HU207104B

HU207104B - Process for producing new somatostatin analogs inhibiting tumour growth and pharmaceutical compositions comprising such compounds

Info

Publication number: HU207104B
Application number: HU91272A
Authority: HU
Inventors: Gyoergy Keri; Imre Mezoe; Aniko Horvath; Zsolt Vadasz; Istvan Templan; Agnes Balogh; Orsolya Csuka; Gyoengyi Boekoenyi; Balazs Szoeke; Judit Horvath; Miklos Idei; Janos Seproedi
Original assignee: Biosignal Kutato Fejlesztoe Kf
Priority date: 1991-01-25
Filing date: 1991-01-25
Publication date: 1993-03-01
Also published as: CA2060034C; JPH05163299A; FI920340A0; DE69202182D1; ES2074294T3; FI920340A; CA2060034A1; HUT60752A; EP0505680A1; DE69202182T2; KR920014828A; HU910272D0; FI105775B; US5480870A; EP0505680B1; JP2514518B2; ATE121753T1

Description

A találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű amely képletben

X, jelentése D-fenil-alaniI-, D-tiroz.il-, p-klór-D-fenilalanil-, D-fenil-glicil-, p-hidroxi-DL-fenil-glicil-, D-2-naftil-alanil-, o-amino-benzoil-, m-amino-benzoil-, D-tetrahidro-izokinolil-karbonil-, szarkozil-, szarkozii-alanil-, vagy

-NH-CH-CH₂-CO-csoport, ahol I

CO-A,

A| jelentése 1 -indolinil-, fenilamino- vagy dietílamino-csoport,

X₂ jelentése fenil-alanil-, tirozil-, p-klór-fenil-alanilvagy hisztidil-csoport,

X₃ jelentése D-triptofil-, o-amino-benzoil-, m-aminobenzoil-, aszpartil-, D-aszpartil-, amino-szukcinilvagy -NH-CH—CH₂-CO-csoport, ahol

I

CO-A,

A, jelentése a fenti,

X₄ jelentése alanil-, valil-, leucil-, izoleucil-, prolilvagy béta-alanil-csoport vagy vegyértékkötés,

X₅ jelentése treonil- vagy triptofil-csoport, n értéke 4

R, jelentése hidrogénatom vagy A₂-CO-csoport, ahol A₂ jelentése 1-4 szénatomos alkil-csoport,

R₂ jelentése hidrogénatom, fenil- vagy p-hidroxi-fenilcsoport,

R₃ jelentése hidrogénatom vagy trifluor-acetil-csoport, R₄ jelentése fenil- vagy p-hidroxi-fenil-csoport vagy R₂ és R₄ jelentése acetamido-metil-S-csoport vagy a kettő együtt diszulfid-hidat képez új peptid-amidok, valamint e vegyületek sóinak az előállítására.

A képletekben alkalmazott rövidítések megegyeznek a peptidkémiában elfogadott nómenklatúrával, amelyet például a J. Bioi. Chem. [241, 527 (1966)] ismertet. A leírásban megnevezett aminosavak mindegyike L-konfigurációjú, ha külön nem jelöljük. Ennek megfelelően a leírásban előforduló rövidítések jelentése a következő:

	X	-X-
Phe	fenil-alanin	(fenil-alanil-csoport)
Trp	triptofán	(triptofil-csoport)
Tyr	tirozin	(tirozil-csoport)
Sár	szarkozin	(szarkozil-csoport)

X -X-

15	Alá	alanin (alanil-csoport)
	His	hisztidin (hisztidil-csoport)
	Val	valin (valil-csoport)
	Thr	treonin (treonil-csoport)
	Pro	prolin (prolil-csoport)
20	Leu	leucin (leucil-csoport)
	Cys	cisztein (ciszteinil-csoport)
	Phg	fenil-glicin (fenil-glicil-csoport)
	Pop	p-hidroxi- fenil-glicin (p-hidroxi-fenil-glicil-cso-
25		port)
	Aa	o-amino- benzoe-sav (o-amino-benzoi!-csoport) antranilsav (antranil-csoport)
	Mab	m-amino-
30		benzoesav (m-amino-benzoil-csoport)
	Tic	tetrahidro-izo- kinolin- karbonsav (tetrahidro-izo-kinolil-kar- bonil-csoport
35	Asu	amino-szukcin- imid (amino-szukcinil-csoport)
	Asp	aszparaginsav (aszpartil-csoport)
	Cpa	p-klór-fenil- alanin (p-klór-fenil-alanil-csoport)
40	Nal	2-naftil-alanin (2-naftil-alanil-csoport)
	Sár	szarkozin (szarkozil-csoport)
	Ac	acetil-csoport
	Acm	acetamido-metil- csoport
45	Boc	tercier-butil-oxi- karbonil-csoport
	Bop	benzotriazol-l-il-oxi- trisz(dimetil- aminoj-foszfóni-
50		um-hexafluoro- foszfát-csoport
	tBu	tercier-butil-csoport
	Bzl	benzil-csoport
	DCC	diciklohexil-kar-
55		bodiimid
	DCU	diciklohexil-karb- amid
	DIC	diizopropil-karbo- diimid
60	DIPE	diizopropil-etil-amin

HU 207 104 Β

X -X-

DMF	dimetil-formamid
Et	etil-csoportetil-csoport
Fmoc	9-fluorenil-metilox i-karbon il-csoport
Fór	forrni 1-csoport
HPLC	nagynyomású folyadékkromatográfia
Me	metil-csoport
ONP	p-nitro-feil-cso- port
Opcp	pentaklór-fenil- csoport
Opfp	pentafluor-fenil- csoport
Ph	fenil-csoport
TEA	trietil-amin
TEAA	trietil-ammónium- acetát
TEAP	trietil-ammónium- foszfát
TFA	trifluor-ecetsav
Tfa	trifiuor-acetil-cso- port
THF	tetrahidro-furán
TLC	vékonyréteg-kro- matográfia
Tos	tozi 1-csoport
UV	ultraibolya
z	benzil-oxi-karboni 1-csoport

A ciklikus tetradekapeptid-szomatosztatint (SRIF) eredetileg hipotalamuszból izolálták mint a növekedési hormon (GH) szekréciójának inhibitorát [Brazeu et al.: Science 179, Τ1-Ί9 (1973)]. Aszomatosztatin biológiai hatása azonban igen kiterjedt, számos biológiai folyamatban vesz részt, többnyire gátló faktorként szerepel (pl. gátolja a prolaktin, inzulin, glukagon, gasztrin, szekretin, kolecisztokinin felszabadulását) [Reichlin,

S.: Somatostatin, N. Eng. J. Med. 309, 1495-1501, 1556-1563 (1983)].

A szomatosztatinnak mint növekedést gátló faktornak az egyik legjelentősebb hatása az, hogy a kóros sejtnövekedés különböző formáit képes befolyásolni. Az irodalomból jól ismert a rákos sejtek növekedésére kifejtett gátló hatása [Schally, A. V.: Cancer Rés. 48, 6977-6985 (1988); Taylor et al.: Biochem. Biophys, Rés. Commun. 153, 81-86 (1988)], amelynek során valószínűleg a rákos folyamatokkal kapcsolatos növekedési faktorokra fejti ki antagonizáló hatását. Újabb vizsgálatok kimutatták azt is, hogy a szomatosztatin és bizonyos szomatosztatin-analógok aktiválják a tirozinfoszfatáz nevű enzimet, amely a tumoros transzformációban igen fontos szerepet játszó tirozinkinázok hatását antagonizálja [Schally, A. V.: Cancer Rés. 48,6977-6985 (1988)]. A tirozin-kinázok jelentőségét bizonyítja az a tény, hogy az onkogének nagy része tirozinkinázt kódol, és a növekedési faktor receptorok nagyobb része is tirozin-kináz [Yardén et al.: Ann. Rév. Biochem. 57,443-478 (1989)].

A natív szomatosztatinnak igen rövid az in vivő hatásideje, mivel az endo- és exo-peptidázok gyorsan inaktiválják. Számos új analógot állítottak elő azzal a céllal, hogy a hormon hatásidejét, biológiai aktivitását és szelektivitását megnöveljék. A hatásos analógok legnagyobb része az eredetinél rövidebb peptidláncot és ciklust tartalmaz. Az első ciklikus hexapeptidet, mely teljes szomatosztatin-hatást mutatott, Veber és mtsai. [Natúré 292,55 (1981)] szintetizálták. Ennek az eredménynek a folytatásaként újabb, hatékonyabb ciklusos hexa- és oktapeptideket állítottak elő [Veber et al.: Life Sci. 34, 1371-1378 (1984); Murphy et al.: Biochem. Biophys, Rés. Commun, 132,922-928 (1985); Cai et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA&3,1896-1900 (1986)], melyek a szomatosztatin-hatás teljes spektrumát is mutatják.

A találmány célja olyan új szomatosztatin-analógok előállítása, amelyek az ismert vegyületeknél kedvezőbb és/vagy szelektívebb biológiai hatást mutatnak.

A találmány alapja az a felismerés, hogy a szomatosztatin oktapeptid analógjainak hatása növelhető, ha az 1-es helyzetű aminosavat olyan szubsztituenssel helyettesítjük, amelynek erősen hidrofób karaktere és olyan szerkezete van, amely megakadályozza az exopeptidázok működését Ez a szubsztitúció előnyösen kombinálható a 3-as helyzetű aminosav különböző aromás aminosavakkal történő szubsztitúciójával, a 4-es helyzetű aminosavnak Daromás aminosavval, aromás aminokarbonsavval, amino-szukcinimiddel vagy az alfa-karboxil-csoporton szubsztituált béta-aszpartil csoporttal történő szubsztitúciójával, a 6-os aminosavnak különböző alkilvagy aralkil-oldalláncot, illetve ezeknek szubsztituált származékait tartalmazó aminosavval, prolinnal, béta-alaninnal történő szubsztitúciójával vagy a 6-os aminosav elhagyásával, a 8-as aminosavnak aromás aminosavval, illetve ezeknek gyűrűben szubsztituált származékaival, illetve treoninnal történő szubsztitúciójával.

A találmány további alapja az a felismerés, hogy amennyiben a 4-es aminosav esetében antranil- [(III) képlet], meta-amino-benozil- [(IV) képlet] vagy amino-szukcinil-szubsztitúciót [(V) képlet] alkalmazunk, nem szükséges a vegyületet ciklizálni, mivel ezen helyettesítések bizonyos esetekben megakadályozzák egy adott peptid szabad térbeli rotációját (4758552 számú USA-beli szabadalmi leírás, 194280 számú magyar szabadalmi leírás), amit egyébként a ciklizált forma [(II) képlet] is akadályoz.

A fentiek alapján a találmány eljárás az (I) általános képletű - amely képletben X_b X₂, X3, X₄ és X₅, valamint R_h R₂, R₃ és R₄ jelentése a fenti - új peptid-amidok és e vegyületek savaddíciós sóinak az előállítására. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a védett aminosavakat vagy reakcióképes származékaikat a peptidszintézisben ismert módon megfelelő sorrendben - kívánt esetben szilárd gyanta hordozóhoz - kondenzálunk, majd az aminosavak védőcsoportjait savas vagy lúgos hasítással eltávolítjuk, adott esetben a pepiidnek a szilárd hordozóról történő lehasításával egyidejűleg vagy azt megelőzően vagy követően, és az így kapott (I) általános képletű peptid-amidot kívánt esetben oxidáljuk és/vagy savval reagáltatva savaddíciós

HU 207 104 B sóvá alakítjuk, vagy kívánt esetben a savaddíciós sóból lúggal reagáltatva felszabadítjuk a bázist.

Az eljárásban szilárd hordozóként benzhidril-amin gyantát vagy klór-metilezett polisztirol gyantát célszerű használni. A védőcsoportokat tartalmazó végtermé- 5 két hidrogén-fluoriddal és/vagy ammonolízissel előnyös lehasítani a gyantáról.

A találmány tárgya továbbá eljárás az (I) általános képletű vegyületek átalakítására gyógyászati kompozíciókká. Ezt az eljárást úgy végezzük, hogy valamely, a 10 fenti eljárással kapott (I) általános képletű vegyületet vagy annak savaddíciós sóját a gyógyszerkészítésben szokásos hordozó-, vivő- és/vagy segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk.

Az (I) általános képletű szomatosztatin-származé- 15 kok egerek esetében, intramuszkuláris, szubkután vagy intravénás injekcióban 0,01-500 gg/testsúly-kg, humán alkalmazás esetén 0,5-2000 mg/testsúly-kg tartományban hatékonyak,

A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a követke- 20 zők:

a) Az eljárással előállított új szomatosztatin-származékok kedvezően alkalmazhatók tumornövekedés gátlására, illetve a tumoros transzformációban fontos szerepet játszó tirozin-kináz enzimek aktivitásának 25 gátlására.

b) Az új aminosavkombinációk segítségével előállíthatok GH-, inzulin-, glukagon- és prolaktin-felszabadulást gátló folyamatok szabályozására és/vagy tumomövekedés gátlására is alkalmas analógok. 30

c) A 4-es helyzetben alkalmazott amino-szukcinil-, orto- és meta-amino-benzoil-szubsztitúciók esetében azok az analógok, amelyek nem tartalmaznak diszulfidhidat, nem rendelkeznek GH-felszabadítást gátló hatással, viszont gátolják a tumoros sejtek növekedését. 35

d) Az eljárással előállított új szomatosztatin származékok olyan kóros folyamatok, pl. pikkelysömör gátlására is felhasználhatók, amelyek a bőrsejtek kóros sarjadzását idézik elő,

e) Az orto- és meta-amino-benzoil-szubsztituensek 40 nem tartalmaznak aszimmetria centrumot, így a szintézis közben racemizáció nem mehet végbe. Ez a végtermék előállítását könnyebbé és olcsóbbá teszi.

f) Az orto- és meta-amino-benzoesav előállítási költsége jóval kisebb, mint az eddig ismert szomatosz- 45 tatin-analógokban a hasonló funkciót betöltő D-aminosavaké.

A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg.

A példákban a vegyületeket a szilárd fázisú pepiid- 50 szintézis általánosan alkalmazott módszereivel állítjuk elő [Stewart et ah: Solid phase peptide synthesis, 2nd Edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, (1984)]. Az egyes aminosavakat lépésenként kapcsoljuk benzhidril-amin vagy klór-metilezett polisztirol gyanta- 55 hoz Boc vagy Fnioc származékaik formájában, szimmetrikus anhidrides vagy aktív észteres kapcsolással, illetve DCC, DIC vagy BOP reagensek segítségével.

A kapcsolási reakciók lejátszódásának mértékét ninhidrin tetszttel vizsgáljuk [E. Kaíser et ah: Anal. 60

Biochem. 34, 595-598 (1970)]. Szabad amino-csoport detektálása esetén az acilezést megismételjük. A kapcsolások időtartama az aminosavaktól függően 1 és 16 óra között változik.

Ha a védőcsoportok eltávolítását és a peptid lehasítását a gyantáról egy lépésben végezzük, előnyösen vízmentes hidrogén-fluoridot használunk [S. Sakakibara et al.: Bull. Chem. Soc., Japan. 40,2164-2167 (1967)].

A kapott nyersterméket kívánt esetben ciklizáljuk.

A nyerstermék tisztítását Sephadex és/vagy preparatív HPLC kromatográfiával végezzük. A végtermékek tisztaságát TLC-vel, analitikai HPLC-vel és aminosav-analízissel vizsgáljuk. A vékonyrétegkromatográfiás R_f értékeket Kieselgel (DC Alufolien, Merck) lemezeken az alábbi oldószerelegyekben határozzuk meg:

1. Etilacetát-piridin-ecetsav-víz

2. Etilacetát-piridin-ecetsav-víz

3. Butanol-piridin-ecetsav-víz

4. n-Butanol-ecetsav-víz

5. n-Butanol-ecetsav-víz-etilacetát

6. n-Butanol-ecetsav-víz

7. i-Propanol-1 mól ecetsav

8. Etilacetát-piridin-ecetsav-víz

30:20:6:11 60:20:6:11 60:20:6:11 4: 1:2

1: 1:1:1 4:1:1 2: 1

5:5:1:3

/. példa béta-Aszpartil-(l-indoliniI)I 1

Cys-Tyr-D-Tip-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂ előállítása

M: 1076

0,47 g (0,25 mmól) benzhidril-amin. HC1 gyantát (0,54 mekv/g) 90 percen keresztül duzzasztunk diklórmetánban, majd az aminosavakkal végzett minden egyes acilezés során a következő ciklust ismételjük:

Lépés	Reagens művelet	Keverési idő (perc)
l.,CH₂Cl₂, mosás háromszor	1
2.	33% TFA, 5% anizol és 62% CH₂C1₂ elegye, hasítás	1
3.	33% TFA, 5% anizol és 62% CH₂C1₂ elegye, hasítás
4.	CH₂C1₂, mosás háromszor	1
5.	Etanol, mosás kétszer	1
6.	CH₂CI₂, mosás háromszor	1
7.	10% TEA és 90% CH₂CI₂elegye, mosás kétszer	2
8.	CH₂C1₂, mosás háromszor	2
9.	Etanol, mosás kétszer	1
10.	CH₂C1₂, mosás háromszor	1
11.	3 ekv. Boc-aminosav, CH₂CI₂ és DMF elegyében oldva és 3 ekv. DCC v. DIC CH₂Cl₂-ben oldva, kapcsolás	60 perc16 óra
12.	CH₂C1₂, mosás háromszor	- 1
13.	Etanol, mosás kétszer	'TL+t

HU 207 104 Β

Minden lépés után ninhidrin-tesztet végzünk; amennyiben pozitív eredményt kapunk, a ciklust a 6. sortól megismételjük.

Az utolsó lépés után kapott béta-Asp(indolinil)Cys(4-Me-Bzl)-Tyr(2-Br-Z)-D-Trp-Lys(Z)-Val-Cys(4Me-Bzl)-Thr(Bzl) peptid-gyantát (0,25 mmól) 10% pkrezolt tartalmazó 3 ml anizolban szuszpendáljuk és 30 ml HF gázt kondenzálunk az elegyre. 45 percig 0 °Con keverjük, ezt követően a HF gázt eltávolítjuk, a maradékot 200 ml etil-acetátban szuszpendáljuk, 15 percig keverjük, majd 250 ml etil-acetátba öntjük. A csapadékot szűrjük, etil-acetáttal mossuk, majd a pepiidet a csapadékból 500 ml gázmentesített, 95%-os ecetsavval szűréssel kioldjuk. Ezután 9,0 ml 0,03 mól jód/metanol oldatot adunk cseppenként az ecetsavas oldathoz, míg narancssáiga színű nem lesz. Ennek elérése után az oldatot 1 órán át keverjük. Óvatosan cinkport adunk az oldathoz a sárga szín eltűnéséig, a cinkport kiszűrjük, majd az oldatot bepároljuk. A szilárd maradékot 6 ml 50%-os ecetsavban oldjuk és Sephadex G-25 oszlopon tisztítjuk. Az elválást 280 nm-nél mért UV-elnyeléssel és TLC-vel követjük. A kívánt anyagot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, bepároljuk, majd preparatív HPLC rendszer segítségével gradiens elúcióval tovább tisztítjuk (oszlop: Whatman Partisii 10 ODS-3 22x250 mm; eluensek: A; 0,25 N TEAP, pH=2,24, B: 80% metanol-20% A). A tiszta termék sómentesítését 0,02 M NH₄OAc, pH=5 (eluens A) és 70% metanol -30% A (eluens B) gradiens elúciójával végezzük. A keletkezett végtermék tömege 120 mg (43%). A vegyület fizikai állandóit az I/A táblázat, a biológiai hatásokat II., III., IV. és V. táblázat foglalja össze.

2. példa

D-Phg-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂ előállítása M:1034

0,5 g (0,27 mmól) benzhidril-amin.HCl gyantából (0,54 mekv./g) kiindulva a pepiidet az 1. példában leírt módon szintetizáljuk, majd hasítjuk le a gyantáról, ciklizáljuk és tisztítjuk Sephadex kromatográfiával. A HPLC tisztításánál alkalmazott oldószerek A: 0,1% TEAA, pH=4,2; B: 80% metanol -20% A. A sómentesítést a termék többszöri lifilizálásával végezzük. A kapott peptid tömege 54 mg (19,4%). A vegyület fizikai állandóit az I/A táblázat, biológiai hatásit a II., III. és IV. táblázat foglalja össze.

3. példa

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys-Thr-NH₂ előállítása

M: 947

0,47 g (0,25 mmól) benzhidril-amin.HCl gyantából (0,54 mekv./g) indulunk ki, és a pepiidet az 1. példában leírt módon szintetizáljuk, ciklizáljuk és tisztítjuk. A keletkezett termék tömege 80,5 mg (34%). A fizikai állandókat az I/A táblázat, a biológiai mérések eredményeit a Π. és III. táblázat foglalja össze.

4. példa

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Leu-Cys-Thr-NH₂ előállítása M:1060

0,47 g (0,25 mmól) benzhidril-amin.HCl gyantából (0,54 mekv./g) indulunk ki, és a pepiidet az 1. példában leírt módon szintetizáljuk, ciklizáljuk és tisztítjuk. A végtermék tömege 106 mg (40%). A vegyület fizikai állandóit az I/A táblázat, a biológiai mérések eredményeit a H., HL, IV., és V. táblázat foglalja össze.

5. példa

D-Phe-Cys-Tyr-béta-Asp( 1 -indo!inil)-Lys-Val-CysThr-NH₂ előállítása

M: 1076

0,47 g (0,25 mmól) benzhidril-amin.HCl gyantából indulunk ki, és a pepiidet az 1. példában leírt módon szintetizáljuk, ciklizáljuk és tisztítjuk. A végtermék tömege 94 mg (35,5%). A vegyület fizikai állandóit az I/A táblázat, a biológiai mérések eredményeit a II., III., IV, és V. táblázat foglalja össze.

6. példa

D-Phe-Tyr-Tyr-Aa-Lys-Val-Phe-Trp-NH₂ előállítása M:1192

0,47 g (0,25 mmól) benzhidriI-amin.HCl gyantából indulunk ki. A pepiidet az 1. példában leírt módon szintetizáljuk. Az utolsó lépés után kapott D-Phe-Tyr(2-Br-Z)Tyr(2-Br-Z)-Aa-Lys(2-Cl-Z)-Val-Phe-Trp peptid gyantát 3 ml anizolban szuszpendáljuk, és 30 ml HF gázt kondenzálunk az elegyre. 45 percig 0 °C-on keverjük, ezt követően a HF gázt eltávolítjuk, a maradékot 200 ml absz. éterben szuszpendáljuk, 15 percen át keverjük, a csapadékot szűrjük és éterrel mossuk. Ezt követően a csapadékból a peptidet 50%-os ecetsavval kioldjuk, majd az oldatot bepároljuk. A kapott D-Phe-Tyr-Tyr-Aa-LysVal-Phe-Trp-NH₂ oktapeptid-amidot preparatív HPLC segítségével tisztítjuk. Eluensek: A: 0,25 N TEAP, pH=2,25, B: 70% acetonitril+30% A. Az elválasztást az

1. példában említett oszlopon, 30% B+70% A komponenst tartalmazó elegy segítségével végezzük. A tiszta terméket az 1. példában említett módon sómentesítjük. A végtermék tömege 89 mg (30%). A vegyület fizikai állandóit az I/A táblázat, a biológiai hatásokat a II. és III. táblázat foglalja össze.

7. példa

Ac-Sar-Ala-Tyr-Tyr-Aa-Lys-Val-Phe-Trp-NH₂ előállítása

M :1217

A peptidet a 6. példában ismertetett eljárás szerint állítjuk elő, de az utolsó ciklusban Ac-Sar-csoportot

HU 207 104 B kapcsolunk a peptidgyantához. A termék lehasítását a gyantáról, valamint tisztítását is a 6. példában említett eljárás szerint végezzük. A végtermék tömege 85 mg (28%). A vegyület fizikai állandóit az I/A táblázat, biológiai hatásait a II., III. és IV. táblázat foglalja össze.

8. példa

Pop-Tyr-Tyr-Aa-Lys-Val-Phe-Trp-NH₂ előállítása

M:1194

A peptid szintézisét az 1. példában leírtak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy all. lépésben az aminosav kapcsolásánál aktiválószerként az aminosavval egyenlő mennyiségű Bop reagenst alkalmazunk, DIPEA felesleg jelenlétében. A végterméket a

6. példában leírt módon nyerjük HF-os hasítás, majd kromatográfiás tisztítás után. A végtermék tömege 105 mg (35%). A vegyület fizikai állandóit az I/A táblázat foglalja össze.

9. példa

Aa-Cys(Acm-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)Trp-NH₂ előállítása

M: 1283

0,47 g (0,25 mmól) benzhidril-aminHCl gyantát 90 percen keresztül duzzasztunk diklór-metánban, majd a megfelelően védett aminosavak Fmoc-származékaíval történő minden egyes acilezés során a következő ciklust ismételjük:

Lépés	Reagens művelet	Keverési idő (perc)
1.	DMF, mosás háromszor	2
2.	20% piperidin és 80% DMF elegye, hasítás	2
3.	20% piperidin és 80% DMF elegye, hasítás	10
4.	DMF, mosás ötször	2
5.	3 ekv. Fmoc-aminósavból készült szimmetrikus anhidrid* vagy Opfpészter, kapcsolás	60
6.	DMF, mosás háromszor	2

+Szimmetrikus anhidrid készítése: 3 ekv. Fmoc-aminosaval feloldunk diklór-metán és DMF elegyében, hozzáadunk 1,5 ekv. DCCl-t és az elegyet 15 percen át szobahőmérsékleten keverjük. A kivált DCU-t szűrjük, az oldatot bepároljuk, és a maradékot DMFben oldva alkalmazzuk a kapcsolás során.

Minden lépés után ninhidrin-tesztet végzünk; amennyiben pozitív eredményt kapunk, a ciklust az 5, sortól megismételjük.

Az utolsó lépés után kapott Aa-Cys(Acm)Tyr(tBu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Trp-peptid gyantát a 6. példában leírt módon kezeljük HF-dal, tizstítjuk és sómentesítjük. A végtermék tömege 147 mg (46%). A vegyület fizikai állandóit az I/A táblázat tartalmazza.

'

10-15. példa

Az 1-5. példákban bemutatott eljárást alkalmazva a következő vegyületeket állítjuk elő:

A-Cys-B-D-Trp-C-E-Cys-Thr-NH₂

A példa sorszáma	A	B	c	D
10.	béta- Asp(NH- Ph)	Tyr	Lys	Val
11.	D-Tic	Tyr	Lys	Val
12.	D-Phe	His	Lys	Val
13.	D-Phe	Tyr	Lys (Tfa)	Val
14.	D-Phe	Tyr	Lys	béta-Ala
15.	D-Phe	Tyr	Lys	Pro

A vegyületek fizikai állandóit az I/A táblázat, a biológiai mérések eredményeit a II., III. és IV. táblázat foglalja.

16. és 17. példa

A 6. példában alkalmazott eljárásnak megfelelően a következő vegyületeket állítjuk elő:

A-B-Tyr-Aa-Lys-Val-Phe-Trp-NH₂

A példa sorszáma	A	B
16.	Ac-Sar	Tyr
17.	D-Phe	Alá

A vegyületek fizikai adatait az I/A táblázat, a biológiai mérések eredményeit a II. táblázat foglalja magában.

18-24. példák

I I

A-Cys-B-C-Lys-Val-Cys-D-NHz

A példa sorszáma	A	B	C	D
18.	D-Phe	Tyr	A a	Τφ
19.	D-Nal	Tyr	Aa	Trp
20.	Aa	Tyr	D-Trp	Trp
21.	D-Phe	Tyr	D-Asp	Thr
22.	D-Phe	Tyr	Asp	Thr
23.	D-Phe	Cpa	D-Trp	Thr
23.	D-Tyr	Phe	D-Tip	Thr
24.	D-Cpa	Tyr	D-Trp	Thr

A vegyületek fizikai állandóit az I/B táblázat tartalmazza.

HU 207 104 Β

25. példa

Az 1-5. példákban bemutatott eljárást alkalmazva állítjuk elő a D-Phe-Cys-Cpa-D-Trp-Lys-Cys-Thr-NH₂heptapeptid-amidot. A vegyület fizikai állandóit az I/B. táblázat tartalmazza.

26. példa

D-Phe-Cys-Tyr-Asu-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂

A vegyület előállítására az 1-5. példákban bemutatott eljárást alkalmazzuk azzal a különbséggel, hogy a Lys beépítése után semlegesítésre nem TEA-t hanem 5%-os diizopropil-etilamin diklórmetánban készült oldatát használjuk. A szintézis végén kapott védett peptidgyantáról az Asp védőcsoportját (fluorenil-metilészter) DMF-piperidin 1:1 arányú elegyében 2x20 percig tartó keveréssel távolítjuk el. Ezt követően Asp-béta-pentafluor-fenil észtert alakítunk ki oly módon, hogy a peptidgyanta DMF-os szuszpenziójához feleslegben pentafluor-fenolt és diizopropil-karbodiimidet adunk, majd 30 percig keverjük, végül a reagensek feleslegét DMF-os mosással eltávolítjuk. Az aszpartimid gyűrű kialakítása céljából a peptidgyantát DMF-ban keverjük és a gyűrűzáródás előrehaladását a felszabadult pentafluor-fenil mérésével követjük (az oldat extincióját mérjük DMF-al szemben 278 nm-en). A további védőcsoportok eltávolítását, a peptid lehasítását a gyantáról, a diszulfid híd kialakítását valamint a nyers tennék tisztítását az 1-5. példákban leírtak szerint végezzük el. A vegyület fizikai adatait az I/B táblázat tartalmazza.

Az (I) általános képletű vegyületek savaddíciós sóinak előállítása céljából az 1. példában leírt módon sómentesített terméket a kívánt sav ekvimoláris mennyiségével reagáltatjuk híg vizes oldatban. Az oldószert bepároljuk, majd a szilárd maradékot éterben eldörzsöljük és a kristályos terméket szűréssel elkülönítjük.

A találmány szerinti vegyületek biológiai hatását az alábbi kísérletekben igazoltuk.

Növekedési hormon (GH) mérése

A növekedési hormon felszabadulását, illetve a felszabadulás gátlásának a mérését patkány-hipofízisen végezzük szuperfúziós technikát alkalmazva [Vigh et al.: Peptides 5,241-247 (1984)]. Kontrollként az a GH mennyiség szerepel, amelyet a mintával azonos dózisban adott GH-t felszabadító hormon (GHRH) szabadít fel. Az adott analóg aktivitását a GHRH hatására felszabaduló GH mennyiség csökkenésének vagy növekedésének százalékában fejezzük ki (II. táblázat).

Sejtosztódás gátlásának mérése

Különböző eredetű tumoros sejteken a H³-timidin beépülését és a sejtszám mérését a Kéi és mtsai. által közölt eljárás szerint végezzük [Tumor Biology 9, 315-322 (1988)]. Az analógok biológiai aktivitását a kontrollként alkalmazott kezeletlen sejteknél mért jel15 zett timidin beépülés vagy sejtszámnövekedés százalékos gátlásaként fejezzük ki (III. táblázat).

Tírozin-kináz aktivitásának mérése A tirozin-kináz aktivitásának mérését szintén a Kéri és mtsai. által közölt eljárás szerint végezzük [Tumor Biology 9, 315-322 (1988)]. Az analógok biológiai aktivitását a kontrollként szolgáló kezeletlen sejteknél mért P³² izotóp beépüléséhez viszonyított gátló hatásuk alapján jellemezzük (IV. táblázat).

A vegyületek tumornovekedésre kifejtett hatásának vizsgálata metasztázis modellben A vegyületek antimetasztatikus hatását Lewis Lung tumoros sejteken (LLT) izom-tüdő, lép-máj metasztá30 zis modellen, valamint ezek megnövekedett metasztatizáló képességű, immunorezisztens sejtvariánsán (LLTHH) vizsgáljuk. A kísérleteket mindkét nemű, C₅₇B1 beltenyészetű egereken végezzük. Izom-tüdő metasztázis modell esetében az LLT-t az izomba transzplantáljuk, lép-máj metasztázis modell esetében a tumorsejtszuszpenziót injekció útján a lépbe juttatjuk. A vizsgálandó vegyületeket injekció formájában (IP, IV, PO, SC) az 5-13. napokon naponta 1-3-szor 0,1-10 mg/kg dózisban alkalmazzuk. A terápiás hatást a metasztázisok száma alapján határozzuk meg oly módon, hogy a lép-máj modell esetében 10-14. nap, az izom-tüdő esetében a 17. és 18. nap között mintát veszünk, és sztereomikroszkóp alatt megszámoljuk a makroszkópos metasztázisokat a májban, ill. a tüdőben. Avegyületek hatékonyságát a kontrollállatokban mért metasztázisok számának százalékában határozzuk meg (V. táblázat).

HA táblázat

A leírásban szereplő vegyületek fizikai állandói

Példa	Op. (°C)		Rf¹	Rf²	R?	Rf⁴	Rf⁵	Rf⁶	Rf⁷	Rf⁸
1		-53	0,62	0,19	0,61	0,55		0,56	0,81
2		-93	0,63	0,19	0,63	0,55		0,58	0,81
3		-98,2	0,55			0,41		0,36	0,73
4		-43	0,65	0,22	0,66	0,59		0,61	0,81
5		-63	0,61	0,19	0,64	0,51		0,55	0,16
6	156-160	-19,6					0,83	0,69		0,88

HU 207 104 Β

Példa	Op. (°C)	[a]^	Rf¹	Rf²	Rf³	Rf	Rf⁵	Rf^fi	Rf⁷	Rf⁸
7	168-172	-34					0,70	0,60	0,70	0,60
8							0,80	0,60		0,90
9	138-140	-47		0,27			0,84	0,40		0,81
10			0,63	0,26		0,72
11		-57,4	0,63	0,22	0,64	0,51		0,55	0,80
12		-116,2	0,43	0,04	0,35	0,36		0,14	0,16
13		-68,6	0,85	0,63	0,76	0,75		0,78	0,93
14		-30,8	0,60	0,01	0,54	0,48		0,43	0,80
15		-63,4	0,57	0,12	0,48	0,41		0,36	0,73
16			0,57	0,25	0,58			0,57
17							0,80	0,60		0,90

+c = 0,5 (1,1% eccisav)

HB. táblázat

A példák szerinti vegyületk fizikai állandói (folytatás)

Példa	[a]²⁰⁺	Rf'	Rf²	R?	Rf⁴	Rf⁵	Rf⁸
18.						0,61	0,38
19.		0,09				0,74	0,49
20.		0,88					0,79
21.	75,0^a
22.	66,9^b
23.						0,80	0,59
24.					0,59	0,78
25.					0,50	0,65
26.	31,2^C		0,13	0,51	0,41

^a = 0,53 (1,1 %-os eccisav) ^b = 1 (1,1 %-os ecetsav) ^c = 0,5 (1,1 %-os ecetsav)

II. táblázat

GHRH hatására bekövetkező GH-felszabadulás változása az analógok hatására

Példa sorszáma	GH-felszabadulás változása (%)
1.	-100
2.	-93
3.	0
4.	-100
5.	+290
6.	+26
7.	-20
11.	-85
12.	-100
14.	-10
15.	0
16.	+9

III. táblázat

Sejtosztódás gátlásának mérése különböző tumoros sejtekben

Példa sorszáma	SejtvonaP	Dózis (pg)	Gátlás (%)
	HT 29	1	36
1.	HT 29	10	44
	MCF7	10	46
2.	HT 29 MCF7	20 20	27 45
	HT 29	20	75
3.	DU 145	10	68
	PC 3	10	45
	HT29	1	57
4.	HT29	10	50
MCF7	10	31
	DU 145	10	36
5.	SW 620	10	68
6. ... .	MCF7	40	48

HU 207 104 B

Példa sorszáma	Sejtvonar	Dózis (gg)	Gátlás (%)
7.	HT29	10	28
MCF 7	20	24
11.	MCF 7	10	21
12.	MCF 7	10	38
MCF 7	20	44
13.	MCF 7	10	13
MCF 7	20
19
14.	MCF 7	20	45
HT29	20	13

⁺HT 29: humán vastagbél eredetű tumor sejtvonal MCF 7: humán emlő eredetű tumor sejtvonal DU 145: humán prosztata eredetű tumor sejtvonal PC 3: humán prosztata eredetű tumor sejtvonal SW 620: humán vastagbél eredetű tumor sejtvonal

IV. táblázat

Tirozin-kináz aktivitásának mérése

Példa sorszáma	SejtvonaP	Dózis (gg)	Gátlás (%)
1.	HT29	10	44
2.	HT29	1	35
HT29	10	22
3.	SW620	1	84
SW620	10	70
4.	HT29	10	50
HT29	30	90
5.	HT29	10	30
HT29	30	45
7.	HT29	10	17
HT29	30	23
12.	HT29 HT29	10 30	nincs hatás nincs hatás

⁺HT 29: humán vastagbél eredetű tumor sejtvonal SW 620: humán vastagbél eredetű tumor sejtvonal

V. táblázat

Tumomövekedésre kifejtett hatás vizsgálata metasztázis modellben

Példa sorszáma	Metasztázisok száma a kontrolihoz (100%) viszonyítva (%)
1.	43
4.	35
5.	25
13.	51

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

1. Eljárás az (I) általános képletű - amely képletben X] jelentése D-fenil-alanil-, D-tirozil-, p-klór-D-fenilalanil-, D-fenil-glicil-, ρ-hidroxi-DL-fenil-glicil-, D2-naftil-alanil-, o-amino-benzoil-, m-amino-benzoil, D-tetrahidro-izokinolil-karbonil-, szarkozil-, szarkozil-alanil- vagy -NH-CH-CH2-CO-csoport, ahol

I

CO-A,

Aj jelentése 1-indolinil-, fenílamino- vagy dietilamino-csoport,

X₃ jelentése D-triptofil-, o-amino-benzoil-, m-aminobenzoil-, aszpartil-, D-aszpartil-, amino-szukcinilvagy -NH-CH-CH₂-CO- csoport, ahol

J

CO-A,

A, jelentése a fenti,

X₅ jelentése treonil- vagy triptofil-csoport, n értéke 4

R, jelentése hidrogénatom vagy A₂-CO- csoport, ahol A₂ jelentése 1-4 szénatomos alkil-csoport,

R₂ jelentése hidrogénatom, fenil- vagy p-hidroxi-fenilcsoport,

R₃ jelentése hidrogénatom vagy trifluor-acetil-csoport, R₄ jelentése fenil- vagy p-hidroxi-fenil-csoport vagy R₂ és R₄ jelentése acetamido-metil-S-csoport vagy a kettő együtt diszulfid-hidat képez peptid-amidok, valamint e vegyületek savaddíciós sóinak az előállítására, azzal jellemezve, hogy a védett aminosavakat vagy reakcióképes származékaikat a peptidszintézisben ismert módon megfelelő sorrendben - kívánt esetben szilárd gyanta hordozóhoz - kondenzálunk, majd az aminosavak védőcsoportjait savas vagy lúgos hasítással eltávolítjuk, adott esetben a pepiidnek a szilárd hordozóról történő lehasításával egyidejűleg vagy azt megelőzően vagy követően és az így kapott (I) általános képletű peptid-amidot kívánt esetben oxidáljuk és/vagy savval reagáltatva savaddíciós sóvá alakítjuk, vagy kívánt esetben a savaddíciós sóból lúggal reagáltatva felszabadítjuk a szabad bázist

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy szilárd gyanta hordozóként benzhidril-amin gyantát vagy klór-metilezett polisztirol gyantát használunk.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a védőcsoportokat tartalmazó végterméket hidrogén-fluoriddal és/vagy ammonolízissel hasítjuk le a gyantáról.

4. Eljárás tumornövekedést gátló gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított (I) általános képletű vegyületet - ahol X,, X₂, X₃, X₄, X5, R,, R₃, R₄ és n jelentése az 1. igénypont szerinti - vagy annak gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóját a gyógyszerkészítésben szokásos hordozó-, vivőés/vagy segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk.