui suivent W contiennent Bzl lorsque W représente Thr et que les parenthèses qui suivent X contiennent Z lorsque X représente Lys, et b) lorsque W et/ou X représente une liaison de valence, l'étape correspondante est omise.

Lorsque l'on prépare un sel thérapeutiquement acceptable, par exemple, l'acétate, la salification doit être effectuée avant l'étape de déprotection finale.

Les solvants utilisés ici sont de qualité Purex. Le DMF est conservé dans un tamis moléculaire 3 et 4

A.

Les CCM sont effectuées sur des plaques analytiques commerciales. Les plaques ont été observées à 254 nm et analysées avec une solution de ninhydrine, selon Pataki. Les solvants suivants sont utilisés:

A: DCM/méthanol (8/2 en volume)

B: n-butanol/AcOH/eau (4/1/1 en volume) et

C: n-butanol/AcOH/eau/pyridine (1/1/1/1 en volume).

Les produits intermédiaires sont purifiés sur une colonne de silice si nécessaire (silice 60 A (40-60 |i) SDS), ils se caractérisent par leur spectre de masse (pic moléculaire ou MH+), par bombardement atomique rapide (BAR).

Les produits finaux sont purifiés par Chromatographie liquide haute pression (CLHP) sur une colonne semipréparative (7,2 mm x 250 mm) CisODS Hypersil 10 n SFCC, en mode isocratique ou avec un gra-diant.

Les analyses des aminoacides sont effectuées après l'hydrolyse acide du peptide avec HCl 6N, à 110°C, pendant 12 heures, sur un appareil CLHP.

Enfin, l'invention concerne des compositions thérapeutiques dont l'ingrédient actif est une quantité suffisante des peptides en question, associée à des excipients appropriés au mode d'administration choisi.

SYNTHESE DES PEPTIDES

Les synthèses ont été effectuées étape par étape selon la méthode à l'anhydride mixte, en utilisant du chloroformate d'isobutyle ou selon la méthode des esters actifs, en utilisant les esters du N-hydroxy succinimide. Les aminoacides protégés sont des produits du commerce.

Déprotection

Le groupement Boc est clivé par acidolyse en utilisant de l'ATF: le peptide est traité par un mélange (1/1 en volume) de DCM/ATF (10 à 30 équivalents) pendant 1 à 2 heures, à température ambiante.

Les groupements ZBzl ou OBzl sont hydrogénolysés. Le peptide, en solution avec un mélange métha-noi/eau (9/1 en volume), est hydrogénolysé en présence de Pd/C à 10%.

Acétvlation

L'acétylation est effectuée en faisant réagir de l'acétylimidazole sur un trifluoroacétate de l'amine neutralisée par le triéthylamine dans le DMF.

Préparation de Boc DfOBzlì Kfzi 1

L'ester du N-hydroxy succinimide de Boc D(OBZI) (1 mole) est dissout dans 2,5 ml de DMF. K(Z) (1,1 eq.) en suspension est ajouté à cette solution, placé dans un bain glacé et 1,1 eq. de triéthylamine sont ajoutés sous agitation. L'agitation est maintenue pendant 24 heures. Le mélange réactionnel est évaporé sous pression réduite. Le résidu est ensuite traité par de l'acétate d'éthyle et une solution de HCl 0,5 N. La phase organique est lavée avec de l'eau puis avec une solution saturée de chlorure de sodium, sé-chée sur du sulfate de sodium et, enfin, évaporée sous pression réduite. Le résidu est chromatographié

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sur une colonne de gel de silice et élué par un mélange DCM/méthanol (95/5 en volume). Les fractions homogènes en CCM sont récupérées. Rendement: 0,540 g.

Préparation de Boc S(Bzl) DfOBzh K(T\ 2

On traite 0,5 mM de 1 par un mélange de 1,4 cm3 de ATF/DCM (1/1 en volume) (20 équivalents). Après 60 minutes à température ambiante, les solvants sont éliminés par évaporation sous pression réduite. Le résidu est traité deux fois par du DCM et séché sous pression réduite en présence de KOH.

L'ester du N-hydroxy succinimide de Boc S(Bzl) (1,2 eq.) et le trifluoroacétate obtenu précédemment sont dissous dans 1,3 ml de DMF. On ajoute un équivalent de triéthylamine sous agitation magnétique. L'agitation est maintenue pendant 24 heures. Le mélange réactionnelle est traité comme pourJL. Le résidu est chromatographié sur gel de silice et le produit obtenu est élué par un mélange éther éthy-lique/méthanol (8/2 en volume). Les fractions homogènes en CCM sont récupérées (rendement: 0,318 g, 83%). En triturant avec du pentane, on obtient un solide (0,27 g). Masse spectrométrique (MS) (FAB) MH+, 763 ont été mesurés; on a trouvé 763 et 763.100 (MH+ -Boc).

Préparation de NAc SfBzH DfOBzO KŒS 3

Le dérivé 2 est déprotégé par une solution de HCl 3,1 N (20 équivalents) dans du tétrahydrofurane. La solution est agitée à température ambiante pendant 6 heures et demie. Le mélange réactionnel est évaporé et séché sous pression réduite pendant une nuit en présence de KOH.

Le chlorhydrate obtenu et un équivalent de 1,1 d'acétyiimidazole sont dissous dans 1 ml de DMF. Le pH de cette solution est porté à 7,5 par addition de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 22 heures. Le mélange réactionnel est ensuite évaporé et le résidu est traité par de l'acétate d'éthyle et une solution de HCl 0,5 N. La phase organique est lavée avec de l'eau puis avec une solution saturée de chlorure de sodium, et enfin séchée sur du sulfate de sodium. MS FAB MH+, 705 ont été mesurés et 705 observés.

Préparation de NAc SDK 4

0,140 g de 3 (0,2 mM) dissous dans 3 ml de méthanol et 1 ml d'eau sont hydrogénolysés pendant 22 heures en présence de Pd/C à 10%. Le catalyseur est filtré sur un tampon celite et le solvant est éliminé par évaporation sous pression réduite. Rendement: 0,079 g. La CCM révèle 2 tâches sensibles à la ninhydrine.

Le produit est purifié par CLHP, mode isocratique;

éluant: eau: ATF 0,1%; débit 4 ml/mn; t = 8 mn.

Analyse des aminoacides:

S: 0,9 (1); D: 1,3 (1);

K: 1,3 (1)

MS: FAB MH+ 391 ont été mesurés et 391 observés.

Préparation de SDK 5

Le tripeptide 2 est initialement traité avec un mélange ATF/DCM (1:1 en volume) pendant une heure et demie; les solvants sont éliminés par évaporation sous pression réduite et le résidu est traité au toluène; le solvant est éliminé par évaporation et le résidu est hydrogénolysé dans une solution de 3 ml de méthanol et 0,3 ml d'eau, pendant 20 heures, à température ambiante et en présence de 0,030 g de Pd/C. Le catalyseur est filtré sur un tampon celite et le solvant est éliminé par évaporation sous pression réduite. Rendement: 0,090 g.

MS MH+ 349 ont été observés et 349 mesurés.

5 est purifié par CLHP, mode isocratique; éluant: eau, ATF 0,10%, débit 2 ml/mn; t = 6 mn.

Analyse des aminoacides:

S: 1(1); D: 0,8(1);

K: 1,3(1)

Les autres peptides de l'invention sont préparés suivant la même technique que SDK.

L'intérêt de la présente invention est mis en évidence par les rapports immunologiques qui suivent.

PROTOCOLE DES ROSETTES

I - PREPARATION D'HEMATIES DE MOUTON

. Laver trois fois les hématies dans RPM11640 ou RBS ou Hanks + médicaments antibiotiques. Centrifuger pendant 7 mn à 3000 t/m.

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. Mettre le suc cellulaire en suspension. Compter. Porter à 2,108 hématies/ml dans une solution RPMI à 20% de sérum fœtal de veau (SFV) (4 ml préalablement adsorbés sur 1 ml de suc d'hématies, 30 mn dans un bain glacé, puis centrifuger pendant 7 mn à 3000 t/m et récupérer dans des conditions stériles).

II - PREPARATION DES CELLULES JURKAT T

. Prendre une aliquote de cellules Jurkat T en culture. Etablir la viabilité avec du bleu Trypan.

. Prélever le volume de cellules requis pour un travail pratique. Laver les cellules trois fois dans RPMI 1640 ou du tampon phosphate ou Hanks + médicaments antibiotiques. Centrifuger pendant 7 mn à 900 t/m.

. Mettre le suc cellulaire en suspension. Compter. Porter à 2,106 cellules Jurkat T/ml de solution de RPMI à 20% de SFV adsorbés.

III - PREPARATION DU PEPTIDE

. Solution inhibitrice = SDK (2,10-7 mole).

Les peptides à évaluer sont dissous dans RPM11640 à une concentration appropriée.

IV-TEST

. Placer, dans le tube, 200 ni de solution inhibitrice + 100 ni de cellules Jurkat T 2,106 M dans RPMI + SFV 20%; laisser 10 mn dans un bain glacé. Ajouter 100 ni d'hématies 2.108 M dans RPMI + SFV 20%. . Centrifuger pendant 5 minutes à 500 t/m. Laisser reposer toute la nuit à 4°C.

V - COMPTAGE DES ROSETTES

. Régler le microscope:

oculaire: x 6 objectif: x 7

. Remettre les cellules en suspension avec précaution, par tapotement. Laisser reposer un instant. . Ajouter, dans le tube, 30 n' de bleu Toluidine 1% (pour colorer les lymphocytes. Tapoter légèrement. . Faire 3 lectures à l'hémocytomètre Malassex par point expérimental.

Les résultats sont reportés dans le tableau suivant.

% Rosettes (% Inhibition)

Peptide

SDK

PSDKP

Contrôle

63 ±4

59 ±4

lO^M

38 ±3 (-40%)*

37 ±7 (-37%)**

10-5 M

45 ±4 (-28%)***

33 ±3 (-44%)*

10-6 M

50 ±2 (-22%)***

27 ±5 (-54%)*

10-7M

49 + 2 (-22%)*

45 ±6 (-24%)***

10-®M

40 ±2 (-36%)*

48 ±2 (-19%)***

10-9 M

43 ±1 (-32%)*

48 ±4 (-19%)***

10-10 M

43 ±3 (-32%)*

52 ±5 (NS)

10"11 M

40 ±1 (-36%)*

10_12M

44 ±3 (-30%)*

IOT13M

51 ±7 (-19%)***

1CT14M

55 ±2 (-14%)***

10_15M

63 ± 4 (NS)

( ) % Inhibition

*: a <0.001

ci <0.01 ***: a < 0.05

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ISOLATION DE CELLULES HUMAINES PERIPHERIQUESMONONUCLEAIRES

I - ISOLATION DE (nPMH)

Diluer le sang à 1/2 dans du tampon phosphate. Sur 15 ml de Ficoll-Hypaque, mettre 35 ml de sang dilué. Centrifuger 30 mn à 1800 t/m, à température ambiante. Récupérer l'anneau correspondant aux cellules mononucléaires (CMN) avec une pipette Pasteur. Laver deux fois dans du tampon phosphate (centrifuger pendant 10 mn à 1800 t/m). Porter à 2,106 cellules/ml avec RPM11640 milieu «complet» +10% SFV.

Il-PRODUITS REACTIFS Phytohémagglutimine:

. Reconstituer une bouteille de 5 ml lyophylisée avec 5 ml de milieu «complet». Solution de 100%. Diluer pour obtenir une solution à 0,4%.

Peptides:

. SDK: Tube 106 mole + 4,35 ml milieu «complet». Solution 2,3 10-4M.

Puis diluer successivement: 450 n' «milieu» + 50 ni de dilution.

III - PROTOCOLE

Dans 96 boîtes NUNC bien stérilisées:

. 100 ni de CMN à 2,106 cellules/ml (2,105 cellules)

. 50 n' de phytohémagglutimine 0,4% (0,1 % final)

. 50 ni de milieu . 30 ni de peptide (3,10-5M)

Laisser incuber pendant 3 jours à 37°C dans une atmosphère air/C02 95/5.

Pendant les 24 dernières heures, donner une impulsion de [3H] Thymidine: 1 nci/puits. Récupérer les puits sur les filtres et compter avec un compteur.

Les résultats sont reportés dans le tableau suivant.

Stimulation de la prolifération des lymphocytes T

par Ser-Asp-Lys (SDK) et Pro-Ser-Asp-Lys-Pro (PSDKP)

PBL avec 0,1% Synthèse ADN provoquée par CMN stimulée de phytohémagglutimine par 0,1 % de phytohémagglutimine

cellules cpmx103/2,105

% stimulation

Contrôle (RPM11640)

35 ±2

+ RBC autologue

44+5

+ 26%**

+ SDK3,10-5M

56±5

+ 60%*

Contrôle (RPM11640)

40±3

+ SDK 3,10-10 M

52±5

+ 30%***

Contrôle (RPM11640)

38 ±3

+ PSDKP 3.10-5 M

54±4

+ 42%***

*: a <0.001

**: a < 0.02 ***: a < 0.01

CMN: cellule mononucléaire

REPONSE HUMORALE

Des souris âgées de 6 à 8 semaines de souche B6D2F1 sont sensibilisées, le jour 0, par 0,2 ml d'une suspension d'hématies de mouton [cellules 108] dans une solution saline de Hanks.

Les peptides Ser-Asp-Lys et Pro-Ser-Asp-Lys-Pro (3 ng/kg) sont injectés en solution dans un sérum physiologique, par voie IP, dans 0,2 ml, à un moment précis.

Le jour + 4, les animaux sont sacrifiés et le nombre de lymphocytes B qui sécrètent des immunoglo-bines IgM est déterminé suivant la technique d'hémolyse de plaques (méthode Jerne).

8 souris/lot-4 déterminations/animal test renouvelé: 2 expériences/point.

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Les résultats sont reportés dans le tableau qui suit.

Stimulation de la réponse humorale, chez les souris, aux hématies de mouton un antigène T dépendant dans les peptides Ser-Asp-Lys et Pro-Ser-Asp-Lys-Pro (Nombre de P.F.C./céllules 10e)

Période

Substances injectées

d'injection

Saline

Ser-Asp-Lys

Pro-Ser-Asp-Lys-Pro

-24 h

444 ±44

644 ±170

630 ±142

(+45)*

(+42)*

Oh

459 ±103

903 ±133

915 ±140

(+97)*

(+99)*

+ 24 h

407 ±66

459± 103

475 ±82

(NS)

+ 48 h

407 ±66

673± 110

589 ±101

(+65)*

(+45)*

+ 72 h

459±103

1073 ± 348

543 ±112

(+134)*

(NS)

*: a <0.001 **: a < 0.01 ( ) % stimulation

Concentration de peptides : 3 [xg/kg

TOXICITE

Aucune toxicité n'a été constatée pour tous les peptides selon l'invention lorsqu'ils sont administrés per os, aux doses maximales administrables, à des rats et des souris. Par voie IP, aucune mort n'a été constatée à 1 g/kg pour les mêmes animaux.

PRESENTATION - POSOLOGIE

Seuls les peptides Ser-Asp-Lys peuvent être administrés oralement et atteindre leur cible thérapeutique sans dégradation importante; les comprimés et les gélules sont des formes appropriées avec des unités de dosage contenant 10 mg de Ser-Asp-Lys. Par cette voie, les peptides supérieurs requièrent des formes protégées et un dosage unitaire plus élevé (20 mg). Les doses quotidiennes peuvent être comprises entre 10 et 100 mg (SDK) ou entre 20 et 200 mg pour les peptides supérieurs. Par voie IP, les doses quotidiennes sont de t à 10 mg pour une action immédiate mais des formes d'administration retardée (microgélules, microsphère et autres) peuvent contenir jusqu'à 300 mg pour une forme retardée à long terme.

Claims

Revendications

1. Peptides de formule générale H2N-W-Ser-Asp-Lys-X-OH

dans laquelle X représente un résidu Pro ou Lys ou une liaison de valence et W représente un résidu Thr ou Pro ou une liaison de valence avec la convention que, si X représente un résidu Pro, alors W représente également un résidu Pro, et des sels thérapeutiquement acceptables de ceux-ci:

2. Ser-Asp-Lys selon la revendication 1.

3. Ser-Asp-Lys-Lys selon la revendication 1.

4. Pro-Ser-Asp-Lys-Lys selon la revendication 1.

5. Thr-Ser-Asp-Lys-Lys selon la revendication 1.

6. Pro-Ser-Asp-Lys selon la revendication 1.

7. Thr-Ser-Asp-Lys selon la revendication 1.

8. Pro-Ser-Asp-Lys-Pro selon la revendication 1.

9. Procédé de préparation des peptides selon la revendication 1 consistant à effectuer, par la méthode de l'anhydride mixte, en utilisant du chloroformate d'isobutyle, la séquence réactionnelle suivante:

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I Boc K(Z)-X( )-OH

II Boc D(OBzl)-K(Z)-X( )-OH

III Boc S(Bzl)-D(OBzl)-K(Z)-X( )-OH

IV Boc W( )-S(Bzl)-D(OBzl)-K(Z)—X( )-OH

avec la convention que:

10. Procédé de préparation des peptides selon la revendication 1 consistant à effectuer, par la méthode des esters actifs, en utilisant les esters du N-hydroxy succinimide, la séquence réactionnelle telle que définie dans la revendication 9.

11. Composition thérapeutique ayant une activité immunomodulatoire, contenant de 1 à 300 mg d'un peptide selon les revendications 1 à 8, comme ingrédient actif, associé à des excipients appropriés au mode d'administration choisi.

12. Composition selon la revendication 11, pour administration orale, qui contient de 10 à 200 mg d'ingrédient actif.

13. Composition selon la revendication 11, pour administration par voie intrapéritonéale, qui contient de 1 à 300 mg d'ingrédient actif.

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