PT93380B - Processo para a preparacao de peptidos sdk - Google Patents

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Description

PATENTE DE INVENÇÃO N2 93 380
NOME: SOCIETE DE CONSEILS DE RECHERCHES ET D'APPLICATIONS
SCIENTIFIQUES S.C.R.A.S. sociedade anónima francesa, [ com sede em 51/53 rue du Docteur Blanche, 75016 Paris, França.
EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PÊPTIDOS SDK
INVENTORES: Maryse Lenfant e Josiane Thierry, residentes na França.
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 42 da Convenção da União de Paris de 20 de Março de 1883.
França, 11 de Março de 1989, sob o N°. 8905606.3.
Descrição referente à patente de invenção de SOCIETE DE CONSEILS DE RECHERCHES ET D' APPLICATIONS SCIENTIFIQUES S.C.R.A.S., sociedade anónima francesa, industrial e comercial, com sede em 51/53 rue du Docteur Blanche, 75016 Paris, França, (inventores: Maryse Lenfant e Josiane Thierry, residentes na França), para: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PÉPTIDOS SDK11.
DESCRIÇÃO
A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de péptidos SDK.
As abreviaturas utilizadas nesta
Descrição seguem as Recomendações de 1983 na Nomenclatura do Simbolismo para Péptidos de Amino Ácidos da IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature(Eur. J. Biochem.138.
9-37 (1984)). Para facilidade de compreensão, apresentam-se contudo em seguida algumas destas abreviaturas:
Asp ou D Ser ou S Lys ou K Pro ou P Thr ou T
Boc
OBzl
Ac
CR.
ácido aspártico serina lisina prolina treonina benziloxicarbonilo t-butoxicarbonilo benziloxi acetilo
MSHUa
Outras abreviaturas utilizadas incluem:
DMF dimetilformamida
DCM diclorometano
NMM N-metilmorfolina
TFA ácido trifluoroacético
TLC croma
FAB bombardeamento de átomos rápidos
A invenção refere-se a péptidos com a fórmula geral I
H2N - W - Ser - Asp - Lys - X - OH (I) na qual
X representa um resíduo Pro Lys ou uma ligação de valência , e
W representa um resíduo Thr ou Pro ou uma ligação de valência,com a condição de quando X represen tar um resíduo Pro então W também representar um resíduo Pro.
Os péptidos incluídos dentro da fór mula geral I podem ser representados da forma seguinte
Ser-Asp-Lys (i)
Ser-Asp-Lys-Lys (ii)
Pro-Ser-Asp-Lys-Lys (iii)
Thr-Ser-Asp-Lys-Lys (iv)
Pro-Ser-Asp-Lys (v)
Thr-Ser-Asp-Lys (vi)
Pro-Ser-Asp-Lys-Pro (vii)
A invenção inclui os sais farmaceuticamente aceitáveis dos péptidos com a fórmula geral I.
Este tripéptido (i), em que os outros péptidos da invenção se baseiam, não parece ter sido isolado ou preparado até à data presente. Contudo, estas se quências de amino ácidos foram encontradas em várias proteínas vivas, por exemplo, Ser-Asp-Lys na proteína da membrana dos linfócitos T em que a sua acção aparece quando uma parte de um marcadoor de linfócitos como por exemplo o linfócito
CD2 bem como sub unidade-ól ou do receptor T, que compreende a sequência específica que tem uma posição em relação a certos receptores específicos do linfócito; estas sequências de aminoácidos podem também ser encontradas em várias proteí nas como por exemplo as proteínas de vírus e também em certas proteínas de complemento ou do factor de necrose de tumores oL .
Deste modo, era particularmente interessante investigar a actividade das sequências específicas de aminoácidos e, de acordo com a invenção, verificou-se que eles jogam papéis importantes no campo da imunomodulação tal como é evidenciado pelos relatórios imunologicos.
A invenção refere-se especificamente a um processo para a preparação destes péptidos que é con duzido pelas vias habituais através da seguinte sequência de reacções:
I Boc K(Z) - X( ) - OH
II Boc D(OBzl) - K(Z) - X( ) OH
III Boc S(Bzl) - D(OBzl) - K(Z) - X( ) - OH
IV Boc W( ) - S(Bzl) - D(OBzl) - K(Z) - X( ) - OH com as convenções seguintes:
a) os parênteses após W ou X estão vazios quando W ou X representam Pro, e os parênteses após W contem Bzl quando W representa Thr e os parênteses após X contém Z quando X representa Lys, e
b) quando W e/ou X representam uma ligação de valência, omite-se a fase correspondente.
Quando se prepara um sal terapeuticamente aceitável, por exemplo acetilo, a salificação deve ser conduzida antes da fase final de desprotecção.
Os solventes aqui utilizados têm uma qualidade Purex. A DMF é armazenada em peneiros moleculares de 3 e 4 A.
Os ensaios de TLC são conduzidos em placas analíticas. As placas foram obervadas a 254 nm e reveladas com uma solução de ninhidrina de acordo com Pataki. Utilizam-se os seguintes solventes:
Α : DCM/metanol 8/2 em volume)
B : n-butanol/AcOH/água (4/1/1 em volume) e
C : n-butanol/AcOH/água/piridina (l/l/l/l em volume) .
Os produtos intermediários são puri ficados numa coluna de sílica quando necessário (sílica 60 A (40-60 μπι) SDS) , são caracterizadas pelo seu espectro de mas sa (pico molecular ou MH+), por bombardeamento rápido atómico (FAB).
Os produtos finais são purificados por HPLC com uma coluna semipreparativa (7,2 mm x 250 mm) C18ODS Hypersil 10 μπι SFCC, com um modo isocrático ou com um gradiente.
A análise de aminoácidos é efectuada após hidrólise ácida dos péptidos com HC1 6N, a HO^c durante 12 horas num dispositivo de HPLC.
A invenção será melhor compreendida a partir da descrição da preparação de Ser-Asp-Lys (1). SÍNTESE DOS PÉPTIDOS
A síntese foi efectuada passo a pas so com o processo do anidrido misto, incluindo c,loroformato de isobutilo ou pelo processo dos ésteres activos, utilizando os ésteres de N-hidroxisuccinimida. os aminoácidos protegidos são os comerciais.
Desprotecção grupo Boc é clivado por acidolise utilizando TFA: o péptido é tratado com uma mistura (1/1 em volume) de DCM/TFA (10 a 30 equivalentes) durante 1 a 2 horas, à temperatura ambiente.
Os grupos ZBzl ou OBzl são hidrogenolisados. O péptido,em solução numa mistura de metanol/água (9/1 em volume), é hidrogenolisado na presença de Pd/C a 10%.
Acetilacão
A acetilação é efectuada fazendo í reagir acetilmidazole com o trifluoroacetato da amina neutra I lizada pela trietilmanina em DMF.
Preparação de Boc D (OBzl) K (ζ) 1 éster da N-hidroxisuccinimida de Boc D (OBzl) (1 mole) é dissolvido em 2,5 ml de DMF. Adicio na-se K (Z) (1,1 eq.) em suspensão a esta solução, coloca-se num banho de gelo e adicionam-se 1,1 eq. de trietilamina com agitação. Mantem-se a agitação durante 24 horas. Evapora-se a mistura reaccional a pressão reduzida. Trata-se em seguida o resíduo com acetato de etilo e uma solução de HC1 0,5 N. Lava-se a fase orgânica com água, e em seguida com uma solução saturada de cloreto de sódio, seca-se em sulfato de sódio e evapora-se finalmente a pressão reduzida. O resíduo é cromatografado numa coluna de gel de sílica e é eluido com uma mistura de DCM/metanol (95/5 em volume). Recolhem-se as fracções homogéneas obtidas de TLC.
Rendimento: 0,540 g.
Preparação de Boc S (Bzl) D (OBzl) K (Z) 2
Tratam-se 0,5 mM de 1 com uma mistu ra de 1,4 cm3 de TFA/DCM (1/1 em volume) (20 equivalentes). Passados 60 mimutos à temperatura ambiente, evaporam-se os solventes a pressão reduzida. Trata-se o resíduo duas vezes com DMC e seca-se a pressão reduzida na presença de KOH.
O éster da N-hidroxisuccinimida de Boc S (Bzl) (1,2 eq.) e o trifluoroacetato anteriormente obtido são dissolvidos em 1,3 ml de DMF. Adiciona-se um equivalente de trietilamina com agitação magnética. Mantem-se a agitação durante 24 horas. Trata-se a mistura reaccional co mo para 1. Cromatografa-se o resíduo em gel de silica e elui-se o produto resultante com uma mistura de éter dietílico/metanol (8:2 em volume). As fracções homogéneas obtidas de TLC são recolhidas (rendimento : 0,318 g, 83%). Quando se tritura com pentano, obtem-se um sólido (0,27 g) . Os valores de espectrometria de massa (MS) (FAB) MH+, 763 foram cal culados, obtendo-se os valores de 763 e 763,100 (MH+ - Boc). Preparação de NAc S (Bzl) D (OBzl) K(Z) 3.
Efectua-se a desprotecção do deriva do 2 por meio de uma solução 3,1 N de HC1 (20 equivalentes) em tetrahidrofurano. Agita-se a solução à temperatura ambiente durante 6,5 horas. Evapora-se a mistura reaccional e
seca-se a pressão reduzida durante uma noite na presença de KOH.
cloridrato resultante e 1,1 equivalentes de acetilimidazole são dissolvidos em 1 ml de DMF. Leva-se o valor do pH desta solução a 7,5 com trietilamina. Agita-se a mistura durante 22 horas. Evapora-se em seguida a mistura e trata-se o resíduo com acetato de etilo e uma so lução 0,5 N de HCl. Lava-se a fase orgânica com água e com uma solução saturada de cloreto de sódio e em seguida seca-se em sulfato de sódio.
Calcularam-se valores de 705 para MS FAB MH+ e encontrou-se o valor de 705.
Preparação de NAc SDK 4.
Faz-se a hidrogenólise de 0,140 g de 3 (0,2 mM) dissolvidos em 3 ml de metanol e 1 ml de água durante 22 horas na presença de 10% Pd/C. Separa-se por fil tração o catalisador num leito de celite e separa-se o solvente por evaporação sob pressão reduzida.
Rendimento : 0,079 g. 0 ensaio de TLC mostra dois picos sen síveis a ninhidrina.
produto é purificado por HPLC, mo
do isocrático; eluente: água: TFA 0,1%; caudal 4 ml/mn;
t = 8 mn.
Análise de aminoácidos S : 0.9 (1) ; D : 1.3 (1) ;
K : 1.3 (1)
MS : FAB MH+ foi calculado o valor de 391 e achou-se o valor
de 391.
Preparação de SDK 5
O tripéptido 2 é inicialmente trata do com uma mistura de TFA/DCM (1:1 em volume) durante uma hora e meia; evaporam-se em seguida os solventes a pressão reduzida e trata-se o resíduo com tolueno; evapora-se o solvente e hidrogenolisa-se o resíduo numa solução de 3 ml de metanol e 0,3 ml de água, durante 20 horas, à temperatura ambiente e na presença de 0,030 g de Pd/C. Separa-se por filtração o catalisador num leito de celite e evapora-se o solvente a pressão reduzida. Obtêm-se : 0,090 g.
Observou-se para MS MH+ o valor de 349 e calculou-se o valor de 349.
é purificado por HPLC, modo isocrático; eluente: água, TFA 0.10 %, caudal 2 ml/mn; t = 6 mn.
Análise de amino-ácidos : S : 1(1) ; D : 0.8(1) ;
K : 1.3(1)
Os outros peptidos da invenção são preparados pela mesma técnica aplicada ao SDK.
interesse da presente invenção se rá exemplificado pelos seguintes relatórios imunológicos.
PROTOCOLO DE ROSETAS
I - PREPARAÇÃO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS VERMELHAS DE CARNEIRO
Lavam-se por três vezes as células sanguíneas vermelhas de carneiro (RBC) em RPMI 1640 ou RBS ou Hanks + medicamentos antibióticos. Centrifuga-se durante 7 min a 3000 rpm.
Coloca-se o caldo das células em suspensão. Contam-se. Levam-se a 2 χ 108 RBC/ml numa solução de RPMI a 20% de Soro Fetal de Vitela (FCS) (4 ml anteriormente adsorvidos em 1 ml de caldo RBC, 30 min num banho de gelo, em seguida centrifugam-se durante 7 min a 3000 rpm e recupe ram-se em condições estabilizadas).
II - PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS JURKAT T
- Toma-se uma aliquota das células Jurkat T em cultura. Faz-se um ensaio de viabilidade com azul de Triptano.
Em seguida toma-se o volume de células necessário para a experimentação. Lavam-se as células por três vezes em RPMI 1640 ou PBS ou Hanks+medicamentos antibióticos. Centrifuga-se durante 7 min a 900 rpm.
Coloca-se o caldo das células em suspensão. Contam-se. Leva-se a 2 χ 106 células de Jurkat T / ml da solução de de RPMI e 20% de FCS adsorvido.
III - PREPARAÇÃO DO PÉPTIDO
Solução de inibição = SDK (2 χ 10-7 mole).
Os péptidos a serem avaliados são dissolvidos em RPMI 1640 na concentração adequada.
IV - ENSAIO
Colocam-se, no tubo, 200 μΐ da solução inibidora + 100 μΐ de células Jurkat T 2 x 106 M em RPMI + FCS 20%; deixa-se durante 10 min num banho de gelo. Adicionam-se 100 Ml de RBC 2 X 10θ M em RPMI + FCS a 20%.
Centrifuga-se durante 5 min a 500 rpm. Deixa-se durante a noite a 4^0.
V - CONTAGEM DAS ROSETAS
Ajusta-se o microscópio: ocular: x 6 objectiva: x 7
Colocam-se cuidadosamente de novo em suspensão as células por agitação. Deixam-se em repouso durante algum tempo.
- Adicionam-se, ao tubo, 30 μΐ de azul de Toluidino a 1% (para colorir os linfócitos). Agita-se moderadamente, fazem-se 3 leituras num hemocitómetro Malassex por ponto experimental,
Os resultados obtidos são apresentados na tabela seguinte
S
% ROSETAS ( % INIBIÇÃO )
Péptido SDK PSDKP
Controlo 63 ± 4 59 ± 4
104 M 38 ± 3 (-40%) * 37 ± 7 (-37%) **
105 M 45 ± 4 (-28%) *** 33 ± 3 (-44%) *
106 M 50 ± 2 (-22%) *** 27 ± 5 (-54%) *
107 M 49 ± 2 (-22%) * 45 ± 6 (-24%) ***
IO-8 M 40 ± 2 (-36%) * 48 ± 2 (-19%) ***
109 M 43 ± 1 (-32%) * 48 ± 4 (-19%) ***
IO-10 M 43 ± 3 (-32%) * 52 ± 5 (NS)
10-11 M 40 ± 1 (-36%) *
IO-12 M 44 ± 3 (-30%) *
1013 M 51 ± 7 (-19%) ***
10“14 M 55 ± 2 (-14%) ***
IO15 M 63 ± 4 (NS)
( ) % inibição
* : & < 0.001
** : o( < 0.01
*** : oí < 0.05
ISOLAMENTO DAS CÉLULAS MONONUCLEARES HUMANAS PERIFÉRICAS
I - ISOLAMENTO DE (nPMN)
Dilui-se sangue para metade em PBS. Em 15 ml de Ficoll-Hypaque, colocam
-se 35 ml de sangue diluído. Centrifuga-se durante 30 min a 1800 rpm, à temperatura ambiente. Toma-se o anel correspondente às células mononucleares (MNC) de novo com uma pipeta de Pasteur.
Lava-se duas vezes em PBS (centrifuga-se durante 10 min a 1800 rpm).
Leva-se a uma concentração de 2 x 10® células/ml com RPMI 1640 de meio completo + 10% de SVF.
II - PRODUTOS REACTIVOS
PHA-M : Reconstitui-se uma garrafa liofilizada de 5 ml com 5 ml de meio completo. Dissolvem-se 100%. Diluem-se para se obter uma solução a 0,4%.
Péptidos:
- SDK: Tubo 10® mole + 4,35 ml de meio completo. Solução 2,3 x IO-4 M.
Em seguida diluem-se sucessivamente : 450 μΐ de meio + 50 μΐ de diluição.
III - PROTOCOLO
Colocam-se em caixas NUNC de 96 furos esterilizados:
. 100 μΐ de MNC a 2 x 10® células/ml (2 x 105 células) μΐ de PHA 0,4 % (0,1 % final) . 50 μΐ de meio . 30 μΐ de péptido (3,10-5 M)
Incubam-se durante 3 dias a 37 sc numa atmosfera de ar/CO2 95/5.
Durante as últimas 24 horas, fazem-se recolhas de [3H] Timidina : 1 μΟϊ/ίηΓΟ . Recolhem-se os furos em filtros e contam-se com um contador.
Os resultados obtidos são apresentados na tabela seguinte.
Estimulação da proliferação dos linfócitos T por Ser-Asp-Lys (SDK) e Pro-Ser-Asp-Lys-Pro (PSDKP)
PBL com 0.1 % PHA
Controlo (RPMI 1640) + RBC Autólogo + SDK 3.105 M
Controlo (RPMI 1640) + SDK 3.10-10 M
Controlo (RPMI 1640) + PSDKP 3.10”5 M
Síntese de ADN Induzida em MNC estimulada com 0.1 % PHA
* < 0.001
** < 0.02
*** : o<- < 0.01
MNC : célula mononuclear
RESPOSTA HUMORAL
Sensibilizam-se ratos com 6 a 8 semanas de idade da estirpe B6D2F1, no dia 0, com 0,2 ml de uma suspensão de células sanguíneas vermelhas de carneiro [108 células] numa solução salina de Hanks.
Os péptidos Ser-Asp-Lys e Pro-Ser-Asp-Lys-Pro (3 /xg/kg) foram injectados em solução em soro fisiológico, pela via IP, em 0,2 ml no tempo adequado.
No dia + 4, sacrificam-se os animais e conta-se o número de linfócitos B que segregam imunoglobulinas IgM pela técnica da placa de hemólise (método Jer ne) .
ratos / lote, 4 determinações / animal teste de confirmação : 2 experiências / ponto.
Os resultados são apresentados na seguinte tabela.
Estimulação da resposta humoral em ratos com células sanguíneas vermelhas de carneiro a um antigénio dependente de T por péptidos Ser-Asp-Lys e Pro-Ser-Asp-Lys-Pro (Número de células P.F.C. / 106)
PERÍODO DE INJECÇÃO SUBSTÂNCIAS INJECTADAS
SALINA Ser-Asp-Lys Pro-Ser-Asp-Lys-Pro
- 24 h 444 ± 44 644 ± 170 (+ 45) * ** 630 ± 142 (+ 42) *
0 h 459 ± 103 903 ± 133 (+ 97) * 915 ± 140 (+ 99) *
+ 24 h 407 ± 66 459 ± 103 (NS) 475 ± 82 (NS)
+ 48 h 407 ± 66 673 ± 110 (+ 65) * 589 ± 101 (+ 45) *
+ 72 h 459 ± 103 1073 ± 348 (+ 134) * 543 ± 112 (NS)
* : 0.001 ** : ckO.Ol ( )% estimulação
Concentração de péptidos : 3 Mg/kg
TOXICIDADE
Não se observou toxicidade para qualquer do péptido de acordo com a invenção quando adminis trados per os, nas doses máximas de administração, a ratos e ratinhos. Pela via IP não se observou qualquer morte para 1 g/kg para os mesmos animais.
APRESENTAÇÃO - POSOLOGIA
Apenas os péptidos Ser-Asp-Lys podem ser administrados oralmente e atingem o seu alvo sem degradação substancial; os comprimidos e as cápsulas de gelatina são adequados como unidades de dosagem contendo 10 mg de Ser-Asp-Lys. Por esta via, os péptidos superiores necessitam de formas protegidas unitárias superiores (20 mg) . As doses diárias podem ser de 10 a 100 mg (SDK) ou de 20 a 200 mg para péptidos superiores. Pela via IP, as doses diárias são de 1 a 10 mg para acção imediata mas as formas de libertação prolongada (microcápsulas, microesferas ou produtos semelhantes) podem conter até 300 mg para uma forma de liber tação de longa duração.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    - ia Processo para a preparação de pépti dos com a fórmula geral
    H2N - W - Ser - Asp - Lys - X - OH na qual
    X representa um resíduo Pro ou Lys ou uma ligação de valência, e
    W representa um resíduo Thr ou Pro ou uma ligação de valência, com a condição de se X representar um resíduo Pro então W também representa um resíduo Pro, caracterizado por se efectuar, pelas vias habituais,a seguinte sequência de reacções;
    I Boc K(Z) - X( ) - OH cisão do grupo t-butoxicarbonilo da v lisina acoplamento com Boc D(OBzl)
    II Boc D(OBzl) - K(Z) - X( ) - OH cisão do grupo t-butoxicarbonilo do ácido aspártico acoplamento com Boc S(Bzl)
    III Boc S(Bzl) - D(OBzl) - K(Z) - X( ) - OH cisão do grupo t-butoxicarbonilo da serina acoplamento com Boc W( )
    IV Boc W( ) - S(Bzl) - D(OBzl) - K(Z) - X( ) - OH em que os ácidos aminados lisina, ácido aspártico e serina são representados pelo código de uma letra, K, D e S, respeç tivamente, em que a cisão dos grupos t-butoxicarbonilo é efectuada por acidólise com ácido trifluoroacético e os acoplamentos são efectuados por um método da química dos péptidos, por exemplo pelo método do éster activo, com as convenções seguintes:
    a) os parenteses a seguir a W ou X estarem vazios quando W e X representarem Pro,os parenteses a seguir a W con terem Bzl quando W representar Thr e os parenteses a seguir a X conterem Z quando X representar Lys, e
    b) quando Q e/ou X representarem uma ligação da valência, se omitir a fase correspondente.
    - 2a Processo de acordo com a reivindica ção l, caracterizado por ser efectuado pelo método do anidri do misto, utilizando cloroformiato de isobutilo.
    - 3a Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por ser efectuado pelo método dos ésteres activos, utilizando os ésteres de N-hidroxisuccinimida.
    A requerente reivindica a priorida de do pedido britânico apresentado em 11 de Março de 1989 sob ο N2.8905606.3.
    Lisboa, 9 de Março de 1990 0 AGENTE OFICIAL DA PKOPBIEDADE INDLSTBIAL
PT93380A 1989-03-11 1990-03-09 Processo para a preparacao de peptidos sdk PT93380B (pt)

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