KR0133850B1 - Sdk 펩디드, 그의 제조 방법 및 그를 함유하는 치료 조성물 - Google Patents

Abstract

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Description

SDK 펩티드, 그의 제조 방법 및 그를 함유하는 치료 조성물

본 발명은 SDK펩티드, 그의 제조 방법 및 그를 함유하는 치료 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용된 약어들은 생화학 명명에 관한 INPAC-IUB 공동 위원회의 아미노산 펩티드 부호에 대한 명명의 1983추천(Eur. J. Biochem. 138, 9-37(1984))에 따르고 있다. 그러나 이해를 돕기 위하여, 약어들의 의미를 이하에 기재하였다.

본 발명은 일반식(Ⅰ)을 갖는 펩티드에 관한 것이다.

상기 식 중, X는 Pro 또는 Lys 잔기 또는 원자가 결합이고, W는 Thr 또는 Pro 잔기 또는 원자가 결합이되, 단 X가 Pro 잔기일 경우 W도 Pro 잔기이다.

일반식(Ⅰ)의 범위내에 포함된 펩티드로는 하기와 같이 열거할 수 있다.

본 발명은 일반식(Ⅰ)의 펩티드의 제약상 허용되는 염을 포함한다.

상기 트리펩티드(ⅰ)는 본 발명의 기타 펩티드의 기본이 되며 현재까지 단리되거나 제조되지 않는 것으로 알려지고 있다. 그러나, 상기 아미노산의 서열은 살아있는 단벽질 중에서 발견되며, 예를 들면 T림프구의 막 단백질 중의 Ser-Asp-Lys이고(이것의 작용은 림프구 CD₂뿐만 아니라 F-수용체의 α-또는γ-소단위와 같은 림프구 마커의 일부가 림프구의 특정한 수용체에 관계된 위치를 갖는 특정 서열로 이루어져 있을 때 나타남), 또한, 이들 아미노산 서열은 바이러스의 단백질과 같은 다양한 단백질 및 보체 또는 종양 괴사 인자α의 특정 단백질에서 발견될 수 있다.

따라서, 특정 아미노산 서열의 작용을 조사하는 것은 특히 흥미로운 일이었고, 본 발명에 의해서 면역학의 여러 논문들에 의해 입증된 바와 같이 면역-조절분야에 있어서 특정 아미노산의 서열이 중요한 역할을 담당하는 것을 밝혀내게 되었다.

또한, 본 발명은 하기 반응 순서를 통해서 통상의 경로로 처리되는 상기 펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.

Ⅰ Boc K(Z)-X()-OH

Ⅱ Boc D(OBzl)-K(Z)-X()-OH

Ⅲ Boc S(Bzl)-D(OBzl)-K(Z)-X()-OH

Ⅳ Boc W()-S(Bzl)-D(OBzl)-K(Z)-X()-OH

상기 반응 순서는 다음과 같은 규칙을 갖는다.

a)W 및 X가 Pro를 의미할 때 W 또는 X 다음의 괄호는 비워지며, W가 Thr일 때 W 다음의 괄호는 Bzl 포함하며 X가 Lys를 의미할 때 X다음의 괄호는 Z를 포함시키고,

b)W 및(또는) X가 원자가 결합을 의미할 때 대응하는 단계는 생략된다.

치료상 허용되는 염(예, 아세틸)을 제조할 경우에 염화 반응은 최종 탈보호 단계 이전에 실시되어야 한다.

여기서 사용된 용매는 Purex quality의 제품이다. DMF는 2 내지 4A-분자체에서 저장한다.

TLC는 통상의 분석 플레이트에서 실시한다. 플레이트를 254nm에서 관찰하고 파다끼(Pataki)의 방법에 따라 닌히드린 용액을 사용하여 밝혀냈다. 다음 용매를 사용하였다.

A : DCM/메탄올(8/2부피비)

B : n-부탄올/AcOH/물(4/1/1부피비)

C : n-부탄올/AcOH/물/피리딘(1/1/1/1 부피비).

필요할 경우 중간 생성물을 실리카 칼럼(실시카 60A(40-60μ) (SDS)상에서 정제하고 질량 스펙트럼(분자 피크 또는 MH+), 고속 질량 충격(FAB)으로 특성을 기술한다.

최종 생성물을 반 예비 칼럼(7.2mm x 250mm) C₁₈ODS Hypersil 10μ SFCC, 이소크라틱법 또는 구배로 HPLC에 의해 정제한다.

아미노산 분석은 110℃에서 12시간 동안 HPLC장치 상에서 6N HCL로 펩티드를 산 가수분해시킨 후 실시한다.

최종적으로, 본 발명은 유효 성분인 충분한 량의 상기 펩티드를 선택된 투여 경로에 적당한 담체에 혼합한 치료 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 다음 Ser-Asp-Lys(ⅰ)의 제조예의 상세한 설명으로부터 더욱 잘 이해될 수 있을 것이다.

[펩티드의 합성]

이소부틸 클로로포르메이트를 사용한 혼합 무수물법 또는 N-히드록시숙신이 미드의 에스테르를 사용한 활성 에스테르법으로 단계적으로 합성을 실시한다. 보호 아미노산은 공업용이다.

[탈보호]

BOC기를 TFA를 사용한 산 첨가 분해로 분열시키고 이 펩티드를 실온에서, 1내지 2시간 동안 DOM/TFA 혼합물(1/1부피비, 10 내지 30당량)로 처리하였다.

ZBzl 또는 OBzl기를 가수소분해시켰다. 이 펩디드를 메탄올/물(9/1부피비)의 혼합 용액 중에 용해하고 10%Pd/c존재하에 가수소분해시켰다.

[아세틸화 반응]

DMF중의 트리에틸아민으로 중화시킨 아민의 트리플루오로아세테이트 상에 아세틸이미다졸을 반응시킴으로써 아세틸화 반응을 실시하였다.

[Boc D (OBzl) K(z)(1)의 제조예]

Boc D (OBzl)의 N-히드록시숙신이미드의 에스테르(1몰)를 DMF.k(z) (1.1당량)2.5ml 현탁액 중에 용해시키고 빙욕조 상에 두고 교반하에서 트리에틸아민 1.1당량을 첨가하였다. 24시간 동안 교반을 계속하였다. 감압하에서 반응혼합물을 증발시켰다. 이어서, 잔류물을 에틸 아세테이트 및 0.5N HC1 용액으로 처리하였다. 유기상을 물에 이어서 염화나트륨 포화 용액으로 세척하고 황산나트륨 상에서 건조시키고 최종적으로 감압하에서 증발시켰다. 잔류물을 실리카겔 칼럼상에서 크로마토그래피하고 DCM/메탄올 (95/5 부피비)의 혼합물로 용출시켰다.

TLC로 부터 균질한 분류물을 수집하였다. 수율 : 0.540g

Boc S(Bzl) D(OBzl)K(Z)(2)의 제조예

0.5mM(1)을 TFA/DCM(1/1부피비, 20당량)의 1.4cm³혼합물로 처리하였다.

실온에서 60분 동안 방치시킨 후, 감압하에서 용매를 증발시켰다. 잔류물을 DCM으로 2회 처리하고 KOH의 존재하에 감압하에서 건조시켰다.

Boc S(Bzl)의 N-히드록시숙신이미드의 에스테르(1.2 당량) 및 전에 얻은 트리플루오로아세테이트를 DMF 1.3ml 중에서 용해시켰다. 자기 교반하에서 트리에틸아민 1당량을 첨가하였다. 24시간 동안 교반을 지속시켰다. 반응 혼합물을(1)에 대한 것과 같이 처리하였다. 잔류물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피하고 생성물을 디에틸에테르/메탄올(8/2부피비)의 혼합물로 용출시켰다. TLC로 부터 균질한 분류물을 수집(수율:0.318g, 83%)하였다. 펜탄으로 처리했을 때 고체(0.27g)을 얻었다. 질량 스펙트럼(MS)(FAB) MH+ 결과:이론치 : 763, 실측치(MH+-Boc)763 및 763.100.

NAc S(Bzl)D(OBzl)K(Z)(3)의 제조예

유도체(2)를 테트라히드로푸란 중의 3.1N HCL(20당량) 용액으로 탈보호시켰다. 용액을 실온에서 6.5시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 증발시키고 KOH의 존재하에 하룻밤 동안 감압하에서 건조시켰다.

생성된 염수화물 및 아세틸이미다졸 1.1당량을 DMF 1m1중에 용해시켰다. 상기용액의 pH를 트리에틸아민으로 7.5가 되게 하였다. 혼합물을 22시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 증발시키고 잔류물을 에틸 아세테이트 및 0.5N HC1용액으로 처리하였다. 유기상을 물 및 염화나트륨 포화 용액으로 세척하고 이어서 황산나트륨 상에서 건조시켰다. MS FAB MH+, 이론치:705, 실측치:705.

[NAc SDK(4)의 제조예]

0.2mM(3) 0.140g을 메탄올 3ml중에 용해하고 물 1ml를 10% Pd/c의 존재하에 22시간 동안 가수소분해시켰다. 촉매를 셀리트 패드 상에서 여과해 내고 감압하에서 용매를 증발시켰다. 수율 : 0.079g. TLC는 닌히드린에 민감한 2개 점을 나타내었다.

생성물을 HPLC, 이소크라틱법; 용출제 : 물 : TFA 0.1%; 유속 4ml/분; t=8분으로 정제하였다.

아미노산의 분석 = S : 0.9(1); D : 1.3(1); K : 1.3(1)

MS : FBB MH+, 이론치 : 391, 실측치 : 391.

[SDK(5)의 제조예]

최초로 트리펩티드(2)를 TFA/DCM(1:1부피비)의 혼합물로 1시간 반동안 처리하고 이어서 용매를 감압하에 증발시키고 잔류물을 톨루엔으로 처리하고 용매를 증발시키고 잔류물을 메탄올 3ml 및 물 0.3ml 용액 중에 Pd/C 0.030g 존재하에 실온에서 20시간 동안 가수소분해하였다. 촉매를 셀리트 패드 상에서 여과하고 용매를 감압하에서 증발시켰다.

수율 : 0.090g

MS MH+ ; 이론치 : 349, 실측치 : 349.

(5)를 HPLC, 이소크라틱법, 용출제 : 물, TFA 0.10%, 유속 2ml/분; t=6분으로 정제하였다.

아미노산의 분석 : S : 1(1); D : 0.8(1); K : 1.3(1)

본 발명의 기타 펩티드는 SDK와 같은 종류의 기술로 제조된다.

본 발명의 잇점은 다음의 면역학적 연구 결과에 의해 예증될 것이다.

[로제트(Rosettes) 실험계획]

I-양의 적혈구 세포의 제조예

- RPMI 1640 또는 RBS 또는 Hanks+항생 약물에서 적혈구 세포(RBC)를 3회 세척하였다. 3000rpm에서 7분간 원심분리시켰다.

- 세포액을 현탄액 중에 넣었다. 계수하고 20% 태내 송아지 혈청(FCS)에서 RPMI 용액 중의 2.10⁸RBC/ml(RBC액 1ml상에서 4ml를 흡수시키고 빙욕조 상에서 30분간 체류시키고 이어서, 3000rpm에서 7분간 원심분리하고 무균 상태로 회수함)이 되게 하였다.

[II-주르카트(Jurkat) T 세포의 제조예]

- 배양액에 일정량의 주르카트 T세포를 넣고 트리판 불루우(Trypan blue)로 생육시켰다.

- 이어서 실제 공정에 필요한 부피의 세포를 취하였다. 세포를 RPMI 1640 또는 PBS 또는 Hanks + 항생 약물에서 3회 세척하였다. 900rpm에서 7분간 원심분리시켰다.

- 세포액을 현탁액에 넣었다. 20% 흡수 FCS에서 RPMI 용액 중 2.106 주르카트 T 세포/ml가 되게하였다.

[III-펩티드의 제조예]

- 억제용액 = SDK(2.10^-7몰)

조사할 펩티드를 적당한 농도에서 RPMI 1640중에 용해시켰다.

[IV-시험]

- 시험관에 억제 용액 200μ1 + RPMI 중 2.10⁶M의 주르카트 T 세포 100μ1 + 20% FCS룰 넣었다. 얼음 욕조 상에서 10분간 체류시켰다. RPMI + 20% FCS 중의 RBC 2.10⁸M 100μ1를 첨가하였다.

- 500rpm에서 5분간 원심분리시켰다. 4℃에서 철야 방치하였다.

[V-로제트의 계수]

- 현미경 배치 = 접안렌즈 : X6

대물렌즈 : X7

- 세포를 가볍게 두드려서 다시 현탁액으로 되돌려 놓았다. 한동안 방치시켰다.

- 시험관에 1% 톨루이딘 불루우 30μ1(림프구를 염색시키기 위함)를 첨가하였다. 가볍게 두드렸다.

- 각 실험 효과를 3개의 말라섹스(Malassex) 혈구계로 표시하였다.

- 결과를 다음 표에 기재하였다.

사람의 말초 단핵 세포의 단리

I-(nPMN)의 단리

PBS 1/2에서 혈액을 희석시켰다.

Ficoll-Hypaque 15ml 상에 희석 혈액 35ml를 첨가하였다. 실온, 1800rpm에서 30분간 원심분리시켰다. 단핵 세포(MNC)에 해당하는 고리부를 파스퇴르 피펫으로 취하였다. PBS(1800rpm에서 10분간 원심분리함)에서 2회 세척하였다. RPMI1640 완전 배지 + 10% SVF로 2.10 세포/ml가 되게 하였다.

[II-반응 생성물]

PHA-M : 완전 배지 5ml로 동결건조시킨 5ml병을 희석시켰다. 100% 용해시키고 용액을 희석하여 0.4% 용액을 얻었다.

펩티드 :

- SDK : 10 몰 + 4.35ml 완전배지를 시험관에 넣었다. 용액 2.3 x 10 M.

이어서 계속해서 희석하였다 : 450μ1 배지 + 희석액 50μ1

[III-실험계획]

96-웰 무균 박스 NUNC 내에

- 2.10 세포/ml(2.10 세포)의 MNC 100μ1

- 0.4%(최종 0.1%)의 PHA 50μ1

- 배지 50μ1

- (3.10-5M)의 펩티드 30μ1를 넣었다.

37℃ 공기/CO2(95/5) 분위기에서 3일간 배양시켰다. 마지막 24시간 동안 [3H]티미딘 : 1μCi/웰을 가하였다. 필터 상에서 웰을 수집하고 계수기로 계수하였다.

결과를 다음 표에 기재하였다.

Ser-Asp-Lys(SDK) 및 Pro-Ser-Asp-Lys-Pro

(PSDKP)에 의한 T림프구의 증식의 자극

[체액 반응]

생후 6 내지 8주의 B6D2F1종 생쥐를 Hanks의 염수 용액 중의 양의 적혈구 세포의 현탁액 [10⁸개 세포] 0.2ml로 0일째에 감작시켰다.

일정시간, 복강내 경로로 Ser-Asp-Lys 및 Pro-Ser-Asp-Lys-Pro 펩티드(3μ/g/kg)을 생리적 장액 중에 용해(0.2ml)시켜 주사하였다.

4일 후, 동물은 사망하였고 IgM 면역 글로블린을 분비하는 많은 B림프구를 용혈 반점 기술(Jerne법)로 계수하였다.

8마리 쥐/배치식으로 4회 측정/동물, 재조작 시험 : 2회 실험/항목

결과를 다음 표에 기재하였다.

양 적혈구 세포에 대한 생쥐의 체액 자극 반응 Ser-Asp-Lys 및 Pro-Ser-Asp-Lys-Pro펩티드에 의한 T종속 항원(P.F.C./10⁶세포수)

[독성]

본 발명에 의한 임의의 펩티드를 최대 투여가능량으로 쥐 및 생쥐에 경구로 투여했을 때 독성이 나타나지 않았다. 동일 복강내 복강내 경로로 1g/체중 kg을 투여했을 때도 케사망 동물이 나타나지 않았다.

[약량학]

Ser-Asp-Lys 펩티드는 경구로만 투여될 수 있으며 실질적인 변질없이 목표에 도달할 수 있다. 정제 및 젤라틴 캡슐제는 Ser-Asp-Lys 10mg을 함유하는 투여 단위가 적당하다. 상기 경로로 좀더 고분자 펩티드는 보호 형태 및 더욱 높은 단위 투여량(20mg)을 필요로 한다. 1일 투여량은 고분자 펩티드 당 10 내지 100mg(SDK)또는 20 내지 200mg일 수 있다. 복강내 경로에 의해 즉시 작용을 위한 1일 투여량은 1 내지 10mg이나 지연 방출형태(미세캡슐제, 미세구형제)는 장기 방출 형태로 최대 300mg을 함유할 수 있다.

Claims (14)

1. 하기 일반식을 갖는 펩티드 및 그의 치료상 허용되는 염.

   H₂N-W-Ser-Asp-Lys-X-OH

   상기식에서, X는 Pro 또는 Lys 잔기 또는 원자가 결합이며, W는 Thr 또는 Pro잔기 또는 원자가 결합이되, 단 X가 Pro 잔기일 경우 W도 Pro 잔기이다.
2. Ser-Asp-Lys.
3. Ser-Asp-Lys-Lys.
4. Pro-Ser-Asp-Lys-Lys.
5. Thr-ser-Asp-Lys.
6. 내용없음
7. Thr-Ser-Asp-Lys.
8. Pro-Ser-Asp-Lys-Pro.
9. 통상적인 경로를 통해 다음 반응 공정을 수행하는 것을 특징으로 하는 제1항 기재 펩티드의 제조 방법.

   I Boc K(Z)-X( )-OH

   II Boc D(OBzl)-K(Z)-X( )-OH,

   III Boc S(Bzl)-D(OBzl)-K(Z)-X( )-OH

   IV Boc W( )-S(Bzl)-D(OBzl)-K(Z)-X( )-OH

   상기 식에서 a) W 및 X가 Pro를 나타낼 때 W 또는 X 다음의 괄호는 빈 괄호이고, W가 Thr을 나타낼 때 W 다음의 괄호는 Bzl을 포함하며, X가 Lys를 나타낼 때 X다음의 괄호는 Z를 포함하고, b) W 및 (또는) X가 원자가 결합일 때 해당하는 공정은 생략된다.
10. 제9항에 있어서, 이소부틸 클로로포름을 사용한 혼합 무수물법에 의해 수행되는 제조 방법.
11. 제9항에 있어서, N-히드록시숙신이미드의 에스테르를 사용한 활성 에스테르법에 의해 수행되는 제조 방법.
12. 유효 성분인 제1 내지 8항에 의한 펩티드 1 내지 300mg 선택된 투여 경로에 따라 적당한 담체와 혼합시킨 면역 조절 작용을 갖는 치료 조성물.
13. 제12항에 있어서, 유효 성분을 10 내지 200mg 함유하는 것을 특징으로 하는 경우 투여용 조성물.
14. 제12항에 있어서, 유효 성분을 1 내지 300mg 함유하는 것을 특징으로 하는 복강내 투여용 조성물.