NL194918C - SDK-peptide, en therapeutische preparaten die deze bevatten. - Google Patents

Description

1 194918 SDK-peptide, en therapeutische preparaten die deze bevatten

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op farmacologisch actieve peptiden die de aminozuursequentie Ser-Asp-Lys bevatten.

5 Peptiden die een dergelijke sequentie bevatten zijn bekend uit de internationale aanvrage WO 88/00594. Deze literatuurplaats heeft betrekking op tetrapeptiden met formule Ser-Asp-Lys-Pro-OH en derivaten daarvan waarin één of meer groepen gesubstitueerd zijn met substituentgroepen zoals acetyl, benzyl, methyl en fenyl, en farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan. WO 88/00594 heeft verder betrekking op de isolatie van deze tetrapeptiden en het gebruik daarvan in geneesmiddelen. De tetrapeptiden remmende 10 de proliferatiecyclus van hematopoëtische stamcellen en kunnen gebruikt worden voor het beschermen van beenmerg tijdens antikankerbehandelingen door middel van chemotherapie.

Gevonden zijn nu nieuwe peptiden die de sequentie Ser-Asp-Lys bevatten en die een immunomodule-rende werking hebben, dat wil zeggen dat zij de proliferatie van specifieke cellen bij de immunorespons zoals T- en B-lymfocyten vergroten. Dit resulteert in een vroege en virulentere immuno-respons.

15 De uitvinding voorziet in peptiden als in de aanhef omschreven, met het kenmerk, dat zij de algemene formule H2N-W-Ser-Asp-Lys-X-0H hebben, waarin X een Pro- of Lysrest of een valentiebinding voorstelt en W een Thr- of Pro-rest of een valentiebinding voorstelt, met dien verstande dat als X een Pro-rest voorstelt, W eveneens een Pro-rest voorstelt, en therapeutisch aanvaardbare zouten daarvan.

De voorkeur hebben peptiden met de formule Ser-Asp-Lys en Pro-Ser-Asp-Lys-Pro.

20 De peptiden van de uitvinding verminderen het aantal rosetten in vivo, zoals blijkt uit de hierna te beschrijven proef "Protocol voor rosettes”. In een kweekmedium van menselijke T-lymfocyten met deze peptiden neemt de ADN synthese toe wat aantoont dat deze peptiden de vermenigvuldiging van menselijk T-lymfocyten in een dergelijk kweekmedium versterken. Dit wordt aangetoond in de later te beschrijven proef "Isolatie van menselijke periferale eenkernige cellen”. Verder worden meer T-lymfocyten die IgM 25 synthetiseren, waargenomen bij muizen die injecties met deze peptiden ontvingen, dan bij controlemuizen.

Dit blijkt uit de hierna te beschrijven proef "Responsie van lichaamsvloeistof’.

De in deze beschrijving gebruikte afkortingen volgen de aanbevelingen voor de nomenclatuur en symbolen voor aminozuren en peptiden uit 1983 van de IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (Eur. J. Biochem. 138, 9-37 (1984)). Voor een gemakkelijk begrip worden bepaalde van deze 30 afkortingen hierna vermeld:

Asp of D asparaginezuur

Ser of S serine 35 Lys of K lysine

Pro of P proline

Thr of T threonine Z benzyloxycarbonyl

Boe t-butoxycarbonyl 40 OBzl benzyloxy

Ac acetyl

Andere gebruikte afkortingen zijn: DMF dimethylformamide DCM dichloormethaan 45 NMM N-methylmorfoline TFA trifluorazijnzuur TLC dunnelaagchromatografie FAB bombardement met snelle atomen 50

De uitvinding heeft verder betrekking op een therapeutisch preparaat met immunologische werking dat 1 tot 300 mg van de peptide volgens een der conclusies 1 tot 3 als werkzaam bestanddeel bevat, in combinatie met geschikte dragers voor de gekozen wijze van toediening. Voor orale toediening en voor IP-toediening bevat het preparaat bij voorkeur respectievelijk 10 tot 200 mg en 1 tot 300 mg.

55 Het tripeptide Ser-Asp-Lys, waarop de andere peptiden volgens de uitvinding zijn gebaseerd, blijkt tot op de voorrangsdatum niet te zijn geïsoleerd of bereid. Deze sequenties van aminozuren zijn echter gevonden in verschillende levende proteïnen, bijvoorbeeld Ser-Asp-Lys in membraanproteïne van T-lymfocyt waar het 194918 2 blijkt te werken als een deel van een merkteken van lymfocyten zoals CD2-lymfocyt, en als a- of γ-subeenheid van T-receptor die de specifieke sequentie bevat welke een (bepaalde) plaats inneemt ten opzichte van bepaalde specifieke receptoren van de lymfocyt; deze aminozuursequenties kunnen ook worden gevonden in verschillende proteïnen, zoals virusproteïnen en ook in bepaalde proteïnen van het 5 complement of tumornecrosefactor α (bijvoorbeeld: WO 86/02381).

De peptiden van de uitvinding kunnen bereid worden met een werkwijze die wordt uitgevoerd langs de gebruikelijke weg door de volgende opeenvolging van reacties:

10 I Boe K(Z) - X() - OH

II Boe D(OBzl) - K(Z) - X() - OH

III Boe S(Bzl) - D(OBzl) - K(Z) - X() - OH

IV Boe W() - S(Bzl) - D(OBzl) - K(Z) - X() - OH

15 met de afspraak dat: a) de haken die staan na W of X leeg zijn als W en X de betekenis Pro hebben, dat de haken die staan na W Bzl bevatten indien W de betekenis Thr heeft en dat de haken die staan na X Z bevatten als X de betekenis Lys heeft, en 20 b) als W en/of X een valentiebinding voorstellen, de corresponderende stap wordt weggelaten.

Als een therapeutisch aanvaardbaar zout wordt bereid, bijvoorbeeld acetaat, moet het omzetten in de zoutvorm worden uitgevoerd voordat de laatste stap van verwijderen van een beschermende groep wordt uitgevoerd.

De oplosmiddelen die hierbij worden gebruikt zijn van Purex kwaliteit (zuiverheid > 99%, in sommige 25 gevallen >99,5%.). DMF wordt bewaard op een moleculaire zeef van 3 en 4 A.

TLCs worden gemaakt op in de handel verkrijgbare analytische platen. De platen worden waargenomen bij 254 nm en het chromatogram wordt zichtbaar gemaakt met een ninhydrine oplossing en volgens Pataki (G. Pataki, J. Chromatografph 12 (4; 1963), 541). Er worden de volgende oplosmiddelen gebruikt: A: DCM/methanol (vol.verh. 8/2) 30 B: n-butanol/AcoH/water (vol.verh. 4/1/1) en C: n-butanol/AcoH/water/pyridine (vol.verh. 1/1/1/1).

Tussenproducten worden zonodig gezuiverd op een kolom van siliciumdioxide (silica 60 A(40-60 pm SDS; natriumdodecylsulfaat) en ze worden gekarakteriseerd door hun massaspectrum (moleculaire piek of MH+), door een bombardement met snelle atomen (FAB).

35 Eindproducten worden gezuiverd door HPLC met een semi-preparatieve kolom (7,2 mm x 250 mm) van C18 C18/(ODS; oetadecylsilaan) ODS Hypersil 10 pm SFCC, waarbij op isocratische wijze of met een gradiënt wordt gewerkt.

Analyse van aminozuren wordt uitgevoerd na zure hydrolyse van het peptide met 6N HCI, bij 110°C gedurende 12 uur in een HPLC apparaat.

40 De uitvinding zal beter worden begrepen uit de beschrijving van de bereiding van Ser-Asp-Lys (i). SYNTHESE VAN PEPTIDEN

Syntheses zijn stap voor stap uitgevoerd met de gemengde anhydridemethode, onder toepassing van isobutylchloorformiaat of volgens de actieve estermethode, onder toepassing van esters van 45 N-hydroxysuccinimide. De beschermde aminozuren zijn in de handel verkrijgbare producten.

VERWIJDEREN VAN EEN BESCHERMENDE GROEP

De Boe groep wordt afgesplitst door acidolyse met TFA: het peptide wordt gedurende 1 tot 2 uur bij kamertemperatuur behandeld met een mengsel (vol.verh. 1/1) van DCM/TFA (10 tot 30 equivalenten).

50 De Z, Bzl of OBzl groepen worden gehydrogenolyseerd.

Het peptide, opgelost in een mengsel van methanol/water (vol.verh. 9/1) wordt gehydrogenolyseerd bij aanwezigheid van 10% Pd op kool.

ACETYLEREN

55 Acetyleren vindt plaats door acetylimidazool in DMF te laten reageren met het trifluoracetaat van het amine dat is geneutraliseerd met triêthylamine.

3 194918 BEREIDING VAN Boe D( OBzl) K(z) 1

De ester van het N-hydroxysuccinimide van Boe D(OBzl) (1 mmol) wordt opgelost in 2,5 ml DMF. Een suspensie van K(Z) (1,1 eq.) wordt aan deze oplossing toegevoegd; het mengsel wordt in een ijsbad geplaatst en onder roeren worden 1,1 eq. triëthylamine toegevoegd. Het roeren wordt 24 uur voortgezet.

5 Het reactiemengsel wordt onder verlaagde druk ingedampt. Het residu wordt daarna behandeld met ethylacetaat en een oplossing van 0,5 N HCI. De organische fase wordt uitgewassen met water, daarna met een verzadigde oplossing van natriumchloride en gedroogd boven natriumsulfaat en wordt tenslotte onder verlaagde druk drooggedampt. Het residu wordt gechromatografeerd over een kolom van silicagel en geëlueerd met een mengsel van DCM/methanol (vol.verh. 95/5). De homogene fracties van TLC worden 10 verzameld. Opbrengst 0,540 g.

BEREIDING VAN Boe S(Bzl) D(OBzl) K(Z) 2 0,5 mM van component 2 worden behandeld met 1,4 cm3 van een mengsel van TFA/DCM (vol.verh. 1/1) (20 equivalenten). Na 60 minuten behandeling bij kamertemperatuur, worden de oplosmiddelen onder verlaagde 15 druk afgedampt. Het residu wordt tweemaal behandeld met DCM en onder verlaagde druk gedroogd bij aanwezigheid van KOH.

De ester van het N-hydroxysuccinimide van Boe S(Bzl) (1,2 eq.) en het eerder verkregen trifluoracetaat worden opgelost in 1,3 ml DMF. Onder roeren met een magnetische roerder wordt 1 equivalent triëthylamine toegevoegd. Het roeren wordt 24 uur voortgezet. Het reactiemengsel wordt op dezelfde wijze 20 behandeld als beschreven voor bereiding 1^. Het residu wordt gechromatografeerd over silicagel en het verkregen product wordt geëlueerd met een mengsel van diëthylether/methanol (vol.verh. 8/2). De homogene fracties van het TLC worden verzameld (opbrengst: 0,318 g, 83%). Bij wrijven met pentaan wordt een vaste stof verkregen (0,27 g). Massaspectrometrie (MS) (FAB) MH+; berekend werd 763 en gevonden werd 763 en 763,100 (MhT - Boe).

25 BEREIDING VAN NAc S(Bzl) D( OBzl) K(Z) 3

Van het derivaat 2 wordt de beschermende groep verwijderd met een oplossing van 3,1 N HCI (20 equivalenten) in tetrahydrofuran. De oplossing wordt 6½ uur bij kamertemperatuur geroerd. Het reactiemengsel wordt ingedampt en onder verlaagde druk gedurende 1 nacht bij aanwezigheid van KOH gedroogd. 30 Het verkregen hydrochloride en 1,1 equivalent acetylimidazool worden opgelost in 1 ml DMF. De pH van deze oplossing wordt met triëthylamine op 7,5 gebracht. Het mengsel wordt 22 uur geroerd. Het reactiemengsel wordt daarna ingedampt en het residu wordt behandeld met ethylacetaat en een 0,5N oplossing van HCI. De organische fase wordt uitgewassen met water en met een verzadigde natriumchlorideoplossing en wordt daarna gedroogd boven natriumsulfaat.

35 MS FAB MH+, hiervoor werd berekend 705 en werd gevonden 705.

BEREIDING VAN NAc SDK 4 0,140 g van het derivaat 3 (0,2 mM) opgelost in 3 ml methanol en 1 ml water wordt 22 uur gehydrogenoly-seerd bij aanwezigheid van 10% Pd/C. De katalysator wordt afgefiltreerd over een filterlaag van celite en het 40 oplosmiddel wordt onder verlaagde druk afgedampt. Opbrengst: 0,079 g. Bij TLC ontstaan 2 vlekken die gevoelig zijn voor ninhydrine.

Het product wordt gezuiverd door HPLC, volgens de isocratische methode; elueermiddel: water TFA 0,1%; debiet 4 ml/min.; t = 8 min.

45 Analyse van aminozuren: S: 0,9 (1); D: 1,3 (1); K: 1,3 (1) MS: FAB MH+ hiervoor werd berekend 391 en werd waargenomen 391.

BEREIDING VAN SDK 5

Het tripeptide 2 wordt eerst 1½ uur lang behandeld met een mengsel van TFA/DCM (vol.verh. 1:1); daarna 50 worden de oplosmiddelen onder verlaagde druk afgedampt en wordt het residu behandeld met tolueen; het oplosmiddel wordt afgedampt en het residu wordt 20 uur lang bij kamertemperatuur gehydrogenolyseerd in een oplossing van 3 ml methanol en 0,3 ml water, bij aanwezigheid van 0,030 g Pd/C. De katalysator wordt afgefiltreerd op een filterlaag van celite en het oplosmiddel wordt onder verlaagde druk afgedampt. Opbrengst: 0,090 g.

55 MS MH+, hiervoor wordt gevonden 349 en werd berekend 349.

Product 5 wordt gezuiverd door middel van HPLC volgens de isocratische methode; elueermiddel: water TFA 0,10%, debiet 2 ml/min; t = 6 min.

194918 4

Analyse van aminozuren: S: 1(1); D: 0,8 (1); K: 1,3 (1).

De andere peptiden volgens de uitvinding worden bereid met dezelfde techniek als toegepast voor SDK. Het belang van de onderhavige uitvinding zal worden toegelicht door de volgende immunologische 5 rapporten.

PROTOCOL VOOR ROSETTES

I - Prepareren van rode bloedcellen van schapen.

Was de rode bloedcellen (RBC) driemaal uit in RPMI 1640 (universeel medium, Moore, c.s., Roswell Park 10 Memorial Institute, 1966) of PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) of Hanks (oplossing) + antibiotica. Centrifugeer gedurende 7 min met 3000 omw/min.

Breng het celsap in suspensie. Tel. Breng de concentratie op 2.108 RBC/ml in een oplossing van RPMI met 20% serum van foetale kalveren (FCS) (4 ml eerder geadsorbeerd aan 1 ml RBC sap, 30 min. houden op een ijsbad en daarna 7 min. centrifugeren met 3000 omw/min. en winnen van het materiaal onder 15 steriele omstandigheden).

II - Prepareren van Jurkat T-cellen.

Neem een afgemeten hoeveelheid van een culture van Jurkat T-cellen. Bepaal de levensvatbaarheid met Trypan blauw.

Neem vervolgens een volume hoeveelheid van de cellen die nodig is voor praktisch werken. Was de 20 cellen driemaal uit in RPMI 1640 of PBS of Hanks (oplossing) + antibiotica. Centrifugeer gedurende 7 min. met 900 omw/min.

Breng het celsap in suspensie. Tel. Breng de concentratie op 2.106 Jurkat T-cellen/ml oplossing van RPMI met 20% geadsorbeerde FCS.

III - Prepareren van het peptide.

25 Remmende oplossing = SDK (2.10'7 mol).

Te evalueren peptiden worden opgelost in RPM11640 in een geschikte concentratie.

IV - Test.

Breng in de proefbuis 200 μΙ van de remmende oplossing + 100 μΙ Jurkat T-cellen (met een concentratie van 2.10® M in RPMI + FCS 20%), laat de buis met inhoud 10 min. in een ijsbad staan. Voeg 100 μΙ RBC 30 2.10® M in RMPI + FCS 20%, toe.

Centrifugeer 5 min. met 500 omw/min.. Laat een nacht bij 4°C staan.

V - Tellen van rosettes.

Rust de microscoop uit met oculair 6x objectief 7x.

Breng de cellen zorgvuldig weer in suspensie door zachtjes te kloppen. Laat de buis met inhoud korte tijd 35 rustig staan.

Voeg aan de buis 30 pl van een 1% oplossing van Toluidine blauw toe (om de lymfocyten te kleuren). Klop zachtjes.

Voer per experimenteelpunt 3 aflezingen met de Malassex hemocytometer uit.

De resultaten zijn vermeld in de volgende tabel.

40 % ROSSETTE (percentage remming)

Peptide SDK PSDKP

45 Controle 63 ± 4 59 ±4 ΙΟ-4 M 38 ±3 (-40%)* 37 ±7 (-37%)** 10*s M 45 ± 4 (-28%) *** 33 ± 3 (-44%) * 10·® M 50 ± 2 (-22%) *** 27 ± 5 (-54%) * 10*7 M 49 ± 2 (-22%) * 45 ± 6 (-24%) *** 50 10·® M 40 ± 2 (-36%) * 48 ± 2 (-19%) *** 10"9 M 43 ± 1 (-32%) * 48 ± 4 (-19%) *** 10"1° M 43 ±3 (-32%)* 52 ± 5 (NS) 10"11 M 40 ± 1 (-36%) * 10’12M 44 ±3 (-30%)* 55 10*13 M 51 ± 7 (-19%) *** 10"14 M 55 ±2 (-14%)*** « 5 194918 % ROSSETTE (percentage remming) (vervolg) « ________

Peptide SDK PSDKP

5 10'1S M 63 ±4 (NS) () percentage remming *: a < 0,001 io *‘:a<0·01 ***: a < 0,05 ISOLATIE VAN MENSELIJKE PERIFERALE EENKERNIGE CELLEN.

I - Isolatie van (nPMN)

Verdun bloed tot de Vz concentratie met PBS. Breng 35 ml verdund bloed op 15 ml Ficoll-Hypaque.

15 Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. met 1800 omw/min. Neem de ring die correspondeert met mononucleaire cellen (MNC) weg met een Pasteur-pipet.

Was tweemaal uit in PBS (10 min. centrifugeren met 1800 omw/min.).

Breng de concentratie op 2.10e cellen/ml met RPMI 1640 ’’volledig” medium + 10% FCS (foetaal kalfsserum).

20 II - Reactieve producten PHA-M: reconstitueer een flesje van 5 ml gevriesdroogd materiaal met 5 ml "volledig” medium.

Oplossing van 100%. Verdun zo dat een 0,4% oplossing wordt verkregen.

Peptiden: SDK: Buis met 10® mol + 4,35 ml ’’volledig” medium. Oplossing 2,3x1ο-4 M.

Verdun daarna achtereenvolgens 450 pl ’’medium” + 50 μΙ verdunde oplossing.

25 III - Protocol

Breng in gesteriliseerde NUNC platen met 96 holten: 100 μΙ MNC met 2.10® cellen/ml (2,10® cellen) 50 μΙ PHA 0,4% (0,1% uiteindelijke concentratie) 50 μΙ medium 30 30 μΙ peptide (3.10 s M).

Incubeer 3 dagen lang bij 37°C in een atmosfeer van lucht/C02 (vol.verh. 95/5). Maak gedurende de laatste 24 uur een puls van [3H] thymidine: 1 pci/holte. Breng de inhoud van de holten op filters en tel met een teller.

De resultaten zijn vermeld in de volgende tabel.

35 Stimulatie van de proliferatie van T lymfocyten door Ser-Asp-Lys (SDK) en Pro-Ser-Asp-Lys-Pro (PSDKP)

PBL met 0,1% PHA DNA synthese geïnduceerd in MNC en gestimuleerd door 0,1% PHA

40 cpm x 103/2.10® cellen percentage stimulatie

Controle (RPM11640) 35 ± 2 + Autoloog RBC 44 ± 5 + 26% ** + SDK 3.105 M 56 ±5 +60%*

Controle (RPM11640) 40 ± 3 45 + SDK 3.10'10 M 52 ± 5 +30%***

Controle (RPM11640) 38 ± 3 + PSDKP 3.1 O'® M 54 ±4 +42%*** 50 *:a< 0,001 **: a < 0,02 —: a < 0,01 MNC: Mononuculeaire cel

55 RESPONSIE VAN LICHAAMSVLOEISTOF

6 tot 8 weken oude muizen van de stam B6D2F1 worden, op dag 0, gesensibiliseerd met 0,2 ml van een suspensie van rode bloedcellen van schapen [10® cellen] in een zoutoplossing volgens Hanks.

Claims (6)

194918 6 De peptiden Ser-Asp-Lys en Pro-Ser-Asp-Lys-Pro (3 pg/kg) werden, opgelost in fysiologisch serum, langs e IP weg, in 0,2 ml, op de bestemde tijd geïnjecteerd. Op dag + 4, worden de dieren gedood en wordt het aantal B-lymfocyten dat IgM immunoglobulinen afscheidt geteld met behulp van de hemolyseplaattechniek (methode van Jeme). 5. muizen/partij. 4 bepalingen/dier herhaalde proef: 2 experimenten/punt. De resultaten zijn vermeld in de volgende tabel. Stimulatie van de lichaamsvloeistof responsie bij muizen op een T-afhankelijk antigeen in de rode bloedcellen van schapen, door de peptiden Ser-Asp-Lys en Pro-Ser-Asp-Lys-Pro 10 (aantal P.F.C./10® cellen) Tijdstip van injectie Geïnjecteerde 15 Zoutoplossing Ser-Asp-Lys Pro-Ser-Asp-Lys-Pro - 24 h 444 ± 44 644 ±170 630 ±142 (+ 45) * (+ 42) * Oh 459 ± 103 903 ± 133 915 ± 140 (+ 97) * (+ 99) * 20 +24h 407 ± 66 459 ±103 475 ± 82 (NS) (NS) + 48 h 407 ±66 673 ±110 589 ± 101 (+ 65) * (+ 45) * + 72 h 459 ± 103 1073 ± 348 543 ± 112 25 (+ 134)* (NS) *: α < 0,001 **: α < 0,01 () percentage stimulatie 30 peptide-concentratie: 3 pg/kg TOXICITEIT Bij toediening per os in de maximaal toedienbare doses, aan ratten en muizen, werd van geen van de peptiden volgens de uitvinding enige toxiciteit vastgesteld. Langs de IP weg werden geen dode dieren 35 gevonden bij een toediening van 1 g/kg voor dezelfde dieren. WIJZE VAN TOEDIENEN EN POSOLOGIE Alleen het Ser-Asp-Lys peptide kan oraal worden toegediend en bereikt het doel zonder in belangrijke mate te worden afgebroken: tabletten en gelatinecapsules zijn geschikt voor doseereenheden die 10 mg 40 Ser-Asp-Lys bevatten. Bij toedienen langs deze weg vereisen de beschermde preparaatvormen en een hogere dosering per eenheid (20 mg). De dagelijkse doses kunnen lopen van 10 tot 100 mg (SDK) of van 20 tot 200 mg voor hogere peptiden. Bij toedienen langs IP weg zijn de dagelijkse doses 1 tot 10 mg voor onmiddellijke werking, maar preparaat vormen voor geleidelijke afgifte over langere tijd (micro-capsules, micro-bolletjes of dergelijke) kunnen tot 300 mg (actieve stof) bevatten voor een geleidelijke afgifte over een 45 langere periode.

1. Farmacologisch actieve peptiden die de aminozuursequentie Ser-Asp-Lys bevatten, met het kenmerk, dat zij de algemene formule H2N-W-Ser-Asp-Lys-X-OH hebben, waarin X een Pro- of Lys-rest of een valentie-binding voorstelt en W een Thr- of Pro-rest of een valentiebinding voorstelt, met dien verstande, dat als X een Pro-rest voorstelt, W eveneens een Pro-rest voorstelt, en therapeutisch aanvaardbare zouten daarvan.

2. Ser-Asp-Lys.

3. Pro-Ser-Asp-Lys-Pro.

4. Therapeutisch preparaat met immunologische werking, dat 1 tot 300 mg van een peptide volgens een der voorgaande conclusies als werkzaam bestanddeel bevat, in combinatie met geschikte drager voor de 7 194918 gekozen wijze van toediening.

5. Therapeutisch preparaat volgens conclusie 4, voor orale toediening, met het kenmerk, dat dit 10 tot 200 mg werkzaam bestanddeel bevat.

6. Therapeutisch preparaat volgens conclusie 4, voor IP-toediening, met het kenmerk, dat dit 1 tot 300 mg 5 werkzaam bestanddeel bevat. ♦