NL8700827A - TRIPEPTIDE WITH IMMUNOSTIMULATING EFFICACY. - Google Patents
TRIPEPTIDE WITH IMMUNOSTIMULATING EFFICACY. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8700827A NL8700827A NL8700827A NL8700827A NL8700827A NL 8700827 A NL8700827 A NL 8700827A NL 8700827 A NL8700827 A NL 8700827A NL 8700827 A NL8700827 A NL 8700827A NL 8700827 A NL8700827 A NL 8700827A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- tripeptide
- cells
- els2
- arg
- pha
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0815—Tripeptides with the first amino acid being basic
- C07K5/0817—Tripeptides with the first amino acid being basic the first amino acid being Arg
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Jè % * -1-* ^ ** S*·Yes% * -1- * ^ ** S *
Tripeptide met immunostimulerende werkzaamheid.Tripeptide with immunostimulating activity.
Uit gegevens van de literatuur is bekend, dat L-alanine belangrijk is voor de werking van T lymfocyten, omdat het wezenlijk is om te bereiken dat deze cellen in vitro respons kunnen geven op mitogene stimuli (Rotter V.Literature data indicate that L-alanine is important for T lymphocyte function because it is essential to achieve that these cells can respond in vitro to mitogenic stimuli (Rotter V.
5 en anderen: J. Immunol. 123, 1726, 1979); bovendien is L-alanine ook wezenlijk voor de groei in vitro van lymfo-cyten (Nordlind K. en anderen: Int. Archs Allergy appl.5 and others: J. Immunol. 123, 1726, 1979); moreover, L-alanine is also essential for the in vitro growth of lymphocytes (Nordlind K. et al. Int. Archs Allergy appl.
Immunol. 59, 215, 1979).Immunol. 59, 215, 1979).
Gegevens uit laboratoria van aanvraagster rapporte-10 ren slechts een zeer zwakke immunostimulerende werkzaamheid van dit aminozuur, zoals is weergegeven in de proef in vitro van Thy 1.2 inductie aan onrijpe T cellen van normale muizen.Applicant laboratories report only very weak immunostimulatory activity of this amino acid, as shown in the in vitro assay of Thy 1.2 induction to immature T cells from normal mice.
Vermeld wordt, dat ook L-arginine immunostimulerende 15 werkzaamheid zowel in vitro als in vivo heeft, in het bijzonder bij gewonde en onder druk verkerende dieren (Barbul A. en anderen: J. Surg. Res. 29, 228, 1980; J. Parenteral Enteral Nutr. 4.446, 1980; ibid. 5.492.1981) en in experimenteel geïnduceerde tumoren (Rettura G.: J. Parenteral En-20 teral Nutrition 3, 409, 1979).L-arginine is also reported to have immunostimulatory activity both in vitro and in vivo, particularly in injured and pressurized animals (Barbul A. et al., J. Surg. Res. 29, 228, 1980; J. Parenteral Enteral Nutr. 4,446, 1980; ibid. 5,492,1981) and in experimentally induced tumors (Rettura G .: J. Parenteral En-20 teral Nutrition 3, 409, 1979).
In de onderhavige test bij Thy 1.2 inductie vertoont L-arginine een geringe werkzaamheid, hoewel statistisch significant.In the present assay at Thy 1.2 induction, L-arginine shows little activity, although statistically significant.
Aanvraagster heeft een tripeptide met de reeks Arg-25 Ala-Arg gesynthetiseerd en heeft in de onderhavige proef de werkzaamheid ervan vergeleken met die van een mengsel van de twee afzonderlijke aminozuren in een molverhouding 2Arg:1Ala. Het tripeptide blijkt veel werkzamer te zijn dan het mengsel van de twee aminozuren, omdat het 13% van 30 de cellen (P < 0,01) induceert vergeleken met slechts 5% (statistisch niet significant) met het mengsel.Applicant has synthesized a tripeptide of the Arg-25 Ala-Arg series and compared its effectiveness in the present experiment to that of a mixture of the two separate amino acids in a 2Arg: 1Ala molar ratio. The tripeptide appears to be much more effective than the mixture of the two amino acids, because it induces 13% of the cells (P <0.01) compared to only 5% (not statistically significant) with the mixture.
L-arginine is gekozen voor beide eindplaatsen van het tripeptide, op grond van het feit dat in vele bekende immunostimulerende peptiden dit aminozuur ofwel de N-eind 35 (als in het geval van thymopeptine) of de C-eind (bijvoorbeeld in tuftsin, ubiquitin, thymopoietin) positie inneemt. DE_CHEMISCHE_KARAKTERISTIEKEN_ZIJN_ALS_VOLGT£ MOLGEWICHT: 401,49 8700327 o -2- OPTISCHE ROTATIE: /*7^°= 3,69 (c = 1 azijnzuur) HPLC ANALYSE: het tripeptide werd geanalyseerd door middel van ion-parings-HPLC, volgens de scheidingsomstandigheden die hier beschre-5 van zijn:L-arginine has been selected for both tripeptide end sites, due to the fact that in many known immunostimulatory peptides this amino acid is either the N-terminus 35 (as in the case of thymopeptin) or the C-terminus (e.g. in tuftsin, ubiquitin , thymopoietin) position. DE_CHEMISCHE_KARAKTERISTKEN_ZIJN_ALS_VOLGT £ MOL WEIGHT: 401,49 8700327 o -2- OPTICAL ROTATION: / * 7 ^ ° = 3,69 (c = 1 acetic acid) HPLC ANALYSIS: the tripeptide was analyzed by ion pairing HPLC, according to the separation conditions described here are 5:
Eluent: NaH2 P04 0,05M pH 4,3. + SDS 5x10-4 M: MeOH; 50:50. Stroomsnelheid: 1 ml/min.Eluent: NaH2 PO4 0.05M pH 4.3. + SDS 5x10-4 M: MeOH; 50:50. Flow rate: 1 ml / min.
Detectie: 225 nm Inspuitvolume: 20 mol 10 Monster: 20 mcgDetection: 225 nm Injection volume: 20 mol 10 Sample: 20 mcg
Kolom: u Bondapack C18 (waters), 300 x 3,9 mm.Column: u Bondapack C18 (waters), 300 x 3.9 mm.
De volgende instrumentatie werd gebruikt:The following instrumentation was used:
Vloeistofchromatograaf; SERIE 4 (Perkin Elmer),Liquid chromatograph; SERIES 4 (Perkin Elmer),
Inspuitklep: Reodyne mod. 7125-075, met een 20 μΐ lus, 15 Detector: Spectrofotometer LC 95 (Perkin Elmer),Injection valve: Reodyne mod. 7125-075, with a 20 μΐ loop, 15 Detector: Spectrophotometer LC 95 (Perkin Elmer),
Berekeningsintegrator: Data Station 3600 (Perkin Elmer),Calculation Integrator: Data Station 3600 (Perkin Elmer),
De figuur geeft het HPLC profiel van het tripeptide weer.The figure shows the HPLC profile of the tripeptide.
BESTANDHEID TEGEN DE IN VITRO GESIMULEERDE MAAGOMGEVING.RESISTANCE TO THE VITRO SIMULATED VIRGIN ENVIRONMENT.
20 Het tripeptide is bestand tegen de in vitro gesimu leerde maagomgeving. In dit onderzoek werd het gesimuleerde maagsap USP XXI (HCl + pepsina) 5 uur lang bij 37°C gebruikt.The tripeptide is resistant to the in vitro simulated gastric environment. In this study, the simulated gastric juice USP XXI (HCl + pepsina) was used at 37 ° C for 5 hours.
_SYNTHESE_ N02 25 Boc-Ala-Arg-OBe (1)_SYNTHESE_ N02 25 Boc-Ala-Arg-OBe (1)
Aan in methyleenchloride opgelost en tot 0°C +/-1 afgekoeld Boc-Ala (0,1 mol) werd isobutylchloorformiaat (0,1 mol) toegevoegd onder roeren terwijl de temperatuur afnam tot -15°C. Na 15 min. lang bij deze temperatuur roeren 30 van het reactiemengsel werd een vooraf gekoelde oplossing van NG.-nitro-arginine-benzylester di-p-tosylaat (0,1 mol) en N-methylmorfoline (NMM) (0,2 mol) in dimethylformamide langzaam toegevoegd en het reactiemengsel werd gedurende de nacht geroerd. Oplosmiddelen werden onder verminderde 35 druk verwijderd en het residu werd in ethylacetaat opgenomen. Het ethylacetaat werd met water, 1N-hydrochloridezuur, water 5%'s natriumbicarbonaatoplossing en water gewassen. Het werd boven natriumsulfaat gedroogd en oplosmiddel werd onder verminderde druk verwijderd. Het produkt is siroop. TLC 40 systeem CHC13:MeOH:HOAc (90:8:2). 95% zuiver: opbrengst 80%.Dissolved in methylene chloride and cooled to 0 ° C +/- 1 Boc-Ala (0.1 mol) isobutyl chloroformate (0.1 mol) with stirring while the temperature decreased to -15 ° C. After stirring the reaction mixture at this temperature for 15 min., A pre-cooled solution of NG.-nitro-arginine-benzyl ester di-p-tosylate (0.1 mol) and N-methylmorpholine (NMM) (0.2 mol ) in dimethylformamide slowly added and the reaction mixture was stirred overnight. Solvents were removed under reduced pressure and the residue was taken up in ethyl acetate. The ethyl acetate was washed with water, 1N hydrochloric acid, water, 5% sodium bicarbonate solution and water. It was dried over sodium sulfate and solvent was removed under reduced pressure. The product is syrup. TLC 40 system CHCl3: MeOH: HOAc (90: 8: 2). 95% pure: yield 80%.
8700827 s -3- (1) werd gedeblokkeerd met 50% trifluorazijnzuur-methyleen-chloridemengsel (1:1), 10 ml per gram, gedurende een half uur. Het werd onder verminderde druk afgedampt, fijngewreven met ether, gefiltreerd, gewassen met ether en in vacuo 5 gedroogd. Opbrengst 98%.8700827 s -3- (1) was unblocked with 50% trifluoroacetic acid-methylene chloride mixture (1: 1), 10 ml per gram, for half an hour. It was evaporated under reduced pressure, triturated with ether, filtered, washed with ether and dried in vacuo. Yield 98%.
Het TFA-Ala-Arg-QBe werd geneutraliseerd met NMM en gekoppeld aan Z3-Aeg in dimethylformamide-tetra-hydrofuran-mengsel onder gebruikmaking van NMM en isobutylchloorformiaat en opgewerkt als in (1). Opbrengst 60%. TLC systeem CHC13:MeOH 10 (92:8). Eén vrij grote vlek.The TFA-Ala-Arg-QBe was neutralized with NMM and coupled to Z3-Aeg in dimethylformamide-tetrahydrofuran mixture using NMM and isobutylchloroformate and worked up as in (1). Yield 60%. TLC system CHCl3: MeOH 10 (92: 8). One fairly large spot.
Het boven vermeld tripeptide werd gehydrogeneerd in azijnzuur-watermethanolmengsel in aanwezigheid van pd/c tot voltooiing ervan. Het werd van katalysator gefiltreerd en het filtraat werd in vacuo afgedampt.The above-mentioned tripeptide was hydrogenated in acetic acid-water methanol mixture in the presence of pd / c until its completion. It was filtered from catalyst and the filtrate was evaporated in vacuo.
15 Het produkt, tripeptide, werd door tegenstroomverde- ling gezuiverd onder gebruikmaking van het systeem N-buta-nol:azijnzuur:water (4:1:5). Opbrengst 50%. TLC systeem butanolïazijnzuur:water:pyridine (32:6:22:20). Eén vrij grote vlek. KPLC 97%.The product, tripeptide, was purified by countercurrent distribution using the N-butanol: acetic acid: water system (4: 1: 5). Yield 50%. TLC system butanol acetic acid: water: pyridine (32: 6: 22:20). One fairly large spot. KPLC 97%.
20 BIOLOGISCHE_WERKZAAMHEDEN20 ORGANIC WORK
2z_A__IN_VITRg_INDUCTIE_VAN_THY_I_.2_ANTIGEEN.2z_A__IN_VITRg_INDUCTIE_VAN_THY_I_.2_ANTIGEEN.
De capaciteit van Arg-Ala-Arg om in vitro de differentiatie van muize T cell voorlopers te induceren in lymfocy-ten die T cel markeerdere uitdrukken, werd onderzocht door 25 de inductie van Thy 1.2 membraan antigeen te bewijzen.The ability of Arg-Ala-Arg to induce the differentiation of mouse T cell precursors in vitro in lymphocytes expressing T cell marker was investigated by proving the induction of Thy 1.2 membrane antigen.
MATERIAAL EN WERKWIJZEN.MATERIAL AND METHODS.
MUIZEN: athymische (nu/nu) muizen van 8 weken oud gekweekt op C3H/He achtergrond, in stand gehouden onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden, werden.gebruikt.MICE: 8 week old athymic (nu / nu) mice grown on C3H / He background, maintained under specific pathogen-free conditions, were used.
30 TOEBEREIDING VAN DE CELLEN: de mild wérd aseptisch verwijderd, fijngehakt, en geleid door een fijnmazige roestvrij stalen zeef naar HBSS. Splenocyten, gewassen en opnieuw gesuspendeerd in 199 medium (Gibco Ltd.) aangevuld met 1 % BSA (Boeh-ringer Mannheim) en gentamycine (100 μg/ml) werden 45 min.30 CELL PREPARATION: the mild was aseptically removed, chopped, and passed through a fine-mesh stainless steel sieve to HBSS. Splenocytes, washed and resuspended in 199 medium (Gibco Ltd.) supplemented with 1% BSA (Boeh-ringer Mannheim) and gentamycin (100 μg / ml) were added for 45 min.
35 lang geincubeerd in in evenwicht verkerende wolkolommen volgens de methode van Julius en anderen (Eur. J. Immunol. 3, 645, 1973). De effluentcelpopulaties verrijkt met voorloper T cellen werden gebruikt in de bioproef.Long incubated in equilibrated wool columns according to the method of Julius et al. (Eur. J. Immunol. 3, 645, 1973). The effluent cell populations enriched with precursor T cells were used in the bioassay.
INDUCTIEBIOPROEF: 0,5 x10^ effluentcellen in 0,1 ml medium 40 werden 18 uur lang bij 37°C geincubeerd met 0,1 ml tripeptide 8700827 * «t _4« of medium alleen. Kweken werden in duplo uitgevoerd. Aan het eind van de incubatie werden de cellen gewassen met 0,87% ammoniumchloride teneinde rode cellen te lyseren en daarna met HBSS.INDUCTION BIO TEST: 0.5 x 10 effluent cells in 0.1 ml of medium 40 were incubated with 0.1 ml of tripeptide 8700827 * t-4 «or medium alone for 18 hours at 37 ° C. Cultures were performed in duplicate. At the end of the incubation, the cells were washed with 0.87% ammonium chloride to lyse red cells and then with HBSS.
5 De inductie van membraan Thy 1.2 antigeen werd bepaald door een direkte immunofluorescentieproef.The induction of membrane Thy 1.2 antigen was determined by a direct immunofluorescence test.
DIRECTE IMMUNOFLUORESCENTIEPROEF: de cellen werden bij 4°C 20 min. lang geincubeerd met fluoresceïne-geconjugeerd mono-clonaal antilichaam (Bio-Yeda) met 1:200 verdunning. Het 10 mengsel werd 5 min. lang bij 300 g gecentrifugeerd, twee maal gewassen in HBSS en daarna gesupendeerd voor telling onder de fluorescentiemicroscoop (Leitz Orthoplan).DIRECT IMMUNOFLUORESCENCE TEST: The cells were incubated with fluorescein-conjugated monoclonal antibody (Bio-Yeda) at 1: 200 dilution for 20 min at 4 ° C. The mixture was centrifuged at 300 g for 5 min, washed twice in HBSS and then suspended for counting under the fluorescence microscope (Leitz Orthoplan).
Het verschil in percentages van fluorescerende cellen tussen kweken met en zonder tripeptide gaven de inducerende 15 werkzaamheid van het produkt.The difference in percentages of fluorescent cells between cultures with and without tripeptide gave the inducing activity of the product.
RESULTATEN * zoals is weergegeven in de tabel, induceert het tripeptide de verschijning van de merkstof Thy 1.2 op onrijpe cellen met een optimale respons bij 10 mcg/ml. De dosis/-responsrelatiekromme is beivormig, omdat lagere en hogere 20 concentraties van het tripeptide een kleinere inductie te weeg brengen.RESULTS * as shown in the table, the tripeptide induces the appearance of the Thy 1.2 marker on immature cells with an optimal response at 10 mcg / ml. The dose / response relationship curve is beiform, because lower and higher concentrations of the tripeptide induce smaller induction.
TRIPEPTIDE I.ï5ï_ii2_+_CELLEN____________TRIPEPTIDE I.ï5ï_ii2 _ + _ CELLS____________
CONCENTRATIE GEMIDDELDE VERSCHILCONCENTRATION AVERAGE DIFFERENCE
+/- S.E.+/- S.E.
25 ------------------------------------------------------------ 0 11 +/- 1'f6 0,001 13 +/- 3,9 + 2 0,001 25 +/- 5 +14 0,01 36 +/- 3,7 +25 30 0,1 36 +/- 5,4 +25 1 41 +/- 1,6 +30 10 48 +/- 2,2 +37 20 33 +/- 3,3 +22 50 29 +/- 3,3 +18 35 100 19 +/- 1,7 +8 200 19 +/- 4,5 +825 ------------------------------------------------- ----------- 0 11 +/- 1'f6 0.001 13 +/- 3.9 + 2 0.001 25 +/- 5 +14 0.01 36 +/- 3.7 +25 30 0.1 36 +/- 5.4 +25 1 41 +/- 1.6 +30 10 48 +/- 2.2 +37 20 33 +/- 3.3 +22 50 29 +/- 3.3 +18 35 100 19 +/- 1.7 +8 200 19 +/- 4.5 +8
lu_§_M_YiY9_ïM2UCTIE_VAN_HET_THY_212_ANTIGEEN MATERIAAL EN WERKWIJZENlu_§_M_YiY9_ïM2UCTIE_VAN_HET_THY_212_ANTIGEEN MATERIAL AND METHODS
40 ELS 2 werd toegediend op 4 achtereenvolgende dagen 8700827 -5- - Αι > waarna de muizen 24 uur lang rust kregen en daarna werden de milten verwijderd en de cellen werden onderzocht op uitdrukking van het Thy 1.2 antigeen door fluorescentie. Aan de vergelijkingsmuizen werd medium 199 (M 199) gegeven, het 5 medium waarin het geneesmiddel werd opgelost. De muizen hadden een gemiddeld gewicht van ongeveer 24 g.40 ELS 2 was administered on 4 consecutive days 8700827 -5- -> after which the mice rested for 24 hours and then spleens were removed and the cells assayed for expression of the Thy 1.2 antigen by fluorescence. The comparative mice were given medium 199 (M 199), the medium in which the drug was dissolved. The mice had an average weight of about 24 g.
RESULTATEN.RESULTS.
Oraal I. P.Oral I.P.
10 Vergelijkingsmateriaal 2% 4% ELS2 42 Rg/kg 3% 4% ELS2 420 μg/kg 6% 7% ELS2 1055 pg/kg 17% 19% ELS2 2110 Mg/kg 16% 17% 15 ELS2 4220 μg/kg 18% 17% ELS2 8440 μg/kg 17% 20%10 Reference material 2% 4% ELS2 42 Rg / kg 3% 4% ELS2 420 μg / kg 6% 7% ELS2 1055 pg / kg 17% 19% ELS2 2110 Mg / kg 16% 17% 15 ELS2 4220 μg / kg 18% 17% ELS2 8440 μg / kg 17% 20%
De gegevens tonen aan dat ELS2 in staat is om de rijping van splenocyten te induceren na zowel orale als i.p. toediening. De optimale dosering is 1055 μg/kg terwijl met 20 hogere doseringen een plateaurespons wordt waargenomen. ^_IN_VITRO_SIMULERING_VAN_LYMFOKINEBEREIDING>lt MATERIAAL EN WERKWIJZENThe data demonstrate that ELS2 is able to induce splenocyte maturation after both oral and i.p. administration. The optimal dose is 1055 μg / kg while a plateau sponge is observed at 20 higher doses. ^ _IN_VITRO_SIMULERING_VAN_LYMFOKINEPREPARATION> lt MATERIAL AND METHODS
BEREIDING VAN MENSOMTREKSBLOED MONONUCLEAIRE CELLEN (PBMC). Omtreksbloed werd verkregen van gezonde vrijwilligers 25 door aderpunktie. De rode bloedcellen werden van witte cellen gescheiden op Ficoll—Hipague gradiënten. De sterk geel gekleurde bekleding (PBMC) werd verwijderd en gewassen, en g de cellen werden opnieuw gesuspendeerd bij 1x10 cellen/ml in RPMI 164G, aangevuld met 1% penicilline/streptomycine, 30 1% glutamine en 1% door hitte onwerkzaam gemaakt fetaal KALF SERUM (FCS, 56 C, 30 min.).PREPARATION OF HUMAN CIRCULAR BLOOD MONONUCLEAR CELLS (PBMC). Circumferential blood was obtained from healthy volunteers by vein puncture. The red blood cells were separated from white cells on Ficoll-Hipague gradients. The strong yellow staining (PBMC) was removed and washed, and the cells were resuspended at 1x10 cells / ml in RPMI 164G supplemented with 1% penicillin / streptomycin, 30% glutamine and 1% heat inactivated fetal CALF SERUM (FCS, 56 C, 30 min.).
BEREIDING VAN GROEIFACTOR.PREPARATION OF GROWTH FACTOR.
6 PBMC bij 1x10 cellen/ml in 1% onder invloed.van hitte onwerkzaam gemaakt FCS werden geincubeerd met of zonder Fyto-35 hemagglutinine (PHA) met een concentratie van 0,75% (v/v).6 PBMC at 1 x 10 cells / ml in 1% heat deactivated FCS were incubated with or without Phyto-35 hemagglutinin (PHA) at a concentration of 0.75% (v / v).
Het te onderzoeken peptide werd toegevoegd met een concentratie van 1 μg/ml aan geschikte kweken. De incubatieperiode is 18-24 uur, bij 37°C in een vochtig gemaakte atmosfeer.The peptide to be tested was added at a concentration of 1 μg / ml to suitable cultures. The incubation period is 18-24 hours, at 37 ° C in a humidified atmosphere.
De kweken werden daarna gefiltreerd door 0,22 mm filters en 40 bovendrijvende materialen werden onderzocht op de aanwezig- 8700827 -6- heid van groeifactoren.The cultures were then filtered through 0.22 mm filters and 40 supernatants were examined for the presence of growth factors.
METINGEN VAN GROEIFACTOREN IN BOVENDRIJVENDE MATERIALEN.MEASUREMENTS OF GROWTH FACTORS IN SUPPLEMENTARY MATERIALS.
A. Onderzoekcellen.A. Research cells.
De B cellen die werden gebruikt voor onderzoek op de 5 aanwezigheid van B celgroeifactor (BCGF) waren lange termijn gekweekte cellijnèn, in stand gehouden op BCGF, en zijn EBV negatief. Deze cellen werden gekweekt in serumvrij medium onder toepassing van Nutridoma (Boehringer, Mannheim Biochemicals), en gaven geen respons op IL-2.The B cells used to test for the presence of B cell growth factor (BCGF) were long term cultured cell lines maintained on BCGF and are EBV negative. These cells were grown in serum-free medium using Nutridoma (Boehringer, Mannheim Biochemicals), and did not respond to IL-2.
10 De T cellen gebruikt voor onderzoek op de aanwezigheid van IL-2 werden vers geïsoleerd. Zij werden in het begin gestimuleerd met PHA (0,75%) en werden in kweek gehouden gedurende tenminste 10 dagen voorafgaande aan het gebruik (ter vermindering van achtergrond en vaststelling van hun 15 afhankelijkheid van IL-2).The T cells used to test for the presence of IL-2 were freshly isolated. They were initially stimulated with PHA (0.75%) and kept in culture for at least 10 days prior to use (to reduce background and determine their dependence on IL-2).
B. Bereiding van onderzoekcellen voor gebruik in proef.B. Preparation of Study Cells for Test Use.
1. B cellen werden gewoonlijk gebruikt 4 dagen na de laatste voeding met. BCGF. Zij werden 4 maal gewassen in RPMI1. B cells were usually used 4 days after the last feeding with. BCGF. They were washed 4 times in RPMI
1640 ter verwijdering van elke overblijvende BCGF, en inge-4 20 steld op 15 x 10 cellen/ml in RPMI 1640 en Nutridoma (bij 1% eindconcentratie).1640 to remove any remaining BCGF, and adjusted to 15 x 10 cells / ml in RPMI 1640 and Nutridoma (at 1% final concentration).
2. T cellen werden gebruikt 4 dagen na de laatste voeding 4 met IL-2. Zij werden 4 maal gewassen en ingesteld op 50x10 cellen/ml in RPMI 1640 met 5% FCS.2. T cells were used 4 days after the last feeding 4 with IL-2. They were washed 4 times and adjusted to 50x10 cells / ml in RPMI 1640 with 5% FCS.
25 C. Proefprocedures.25 C. Test procedures.
1. Lange termijn gekweekte B cellen werden geincubeerd met uiteenlopende concentraties van bovendrijvend materiaal uit PBMC kweken, in 96 vlakke bodem microtiterplaten. Elke bron had een totaal volume van 200 μΐ, bestaande uit 100 μΐ 3 30 B cellen (15x10 cellen) en 100 μΐ bovendrijvend materiaal. Aanvraagster onderzocht de doeltreffendheid van de onderhavige proef B cellen door hen te incuberen met uiteenlopende concentraties van gezuiverd BCGF (Cellular Products, Ine. Buffalo, N.Y.).1. Long-term cultured B cells were incubated with varying concentrations of supernatant from PBMC cultures in 96 flat bottom microtiter plates. Each source had a total volume of 200 μΐ consisting of 100 μΐ 3 30 B cells (15x10 cells) and 100 μΐ supernatant. The applicant investigated the effectiveness of the present Test B cells by incubating them with varying concentrations of purified BCGF (Cellular Products, Ine. Buffalo, N.Y.).
35 De kweken werden 24 uur-lang geincubeerd waarna 1 pCurie van /^H-Tdrj werd toegevoegd en daarna 12 uur lang extra werden geincubeerd. De kweek werd daarna geoogst en geteld in een scintillatieteller.The cultures were incubated for 24 hours after which 1 µCurie of /H-Tdrj was added and additional incubated for 12 hours. The culture was then harvested and counted in a scintillation counter.
2. T cellen werden geincubeerd in platbodembronnen. Het 40 totale volume in elke bron was 200 μΐ, hetgeen insluit 87008272. T cells were incubated in flat bottom sources. The total volume in each source was 200 μΐ, which includes 8700827
• Λ.' 'S• Λ. " S
-7- 3 50x10 Τ cellen/bron.-7- 3 50x10 Τ cells / source.
De incubatieperiode was 72 uur hetgeen insluit 12 uur O ^ labellering met /5 -Tdr/.The incubation period was 72 hours, which includes 12 hours of O-labeling with / 5 -Tdr /.
RESULTATEN.RESULTS.
5 1} GROEIFACTORBEREIDINGEN.5 1} GROWTH FACTOR PREPARATIONS.
_EXPERIMENT__1 (C.P.M.) %_Sup_._EXPERIMENT__1 (C.P.M.)% _Sup_.
Supt^^it 3^05 6_.25 12^5 25___50__ 10 PBL + PHA 424 1026 1674 3172 8392 PBL + PHA + ELS2 2772 4616 6336 8186 9818 TCGF_WERKZAAMHEID .(C. P. M. ) %_Sugj: PBL + PHA 542 192 224 564 1144 15 PBL + PHA + ELS2 384 718 1832 4028 8338 EXPERIMENT^ BCGF_ï^RKZAAMHEID (C.P.M.) %_Sug.Supt ^^ it 3 ^ 05 6_.25 12 ^ 5 25___50__ 10 PBL + PHA 424 1026 1674 3172 8392 PBL + PHA + ELS2 2772 4616 6336 8186 9818 TCGF_ACTIVITY. (CPM)% _Sugj: PBL + PHA 542 192 224 564 1144 15 PBL + PHA + ELS2 384 718 1832 4028 8338 EXPERIMENT ^ BCGF_ICABILITY (CPM)% _Sug.
Sugt.uit 3.125 6_. 25 12^5 25 _ 50__ 20 PBL + PHA 1369 2187 2894 48768104 PBL + PHA +ELS2 2690 4214 7442 8730 11754 TCGF_^RKZAAMHEID (C.P.M.) %_Sug_.Sugt. From 3.125 6_. 25 12 ^ 5 25 _ 50__ 20 PBL + PHA 1369 2187 2894 48768104 PBL + PHA + ELS2 2690 4214 7442 8730 11754 TCGF_ ^ RIGENESS (C.P.M.)% _Sug_.
PBL + PHA 1482 3146 4322 7184 9012 25 PBL + PHA +ELS2 2968 622Ö 9354 1201412984 ^.ΗΕΐςΤ^ΟΡ^ΝΑ,εΥΝΤΗΕεΕ^ EFFECT VAN ELS2 OP RNA SYNTHESE IN T CELLENS VAN DE MENS, ZOALS WAARGENOMEN DOOR OPNEMING VAN 3H-URIDINE. TELLINGEN PER MINUUT (CPM).PBL + PHA 1482 3146 4322 7184 9012 25 PBL + PHA + ELS2 2968 622Ö 9354 1201412984 ^ .ΗΕΐςΤ ^ ΟΡ ^ ΝΑ, εΥΝΤΗΕεΕ ^ EFFECT OF ELS2 ON RNA SYNTHESIS IN T CELLENS OF HUMAN AS OBSERVED BY 3. COUNTINGS PER MINUTE (CPM).
30 RESULTATEN VERKREGEN NA 24 UUR INCUBATIE.30 RESULTS OBTAINED AFTER 24 HOURS OF INCUBATION.
T 3732 T+PHA 20752 ELS2_Concentratie pg/ml _0.1 _1_ 10, 20_ 35 T + ELS 2 4741 4834 5086 5130 T + ELS2 +PHA 31000 31413 32706 31494 4 r_lHiSï_2E_5NA_SYNTHESE.T 3732 T + PHA 20752 ELS2_ Concentration pg / ml _0.1 _1_ 10,20_ 35 T + ELS 2 4741 4834 5086 5130 T + ELS2 + PHA 31000 31413 32706 31494 4 r_lHiSi_2E_5NA_SYNTHESE.
EFFECT VAN ELS2 OP DNA SYNTHESE IN T CELLEN VAN DE MENS, ALS WAARGENOMEN DOOR OPNEMING VAN H-3THYMIDINE. AANTALLEN 40 PER MINUUT (CPM).EFFECT OF ELS2 ON DNA SYNTHESIS IN T CELLS OF HUMANS AS OBSERVED BY INCLUSION OF H-3THYMIDINE. NUMBERS 40 PER MINUTE (CPM).
8700827 ) -8- RESULTATEN VERKREGEN NA 3 DAGEN INCUBATIE.8700827) -8- RESULTS OBTAINED AFTER 3 DAYS OF INCUBATION.
T 154 T+PHA 6076.T 154 T + PHA 6076.
ELS2 Concentratie pg/ml 5 0_.02 0Λ1_ 2___ 12__ T + ELS2 152 166 190 234 T + ELS2 + PHA 5758 6477 7548 12317 5r_ïN_Yïï52_ï2l™ING_VAN_CELAANTAL_1_ELS2 Concentration pg / ml 5 0_.02 0Λ1_ 2___ 12__ T + ELS2 152 166 190 234 T + ELS2 + PHA 5758 6477 7548 12317 5r_ïN_Yïï52_ï2l ™ ING_VAN_CELAANTAL_1_
Het tripeptide, toegevoegd aan kweken van hetzij T 10 lymfocyten hetzij mengsels van T en B lymfocyten elke vierde dag met een concentratie van 5μg/ml gedurende een periode van 30 dagen, is in staat het celaantal te vergroten met een maximum van +50% ten opzichte van de vergelijkings-kweken, waargenomen tussen dag 10 en dag 15 van het experi-15 ment.The tripeptide, added to cultures of either T 10 lymphocytes or mixtures of T and B lymphocytes every fourth day at a concentration of 5μg / ml over a 30 day period, is able to increase the cell number by a maximum of + 50% to the comparison cultures observed between day 10 and day 15 of the experiment.
ACUTE TOXICITEIT.ACUTE TOXICITY.
Onderzoeken naar acute toxiciteit uitgevoerd op muizen en ratten hebben aangetoond dat ten hoogste tot een 20 dosis van 1000 mg/kg i.m. het tripeptide totaal vrij was van toxische effecten.Acute toxicity studies conducted on mice and rats have shown that up to a dose of 1000 mg / kg i.m. the tripeptide was completely free of toxic effects.
VERDRAAGBAARHEID.Tolerability.
Onderzoeken aan konijnen en muizen hebben aangetoond dat het produkt, met de dosering van 100 mg/kg resp. i.v.Studies in rabbits and mice have shown that the product, at the dose of 100 mg / kg resp. i.v.
25 en i.p., niet enige hemodynamische modificatie en gedragseffect deden ontstaan. In het bijzonder vertoonde de slaap-tijd slechts een geringe verlenging.25 and i.p., did not induce any hemodynamic modification and behavioral effect. In particular, the sleep time showed only a slight extension.
ALLERGIE-INDUCERENDE WERKZAAMHEID.ALLERGY-INDUCING EFFICACY.
Het produkt induceerde met de dosis van 100 mg/kg i.m., 30 geen enkel sensitiseringsverschijnsel bij het guinese biggetje.At the dose of 100 mg / kg i.m., the product did not induce any sensitization phenomenon in the guinea pig.
ZOUTEN_VAN_HET_TRIPEPTIDESALTS_VAN_HET_TRIPEPTIDE
De boven vermelde onderzoeken werden uitgevoerd met een acetaatzout van het tripeptide, maar het is bekend uit 35 de stand van de techniek dat soortgelijke resultaten kunnen worden verkregen onder toepassing van andere zouten van, bijvoorbeeld trifluoracetaat, hydrochloride, sulfaat.The above studies were conducted with an acetate salt of the tripeptide, but it is known in the art that similar results can be obtained using other salts of, for example, trifluoroacetate, hydrochloride, sulfate.
-conclusies- 8700827- conclusions - 8700827
Claims (5)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT2002786 | 1986-04-09 | ||
IT20027/86A IT1188646B (en) | 1986-04-09 | 1986-04-09 | TRIPEPTIDE WITH IMMUNOSTIMULANT ACTIVITY |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NL8700827A true NL8700827A (en) | 1987-11-02 |
Family
ID=11163225
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NL8700827A NL8700827A (en) | 1986-04-09 | 1987-04-08 | TRIPEPTIDE WITH IMMUNOSTIMULATING EFFICACY. |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0645637B2 (en) |
KR (1) | KR870010080A (en) |
AR (1) | AR242799A1 (en) |
AT (1) | ATA88387A (en) |
AU (1) | AU597048B2 (en) |
BE (1) | BE1000263A4 (en) |
CA (1) | CA1322715C (en) |
CH (1) | CH676467A5 (en) |
DE (1) | DE3712050A1 (en) |
ES (1) | ES2003043A6 (en) |
FR (1) | FR2597107B1 (en) |
GB (1) | GB2189491B (en) |
GR (1) | GR870568B (en) |
IE (1) | IE59806B1 (en) |
IT (1) | IT1188646B (en) |
NL (1) | NL8700827A (en) |
SE (1) | SE8701457L (en) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2058553C1 (en) * | 1994-03-18 | 1996-04-20 | Иван Николаевич Головистиков | Method of estimation of human immune status suppressive link |
RU2056852C1 (en) * | 1994-03-18 | 1996-03-27 | Иван Николаевич Головистиков | Agent for treatment of autoimmune diseases with suppressor immunodeficiency and a method of autoimmune diseases treatment |
GB0130285D0 (en) * | 2001-12-19 | 2002-02-06 | Astrazeneca Ab | Chemical process |
GB0130286D0 (en) * | 2001-12-19 | 2002-02-06 | Astrazeneca Ab | Chemical process |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3778426A (en) * | 1970-12-16 | 1973-12-11 | Research Corp | Therapeutically useful polypeptides |
US4215112A (en) * | 1979-03-14 | 1980-07-29 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Tripeptides and methods |
-
1986
- 1986-04-09 IT IT20027/86A patent/IT1188646B/en active
-
1987
- 1987-04-06 IE IE88187A patent/IE59806B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-04-07 CH CH1336/87A patent/CH676467A5/it not_active IP Right Cessation
- 1987-04-07 SE SE8701457A patent/SE8701457L/en not_active Application Discontinuation
- 1987-04-08 NL NL8700827A patent/NL8700827A/en not_active Application Discontinuation
- 1987-04-08 AU AU71182/87A patent/AU597048B2/en not_active Ceased
- 1987-04-08 CA CA000534201A patent/CA1322715C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-04-09 FR FR878705021A patent/FR2597107B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-04-09 BE BE8700377A patent/BE1000263A4/en not_active IP Right Cessation
- 1987-04-09 GR GR870568A patent/GR870568B/en unknown
- 1987-04-09 ES ES8701042A patent/ES2003043A6/en not_active Expired
- 1987-04-09 KR KR870003455A patent/KR870010080A/en not_active Application Discontinuation
- 1987-04-09 JP JP62087896A patent/JPH0645637B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-09 AT AT0088387A patent/ATA88387A/en not_active Application Discontinuation
- 1987-04-09 DE DE19873712050 patent/DE3712050A1/en active Granted
- 1987-04-09 AR AR87307260A patent/AR242799A1/en active
- 1987-04-09 GB GB8708492A patent/GB2189491B/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU597048B2 (en) | 1990-05-24 |
AU7118287A (en) | 1987-10-15 |
FR2597107A1 (en) | 1987-10-16 |
GB8708492D0 (en) | 1987-05-13 |
JPS62267296A (en) | 1987-11-19 |
SE8701457L (en) | 1987-10-10 |
SE8701457D0 (en) | 1987-04-07 |
GB2189491B (en) | 1990-02-21 |
DE3712050A1 (en) | 1987-10-15 |
DE3712050C2 (en) | 1992-02-13 |
IE59806B1 (en) | 1994-04-06 |
CA1322715C (en) | 1993-10-05 |
BE1000263A4 (en) | 1988-09-27 |
AR242799A1 (en) | 1993-05-31 |
IT1188646B (en) | 1988-01-20 |
ATA88387A (en) | 1996-05-15 |
IT8620027A1 (en) | 1987-10-09 |
ES2003043A6 (en) | 1988-10-01 |
JPH0645637B2 (en) | 1994-06-15 |
KR870010080A (en) | 1987-11-30 |
GR870568B (en) | 1987-08-12 |
IE870881L (en) | 1987-10-09 |
CH676467A5 (en) | 1991-01-31 |
GB2189491A (en) | 1987-10-28 |
IT8620027A0 (en) | 1986-04-09 |
FR2597107B1 (en) | 1991-02-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2060998C1 (en) | Method of synthesis of peptides, peptides, immunomodulating composition and a method of regulation of insufficient or excessive function of t-cells in patient | |
KR100602529B1 (en) | Gamma-Glutamyl and Beta-Aspartyl Containing Immunomodulator Compounds and Methods Therewith | |
GB2027716A (en) | Oligomers of compounds of the muramylpeptide type and medicaments containing them | |
NL8700827A (en) | TRIPEPTIDE WITH IMMUNOSTIMULATING EFFICACY. | |
CA1315478C (en) | Tripeptide with immunostimulating activity | |
JPH0737479B2 (en) | Muramyl dipeptide derivative | |
NL194918C (en) | SDK peptide, and therapeutic compositions containing it. | |
EP0382251A2 (en) | New adamantyl comprising tripeptides, derivatives and hydrochlorides thereof, their preparation and use | |
US5656601A (en) | Acylated splenopentins, methods for their synthesis and their use | |
ES2350039T3 (en) | IMMUNOMODULATING COMPOUNDS CONTAINING GAMMA-GLUTAMILO AND BETA-ASPARTILO AND METHODS WITH THEM. | |
JPH11503426A (en) | MDP derivatives and complexes exhibiting stimulatory activity with respect to hematopoietic function and compositions containing them |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
BT | A notification was added to the application dossier and made available to the public | ||
BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
BB | A search report has been drawn up | ||
BC | A request for examination has been filed | ||
BV | The patent application has lapsed |