FI105775B - Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten somatostatiinijohdannaisten valmistamiseksi - Google Patents

Description

105775

Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten somato-statiinijohdannaisten valmistamiseks i ' 5 Keksintö liittyy uusiin yleisen kaavan (I) * r1-x,-nh-ch-co-x2-x3-nh-ch-co-x4-nh-ch-co-x5-nh2 <!:h2 (ch2) „ ch-r3 (i) I I | R2 NH-R, r< 10 mukaisiin hepta- ja oktapeptidiamidijohdannaisiin sekä niiden suoloihin, jossa kaavassa X, merkitsee aromaattista D-aminohappo-tähdettä tai sen johdannaista, joka on rengassubstituoitu halogeenilla 15 tai hydroksyyIillä, tai D-fenyyliglysyyli-, p-hydroksi- fenyyliglysyyli-, o-aminobentsoyyli-, m-aminobentsoyy-li-, D-tetrahydroisokinolyylikarbonyyli-, sarkosyy-lialanyyli-ryhmää tai kaavan -NH-CH-CH2-CO- mukaista ryhmää, jossa 20 CO-A, A, merkitsee primaarista tai sekundaarista aromaattista tai alifaattista aminoryhmää tai alkoksi-, aryylioksi-tai aralkyylioksiryhmää, X2 merkitsee aromaattista aminohappo-tähdettä tai sen 25 johdannaista, joka on rengassubstituoitu halogeeni- tai hydroksyyliryhmällä, tai histidyyliryhmää, ” X3 merkitsee D-tryptofyyli-, o-aminobentsoyyli-, m-amino- bentsoyyli-, aspartyyli-, D-aspartyyli-, fl-aspartyyli-, β-D-aspartyyli-, aminosukkinyyli-ryhmää tai kaavan 30 -NH-CH-CH2-C0- mukaista ryhmää CO-A, jossa tähteellä A, on yllä määritelty merkitys, X4 merkitsee aminohappo-tähdettä, joka sisältää alkyyli- tai aralkyyli-sivuketjun, tai sen johdannaista, joka on 35 substituoitu hydroksyyli- tai metyyli-ryhmällä β-asemas- sa, tai prolyyli- tai β-alanyyli-ryhmää, tai valenssi-sidosta, X5 merkitsee aromaattista aminohappo-tähdettä tai sen joh- 105775 2 dannaista, joka on rengassubstituoitu halogeeni- tai hydroksyyli-ryhmällä, tai treonyyli-ryhmää, R, merkitsee vetyä tai A2-CO-ryhmää, jossa A2 merkitsee vetyä tai CM-alkyyliryhmää, joka on valinnaisesti substi-5 tuoitu halogeenilla, R2 merkitsee vetyä, -S-, -S-asetamidometyyli-, fenyyli- tai p-hydroksifenyyli-ryhmää, R3 merkitsee vetyä tai hydroksyyli-ryhmää, R4 merkitsee fenyyli- tai p-hydroksi fenyyli-ryhmää, tai -s- 10 tai -S-asetamidometyyli-ryhmää silloin, kun R2 merkitsee samaa ryhmää, tai metyyli-ryhmää silloin, kun R3 on hydroksyyli-ryhmä, ja n on 1, 2, 3 tai 4.

I5 Keksintö liittyy myös näitä yhdisteitä sisältäviin farma seuttisiin koostumuksiin.

Etenkin keksintö koskee menetelmää uusien yleisen kaavan (I) mukaisten yndisteiden ja niiden suolojen valmistamiseksi 20 patenttivaatimuksen 1 johdannon mukaisesti.

Näissä kaavoissa käytetyt lyhenteet ovat peptidikemiassa hyväksytyn nimistön mukaisia, joka on julkaistu esim. julkaisussa J. Biol. Chem. 241, 527 (1966). Tämän mukaisesti seli-25 tyksessä esiintyvät lyhennykset ovat seuraavia: - · * X -X-

Phe fenyylialaniini (fenyylialanyyli)

Trp tryptofaani (tryptofyyli) 30 Tyr tyrosiini (tyrosyyli)

Sar sarkosiini (sarkosyyli) 9

Ala alaniini (alanyyli)

His histidiini (histidyyli)

Vai väliini (valyyli) 35 Thr treoniini (treonyyli)

Pro proliini (prolyyli)

Leu leusiini (leusyyli) 3 105775

Cys kysteiini (kysteinyyli)

Phg fenyyliglysiini (fenyyliglysyyli) _ Pop p-hydroksifenyyliglysiini (p-hydroksifenyyliglysyyli)

Aa o-aminobentsoehappo (o-aminobentsoyyli) 5 antraniilihappo (antranilyyli)

Mab m-aminobentsoehappo (m-aminobentsoyyli)

Tie tetrahydroisokinoliini- (tetrahydroisokinolyyli-karboksyylihappo karbonyyli)

Asu aminosukkinimidi (aminosukkinyyli) 10 Ac asetyyli

Boc tertiaarinen butyylioksikarbonyyli

Bop bentsotriatsol-l-yyli-oksi-tris(dimetyyliamino)-fos-fonium-heksafluorifosfaatti tBu tertiaarinen butyyli 15 Bzl bentsyyli DCC disykloheksyylikarbodi-imidi DCU disykloheksyyliurea DIC di-isopropyylikarbodi-imidi DIPEA di-isopropyylietyyliamiini 20 DMF dimetyyliformamidi

Et etyyli

Fmoc (9-fluorenyy1imetyy1i)oks ikarbonyy1i For formyyli HPLC suurtehonestekromatografia 25 Me metyyli ONP p-nitrofenyyli Opcp pentakloorifenyyli Opfp pentafluorifenyyli Ph fenyyli 30 TEA trietyyliamiini TEAA trietyyliammoniumasetaatti TEAP trietyyliammoniumfosfaatti TFA trifluorietikkahappo Tfa trifluoriasetyyli 35 THF tetrahydrofuraani TLC ohutkerroskromatografia Tos tosyyli 4 105775 UV ultravioletti Z bentsyylioksikarbonyyli

Somatostatiini, syklinen tetradekapeptidi (SRIF), joka on 5 kasvuhormononin (GH) erittymisen inhibiittori, on alunperin eristetty hypotalamuksesta (väliaivojen pohjaosasta) [Brazeau et ai.: Science 179, 77 (1973)]. Somatostatiinilla on biologisten vaikutusten hyvin laaja spektri, se osallistuu suureen määrään biologisia prosesseja ja useimmissa tapauksissa sillä 10 on inhibitorisen tekijän merkitys (se estää esim. prolaktii nin, insuliinin, glukagonin, gastriinin, sek-retiinin ja kolekystokiniinin vapautumisen) [S. Reichlin: Somatostatin, N. Eng. J. Med. 309, 1495 ja 1556 (1983)].

15 Eräs somatostatiinin tärkeimmistä vaikutuksista, nimittäin kasvua estävä tekijä, muodostuu sen kyvystä vaikuttaa patologisen solukasvun eri muotoihin. Kirjallisuudesta on hyvin tunnettua, että sillä on inhibitorinen vaikutus syöpäsolujen kasvuun [A. V. Schally: Cancer Rs. 48, 6977 (1988); Taylor et 20 ai.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 153, 81 (1988)]. Samoin somatostatiini kohdistaa antagonisoivan vaikutuksensa syöpä-prosessiin liittyviin kasvutekijöihin. Viimeaikaisilla tutkimuksilla on osoitettu, että somatostatiini ja muutamat soma-tostatiinianalogit pystyvät aktivoimaan tyrosiinifosfataasi— 25 entsyymin, joka antagonisoi tyrosiinikinaasien vaikutusta, joilla on hyvin tärkeä merkitys tuumoritransformaatiossa [A. V. Schally: Cancer Res. 48, 6977 (1988)]. Tyrosiinikinaasien tärkeyttä tukee se seikka, että onkogeenien suurin osa koodaa tyrosiinikinaasia ja kasvutekijäreseptoreiden tärkeimmän osan 30 muodostaa tyrosiinikinaasi [Yarden et ai.: Ann. Rev. Biochem.

57, 443 (1989)].

Natiivisella somatostatiinilla on hyvin lyhyt vaikutuksen kesto in vivo, koska endo- ja eksopeptidaasit inaktivoivat 25 sen nopeasti. Useita uusia analogeja on valmistettu tämän hormonin vaikutuksen keston, biologisen aktiivisuuden ja selektiivisyyden parantamiseksi. Useimmat aktiivisista analo- 5 105775 geista sisältävät renkaan ja peptidiketjun, joka on lyhyempi kuin alkuperäinen. Ensimmäisen syklisen heksapeptidin, jolla , on somatostatiinin kaikki vaikutukset, ovat syntetisoineet

Veber et ai. [Nature 292, 55 (1981)]. Myöhemmin on synte-t 5 tisoitu uudempia ja tehokkaampia syklisiä heksa- ja oktapep- tidejä, joilla on somatostatiinin koko vaikutusspektri [Veber et ai.: Life Sei. 34, 1371 (1984); Murphy et ai.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 132, 922 (1985); Cai et ai.: Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 83, 1896 (1986)].

10 Tämän keksinnön tehtävänä on syntetisoida uusia somatosta-tiinianalogeja, joilla on edullisempi ja/tai selektiivisempi biologinen vaikutus ^verrattuna tunnettujen yhdisteiden vaikutukseen.

15

Keksintö perustuu siihen havaintoon, että somatostatiinin heptapeptidi- ja oktapeptidianalogien vaikutusta voidaan vahvistaa siten, että 1-aseman aminohappo korvataan substi-tuentilla, joka on erittäin hydrofobinen ja jolla on rakenne, 20 joka inhiboi eksopeptidaasien aktiivisuuden. Tähän substituu tioon voidaan liittää 3-aseman aminohapon korvaaminen erilaisilla aromaattisilla aminohapoilla tai 4-aseman aminohapon korvaaminen aromaattisella D-aminohapolla, aromaattisella aminokarboksyylihapolla, aminosukkinimidillä tai B-aspartyy-25 li-ryhmällä, joka on substituoitu a-karboksyyliryhmässään, tai 6-aseman aminohapon korvaaminen aminohapolla, jossa on alkyyli- tai aralkyyli-sivuketju, tai sen substituoiduilla johdannaisilla tai proliinilla tai β-alaniinilla, tai 6-aseman aminohapon poisjättäminen, tai 8-aseman aminohapon kor-30 vaaminen aromaattisella aminohapolla tai sen rengassubstitu- oidulla johdannaisella tai treoniinilla.

Keksintö perustuu edelleen siihen havaintoon, että käytettäessä antranilyyli-, [ks. kaava (III)] 5 6 105775

AC-SAR-*ALA-TYR-TYR-NH

Ύο) (ΐιΐ) a2n-^- TRP-PHE-VAL-LYS-OC*^^^ m-aminobentsoyyli- [ks. kaava (IV)] H-D-PHE -^TYR-TYR-HN—

Jo] <IV> H2N-TRP*- PHE-VAL-LYS-OC^^^"^ 10 tai aminosukkinyyli- [ks. kaava (V)]

H-D-PHE s/TYR-TYR-HN-CH

/\ 0=c ch2 (V) h2n-thr <-phe-val-lys-n-co 15 substituutiota yhdistettä ei tarvitse syklisoida, koska nämä korvaukset inhiboivat joissakin tapauksissa määrätyn peptidin vapaan steerisen kiertymisen (US-patenttijulkaisu n:o 4,758,552; unkarilainen patenttijulkaisu n:o 194,280); 20 muutoin kiertyminen estetään myös syklisoidulla muodolla [ks. kaava (II)].

H-D-PHE -?CYS-TYR-D-TRP

I \ (II)

25 H2N-THR«-CYS-VAL*-LYS

Keksinnön mukaiset uudet yleisen kaavan (I) mukaiset hepta-peptidi- ja oktapeptidiamidit, jossa kaavassa tähteillä Xlf X2, X3, X4, Xs, RIf R2, R3, R4 ja symbolilla n on yllä määri-30 tellyt merkitykset, samoin kuin niiden happoadditiosuolat valmistetaan kiinteäfaasi-peptidisynteesimenetelmän avulla kondensoimalla asteittain suojatut aminohapot kiinteälle hartsikantoaineelle karbodi-imidin tai aktivoidun esterin kytkennän avulla vastaavassa järjestyksessä, poistamalla 35 sitten lopputuote kiinteästä kantoaineesta lohkaisemalla happamasti tai alkalisesti, poistamalla suojaryhmät aminohapoista samanaikaisesti, kun lohkaistaan hartsista, tai sitä ... ! 7 105775

•I

ennen tai sen jälkeen, ja haluttaessa muunnetaan näin saatu yleisen kaavan (I) mukainen hepta- tai oktapeptidiamidi happo-additiosuolaksi saattamalla se reagoimaan farmaseuttisesti hy- vaksyttävän hapon kanssa tai haluttaessa vapautetaan vapaa emäs 5 saadusta happoadditiosuolasta saattamalla se reagoimaan alkalin ' kanssa. Keksinnön mukaiselle menetelmälle onkin tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään edullisesti kiinteänä kantoaineena bentshydryyliamiinihartsia tai kloori-10 metyloitua polystyreenihartsia. Suojaryhmiä sisältävä loppu tuote voidaan lohkaista edullisesti hartsista käyttämällä fluorivetyä ja/tai ammonolyysiä.

Seuraavassa kuvataan edelleen farmaseuttisia koostumuksia, 15 jotka sisältävät aktiivisena aineosana yleisen kaavan (I) mukaista yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää happoadditiosuolaa yhdessä farmaseuttisella alalla yleisesti käytettyjen kantoaineiden ja/tai lisäaineiden kanssa. Nämä koostumukset valmistetaan käyttämällä sinänsä tunnettuja 20 menetelmiä.

Keksinnön mukaan valmistettavat yhdisteet voidaan käyttää menetelmässä tuumorisairauden hoitamiseksi ja tyrosiini-kinaasiaktiivisuuden inhiboimiseksi. Tässä menetelmässä 25 potilaalle annetaan terapeuttisesti vaikuttava määrä yleisen ” kaavan (I) mukaista aktiivista aineosaa tai sen farmaseutti sesti hyväksyttävää happoadditiosuolaa.

Yleisen kaavan (I) mukaisten somatostatiini-johdannaisten on 30 todettu olevan aktiivisia annostusalueella 0,01 - 50 hiiressä ja vastaavasti 0,5 - 2000 mg/kg ihmisessä.

Keksinnön pääedut ovat seuraavat: 35 a) Keksinnön mukaisia uusia somatostatiini-johdannaisia voi daan käyttää tuumorikasvun tai tuumoritransformaatiossa tärkeän merkityksen omaavien tyrosiinikinaasi-entsyymien aktii- 105775 8 visuuden inhiboimiseksi.

b) Keksinnön mukaisia uusia aminohappoyhdistelmiä voidaan käyttää myös kasvuhormonin (GH), insuliinin, glukagonin ja 5 prolaktiinin vapautumisen säätämiseen ja/tai tuumorikasvun inhibointiin.

c) Analogeista, jotka sisältävät aminosukkinyyli-, o- ja m-aminobentsoyyli-substituentin, sellaisilla, jotka eivät si- 10 säilä disulfidi-siltaa, ei ole mitään inhibitorista vaiku tusta GH:n vapautumiseen, mutta ne inhiboivat tuumorisolujen kasvun.

d) Tämän keksinnön mukaisia uusia somatostatiini-johdannai- 15 siä voidaan käyttää patologisten prosessien, kuten ihosolu- jen patologisen proliferaation esiintuoman psoriaasin inhiboimiseksi.

e) o- ja m-aminobentsoyyli-substituenteista puuttuu asymmet- 20 riakeskus ja siten ei tapahdu mitään rasemisoitumista niiden synteesin aikana. Siten lopputuotteen valmistus on helpompaa ja halvempaa.

f) o- ja m-aminobentsoehapon valmistuskustannukset ovat pal- 25 jon alhaisemmat kuin D-aminohappojen, joilla on samanlainen merkitys tähän asti tunnetuissa somatostatiinianalogeissa.

Keksintöä selitetään lähemmin seuraavien ei-rajoittavien esimerkkien avulla.

30

Esimerkeissä yhdisteet valmistetaan menetelmillä, joita käytetään yleisesti kiinteän faasin peptidisynteesissä (Stewart et ai.: Solid Phase Peptide Synthesis, 2. painos, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, 1984). Yksittäiset 35 aminohapot sidotaan asteittain niiden Boc- tai Fmoc-johdan naisten muodossa bentshydryyliamiini- tai kloorimetyloituun polystyreenihartsiin symmetrisen anhydridin tai aktiivisen 9 105775 esterin kytkennän avulla tai DCC-, DIC- tai BOP-reagenssien avulla.

Reaktion etenemistä valvotaan ninhydriini-testillä [E. Kai-5 ser et ai.: Anal. Biochem. 34, 595 (1970)]. Asylointi tois- 9 tetaan silloin, kun havaitaan vapaa amino-ryhmä. Kytkentään tarvittava aika vaihtelee aminohappojen mukaan ja se on 1 -16 tuntia.

10 Sekä suojaryhmien poisto että peptidin lohkaisu hartsista suoritetaan edullisesti yhdessä ainoassa vaiheessa käyttämällä vedetöntä nestemäistä fluorivetyä [S. Sakakibara et ai.: Bull. Chem. Soc. Japan 40, 2164 (1967)].

15 Haluttaessa HF-lohkaisun avulla saatu raakatuote syklisoi- daan.

Raakatuote puhdistetaan käyttämällä Sephadex-kromatografiaa ja/tai preparatiivista HPLC-menetelmää. Lopputuotteen puh-20 taus tutkitaan TLC:llä, analyyttisellä HPLC:llä ja aminohap- poanalyysillä. TLC:n Rf-arvot määritetään Kieselgel-levyillä (DC Alufolien, Merck) käyttämällä seuraavia liuotinseoksia: 1. etyyliasetaatti/pyridiini/etikkahappo/vesi 30:20:6:11 25 2. etyyliasetaatti/pyridiini/etikkahappo/vesi 60:20:6:11 3. butanoli/pyridiini/etikkahappo/vesi 60:20:6:11 4. n-butanoli/etikkahappo/vesi 4:1:2 5. n-butanoli/etikkahappo/vesi/etyyliasetaatti 1:1:1:1 6. n-butanoli/etikkahappo/vesi 4:1:1 30 7. isopropanoli/l moolinen etikkahappo 2:1 8. etyyliasetaatti/pyridiini/etikkahappo/vesi 5:5:1:3

Esimerkki 1 ' β-aspartyyli-(indolinyyli)-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr- 35 NH2:n (mp. : 1076) valmistus 0,47 g (0,25 mmoolia) bentshydryyliamiinihydrokloridi-hart- > 105775 10 siä (0,54 milliekvivalenttia/g) turvotetaan metyleeniklori-dissa (CH2C12) 90 minuutin ajan, sitten seuraava jakso toistetaan jokaisen aminohapoilla suoritetun asyloinnin jälkeen: 5 Vaihe Reagenssit, toimenpide Sekoitusaika (min.) 1 CH2C12; 3 pesua 1 2 seos, joka sisältää 33 % TFA:ta, 5 % 10 anisolia ja 62 % CH2Cl2:ta; lohkaisu 1 3 seos, joka sisältää 33 % TFArta, 5 % anisolia ja 62 % CH2Cl2:ta; lohkaisu 1 4 CH2C12; 3 pesua 1 5 etanoli; 2 pesua 1 15 6 CH2C12; 3 pesua 1 7 seos, joka sisältää 10 % TEA:ta ja 90 % CH2Cl2:ta; 2 pesua 2 8 CH2C12; 3 pesua 2 9 etanoli; 2 pesua 1 20 10 CH2C12; 3 pesua 1 11 3 ekvivalenttia BOC-aminohappoa, joka on liuotettu CH2Cl2:n ja DMF:n seokseen, sekä 3 ekvivalenttia DCC:tä tai DIC:tä, joka on liuotettu CH2Cl2:een; kytkentä 60 min. - 25 16 h 12 CH2C12; 3 pesua 1 13 etanoli; 2 pesua 1 30 Jokaisen vaiheen jälkeen suoritetaan ninhydriini-testi. Kun tulos on positiivinen, jakso toistetaan 6. vaiheesta alkaen.

0,25 mmoolia B-Asp(indolinyyli)-Cys(4-Me-Bzl)-Tyr(2-Br-Z)-D-Trp-Lys(Z)-Val-Cys(4-Me-Bz1)-Thr(Bz1)-peptidihartsia sus-35 pendoidaan 3 ml:aan anisolia, jossa on 10 seka-% p-kresolia, ja seoksen päälle kondensoidaan 30 ml HF-kaasua. Sekoitetaan 0 °C:ssa 45 minuutin ajan ja sitten HF poistetaan, jäännös 11 105775 suspendoidaan 200 ml:aan etyyliasetaattia, sekoitetaan 15 minuutin ajan ja kaadetaan sitten 250 ml:aan etyyliasetaattia. Suodattamisen jälkeen sakka suodatetaan, pestään etyyliasetaatilla, sitten peptidi liuotetaan sakasta suodattamal-5 la käyttämällä 500 ml 95 %:sta kaasuvapaata etikkahappoa.

Sitten etikkahappoliuokseen lisätään tipoittain 9,0 ml 0,03 M jodi/metanoli-liuosta, kunnes liuos muuttuu oranssinkeltaiseksi. Tämän jälkeen liuosta sekoitetaan tunnin ajan. Liuokseen lisätään varovasti sinkkijauhetta, kunnes keltainen väri 10 häviää, sitten sinkkijauhe suodatetaan ja liuos haihdutetaan.

Kiinteä jäännös liuotetaan 6 ml:aan 50 %:sta etikkahappoa ja puhdistetaan Sephadex G-25-pylväällä. Eluoinnin jälkeen käytetään UV-absorptiota, joka mitataan 280 nm:ssä, ja TLC:tä. Aiotun tuotteen sisältävät fraktiot kerätään, haihdu-15 tetaan ja puhdistetaan edelleen gradienttieluoinnin avulla preparatiivisessa HPLC-järjestelmässä (pylväs: Whatman Par-tisil 10 ODS-3 22 x 250 mm; eluentti A: 0,25 N TEAP, pH 2,24; eluentti B: 80 % metanolia ja 20 % A:ta). Puhtaasta tuotteesta poistetaan suola gradienttieluoinnin avulla käyttämällä 2 0 0,02 M NH4OAc:tä, pH 5 (eluentti A) sekä 70 % metanolia ja 30 % eluenttia A (eluentti B), jolloin saadaan 120 mg (43 %) lopputuotetta. Tämän yhdisteen fysikaaliset ominaisuudet on esitetty taulukossa I, biologiset vaikutukset on esitetty taulukoissa II, III, IV ja V.

25

Esimerkki 2 D-Phg-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2:n (mp.: 1034) valmistus 30 Aiottu peptidi syntetisoidaan esimerkissä 1 esitetyllä taval la lähtemällä 0,5 g:sta (0,27 mmoolia) bentshydryyliamiini-hydrokloridi-hartsia (0,54 milliekvivalenttia/g), lohkaistaan hartsista, syklisoidaan ja puhdistetaan käyttämällä Sephadex-kromatografiaa. HPLC-puhdistuksessa käytetyt liuottimet ovat 35 seuraavat: A: 0,1 % TEAA:ta, pH 4,2; B: 80 % metanolia ja 20 % A:ta. Tuotteesta poistetaan suola lyofilisoimalla useita kertoja. Tällä tavalla saadaan 54 mg (19,4 %) aiottua pepti- 105775 12 diä. Tämän yhdisteen fysikaaliset ominaisuudet on esitetty taulukossa I, biologiset vaikutukset on esitetty taulukoissa II, III ja IV.

5 Esimerkki 3 D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys-Thr-NH2:n (mp.: 947) valmistus Lähtemällä 0,47 g:sta (0,25 mmoolia) bentshydryyliamiinihyd-rokloridi-hartsia (0,54 milliekvivalenttia/g) peptidi synte-10 tisoidaan, syklisoidaan ja puhdistetaan esimerkissä 1 esite tyllä tavalla, jolloin saadaan 80,5 mg (34 %) lopputuotetta. Fysikaaliset ominaisuudet on esitetty taulukossa I, biologiset vaikutukset on esitetty taulukoissa II ja III.

15 Esimerkki 4 D-Phe-C^s-Tyr-D-Trp-Lys-Leu-C^s-Thr-NH2:n (mp.: 1060) valmistus Lähtemällä 0,47 g:sta (0,25 mmoolia) bentshydryyliamiinihyd-20 rokloridi-hartsia (0,54 milliekvivalenttia/g) aiottu peptidi syntetisoidaan, syklisoidaan ja puhdistetaan esimerkissä l esitetyllä tavalla, jolloin saadaan 106 mg (40 %) lopputuotetta. Tämän yhdisteen fysikaaliset ominaisuudet on esitetty taulukossa I, biologisten analyysien tulokset on esi-25 tetty taulukoissa II, III, IV ja V.

Esimerkki 5 D-Phe-Ojrs-Tyr-B-Asp(indolinyyli) -Lys-Leu-C^s-Thr-NH2:n (mp.: 1076) valmistus 30 Lähtemällä 0,47 g:sta (0,25 mmoolia) bentshydryyliamiinihyd-rokloridi-hartsia aiottu peptidi syntetisoidaan, syklisoidaan ja puhdistetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla, jolloin saadaan 94 mg (35,5 %) lopputuotetta. Tämän yhdisteen fysi-35 kaaliset ominaisuudet on esitetty taulukossa I, biologisten analyysien tulokset on esitetty taulukoissa II, III, IV ja V.

13 105775

Esimerkki 6 D-Phe-Tyr-Tyr-Aa-Lys-Val-Phe-Trp-NH2:n (mp.: 1192) valmistus Lähtemällä 0,47 g:sta (0,25 mmoolia) bentshydryyliamiinihyd-, 5 rokloridi-hartsia peptidi syntetisoidaan esimerkissä l esite tyllä tavalla. Viimeisen vaiheen jälkeen saatu D-Phe-Tyr-(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Aa-Lys(2-C1-Z)-Val-Phe-Trp-peptidihartsi suspendoidaan 3 ml:aan anisolia, sitten konden'soidaan 30 ml kaasumaista HF:ää seoksen päälle, jota sekoitetaan sitten 10 0 eC:ssa 45 minuutin ajan. Kaasumaisen HF:n poistamisen jäl keen jäännös suspendoidaan 200 ml:aan abs. eetteriä, sitä sekoitetaan 15 minuutin ajan ja suodattamisen jälkeen sakka pestään eetterillä. Tämän jälkeen peptidi liuotetaan sakasta 50 %:sella etikkahapolla, liuos haihdutetaan ja näin saatu 15 D-Phe-Tyr-Tyr-Aa-Lys-Val-Phe-Trp-NH2-oktapeptidiamidi puhdis tetaan preparatiivisella HPLC:llä. Eluentti A: 0,25 N TEAP, pH 2,25; eluentti B: seos, jossa on 70 % asetonitriiliä ja 30 % eluenttia A. Erotetaan esimerkissä 1 mainitulla pylväällä käyttämällä seosta, joka sisältää 30 % eluenttia B ja 70 % 20 eluenttia A. Puhtaasta tuotteesta poistetaan suola esimerkis sä 1 esitetyllä tavalla, jolloin saadaan 89 mg (30 %) lopputuotetta. Tämän yhdisteen fysikaaliset ominaisuudet on esitetty taulukossa I, biologiset vaikutukset on esitetty taulukoissa II ja III.

25

Esimerkki 7

Ac-Sar-Ala-Tyr-Tyr-Aa-Lys-Val-Phe-Trp-NH2:n (mp.: 1217) valmistus 30 Aiottu peptidi valmistetaan käyttämällä esimerkin 6 menetel- . : mää sillä erotuksella, että Ac-Sar-ryhmä kytketään peptidi- hartsiin viimeisessä jaksossa. Tuotteen lohkaisu hartsista ja ; puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 6 esitetyllä taval la, jolloin saadaan 85 mg (28 %) lopputuotetta. Yhdisteen 35 fysikaaliset ominaisuudet on esitetty taulukossa I ja sen biologiset vaikutukset on esitetty taulukoissa II, III ja IV.

14 105775

Esimerkki 8

Pop-Tyr-Tyr-Aa-Lys-Val-Phe-Trp-NH2:n (mp.: 1194) valmistus Tämä peptidi syntetisoidaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla 5 sillä erotuksella, että 11. vaiheessa Bop-reagenssia käyte tään aminohappoa vastaava määrä aktivointiaineena aminohapon kytkemiseksi DIPEA:n ylimäärän läsnäollessa. Lohkaisu suoritetaan HF:llä ja puhdistus kromatografialla, jolloin lopputuotetta saadaan esimerkissä 6 esitetyllä tavalla 105 mg 10 (35 %). Yhdisteen fysikaaliset ominaisuudet on esitetty taulukossa I.

Esimerkki 9

Aa-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Trp-NH2:n (mp.: 1283) 15 valmistus 0,47 g (0,25 mmoolia) bentshydryyliamiinihydrokloridi-hartsia turvotetaan metyleenikloridissa 90 minuutin ajan, minkä jälkeen seuraava jakso suoritetaan jokaisen sopivasti suojat-20 tujen aminohappojen Fmoc-johdannaisilla suoritetun asyloinnin jälkeen:

Vaihe Reagenssit, toimenpide Sekoitus- aika (min.) 25 ______ : 1 DMF; 3 pesua 2 2 seos, joka sisältää 20 % piperidiiniä ja 80 % DMFrää; lohkaisu 2 3 seos, joka sisältää 20 % piperidiiniä 20 ja 80 % DMF:ää, lohkaisu 10 ---. 4 DMF; 5 pesua 2 5 symmetrinen anhydridi+, joka on valmis tettu 3 ekvivalentista Fmoc-aminohappoa tai Opfp-esteriä; kytkentä 60 35 6 DMF; 3 pesua 2 . + = symmetrisen anhydridin valmistus: 3 ekvivalenttia Fmoc- I · 15 105775 aminohappoa liuotetaan seokseen, jossa on CH2Cl2:ta ja DMF:ää. Lisätään 1,5 ekvivalenttia DCC:tä ja sitten seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 15 minuutin ajan. DCU-sakka suodatetaan pois, liuos haihdutetaan ja jäännöstä, joka on liuo-5 tettu DMF:ään, käytetään kytkentään.

Jokaisen vaiheen jälkeen suoritetaan ninhydriini-testi. Kun saadaan positiivinen tulos, jakso toistetaan 5. vaiheesta alkaen.

10

Viimeisen vaiheen jälkeen saatu Aa-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Trp-peptidi-hartsi käsitellään HF:llä, puhdistetaan ja sitten siitä poistetaan suola esimerkissä 6 esitetyllä tavalla, jolloin saadaan 147 mg (46 %) loppu-15 tuotetta. Yhdisteen fysikaaliset ominaisuudet on esitetty taulukossa I.

Esimerkit 10 - 15 20 Seuraavan kaavan mukaiset yhdisteet valmistetaan käyttämällä esimerkeissä 1-5 esitettyä menetelmää.

A-Cys-B-D-Trp-C-E-Cys-Thr-NH2 25 Esim. A B C E Koodi-n:o • 10 β-Asp(NH-Ph) Tyr “ Lys Vai TT 2-22 11 Tie Tyr Lys Vai MI 1811 30 12 D-Phe His Lys Vai MK 1-42 13 D-Phe Tyr Lys(Tfa) Vai TH 363 14 D-Phe Tyr Lys α-Ala TT 2-18 ’ ·. 15 D-Phe Tyr Lys Pro TT 2-28 35 *

Yllä esitettyjen yhdisteiden fysikaaliset ominaisuudet on esitetty taulukossa I ja biologisten analyysien tulokset on esitetty taulukoissa II, III ja IV.

l6 105775

Esimerkit 16 ia 17

Seuraavan kaavan mukaiset yhdisteet valmistetaan esimerkissä 6 esitetyllä tavalla: 5 A-B-Tyr-Aa-Lys-Val-Phe-Trp-NH2

Esim. A B Koodi-n:o 10 16 Ac-Sar Tyr AH32/2 17 D-Phe Ala AH52

Yllä esitettyjen yhdisteiden fysikaaliset ominaisuudet on 15 esitetty taulukossa I, biologisten analyysien tulokset on esitetty taulukossa II.

Esimerkit 18 ~ia 19 20 Seuraavat yhdisteet valmistetaan käyttämällä esimerkissä 1 esitettyä menetelmää: A-Cys-Tyr-Aa-Lys-Val-Cys-Trp-NH2 25 Esimerkissä 18 "A” merkitsee D-Phe-ryhmää, esimerkissä 19 D- 2-naftyyli-alanyyli-ryhmää. Yhdisteiden fysikaaliset arvot on esitetty taulukossa I/A.

Esimerkki 20 30 . Seuraava yhdiste valmistetaan käyttämällä esimerkissä 1 esi tettyä menetelmää:

Aa-Cys -Tyr-D-Trp-Ly s -Va 1 -C}rs-Trp-NH2 35

Yhdisteen fysikaaliset arvot on esitetty taulukossa I/A.

17 105775

Esin^rKkj Z1 D-Phe-C^s-Tyr-Äsu-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 / 5 Yhdiste valmistetaan käyttämällä esimerkissä 1 esitettyä menetelmää sillä erotuksella, että Lys-tähteen kytkennän jälkeen neutraloidaan 5 %:sella di-isopropyyli-etyyliamiinil-la dikloorimetaanissa TEA:n sijasta. Asp:n sivuketjusuojaryh-mä (fluorenyylimetyyliesteri) poistetaan suojatusta peptidi-10 hartsista sekoittamalla sitä 2 x 20 minuutin ajan DMF:n ja piperidiinin 1:1-seoksessa. Asp-fi-pentafluorifenyyliesteri muodostetaan sekoittamalla peptidihartsin suspensiota 30 minuutin ajan DMF:ssä pentafluorifenolin ylimäärän ja di-iso-propyylikarbodi-imidin kanssa. Peptidihartsi suodatetaan ja 15 pestään DMF:llä. Aspartimidi-johdannainen muodostetaan penta- fluorifenyyliesteri-johdannaisesta sekoittamalla peptidihart-sia DMF:ssä. Aspartimidi-renkaan muodostamisen jälkeen mitataan vapautunut pentafluorifenoli. Suodatetun reaktioseoksen pienen määrän UV-absorptio mitataan 278 nm:ssä käyttämällä 20 kontrollina DMF:ää. Jäljelle jääneiden suojaryhmien lohkaisu, peptidin lohkaisu hartsista, disulfidi-sillan muodostaminen ja raakatuotteen puhdistus suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla.

25 Yhdisteen fysikaaliset arvot on esitetty taulukossa I/A.

Keksinnön mukaisten yhdisteiden biologisia vaikutuksia tukevat seuraavassa selitetyt testit.

30 Kasvutekijän (GH1 analyysi » · GH:n vapautuminen tai vastaavasti inhibiitio mitattiin rotan . hypofyysissä (aivolisäkkeessä) käyttämällä superfuusio- menetelmää [Vigh et ai.: Peptides 5, 241 (1984)]. Kontrollina 35 pidettiin GH-määrää, joka vapautui GH-ta vapauttavan hormonin (GHRH) toimesta, jota annettiin samana annoksena kuin näytettä. Somatostatiinianalogin aktiivisuus ilmaistiin GHRH:n 105775 18 vapauttaman GH-määrän vähenemisen tai vastaavasti lisääntymisen prosentteina (taulukko II).

Soluiakautuman inhibiition analyysi 5 (3H]-tymidiinin yhdistäminen erilaista alkuperää oleviin tuumorisoluihin ja solumäärän mittaus suoritettiin menetelmän mukaisesti, jonka ovat esittäneet K6ri et ai. [Tumor Biology 9, 315 (1988)]. Analogien biologinen aktiivisuus ilmaistiin 10 leimatun tymidiinin yhtymisen inhibiition tai kontrollina käytettyjen käsittelemättömien solujen määrän kasvun prosentteina (taulukko III).

Tvrosiinikinaasiaktiivisuuden mittaus 15

Tyrosiinikinaasiaktiivisuus määritettiin samoin menetelmän mukaisesti, jonka ovat esittäneet Kiri et ai. [Tumor Biology 9, 315 (1988)]. Analogien aktiivisuus karakterisoitiin niiden inhibitorisen vaikutuksen perusteella verrattuna 32P-isotoo-20 pin yhtymiseen kontrollina käytettyhin käsittelemättömiin soluihin (taulukko IV).

Yhdisteiden tehokkuuden tutkimus tuumorikasvuun metastaasi-mallissa 25

Yhdisteiden antimetastaattista vaikutusta tutkittiin Lewis-keuhkotuumori- (LLT) soluissa lihas-keuhko- ja perna-maksa-metastaasimallissa sekä niiden immunoresistentissä solumuun-nelmassa (LLT-HH). Nämä tutkimukset suoritettiin umpisiite-30 tyillä, koiras- ja naaraspuolisilla C57Bl-hiirillä. LLT

: siirrettiin lihakseen lihas-keuhko-metastaasimallin kehittä miseksi, kun taas tuumorisolujen suspensiota ruiskutettiin pernaan perna-maksa-metastaasin muodostamiseksi. Testattavia yhdisteitä annettiin intraperitoneaalisesti (i.p.), intrave-35 noosisesti (i.v.), oraalisesti (p.o.) tai subkutaanisesti (s.c.) 0,1 - 10 mg:n/kg annoksina päivittäin 1-3 kertaa 5.

- 13. päivänä. Terapeuttinen vaikutus arvioitiin metastaasien 19 105775 määrän perusteella siten, että näyte otettiin pernamaksa-mal-lissa 10. ja 14. päivän välillä, lihas-keuhko-mallissa 17. ja 18. päivän välillä, ja makroskooppiset metastaasit maksassa ja keuhkoissa vastaavasti. Yhdisteiden tehokkuus ilmaistiin 5 kontrollieläimissä määritettyjen metastaasien määrän prosent- j teinä (taulukko V).

20 105775

Il

Il 11

Il OO O O Ή O II

oo li oo Ό σ> co on il (JJ n » » ·* ·> *· Il

k II O O O O O II

11 !! 11

Il 11

jjf-)i-tn>-ivo o o vo n o o II

r-» il co oo r» oo ή r» co »-t σν co r» (I

<4^ H «.·.»*· · » Il

06 II O O O O O O O O O O O II

<i !!

* !! S

Q> Il vOCOVOr-linONOOO lO-iCOnvOr^O II

Ό vo il ιηιηηΛιηνΟΌ.Ά'ί ιηΗΡ'ττηιηνοιι 3 Ί-ιΙΙ «»»»»····*" n 3 OillOOOOOOOOO o O O O O O O jl ’ii !! 11 2 li 11

C II n O O s· O II

•g in H eo r» co oo oo II

C(i||i ·«»».» » Il

o OJ II OOOO O II

4* Il S

OJ II

j n in m »m on h es <-n vo m co «-t II

j <r li in in ^ m ifl r* in n r- <* s· Il (O Il *i ·» #* * »* •»pv^pkrkr. jl

2 oi O O O O O O O O O O O II

3 il II

C; Il jj

“ ϋ h n vo xr TT in vo 4* CO CD II

,, nnvovo vo vo vo m n» m -«r w *“> ^ <M||«V» * *N *·»·*·►·» Il oc «noo oo O O O O O O jl λ: v j! i! a: ό n

3 Tj H ov O' <NOV ΡίΟΜΙ'ΠΗΝίη II

-HO) CvJ II H H IN H CSCMCMOVOOHCS

{*. jj * * *» •.»»•»•‘•λ·'·'·' Il

3 tn KIIOO OO OOOOOOOO II

*H II II

s s »

«jj II

>1 π oi n in in h m m m in o ρ> r·» Il o h n vo vo m vo Ό vo vo co vo n n H « C ij I « > · « · *·'·'·>**''· 11« 5 ailooooo O o o o o o o n rt •H II II Λ* > n m (0 u x

• -P ^ Il es II

m OH N Ό s· - vo CO s· jj £ w *. jj m M *» ► »v ·. Il +*

Qllmncommcns· r- ^ ° jj ® 2 .— M ntTiOis-vor-tn ·<τ i(i h vo m vo c g e II I I I I I I I 1 I I I I I jj g

rH W jj II C

3 II " > ~ ί! jj ^ 5 ? !! » - 2 —' I! O CM O jj - : -«Λ S H S n - 3 W III 11 6 II vo co co ^ , Il in VO n * S3 ^ H H !! S * !! 11 •h a> n u w E ti ^ ^ m -jrtj^^iiovor^coo'OfHiscos'invop' Il *

Φ oj rHfMn^lflvon·™ HiHHi—IHt-NrHr-l II

« M Jj II * 21 105775

Taulukko I/A

Yhdisteiden 18-21 fysikaaliset arvot Esim.

j 5 n: o [a]Do+ R/ R? R,3 R/ r/ Rf 18 0,61 0,38 19 0,09 0,74 0,49 20 0,88 0,79 10 21 -31,2 0,13 0,51 0,41 +: c * 0,5 (0,1 %:nen etikkahappo)

Taulukko II 15 GHRHrn aikaansaaman GH:n vapautumisen muutos keksinnön mukaisten analogien vaikutuksessa

Koodi-n:o Esimerkki GH:n vapautumisen muutos 20 _. _ TT 2-48 1 -100 TT 2-20 2 -93 TT 2-32 3 0 TT 2-50 4 -100 25 MK 1-43 5 +290 AH 31 6 +26 AH 25 7 -20 MI 1811 11 -85 MK 1-42 12 -100 30 TT 2-18 14 -10 TT 2-28 15 0 AH 32/2 16 +9 ' : 35 • —— 22 105775

Taulukko III

Solujakautuman inhibiition analyysi erilaisissa tuumoriso-luissa 5

Koodi-n:o Esimerkki Solulinja+ Annos Inhibiitio (Mg) (%) 10 HT 29 1 36 TT 2-48 1 HT 29 10 44 MCF 7 10 46 TT 2-20 2 HT 29 20 27 15 MCF 7 20 45 HT 29 20 75 TT 2-32 3 DU 145 10 68 PC 3 10 45 20 HT 29 1 57 HT 29 10 50 TT 2-50 4 MCF 7 10 31 DU 145 10 36 25 MK 1-43 5 SW 620 10 68 AH 31 6 MCF 7 40 48 30 AH 25 7 HT 29 10 28 MCF 7 20 24 MI 1811 11 MCF 7 10 21 35 MK 1-42 12 MCF 7 10 38 MCF 7 20 44 TH 363 13 MCF 7 10 13 MCF 7 20 19 40 TT 2-18 14 MCF 7 20 45 HT 29 20 13 45 + HT29 = tuumorisolulinja ihmisen paksusuolesta ·· MCF 7 » tuumorisolulinja ihmisen rinnasta DU 145 = tuumorisolulinja ihmisen eturauhasesta PC 3 = tuumorisolulinja ihmisen eturauhasesta SW 620 = tuumorisolulinja ihmisen paksusuolesta

- I

Taulukko IV

23 105775

Tyrosiinikinaasiaktiivisuuden analyysi 5 Koodi-n:o Esimerkki Solulinja+ Annos Inhibiitio • (M9) (%) TT 2-48 1 HT 29 10 44 10 TT 2-20 2 HT 29 1 35 HT 29 10 22 TT 2-32 "3' SW 620 1 84 15 SW 620 10 70 TT 2-50 4 HT 29 10 50 HT 29 30 90 20 MK 1-43 5 HT 29 10 30 HT 29 30 45 AH 25 7 HT 29 10 17 HT 29 30 23 25 _____ + = HT 29: tuumorisolulinja ihmisen paksusuolesta SW 620: tuumorisolulinja ihmisen paksusuolesta .· 30

Taulukko V

Vaikutus tuumorikasvuun metastaasimallissa 35 Koodi-n:o Esimerkki Metastaasien määrä (%) suhteessa kontrolliin (100 %) m _ « _________ __ _ TT 2-48 1 43 * 40 TT 2-50 4 35 MK 1-43 5 25 TH 363 13 51

Claims (9)

1. 24 1 0 5 7 7 5
2. 1. Menetelmä uusien yleisen kaavan (I) 5 R,-X,-NH-CH-CO-X2-X3-NH-CH-CO-X4-NH-CH-CO-X5-NH2 yH2 (CH2)„ CH-R3 (I) R2 nh-r, 10 mukaisten, terapeuttisesti käyttökelpoisten hepta- ja oktapeptidiamidijohdannaisten ja niiden happoadditio-suolojen valmistamiseksi, jossa kaavassa x3 merkitsee aromaattista D-aminohappotähdettä tai sen 15 johdannaista, joka on rengassubstituoitu halogeenilla tai hydroksyylillä, tai D-fenyyliglysyyli-, p-hyd-roksifenyyliglysyyli-, o-aminobentsoyyli-, m-amino-bentsoyyli-, D-tetrahydroisokinolyylikarbonyyli-, 20 sarkosyylialanyyliryhmää tai kaavan -NH-CH-CH2-CO- mukaista ryhmää, jossa CO-Aj Ai merkitsee primääristä tai sekundaarista aromaattista tai alifaattista aminoryhmää tai 25 alkoksi-, aryylioksi-,tai aralkyylioksiryhmää, X2 merkitsee aromaattista aminohappo-tähdettä tai sen johdannaista, joka on rengassubstituoitu halogeeni-tai hydroksyyliryhmällä, tai histidyyliryhmää, » X3 merkitsee D-tryptofyyli-, o-aminobentsoyyli-, 30 m-aminobentsoyyli-, aspartyyli-, D-aspartyyli-, β-aspartyyli-, β-D-aspartyyli-, aminosukkinyyli-ryhmää tai kaavan ' [ 25 105775 -NH-CH-CH2-CO- mukaista ryhmää CO-Ai jossa tähteellä A3 on yllä määritelty merkitys,
3. 5 X4 merkitsee aminohappo-tähdettä, joka sisältää t alkyyli- tai aralkyyli-sivuketjun, tai sen johdannaista, joka on substituoitu hydroksyyli- tai metyyli-ryhmällä β-asemassa, tai prolyyli- tai β-alanyyli-ryhmää, tai valenssisidosta,
4. 10 X5 merkitsee aromaattista aminohappo-tähdettä tai sen johdannaista, joka on rengassubstituoitu halogeeni -tai hydroksyyli-ryhmällä, tai treonyyli-ryhmää, R3 merkitsee vetyä tai A2-C0-ryhmää, jossa A2 merkitsee vetyä tai C^-alkyyliryhmää, joka on 15 valinnaisesti substituoitu halogeenilla, R2 merkitsee vetyä,-S-,-S-asetamidometyyli-, fenyyli- tai p-hydroksifenyyli-ryhmää, R3 merkitsee vetyä tai hydroksyyli-ryhmää, R4 merkitsee fenyyli- tai p-hydroksifenyyli-ryhmää, 20 tai -S-tai -S-asetamidometyyli-ryhmää silloin, kun R2 merkitsee samaa ryhmää, tai metyyli-ryhmää silloin, . kun R3 on hydroksyyli-ryhmä,siinä tapauksessa, että Rz ja R4 ovat molemmat -S-, molempien yksi sidos on 25 yhdistynyt yhdeksi sidokseksi muodostaen sillan R2:n ja R4:n välille ja n on 1, 2, 3 tai 4, edellyttäen, että a) jos m 30 Xx on β-D-Nal tai D-Phe, joka on valinnaisesti substituoitu halogeenilla tai hydroksi-ryhmällä, X2 on Tyr tai Phe, X3 on D-Trp, 26 1 0 5 7 7 5 X5 on Trp tai Thr ja R2 ja R4 ovat molemmat -S-, molempien yhden 5 sidoksen ollessa yhdistynyt yhdeksi sidokseksi muodostaen sillan R2:n ja R4:n välille ja X4 ei ole Vai, Thr tai Ser, b) jos
5. 10 X„ on Vai, Thr tai Ser, X1 on aromaattinen D-aminohappotähde tai sen johdannainen, joka on rengassubstituoitu halogeenilla tai hydroksi-ryhmällä, ja X2 on aromaattinen aminohappotähde tai sen 15 johdannainen, joka on rengassubstituoitu halogeenilla tai hydroksi-ryhmällä, vähintään yksi seuraavista ehdoista on täytetty a) X3 ei ole D-Trp tai 20 β) R2 ja R4 yhdessä eivät tarkoita -S-S-ryh- mää(disulfiäisiltä), tunnettu siitä, että käytetään kiinteän faasin . peptidisynteesimenetelmää kondensoimalla asteittain suojatut aminohapot kiinteälle hartsikantoaineelle karbodi-imidin tai 25 aktiivisen esterin kytkennän avulla vastaavassa järjestyksessä, poistamalla sitten lopputuote kiinteästä kantoaineesta lohkaisemalla happamasti tai alkalisesti, poistamalla suoja-; ryhmät aminohapoista samanaikaisesti, kun lohkaistaan hart sista, tai sitä ennen tai sen jälkeen, ja haluttaessa muunne-30 taan näin saatu yleisen kaavan (I) mukainen hepta- tai okta- _ peptidiamidi happoadditiosuolaksi saattamalla se reagoimaan farmaseuttisesti hyväksyttävän hapon kanssa tai haluttaessa vapautetaan vapaa emäs saadusta happoadditiosuolasta saattamalla se reagoimaan alkalin kanssa. 105775
6. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 5 siitä, että kiinteänä hartsikantoaineena käytetään bents- i hydryyliamiinihartsia tai kloorimetyloitua polystyreeni-hartsia.
7. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 10 siitä, että suojaryhmiä sisältävä lopputuote lohkaistaan fluorivedyllä ja/tai ammonolyysillä.
8. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan 15 - β-aspartyyli(indolinyyli) -Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr- NH2, - D-Phg-Cys -Tyr-D-Trp-Lys-Val-C^s-Thr-NH2, - D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-C^s-Thr-NH2, - D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Leu-Cys-Thr-NH2,
9. 20. D-Phe-Cys-Tyr-β-Asp(indolinyy1i)-Lys-Leu-Cys-Thr-NH2, - D-Phe-Tyr-Tyr-Aa -Lys-Vai-Phe-Trp-NH2, - Ac-Sar-Aia-Tyr-Tyr-Aa-Lys-Vai-Phe-Trp-NH2, . - Pop-Tyr-Tyr-Aa-Lys-Val-Phe-Trp-NH2, - Aa-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Trp-NH2. ^ · · 28 1 0 5 7 7 5