NL8700827A - Tripeptide met immunostimulerende werkzaamheid. - Google Patents

Description

Jè % * -1-* ^ ** S*·

Tripeptide met immunostimulerende werkzaamheid.

Uit gegevens van de literatuur is bekend, dat L-alanine belangrijk is voor de werking van T lymfocyten, omdat het wezenlijk is om te bereiken dat deze cellen in vitro respons kunnen geven op mitogene stimuli (Rotter V.

5 en anderen: J. Immunol. 123, 1726, 1979); bovendien is L-alanine ook wezenlijk voor de groei in vitro van lymfo-cyten (Nordlind K. en anderen: Int. Archs Allergy appl.

Immunol. 59, 215, 1979).

Gegevens uit laboratoria van aanvraagster rapporte-10 ren slechts een zeer zwakke immunostimulerende werkzaamheid van dit aminozuur, zoals is weergegeven in de proef in vitro van Thy 1.2 inductie aan onrijpe T cellen van normale muizen.

Vermeld wordt, dat ook L-arginine immunostimulerende 15 werkzaamheid zowel in vitro als in vivo heeft, in het bijzonder bij gewonde en onder druk verkerende dieren (Barbul A. en anderen: J. Surg. Res. 29, 228, 1980; J. Parenteral Enteral Nutr. 4.446, 1980; ibid. 5.492.1981) en in experimenteel geïnduceerde tumoren (Rettura G.: J. Parenteral En-20 teral Nutrition 3, 409, 1979).

In de onderhavige test bij Thy 1.2 inductie vertoont L-arginine een geringe werkzaamheid, hoewel statistisch significant.

Aanvraagster heeft een tripeptide met de reeks Arg-25 Ala-Arg gesynthetiseerd en heeft in de onderhavige proef de werkzaamheid ervan vergeleken met die van een mengsel van de twee afzonderlijke aminozuren in een molverhouding 2Arg:1Ala. Het tripeptide blijkt veel werkzamer te zijn dan het mengsel van de twee aminozuren, omdat het 13% van 30 de cellen (P < 0,01) induceert vergeleken met slechts 5% (statistisch niet significant) met het mengsel.

L-arginine is gekozen voor beide eindplaatsen van het tripeptide, op grond van het feit dat in vele bekende immunostimulerende peptiden dit aminozuur ofwel de N-eind 35 (als in het geval van thymopeptine) of de C-eind (bijvoorbeeld in tuftsin, ubiquitin, thymopoietin) positie inneemt. DE_CHEMISCHE_KARAKTERISTIEKEN_ZIJN_ALS_VOLGT£ MOLGEWICHT: 401,49 8700327 o -2- OPTISCHE ROTATIE: /*7^°= 3,69 (c = 1 azijnzuur) HPLC ANALYSE: het tripeptide werd geanalyseerd door middel van ion-parings-HPLC, volgens de scheidingsomstandigheden die hier beschre-5 van zijn:

Eluent: NaH2 P04 0,05M pH 4,3. + SDS 5x10-4 M: MeOH; 50:50. Stroomsnelheid: 1 ml/min.

Detectie: 225 nm Inspuitvolume: 20 mol 10 Monster: 20 mcg

Kolom: u Bondapack C18 (waters), 300 x 3,9 mm.

De volgende instrumentatie werd gebruikt:

Vloeistofchromatograaf; SERIE 4 (Perkin Elmer),

Inspuitklep: Reodyne mod. 7125-075, met een 20 μΐ lus, 15 Detector: Spectrofotometer LC 95 (Perkin Elmer),

Berekeningsintegrator: Data Station 3600 (Perkin Elmer),

De figuur geeft het HPLC profiel van het tripeptide weer.

BESTANDHEID TEGEN DE IN VITRO GESIMULEERDE MAAGOMGEVING.

20 Het tripeptide is bestand tegen de in vitro gesimu leerde maagomgeving. In dit onderzoek werd het gesimuleerde maagsap USP XXI (HCl + pepsina) 5 uur lang bij 37°C gebruikt.

_SYNTHESE_ N02 25 Boc-Ala-Arg-OBe (1)

Aan in methyleenchloride opgelost en tot 0°C +/-1 afgekoeld Boc-Ala (0,1 mol) werd isobutylchloorformiaat (0,1 mol) toegevoegd onder roeren terwijl de temperatuur afnam tot -15°C. Na 15 min. lang bij deze temperatuur roeren 30 van het reactiemengsel werd een vooraf gekoelde oplossing van NG.-nitro-arginine-benzylester di-p-tosylaat (0,1 mol) en N-methylmorfoline (NMM) (0,2 mol) in dimethylformamide langzaam toegevoegd en het reactiemengsel werd gedurende de nacht geroerd. Oplosmiddelen werden onder verminderde 35 druk verwijderd en het residu werd in ethylacetaat opgenomen. Het ethylacetaat werd met water, 1N-hydrochloridezuur, water 5%'s natriumbicarbonaatoplossing en water gewassen. Het werd boven natriumsulfaat gedroogd en oplosmiddel werd onder verminderde druk verwijderd. Het produkt is siroop. TLC 40 systeem CHC13:MeOH:HOAc (90:8:2). 95% zuiver: opbrengst 80%.

8700827 s -3- (1) werd gedeblokkeerd met 50% trifluorazijnzuur-methyleen-chloridemengsel (1:1), 10 ml per gram, gedurende een half uur. Het werd onder verminderde druk afgedampt, fijngewreven met ether, gefiltreerd, gewassen met ether en in vacuo 5 gedroogd. Opbrengst 98%.

Het TFA-Ala-Arg-QBe werd geneutraliseerd met NMM en gekoppeld aan Z3-Aeg in dimethylformamide-tetra-hydrofuran-mengsel onder gebruikmaking van NMM en isobutylchloorformiaat en opgewerkt als in (1). Opbrengst 60%. TLC systeem CHC13:MeOH 10 (92:8). Eén vrij grote vlek.

Het boven vermeld tripeptide werd gehydrogeneerd in azijnzuur-watermethanolmengsel in aanwezigheid van pd/c tot voltooiing ervan. Het werd van katalysator gefiltreerd en het filtraat werd in vacuo afgedampt.

15 Het produkt, tripeptide, werd door tegenstroomverde- ling gezuiverd onder gebruikmaking van het systeem N-buta-nol:azijnzuur:water (4:1:5). Opbrengst 50%. TLC systeem butanolïazijnzuur:water:pyridine (32:6:22:20). Eén vrij grote vlek. KPLC 97%.

20 BIOLOGISCHE_WERKZAAMHEDEN

2z_A__IN_VITRg_INDUCTIE_VAN_THY_I_.2_ANTIGEEN.

De capaciteit van Arg-Ala-Arg om in vitro de differentiatie van muize T cell voorlopers te induceren in lymfocy-ten die T cel markeerdere uitdrukken, werd onderzocht door 25 de inductie van Thy 1.2 membraan antigeen te bewijzen.

MATERIAAL EN WERKWIJZEN.

MUIZEN: athymische (nu/nu) muizen van 8 weken oud gekweekt op C3H/He achtergrond, in stand gehouden onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden, werden.gebruikt.

30 TOEBEREIDING VAN DE CELLEN: de mild wérd aseptisch verwijderd, fijngehakt, en geleid door een fijnmazige roestvrij stalen zeef naar HBSS. Splenocyten, gewassen en opnieuw gesuspendeerd in 199 medium (Gibco Ltd.) aangevuld met 1 % BSA (Boeh-ringer Mannheim) en gentamycine (100 μg/ml) werden 45 min.

35 lang geincubeerd in in evenwicht verkerende wolkolommen volgens de methode van Julius en anderen (Eur. J. Immunol. 3, 645, 1973). De effluentcelpopulaties verrijkt met voorloper T cellen werden gebruikt in de bioproef.

INDUCTIEBIOPROEF: 0,5 x10^ effluentcellen in 0,1 ml medium 40 werden 18 uur lang bij 37°C geincubeerd met 0,1 ml tripeptide 8700827 * «t _4« of medium alleen. Kweken werden in duplo uitgevoerd. Aan het eind van de incubatie werden de cellen gewassen met 0,87% ammoniumchloride teneinde rode cellen te lyseren en daarna met HBSS.

5 De inductie van membraan Thy 1.2 antigeen werd bepaald door een direkte immunofluorescentieproef.

DIRECTE IMMUNOFLUORESCENTIEPROEF: de cellen werden bij 4°C 20 min. lang geincubeerd met fluoresceïne-geconjugeerd mono-clonaal antilichaam (Bio-Yeda) met 1:200 verdunning. Het 10 mengsel werd 5 min. lang bij 300 g gecentrifugeerd, twee maal gewassen in HBSS en daarna gesupendeerd voor telling onder de fluorescentiemicroscoop (Leitz Orthoplan).

Het verschil in percentages van fluorescerende cellen tussen kweken met en zonder tripeptide gaven de inducerende 15 werkzaamheid van het produkt.

RESULTATEN * zoals is weergegeven in de tabel, induceert het tripeptide de verschijning van de merkstof Thy 1.2 op onrijpe cellen met een optimale respons bij 10 mcg/ml. De dosis/-responsrelatiekromme is beivormig, omdat lagere en hogere 20 concentraties van het tripeptide een kleinere inductie te weeg brengen.

TRIPEPTIDE I.ï5ï_ii2_+_CELLEN____________

CONCENTRATIE GEMIDDELDE VERSCHIL

+/- S.E.

25 ------------------------------------------------------------ 0 11 +/- 1'f6 0,001 13 +/- 3,9 + 2 0,001 25 +/- 5 +14 0,01 36 +/- 3,7 +25 30 0,1 36 +/- 5,4 +25 1 41 +/- 1,6 +30 10 48 +/- 2,2 +37 20 33 +/- 3,3 +22 50 29 +/- 3,3 +18 35 100 19 +/- 1,7 +8 200 19 +/- 4,5 +8

lu_§_M_YiY9_ïM2UCTIE_VAN_HET_THY_212_ANTIGEEN MATERIAAL EN WERKWIJZEN

40 ELS 2 werd toegediend op 4 achtereenvolgende dagen 8700827 -5- - Αι > waarna de muizen 24 uur lang rust kregen en daarna werden de milten verwijderd en de cellen werden onderzocht op uitdrukking van het Thy 1.2 antigeen door fluorescentie. Aan de vergelijkingsmuizen werd medium 199 (M 199) gegeven, het 5 medium waarin het geneesmiddel werd opgelost. De muizen hadden een gemiddeld gewicht van ongeveer 24 g.

RESULTATEN.

Oraal I. P.

10 Vergelijkingsmateriaal 2% 4% ELS2 42 Rg/kg 3% 4% ELS2 420 μg/kg 6% 7% ELS2 1055 pg/kg 17% 19% ELS2 2110 Mg/kg 16% 17% 15 ELS2 4220 μg/kg 18% 17% ELS2 8440 μg/kg 17% 20%

De gegevens tonen aan dat ELS2 in staat is om de rijping van splenocyten te induceren na zowel orale als i.p. toediening. De optimale dosering is 1055 μg/kg terwijl met 20 hogere doseringen een plateaurespons wordt waargenomen. ^_IN_VITRO_SIMULERING_VAN_LYMFOKINEBEREIDING>lt MATERIAAL EN WERKWIJZEN

BEREIDING VAN MENSOMTREKSBLOED MONONUCLEAIRE CELLEN (PBMC). Omtreksbloed werd verkregen van gezonde vrijwilligers 25 door aderpunktie. De rode bloedcellen werden van witte cellen gescheiden op Ficoll—Hipague gradiënten. De sterk geel gekleurde bekleding (PBMC) werd verwijderd en gewassen, en g de cellen werden opnieuw gesuspendeerd bij 1x10 cellen/ml in RPMI 164G, aangevuld met 1% penicilline/streptomycine, 30 1% glutamine en 1% door hitte onwerkzaam gemaakt fetaal KALF SERUM (FCS, 56 C, 30 min.).

BEREIDING VAN GROEIFACTOR.

6 PBMC bij 1x10 cellen/ml in 1% onder invloed.van hitte onwerkzaam gemaakt FCS werden geincubeerd met of zonder Fyto-35 hemagglutinine (PHA) met een concentratie van 0,75% (v/v).

Het te onderzoeken peptide werd toegevoegd met een concentratie van 1 μg/ml aan geschikte kweken. De incubatieperiode is 18-24 uur, bij 37°C in een vochtig gemaakte atmosfeer.

De kweken werden daarna gefiltreerd door 0,22 mm filters en 40 bovendrijvende materialen werden onderzocht op de aanwezig- 8700827 -6- heid van groeifactoren.

METINGEN VAN GROEIFACTOREN IN BOVENDRIJVENDE MATERIALEN.

A. Onderzoekcellen.

De B cellen die werden gebruikt voor onderzoek op de 5 aanwezigheid van B celgroeifactor (BCGF) waren lange termijn gekweekte cellijnèn, in stand gehouden op BCGF, en zijn EBV negatief. Deze cellen werden gekweekt in serumvrij medium onder toepassing van Nutridoma (Boehringer, Mannheim Biochemicals), en gaven geen respons op IL-2.

10 De T cellen gebruikt voor onderzoek op de aanwezigheid van IL-2 werden vers geïsoleerd. Zij werden in het begin gestimuleerd met PHA (0,75%) en werden in kweek gehouden gedurende tenminste 10 dagen voorafgaande aan het gebruik (ter vermindering van achtergrond en vaststelling van hun 15 afhankelijkheid van IL-2).

B. Bereiding van onderzoekcellen voor gebruik in proef.

1. B cellen werden gewoonlijk gebruikt 4 dagen na de laatste voeding met. BCGF. Zij werden 4 maal gewassen in RPMI

1640 ter verwijdering van elke overblijvende BCGF, en inge-4 20 steld op 15 x 10 cellen/ml in RPMI 1640 en Nutridoma (bij 1% eindconcentratie).

2. T cellen werden gebruikt 4 dagen na de laatste voeding 4 met IL-2. Zij werden 4 maal gewassen en ingesteld op 50x10 cellen/ml in RPMI 1640 met 5% FCS.

25 C. Proefprocedures.

1. Lange termijn gekweekte B cellen werden geincubeerd met uiteenlopende concentraties van bovendrijvend materiaal uit PBMC kweken, in 96 vlakke bodem microtiterplaten. Elke bron had een totaal volume van 200 μΐ, bestaande uit 100 μΐ 3 30 B cellen (15x10 cellen) en 100 μΐ bovendrijvend materiaal. Aanvraagster onderzocht de doeltreffendheid van de onderhavige proef B cellen door hen te incuberen met uiteenlopende concentraties van gezuiverd BCGF (Cellular Products, Ine. Buffalo, N.Y.).

35 De kweken werden 24 uur-lang geincubeerd waarna 1 pCurie van /^H-Tdrj werd toegevoegd en daarna 12 uur lang extra werden geincubeerd. De kweek werd daarna geoogst en geteld in een scintillatieteller.

2. T cellen werden geincubeerd in platbodembronnen. Het 40 totale volume in elke bron was 200 μΐ, hetgeen insluit 8700827

• Λ.' 'S

-7- 3 50x10 Τ cellen/bron.

De incubatieperiode was 72 uur hetgeen insluit 12 uur O ^ labellering met /5 -Tdr/.

RESULTATEN.

5 1} GROEIFACTORBEREIDINGEN.

_EXPERIMENT__1 (C.P.M.) %_Sup_.

Supt^^it 3^05 6_.25 12^5 25___50__ 10 PBL + PHA 424 1026 1674 3172 8392 PBL + PHA + ELS2 2772 4616 6336 8186 9818 TCGF_WERKZAAMHEID .(C. P. M. ) %_Sugj: PBL + PHA 542 192 224 564 1144 15 PBL + PHA + ELS2 384 718 1832 4028 8338 EXPERIMENT^ BCGF_ï^RKZAAMHEID (C.P.M.) %_Sug.

Sugt.uit 3.125 6_. 25 12^5 25 _ 50__ 20 PBL + PHA 1369 2187 2894 48768104 PBL + PHA +ELS2 2690 4214 7442 8730 11754 TCGF_^RKZAAMHEID (C.P.M.) %_Sug_.

PBL + PHA 1482 3146 4322 7184 9012 25 PBL + PHA +ELS2 2968 622Ö 9354 1201412984 ^.ΗΕΐςΤ^ΟΡ^ΝΑ,εΥΝΤΗΕεΕ^ EFFECT VAN ELS2 OP RNA SYNTHESE IN T CELLENS VAN DE MENS, ZOALS WAARGENOMEN DOOR OPNEMING VAN 3H-URIDINE. TELLINGEN PER MINUUT (CPM).

30 RESULTATEN VERKREGEN NA 24 UUR INCUBATIE.

T 3732 T+PHA 20752 ELS2_Concentratie pg/ml _0.1 _1_ 10, 20_ 35 T + ELS 2 4741 4834 5086 5130 T + ELS2 +PHA 31000 31413 32706 31494 4 r_lHiSï_2E_5NA_SYNTHESE.

EFFECT VAN ELS2 OP DNA SYNTHESE IN T CELLEN VAN DE MENS, ALS WAARGENOMEN DOOR OPNEMING VAN H-3THYMIDINE. AANTALLEN 40 PER MINUUT (CPM).

8700827 ) -8- RESULTATEN VERKREGEN NA 3 DAGEN INCUBATIE.

T 154 T+PHA 6076.

ELS2 Concentratie pg/ml 5 0_.02 0Λ1_ 2___ 12__ T + ELS2 152 166 190 234 T + ELS2 + PHA 5758 6477 7548 12317 5r_ïN_Yïï52_ï2l™ING_VAN_CELAANTAL_1_

Het tripeptide, toegevoegd aan kweken van hetzij T 10 lymfocyten hetzij mengsels van T en B lymfocyten elke vierde dag met een concentratie van 5μg/ml gedurende een periode van 30 dagen, is in staat het celaantal te vergroten met een maximum van +50% ten opzichte van de vergelijkings-kweken, waargenomen tussen dag 10 en dag 15 van het experi-15 ment.

ACUTE TOXICITEIT.

Onderzoeken naar acute toxiciteit uitgevoerd op muizen en ratten hebben aangetoond dat ten hoogste tot een 20 dosis van 1000 mg/kg i.m. het tripeptide totaal vrij was van toxische effecten.

VERDRAAGBAARHEID.

Onderzoeken aan konijnen en muizen hebben aangetoond dat het produkt, met de dosering van 100 mg/kg resp. i.v.

25 en i.p., niet enige hemodynamische modificatie en gedragseffect deden ontstaan. In het bijzonder vertoonde de slaap-tijd slechts een geringe verlenging.

ALLERGIE-INDUCERENDE WERKZAAMHEID.

Het produkt induceerde met de dosis van 100 mg/kg i.m., 30 geen enkel sensitiseringsverschijnsel bij het guinese biggetje.

ZOUTEN_VAN_HET_TRIPEPTIDE

De boven vermelde onderzoeken werden uitgevoerd met een acetaatzout van het tripeptide, maar het is bekend uit 35 de stand van de techniek dat soortgelijke resultaten kunnen worden verkregen onder toepassing van andere zouten van, bijvoorbeeld trifluoracetaat, hydrochloride, sulfaat.

-conclusies- 8700827

Claims (5)

1. Tripeptide gekenmerkt door het L-ala (alanine) en 2 L-Arg (arginine) met de volgende structuur Arg-Ala-Arg.

2. Tripeptide volgens conclusie 1, gekenmerkt door een. immunostimulerende werkzaamheid.

3. Tripeptide volgens conclusie 1, m e t het kenmerk , dat men deze eventueel therapeutisch toepast als geneesmiddel in ziekte r* die worden gekarakteriseerd 10 door primaire en secundaire deficiënties van het immune systeem.

4. Tripeptide volgens conclusie 1, gekenmerkt doordat het in staat is een immunostimulerende werkzaamheid na parenterale en orale toediening uit te oefenen.

5. Farmaceutisch aanvaardbare zouten van het tripeptide gekenmerkt , doordat men hen eventueel gebruikt als een geneesmiddel volgens conclusie 3 bijvoorbeeld acetaat , trifluoracetaat, hydrochloride, sulfaat. 8700827