CN108586601A - 一种骨靶向性鲑鱼降钙素及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种骨靶向性鲑鱼降钙素，是将鲑鱼降钙素分子中的二硫键打开并与骨靶向性偶联分子共价偶联形成，制备方法如下：(1)制备骨靶向性偶联分子，(2)将鲑鱼降钙素溶解于pH值为5～7的水溶性溶剂中，加入还原剂将鲑鱼降钙素的二硫键还原形成自由巯基，然后加入骨靶向性偶联分子，在0～40℃搅拌反应0.5～12h，将粗产物分离，采用制备型液相色谱纯化，即得骨靶向性鲑鱼降钙素。本发明提供的骨靶向性鲑鱼降钙素不具有细胞毒性和免疫原性，能提高降钙素的骨组织富集能力，可有效修复骨组织，具有广阔的应用前景。

Description

一种骨靶向性鲑鱼降钙素及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种骨靶向性鲑鱼降钙素及其制备方法。
背景技术
鲑鱼降钙素(Salmon calcitonin，sCT)是一种含有32个氨基酸的单链多肽类激素，能够调节血液中的钙离子浓度，减少骨吸收，并有明确的止痛作用。随着年龄的增长，人自身脏器逐渐衰老，降钙素和其他相关激素分泌的能力会大大降低，导致骨量减少，骨结构紊乱，抑制骨吸收的能力下降，逐步发展成骨质疏松症。目前用于治疗绝经后妇女骨质疏松症的药物多为降钙素类蛋白质及多肽药物，而且需要长期用药。
在外源性给予降钙素的治疗过程中，由于降钙素的半衰期非常短，会迅速从体内清除致使药效难以发挥到极致，导致其全身生物利用度较低。同时，由于人体骨骼仅占总体重的4％～5％，传统的药物递送系统仅会将一小部分sCT输送到骨骼部位达到治疗效果。sCT虽然与破骨细胞上的降钙素受体(CTR)相互作用而达到其抗吸收作用。但是CTR也广泛分布在非骨骼组织中。研究发现，已经证实可以与降钙素高亲和力结合的组织有：肾脏，脑，肺部，胎盘，卵巢，睾丸和精子等等。因此，如果全身施用药物而不特异性地靶向骨组织，这样的治疗方案会使得sCT药物在这些组织的CTR中存在竞争，这会进一步降低破骨细胞的sCT可利用性。采用骨靶向性分子可以改善sCT靶向、定位和骨保留，有望提高sCT的疗效，同时降低含有CTR的非骨位点的药物浓度。
通过对降钙素进行改性增加功能基团是改善降钙素骨靶向性的手段之一。现有技术大多采用对降钙素氨基酸序列中的赖氨酸残基进行偶联改性，但是由于可结合的位点较多，通常会得到混合物(参见M.W.Jones,etc.,Chemical Communications 35(35)(2009)5272-5274；D.Samanta,etc.,Biomacromolecules 9(10)(2008)2891-2897；K.H.Bhandari,etc.,International Journal of Pharmaceutics 394(1–2)(2010)26-34.)。通过乙酰化修饰鲑鱼降钙素(sCT)的Lys-11和Lys-18会导致生物效能的显着降低，因此不能通过氨基进行sCT衍生化(参见S.M.Ryan,etc.,Journal of Controlled Release 149(2)(2011)126-132；G.Andreotti,etc.,Journal of Biological Chemistry 281(34)(2006)24193-203.)。研究已经证明Gln-14可以使转谷氨酰胺酶被衍生化而不丧失活性，然而该方法并不是一种通用方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种骨靶向性鲑鱼降钙素，以在不降低鲑鱼降钙素生物效能的基础上有效提高其骨靶向性，同时为鲑鱼降钙素的骨靶向改性提供一种通用方法。
本发明提供的骨靶向性鲑鱼降钙素，是将鲑鱼降钙素分子中的二硫键打开并与骨靶向性偶联分子共价偶联形成，该骨靶向性鲑鱼降钙素的结构式如式(Ⅰ)所示，
式(Ⅰ)中， n为2～9中的整数。
本发明还提供了一种上述骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法，步骤如下：
(1)制备骨靶向性偶联分子
①将二取代马来酰亚胺和N-甲基吗啉溶解于乙酸乙酯中，避光加入氯甲酸甲酯，搅拌反应0.5～6h，分离出粗产物，将粗产物溶于二氯甲烷，用水洗涤，分离出有机相，干燥除去有机相中的水，然后除去二氯甲烷，得到第一中间体；
二取代马来酰亚胺与N-甲基吗啉的摩尔比为1:(1～1.5)，氯甲酸甲酯的加入量为二取代马来酰亚胺的摩尔量的1～1.5倍；
②将第一中间体溶解于二氯甲烷中，加入三乙胺和甘氨酸叔丁酯反应0.5～6h，除去二氯甲烷，将所得粗产物通过柱层析纯化，得到第二中间体，对第二中间体进行叔丁基脱保护，得到第三中间体；第一中间体与甘氨酸叔丁酯的摩尔比为1:(1～1.5)，三乙胺与第一中间体的摩尔比为1:(1～3)；
③将第三中间体、N-甲基吗啉和1-羟基苯并三唑加入N,N-二甲基甲酰胺中进行搅拌，在冰浴、通氩气条件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，持续通氩气0.5～2h后加入羧基保护的天冬氨酸寡肽或者羧基保护的谷氨酸寡肽，然后在冰浴条件下继续搅拌反应20～30h，冷冻干燥，透析，冷冻干燥，得到第四中间体，对第四中间体进行叔丁基脱保护即得骨靶向性偶联分子；
第三中间体、N-甲基吗啉与1-羟基苯并三唑的摩尔比为0.5:(1～1.5):(1.5～2)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的加入量为第三中间体摩尔量的3～4倍，羧基保护的天冬氨酸寡肽或者羧基保护的谷氨酸寡肽的加入量为第三中间体的摩尔量的1～1.5倍；
(2)制备骨靶向性鲑鱼降钙素
将鲑鱼降钙素溶解于pH值为5～7的水溶性溶剂中，然后加入还原剂将鲑鱼降钙素的二硫键还原形成自由巯基，再加入骨靶向性偶联分子，在0～40℃搅拌反应0.5～12h，将粗产物分离，采用制备型液相色谱纯化，即得骨靶向性鲑鱼降钙素；还原剂和骨靶向性偶联分子的加入量均为鲑鱼降钙素摩尔量的1～1.5倍。
上述骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法的技术方案中，所述天冬氨酸寡肽的氨基酸个数为3～10个，谷氨酸寡肽的氨基酸个数为3～10个。
上述骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法的技术方案中，所述二取代马来酰亚胺优选为二溴马来酰亚胺、二硫苯基马来酰亚胺或二氧苯基马来酰亚胺。
上述骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法的技术方案中，所述还原剂优选为2-巯基乙醇、二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦盐酸盐。
上述骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法的技术方案中，步骤(1)和步骤(2)中优选的化合物浓度如下：步骤(1)①中将二取代马来酰亚胺和N-甲基吗啉溶于乙酸乙酯中使二取代马来酰亚胺的浓度为1～5mg/mL，步骤(1)②中将第一中间体溶解于二氯甲烷中使第一中间体的浓度为20～40mg/mL，步骤(1)③中将第三中间体、N-甲基吗啉和1-羟基苯并三唑加入N,N-二甲基甲酰胺中使第三中间体的浓度为2～10mg/mL；步骤(2)中将鲑鱼降钙素溶解于pH值为5～7的水溶性溶剂中使鲑鱼降钙素的浓度为0.1～0.5mmol/L。
上述骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法的技术方案中，所述pH值为5～7的水溶性溶剂优选为PBS缓冲液。
上述骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法的技术方案中，步骤(1)②中采用柱层析纯化粗产物时，采用的柱填料为硅胶，洗脱溶剂为乙酸乙酯与石油醚的混合液，乙酸乙酯与石油醚的体积比为(3～4):10，优选地，柱填料硅胶为300～400目的硅胶。
上述骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法的技术方案中，步骤(2)中采用制备型液相色谱纯化粗产物时，采用的色谱柱为C-18制备色谱柱，流动相为0.1wt％～0.15wt％的三氟乙酸水溶液。
上述骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法的技术方案中，对第二中间体和第四中间体进行叔丁基脱保护时，优选采用以下方案：将第二中间体或第四中间体用二氯甲烷溶解，加入三氟乙酸的二氯甲烷溶液，在室温搅拌反应1h，即完成叔丁基脱保护，除去二氯甲烷，将粗产物通过重结晶纯化即可。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1.本发明提供了一种骨靶向性鲑鱼降钙素，对鲑鱼降钙素的半胱氨酸残基进行改性，具体是将鲑鱼降钙素分子的半胱氨酸残基中的二硫键打开并与骨靶向性偶联分子共价偶联形成，其中骨靶向性偶联分子是由对羟基磷灰石具有高亲和力的骨靶向功能分子和二取代马来酰亚胺作为基础经过系列化学反应合成的，骨靶向功能分子通过二取代马来酰亚胺与鲑鱼降钙素连接。对鲑鱼降钙素可还原的二硫键改性过程不影响蛋白质构象、稳定性和生物活性，而二取代马来酰亚胺是一种有效且快速反应的二硫化物结合剂，具有较为刚性稳定的结构，并且能在细胞内以可逆方式被可切割，复原成还原态的天然鲑鱼降钙素。由于羟基磷灰石基本不存在于其他非骨组织中，由此就实现了鲑鱼降钙素在骨组织的靶向富集，是提高鲑鱼降钙素药物生物利用度和治疗效果的有效手段。
2.本发明通过实验证实了本发明提供的骨靶向性鲑鱼降钙素不具有细胞毒性和免疫原性，并可以提高降钙素的骨组织富集能力，可有效修复骨组织，具有广阔的应用前景。
3.本发明还提供了制备骨靶向性鲑鱼降钙素的方法，该方法无需使用特殊的试剂和设备，操作难度不大，工艺条件温和，具有容易实现生产和推广应用的特点。
附图说明
图1是实施例1制备的骨靶向性鲑鱼降钙素的飞行时间质谱。
图2是实施例10中的细胞毒性测试结果。
图3是实施例11中的免疫原性测试结果。
图4是实施例12中的降钙素体内药物分布测试结果。
图5是实施例13中的骨小梁修复后的股骨CT图像。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明提供的骨靶向性鲑鱼降钙素及其制备方法作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护的范围。
实施例1
本实施例中，提供骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法，步骤如下：
(1)制备骨靶向性偶联分子
①合成第一中间体
将二硫苯基马来酰亚胺和N-甲基吗啉按照1:1的摩尔比溶解于乙酸乙酯中使二硫苯基马来酰亚胺的浓度为3mg/mL，避光加入与二硫苯基马来酰亚胺等摩尔量的氯甲酸甲酯，在室温搅拌反应1h，反应结束后旋蒸分离出粗产物，将粗产物溶于二氯甲烷中，用去离子水洗涤三次，然后去掉水相、保留有机相，向有机相中加入干燥剂无水MgSO4除去有机相中的水，然后过滤除去MgSO4，旋转除去二氯甲烷，得到第一中间体3,4-二硫苯基-2,5-二氧代-吡咯-1-羧酸甲酯，为橙色固体，第一中间体的结构式如式(Ⅱ)所示。
②合成第二中间体和第三中间体
将第一中间体溶解于二氯甲烷中使第一中间体的浓度为30mg/mL，加入三乙胺和甘氨酸叔丁酯在室温反应1h，然后旋蒸除去二氯甲烷，将所得粗产物通过柱层析纯化，柱层析纯化时采用的柱填料为300～400目的硅胶，洗脱溶剂为乙酸乙酯与石油醚的混合液，乙酸乙酯与石油醚的体积比为3:10，将所得洗脱液旋蒸得到第二中间体3,4-二硫苯基-2,5-二氧代-吡咯-1-乙酸叔丁酯，为黄色固体，第二中间体的结构式如式(Ⅲ)所示。该步骤中，第一中间体与甘氨酸叔丁酯的摩尔比为1:1，三乙胺与第一中间体的摩尔比为1:1。
将第二中间体溶解于二氯甲烷中使第二中间体的浓度为30mg/mL，然后加入三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷溶液，在室温搅拌反应1h，完成第二中间体的叔丁基脱保护，旋蒸除去二氯甲烷，将粗产物通过重结晶纯化，得到第三中间体3,4-二硫苯基-2,5-二氧代-吡咯-1-乙酸，为橙色固体，第三中间体的结构式如式(Ⅳ)所示。该步骤中，TFA的二氯甲烷溶液的浓度为10wt％，加入量应使TFA与第二中间体的摩尔比为1:1。
③合成骨靶向性偶联分子
将第三中间体、N-甲基吗啉和1-羟基苯并三唑(HoBt)加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中进行搅拌，在冰浴、通氩气条件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，持续通氩气1h后加入羧基保护的天冬氨酸六肽(Asp6肽)，然后在冰浴条件下继续搅拌24h，使第三中间体3,4-二硫苯基-2,5-二氧代-吡咯-1-乙酸与羧基保护的Asp6肽进行酰胺化反应，冷冻干燥除去DMF，再透析、冷冻干燥，得到第四中间体。该步骤中，第三中间体、N-甲基吗啉与HoBt的摩尔比为0.5:1:1.5，EDCI的加入量为第三中间体摩尔量的3倍，羧基保护的Asp6肽的加入量为第三中间体的摩尔量的1倍。
将第四中间体溶解于二氯甲烷中使第四中间体的浓度为30mg/mL，然后加入TFA的二氯甲烷溶液，在室温搅拌反应1h，完成第四中间体的叔丁基脱保护，旋蒸除去二氯甲烷，将粗产物通过重结晶纯化，得到骨靶向性偶联分子，为黄色固体，骨靶向性偶联分子的结构式如式(Ⅴ)所示。该步骤中，TFA的二氯甲烷溶液的浓度为10wt％，加入量应使TFA与第四中间体的摩尔比为1:1。
(2)制备骨靶向性鲑鱼降钙素
将鲑鱼降钙素(sCT)溶解于50mmol/L pH＝6.4的PBS缓冲液中使得sCT的浓度为0.3mmol/L，加入还原剂二硫苏糖醇在室温搅拌1h将sCT的二硫键还原形成自由巯基，再加入骨靶向性偶联分子，在25℃搅拌反应1h，将粗产物分离，采用制备型液相色谱纯化即得骨靶向性鲑鱼降钙素，记作sCT-1，sCT-1的飞行时间质谱如图1所示，sCT-1的结构式如式(Ⅰ)所示，式(Ⅰ)中，n＝5。
该步骤中，纯化时采用的色谱柱为Shimadzu C-18制备色谱柱(20mm×250mm×5μm)，流动相为0.1wt％的TFA水溶液，流速为2.5mL/min，检测波长为220nm；该步骤在，二硫苏糖醇和骨靶向性偶联分子的加入量均为sCT摩尔量的1倍。
实施例2
本实施例中，提供骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法，步骤如下：
(1)制备骨靶向性偶联分子
①合成第一中间体
将二溴马来酰亚胺和N-甲基吗啉按照1:1.2的摩尔比溶解于乙酸乙酯中使二溴马来酰亚胺的浓度为4mg/mL，避光加入氯甲酸甲酯，氯甲酸甲酯的加入量为二溴马来酰亚胺等摩尔量的1.2倍，在室温搅拌反应2h，反应结束后旋蒸分离出粗产物，将粗产物溶于二氯甲烷中，用去离子水洗涤三次，然后去掉水相、保留有机相，向有机相中加入干燥剂无水MgSO4除去有机相中的水，然后过滤除去MgSO4，旋转除去二氯甲烷，得到第一中间体3,4-二溴-2,5-二氧代-吡咯-1-羧酸甲酯。
②合成第二中间体和第三中间体
将第一中间体溶解于二氯甲烷中使第一中间体的浓度为40mg/mL，加入三乙胺和甘氨酸叔丁酯在室温反应2h，然后旋蒸除去二氯甲烷，将所得粗产物通过柱层析纯化，柱层析纯化时采用的柱填料为300～400目的硅胶，洗脱溶剂为乙酸乙酯与石油醚的混合液，乙酸乙酯与石油醚的体积比为3:10，将所得洗脱液旋蒸得到第二中间体3,4-二溴-2,5-二氧代-吡咯-1-乙酸叔丁酯。该步骤中，第一中间体与甘氨酸叔丁酯的摩尔比为1:1.2，三乙胺与第一中间体的摩尔比为1:2。
将第二中间体溶解于二氯甲烷中使第二中间体的浓度为20mg/mL，然后加入TFA的二氯甲烷溶液，在室温搅拌反应1h，完成第二中间体的叔丁基脱保护，旋蒸除去二氯甲烷，将粗产物通过重结晶纯化，得到第三中间体3,4-二溴-2,5-二氧代-吡咯-1-乙酸。该步骤中，TFA的二氯甲烷溶液的浓度为10wt％，加入量应使TFA与第二中间体的摩尔比为1:1。
③合成骨靶向性偶联分子
将第三中间体、N-甲基吗啉和HoBt加入DMF中进行搅拌，在冰浴、通氩气条件下加入EDCI，持续通氩气2h后加入羧基保护的天冬氨酸三肽(Asp3肽)，然后在冰浴条件下继续搅拌20h，使第三中间体3,4-二溴-2,5-二氧代-吡咯-1-乙酸与羧基保护的Asp3肽进行酰胺化反应，冷冻干燥除去DMF，再透析、冷冻干燥，得到第四中间体。该步骤中，第三中间体、N-甲基吗啉与HoBt的摩尔比为0.5:1.1:1.6，EDCI的加入量为第三中间体摩尔量的3.2倍，羧基保护的Asp3肽的加入量为第三中间体的摩尔量的1.3倍。
将第四中间体溶解于二氯甲烷中使第四中间体的浓度为20mg/mL，然后加入TFA的二氯甲烷溶液，在室温搅拌反应1h，完成第四中间体的叔丁基脱保护，旋蒸除去二氯甲烷，将粗产物通过重结晶纯化，得到骨靶向性偶联分子。该步骤中，TFA的二氯甲烷溶液的浓度为10wt％，加入量应使TFA与第四中间体的摩尔比为1:1。
(2)制备骨靶向性鲑鱼降钙素
将sCT溶解于50mmol/L pH＝6.4的PBS缓冲液中使得sCT的浓度为0.3mmol/L，加入还原剂二硫苏糖醇在室温搅拌1h将sCT的二硫键还原形成自由巯基，再加入骨靶向性偶联分子，在30℃搅拌反应1h，将粗产物分离，采用制备型液相色谱纯化即得骨靶向性鲑鱼降钙素，记作sCT-2，sCT-2的结构式如式(Ⅰ)所示，式(Ⅰ)中，n＝2。
该步骤中，纯化时采用的色谱柱为Shimadzu C-18制备色谱柱(20mm×250mm×5μm)，流动相为0.1wt％的TFA水溶液，流速为2.5mL/min，检测波长为220nm；该步骤在，二硫苏糖醇和骨靶向性偶联分子的加入量均为sCT摩尔量的1.2倍。
实施例3
本实施例中，提供骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法，步骤如下：
(1)制备骨靶向性偶联分子
①合成第一中间体
将二硫苯基马来酰亚胺和N-甲基吗啉按照1:1的摩尔比溶解于乙酸乙酯中使二硫苯基马来酰亚胺的浓度为2mg/mL，避光加入与二硫苯基马来酰亚胺等摩尔量的氯甲酸甲酯，在室温搅拌反应1h，反应结束后旋蒸分离出粗产物，将粗产物溶于二氯甲烷中，用去离子水洗涤三次，然后去掉水相、保留有机相，向有机相中加入干燥剂无水MgSO4除去有机相中的水，然后过滤除去MgSO4，旋转除去二氯甲烷，得到第一中间体3,4-二硫苯基-2,5-二氧代-吡咯-1-羧酸甲酯。
②合成第二中间体和第三中间体
将第一中间体溶解于二氯甲烷中使第一中间体的浓度为30mg/mL，加入三乙胺和甘氨酸叔丁酯在室温反应1h，然后旋蒸除去二氯甲烷，将所得粗产物通过柱层析纯化，柱层析纯化时采用的柱填料为300～400目的硅胶，洗脱溶剂为乙酸乙酯与石油醚的混合液，乙酸乙酯与石油醚的体积比为4:10，将所得洗脱液旋蒸得到第二中间体3,4-二硫苯基-2,5-二氧代-吡咯-1-乙酸叔丁酯。该步骤中，第一中间体与甘氨酸叔丁酯的摩尔比为1:1，三乙胺与第一中间体的摩尔比为1:1。
将第二中间体溶解于二氯甲烷中使第二中间体的浓度为30mg/mL，然后加入TFA的二氯甲烷溶液，在室温搅拌反应1h，完成第二中间体的叔丁基脱保护，旋蒸除去二氯甲烷，将粗产物通过重结晶纯化，得到第三中间体3,4-二硫苯基-2,5-二氧代-吡咯-1-乙酸。该步骤中，TFA的二氯甲烷溶液的浓度为10wt％，加入量应使TFA与第二中间体的摩尔比为1:1。
③合成骨靶向性偶联分子
将第三中间体、N-甲基吗啉和HoBt加入DMF中进行搅拌，在冰浴、通氩气条件下加入EDCI，持续通氩气1h后加入羧基保护的谷氨酸六肽(Glu6肽)，然后在冰浴条件下继续搅拌24h，使第三中间体3,4-二硫苯基-2,5-二氧代-吡咯-1-乙酸与羧基保护的Glu6肽进行酰胺化反应，冷冻干燥除去DMF，再透析、冷冻干燥，得到第四中间体。该步骤中，第三中间体、N-甲基吗啉与HoBt的摩尔比为0.5:1:1.5，EDCI的加入量为第三中间体摩尔量的3倍，羧基保护的Glu6肽的加入量为第三中间体的摩尔量的1倍。
将第四中间体溶解于二氯甲烷中使第四中间体的浓度为40mg/mL，然后加入TFA的二氯甲烷溶液，在室温搅拌反应1h，完成第四中间体的叔丁基脱保护，旋蒸除去二氯甲烷，将粗产物通过重结晶纯化，得到骨靶向性偶联分子。该步骤中，TFA的二氯甲烷溶液的浓度为10wt％，加入量应使TFA与第四中间体的摩尔比为1:1。
(2)制备骨靶向性鲑鱼降钙素
将sCT溶解于50mmol/L pH＝6.4的PBS缓冲液中使得sCT的浓度为0.4mmol/L，加入还原剂三(2-羧乙基)膦盐酸盐在室温搅拌1h将sCT的二硫键还原形成自由巯基，再加入骨靶向性偶联分子，在25℃搅拌反应3h，将粗产物分离，采用制备型液相色谱纯化即得骨靶向性鲑鱼降钙素，记作sCT-3，sCT-3的结构式如式(Ⅰ)所示，式(Ⅰ)中，n＝5。
该步骤中，纯化时采用的色谱柱为Shimadzu C-18制备色谱柱(20mm×250mm×5μm)，流动相为0.15wt％的TFA水溶液，流速为2.5mL/min，检测波长为220nm；该步骤在，三(2-羧乙基)膦盐酸盐和骨靶向性偶联分子的加入量均为sCT摩尔量的1倍。
实施例4
本实施例中，提供骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法，步骤如下：
(1)制备骨靶向性偶联分子
①合成第一中间体
将二氧苯基马来酰亚胺和N-甲基吗啉按照1:1.5的摩尔比溶解于乙酸乙酯中使二氧苯基马来酰亚胺的浓度为5mg/mL，避光加入氯甲酸甲酯，氯甲酸甲酯的加入量为二氧苯基马来酰亚胺摩尔量的1.5倍，在室温搅拌反应0.5h，反应结束后旋蒸分离出粗产物，将粗产物溶于二氯甲烷中，用去离子水洗涤三次，然后去掉水相、保留有机相，向有机相中加入干燥剂无水MgSO4除去有机相中的水，然后过滤除去MgSO4，旋转除去二氯甲烷，得到第一中间体3,4-二氧苯基-2,5-二氧代-吡咯-1-羧酸甲酯。
②合成第二中间体和第三中间体
将第一中间体溶解于二氯甲烷中使第一中间体的浓度为10mg/mL，加入三乙胺和甘氨酸叔丁酯在室温反应0.5h，然后旋蒸除去二氯甲烷，将所得粗产物通过柱层析纯化，柱层析纯化时采用的柱填料为300～400目的硅胶，洗脱溶剂为乙酸乙酯与石油醚的混合液，乙酸乙酯与石油醚的体积比为3:10，将所得洗脱液旋蒸得到第二中间体3,4-二氧苯基-2,5-二氧代-吡咯-1-乙酸叔丁酯。该步骤中，第一中间体与甘氨酸叔丁酯的摩尔比为1:1.5，三乙胺与第一中间体的摩尔比为1:3。
将第二中间体溶解于二氯甲烷中使第二中间体的浓度为10mg/mL，然后加入TFA的二氯甲烷溶液，在室温搅拌反应1h，完成第二中间体的叔丁基脱保护，旋蒸除去二氯甲烷，将粗产物通过重结晶纯化，得到第三中间体3,4-二氧苯基-2,5-二氧代-吡咯-1-乙酸。该步骤中，TFA的二氯甲烷溶液的浓度为10wt％，加入量应使TFA与第二中间体的摩尔比为1:1。
③合成骨靶向性偶联分子
将第三中间体、N-甲基吗啉和HoBt加入DMF中进行搅拌，在冰浴、通氩气条件下加入EDCI，持续通氩气6h后加入羧基保护的天冬氨酸六肽(Asp6肽)，然后在冰浴条件下继续搅拌30h，使第三中间体3,4-二氧苯基-2,5-二氧代-吡咯-1-乙酸与羧基保护的Glu6肽进行酰胺化反应，冷冻干燥除去DMF，再透析、冷冻干燥，得到第四中间体。该步骤中，第三中间体、N-甲基吗啉与HoBt的摩尔比为0.5:1.5:2，EDCI的加入量为第三中间体摩尔量的3.5倍，羧基保护的Asp6肽的加入量为第三中间体的摩尔量的1.2倍。
将第四中间体溶解于二氯甲烷中使第四中间体的浓度为10mg/mL，然后加入TFA的二氯甲烷溶液，在室温搅拌反应1h，完成第四中间体的叔丁基脱保护，旋蒸除去二氯甲烷，将粗产物通过重结晶纯化，得到骨靶向性偶联分子。该步骤中，TFA的二氯甲烷溶液的浓度为10wt％，加入量应使TFA与第四中间体的摩尔比为1:1。
(2)制备骨靶向性鲑鱼降钙素
将sCT溶解于50mmol/L pH＝6.4的PBS缓冲液中使得sCT的浓度为0.5mmol/L，加入还原剂2-巯基乙醇在室温搅拌1h将sCT的二硫键还原形成自由巯基，再加入骨靶向性偶联分子，在40℃搅拌反应0.5h，将粗产物分离，采用制备型液相色谱纯化即得骨靶向性鲑鱼降钙素，记作sCT-4，sCT-4的结构式如式(Ⅰ)所示，式(Ⅰ)中，n＝5。
该步骤中，纯化时采用的色谱柱为Shimadzu C-18制备色谱柱(20mm×250mm×5μm)，流动相为0.1wt％的TFA水溶液，流速为2.5mL/min，检测波长为220nm；该步骤在，2-巯基乙醇和骨靶向性偶联分子的加入量均为sCT摩尔量的1倍。
实施例5
本实施例中，提供骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法，步骤如下：
(1)制备骨靶向性偶联分子
①合成第一中间体
将二溴马来酰亚胺和N-甲基吗啉按照1:1.1的摩尔比溶解于乙酸乙酯中使二溴马来酰亚胺的浓度为1mg/mL，避光加入氯甲酸甲酯，氯甲酸甲酯的加入量为二溴马来酰亚胺摩尔量的1.1倍，在室温搅拌反应6h，反应结束后旋蒸分离出粗产物，将粗产物溶于二氯甲烷中，用去离子水洗涤三次，然后去掉水相、保留有机相，向有机相中加入干燥剂无水MgSO4除去有机相中的水，然后过滤除去MgSO4，旋转除去二氯甲烷，得到第一中间体3,4-二溴-2,5-二氧代-吡咯-1-羧酸甲酯。
②合成第二中间体和第三中间体
将第一中间体溶解于二氯甲烷中使第一中间体的浓度为20mg/mL，加入三乙胺和甘氨酸叔丁酯在室温反应6h，然后旋蒸除去二氯甲烷，将所得粗产物通过柱层析纯化，柱层析纯化时采用的柱填料为300～400目的硅胶，洗脱溶剂为乙酸乙酯与石油醚的混合液，乙酸乙酯与石油醚的体积比为3:10，将所得洗脱液旋蒸得到第二中间体3,4-二溴-2,5-二氧代-吡咯-1-乙酸叔丁酯。该步骤中，第一中间体与甘氨酸叔丁酯的摩尔比为1:1.1，三乙胺与第一中间体的摩尔比为1:1.5。
将第二中间体溶解于二氯甲烷中使第二中间体的浓度为50mg/mL，然后加入TFA的二氯甲烷溶液，在室温搅拌反应1h，完成第二中间体的叔丁基脱保护，旋蒸除去二氯甲烷，将粗产物通过重结晶纯化，得到第三中间体3,4-二溴-2,5-二氧代-吡咯-1-乙酸。该步骤中，TFA的二氯甲烷溶液的浓度为10wt％，加入量应使TFA与第二中间体的摩尔比为1:1。
③合成骨靶向性偶联分子
将第三中间体、N-甲基吗啉和HoBt加入DMF中进行搅拌，在冰浴、通氩气条件下加入EDCI，持续通氩气0.5h后加入羧基保护的谷氨酸六肽(Glu3肽)，然后在冰浴条件下继续搅拌24h，使第三中间体3,4-二溴-2,5-二氧代-吡咯-1-乙酸与羧基保护的Glu3肽进行酰胺化反应，冷冻干燥除去DMF，再透析、冷冻干燥，得到第四中间体。该步骤中，第三中间体、N-甲基吗啉与HoBt的摩尔比为0.5:1.2:1.8，EDCI的加入量为第三中间体摩尔量的4倍，羧基保护的Asp3肽的加入量为第三中间体的摩尔量的1.5倍。
将第四中间体溶解于二氯甲烷中使第四中间体的浓度为25mg/mL，然后加入TFA的二氯甲烷溶液，在室温搅拌反应1h，完成第四中间体的叔丁基脱保护，旋蒸除去二氯甲烷，将粗产物通过重结晶纯化，得到骨靶向性偶联分子。该步骤中，TFA的二氯甲烷溶液的浓度为10wt％，加入量应使TFA与第四中间体的摩尔比为1:1。
(2)制备骨靶向性鲑鱼降钙素
将sCT溶解于50mmol/L pH＝7的PBS缓冲液中使得sCT的浓度为0.2mmol/L，加入还原剂二硫苏糖醇在室温搅拌1h将sCT的二硫键还原形成自由巯基，再加入骨靶向性偶联分子，在0℃搅拌反应12h，将粗产物分离，采用制备型液相色谱纯化即得骨靶向性鲑鱼降钙素，记作sCT-5，sCT-5的结构式如式(Ⅰ)所示，式(Ⅰ)中，n＝2。
该步骤中，纯化时采用的色谱柱为Shimadzu C-18制备色谱柱(20mm×250mm×5μm)，流动相为0.12wt％的TFA水溶液，流速为2.5mL/min，检测波长为220nm；该步骤在，二硫苏糖醇和骨靶向性偶联分子的加入量均为sCT摩尔量的1.5倍。
实施例6
本实施例中，骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法与实施例1基本相同，不同之处仅在于将步骤(1)③中的Asp6肽替换为Asp9肽，制备得到骨靶向性鲑鱼降钙素，记作sCT-6。
实施例7
本实施例中，骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法与实施例1基本相同，不同之处仅在于将步骤(1)③中的Asp6肽替换为Asp10肽，制备得到骨靶向性鲑鱼降钙素，记作sCT-7。
实施例8
本实施例中，骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法与实施例3基本相同，不同之处仅在于将步骤(1)③中的Glu6肽替换为Glu5肽，制备得到骨靶向性鲑鱼降钙素，记作sCT-8。
实施例9
本实施例中，骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法与实施例3基本相同，不同之处仅在于将步骤(1)③中的Glu6肽替换为Glu10肽，制备得到骨靶向性鲑鱼降钙素，记作sCT-9。
实施例10
本实施例中，使用骨肉瘤MG-63细胞株对本发明的骨靶向性鲑鱼降钙素进行细胞毒性测试，选择实施例1～4制备的sCT-1、sCT-2、sCT-3和sCT-4作为测试样品，采用sCT作为对照样品进行测试。
按照细胞复苏和传代操作程序对骨肉瘤MG-63细胞株进行培养，当细胞生长稳定后进行胰酶消化，细胞计数。将细胞悬液接种在96孔细胞培养板中，细胞密度每孔约5000个(DMEM培养基，含有10％FBS，100U/mL青霉素，和0.1mg/mL链霉素)。将孔板放置在37℃含有5％CO2的孵箱中孵育24h以完全贴壁铺展。随后分别加入与不同浓度的sCT-1、sCT-2、sCT-3、sCT-4溶液和sCT溶液温育48h，然后每孔加入10μL CCK-8，在孵箱中继续孵育2h后测试细胞毒性，结果如图2所示。由图2可知，鲑鱼降钙素与本发明提供的骨靶向性鲑鱼降钙素均没有细胞毒性。
实施例11
本实施例中，采用C57BL/6小鼠进行药物免疫实验，鲑鱼降钙素免疫剂量为50μg/只，溶解于PBS中或者以PBS与弗氏佐剂体积比1:1混合乳化的液中，注射溶液体积为200μL。第一天注射后14天进行二次免疫注射，二次免疫后14天分离血清进行免疫效价评定，结果如图3所示。由图3可知，本发明提供的骨靶向性鲑鱼降钙素的免疫原性均为阴性。
实施例12
本实施例中，采用4～6周龄无胸腺雌裸鼠进行药物分布实验，选择实施例1～4制备的sCT-1、sCT-2、sCT-3和sCT-4作为测试样品，采用sCT作为对照样品进行测试。小鼠在成像前6h开始禁食，通过腹腔注射浓度为0.5mg/mL的荧光标记药物200μL，在注射后0.5h进行解剖，将脏器进行匀浆，进行荧光光度测试，采用曲线积分面积(AUC)与注射药物总量的吸光度AUC进行比值，计算药物在各个脏器分布的所占百分比，结果如图4所示。由图4可知，本发明提供的骨靶向性鲑鱼降钙素在骨组织周围富集的浓度明显提高。
实施例13
本实施例中，采用本发明提供的骨靶向性鲑鱼降钙素对SD大鼠进行降钙素药物治疗，用于骨小梁修复。选择实施例1～4制备的sCT-1、sCT-2、sCT-3和sCT-4作为测试样品，采用sCT作为对照样品。注射量以sCT每日注射20IU/kg剂量等摩尔进行换算，每隔一天注射一次以评价药物长期疗效，注射周期为4周，注射周期结束后，将大鼠断颈处死，立即解剖取出其双侧股骨置于4℃的多聚甲醛溶液中。然后使用Micro-CT断层扫描骨组织样本，结果如图5所示。由图5可知，本发明提供的骨靶向性鲑鱼降钙素用于骨小梁修复后，对造模大鼠的骨小梁均有一定的修复效果。

Claims (10)

1.一种骨靶向性鲑鱼降钙素，其特征在于是将鲑鱼降钙素分子中的二硫键打开并与骨靶向性偶联分子共价偶联形成，该骨靶向性鲑鱼降钙素的结构式如式(Ⅰ)所示，
式(Ⅰ)中， n为2～9中的整数。
2.一种骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)制备骨靶向性偶联分子
①将二取代马来酰亚胺和N-甲基吗啉溶解于乙酸乙酯中，避光加入氯甲酸甲酯，搅拌反应0.5～6h，分离出粗产物，将粗产物溶于二氯甲烷，用水洗涤，分离出有机相，干燥除去有机相中的水，然后除去二氯甲烷，得到第一中间体；
二取代马来酰亚胺与N-甲基吗啉的摩尔比为1:(1～1.5)，氯甲酸甲酯的加入量为二取代马来酰亚胺的摩尔量的1～1.5倍；
②将第一中间体溶解于二氯甲烷中，加入三乙胺和甘氨酸叔丁酯反应0.5～6h，除去二氯甲烷，将所得粗产物通过柱层析纯化，得到第二中间体，对第二中间体进行叔丁基脱保护，得到第三中间体；第一中间体与甘氨酸叔丁酯的摩尔比为1:(1～1.5)，三乙胺与第一中间体的摩尔比为1:(1～3)；
③将第三中间体、N-甲基吗啉和1-羟基苯并三唑加入N,N-二甲基甲酰胺中进行搅拌，在冰浴、通氩气条件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，持续通氩气0.5～2h后加入羧基保护的天冬氨酸寡肽或者羧基保护的谷氨酸寡肽，然后在冰浴条件下继续搅拌反应20～30h，冷冻干燥，透析，冷冻干燥，得到第四中间体，对第四中间体进行叔丁基脱保护即得骨靶向性偶联分子；
第三中间体、N-甲基吗啉与1-羟基苯并三唑的摩尔比为0.5:(1～1.5):(1.5～2)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的加入量为第三中间体摩尔量的3～4倍，羧基保护的天冬氨酸寡肽或者羧基保护的谷氨酸寡肽的加入量为第三中间体的摩尔量的1～1.5倍；
(2)制备骨靶向性鲑鱼降钙素
将鲑鱼降钙素溶解于pH值为5～7的水溶性溶剂中，加入还原剂将鲑鱼降钙素的二硫键还原形成自由巯基，然后加入骨靶向性偶联分子，在0～40℃搅拌反应0.5～12h，将粗产物分离，采用制备型液相色谱纯化，即得骨靶向性鲑鱼降钙素；还原剂和骨靶向性偶联分子的加入量均为鲑鱼降钙素摩尔量的1～1.5倍。
3.根据权利要求2所述骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于，所述天冬氨酸寡肽的氨基酸个数为3～10个，谷氨酸寡肽的氨基酸个数为3～10个。
4.根据权利要求2或3所述骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于，所述二取代马来酰亚胺为二溴马来酰亚胺、二硫苯基马来酰亚胺或二氧苯基马来酰亚胺。
5.根据权利要求2或3所述骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于，所述还原剂为2-巯基乙醇、二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦盐酸盐。
6.根据权利要求2或3所述骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于，步骤(1)①中将二取代马来酰亚胺和N-甲基吗啉溶于乙酸乙酯中使二取代马来酰亚胺的浓度为1～5mg/mL，步骤(1)②中将第一中间体溶解于二氯甲烷中使第一中间体的浓度为20～40mg/mL，步骤(1)③中将第三中间体、N-甲基吗啉和1-羟基苯并三唑加入N,N-二甲基甲酰胺中使第三中间体的浓度为2～10mg/mL。
7.根据权利要求2或3所述骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于，步骤(2)中将鲑鱼降钙素溶解于pH值为5～7的水溶性溶剂中使鲑鱼降钙素的浓度为0.1～0.5mmol/L。
8.根据权利要求2或3所述骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于，所述pH值为5～7的水溶性溶剂为PBS缓冲液。
9.根据权利要求2或3所述骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于，步骤(1)②中采用柱层析纯化粗产物时，采用的柱填料为硅胶，洗脱溶剂为乙酸乙酯与石油醚的混合液，乙酸乙酯与石油醚的体积比为(3～4):10。
10.根据权利要求2或3所述骨靶向性鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于步骤(2)中采用制备型液相色谱纯化粗产物时，采用的色谱柱为C-18制备色谱柱，流动相为0.1wt％～0.15wt％的三氟乙酸水溶液。
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