CN114213216B - 一种没药烷型倍半萜类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种没药烷型倍半萜类化合物及其制备方法与应用，属于化学药物技术领域。该没药烷型倍半萜类化合物为式Ⅰ所示的化合物、或其晶型、或其盐。其中，R1～R5分别或同时选自氢、C1～C6烷基、卤素、羟基、C1～C6烷氧基、氨基、羧基。本发明通过对姜黄提取、分离纯化，得到一种具有良好舒张血管作用的倍半萜类化合物。该化合物可用于舒张血管，为临床上筛选和/或制备舒张血管药物提供了一种新的选择。
Figure DDA0003415518010000011

Description

一种没药烷型倍半萜类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于化学药物技术领域，具体涉及一种没药烷型倍半萜类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是指由于心脏或血管功能异常引起的高血压、冠心病、中风、心肌梗死等疾病的统称，是医学界公认的威胁人类健康的第一杀手。世界卫生组织将其列为世界三大重大防治疾病之一，预防和治疗CVD是当代医药学亟待解决的科学问题。
姜黄药材为姜科(Zigiberaceae)植物姜黄Curcuma longa L.的干燥根茎，为传统的活血化瘀中药，具有活血行气、通经止痛的作用，临床上用于胸胁刺痛，胸痹心痛，痛经经闭，癥瘕，风湿肩臂疼痛，跌扑肿痛等症。现代药理研究发现姜黄具有抗血小板聚集、抗凝和心血管保护等活性。近年来，随着国内外对姜黄中有效成分及作用机制的深入研究，越来越多的资料表明姜黄及其含有的某些化学成分具有舒张血管作用，为该系列心血管疾病疾病防治提供了新的方向。
姜黄素倍半萜类化合物是姜黄中的主要活性物质，其中没药烷型倍半萜化合物含量最为丰富。因此姜黄素没药烷型倍半萜化合物成为研究热点。但是论文《姜黄中1个新的裂环没药烷型倍半萜成分》虽然从姜黄中提取得到一种新的没药烷型倍半萜化合物，但试验证明该化合物并没有舒张血管的作用。
因此，从姜黄药材中分离提取出舒张血管作用的新化合物并且以此为基础进行衍生，具有重要的现实意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种没药烷型倍半萜类化合物及其制备方法与应用。
本发明提供了式Ⅰ所示的化合物、或其晶型、或其盐：
其中，R1～R5分别或同时选自氢、C1～C6烷基、卤素、羟基、C1～C6烷氧基、氨基、羧基。
进一步地，R1～R5分别或同时选自氢、卤素、羟基、甲氧基、乙氧基、氨基；
优选地，R1～R4同时为氢。
进一步地，R5为羟基。
进一步地，所述化合物为如下化合物：
进一步地，所述化合物为如下化合物：
本发明还提供了前述化合物的制备方法，它包括如下步骤：
a.取姜黄药材，95％乙醇浸泡过夜后加热回流提取，提取液减压浓缩，得到姜黄提取物，将姜黄提取物用水混悬，依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到姜黄石油醚萃取部位和乙酸乙酯萃取部位；
b.取步骤a所得的姜黄乙酸乙酯部位，经硅胶柱层析，分别依次用石油醚：乙酸乙酯体积比为1:0、7:3、4:6、0:1的混合溶液和乙酸乙酯：甲醇体积比为1:1、0:1的混合溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，合并各梯度洗脱液，分别减压浓缩至稠浸膏，得到石油醚：乙酸乙酯体积比为7:3时的洗脱液浓缩的浸膏B；
c.取步骤b所得的浸膏B，经硅胶柱色谱，依次以二氯甲烷：乙酸乙酯体积比为100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、1:1、0:1的混合溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，经薄层色谱法检视，合并主成分一致的洗脱馏分并减压浓缩，得到16个馏分F1～F16；用馏分F6进一步分离纯化，馏分F6为二氯甲烷：乙酸乙酯体积比为25:1的混合溶液洗脱的部分；
d.取步骤c所得的馏分F6，经中压液相色谱，以甲醇：水体积比为30:70、35:65、40:60、50:50、70:30、100:0的混合溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，经薄层色谱检视，合并主成分一致的馏分并减压浓缩，最后得到12个馏分F6-1～F6-12；用馏分F6-1进一步分离纯化，馏分F6-1为甲醇：水体积比为30:70的混合溶液洗脱的部分；
e.取步骤d所得的馏分F6-1，经制备薄层色谱分离，展开剂为石油醚：乙酸乙酯体积比为10:1的混合溶液，得到F6-1-1与F6-1-2两个组分；用馏分F6-1-2进一步分离纯化，馏分F6-1-2为制备薄层板上Rf值小的一个组分；
f.取步骤e所得的F6-1-2，经反相半制备液相色谱，洗脱剂为甲醇：水体积比为78:22的混合溶液，分离纯化，取tR＝60.2min，即得前述所示化合物
进一步地，
步骤a中，所述姜黄药材与95％乙醇的重量体积比为1:8～24kg/L；和/或，所述提取的次数为3次，提取的时间为：第一次3h，第二次2h，第三次1.5h；和/或，所述姜黄提取物与水的重量体积比为7:20kg/L；和/或，所述姜黄提取物与石油醚的重量体积比为7:20～60kg/L；和/或，所述姜黄提取物与乙酸乙酯的重量体积比为7:20～60kg/L；
和/或，步骤b中，所述梯度洗脱条件如下：
和/或，步骤c中，所述梯度洗脱的条件如下：
和/或，步骤d中，所述梯度洗脱的条件如下：
本发明还提供了前述的化合物、或其晶型、或其盐在制备治疗心血管疾病的药物中的用途。
本发明还提供了前述的化合物、或其晶型、或其盐在制备对主动脉血管收缩有舒张作用的药物中的用途；
优选地，所述药物为促进NO产生的药物；
和/或，所述药物为促进PI3K/Akt/eNOS通路磷酸化蛋白的表达的药物；
和/或，所述药物为激活PI3K/Akt/eNOS通路的药物。
本发明还提供了一种药物，它是以前述的化合物、或其晶型、或其盐为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而得的制剂。
本发明中，式I化合物的R1～R5分别或同时选自氢、C1～C6烷基、卤素、羟基、C1～C6烷氧基、氨基、羧基，可以采用R1～R4同时为氢，R5为羟基的化合物产品为原料，按照化学领域中常规的方法取代而制得，例如，烷基的卤代反应等。
本发明通过对姜黄提取、分离纯化，得到一种具有良好舒张血管作用的倍半萜类化合物。该化合物可用于舒张血管，为临床上筛选和/或制备舒张血管药物提供了一种新的选择。
关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
本发明中“盐”为“药学上可接受的盐”，术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。
术语“盐”和“可药用的盐”是指上述化合物或其立体异构体，与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物，或其立体异构体，与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。本发明中所述盐可以是化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。
本发明的一种或多种化合物可以彼此联合使用，也可选择将本发明的化合物与任何其它的活性试剂结合使用。如果使用的是一组化合物，则可将这些化合物同时、分别或有序地对受试对象进行给药。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明目标化合物的HRESIMS图。
图2为本发明目标化合物的1H-NMR图。
图3为本发明目标化合物的13C-NMR图。
图4为本发明目标化合物的IR图。
图5为本发明目标化合物的1H-1H COSY和HMBC信号图。
图6为本发明目标化合物对KCl或PHE预收缩血管环的舒张作用：A为对KCl预收缩血管环的舒张作用；B为对PHE预收缩血管环的舒张作用。
图7为本发明目标化合物对PHE诱导的完整内皮和去内皮血管环收缩张力的作用。
图8为本发明目标化合物对预孵育L-NAME的血管环收缩张力的影响。
图9为本发明目标化合物对HUVECs中NO含量的影响。
图10为本发明目标化合物激活PI3K/Akt/eNOS通路：A为p-PI3K、p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)蛋白的表达水平；B为p-PI3K/PI3K的表达比率；C为p-Akt/Akt的表达比率；D为p-eNOS/eNOS的表达比率。
图11为本发明目标化合物在HUVECs中用LY294002或MK-2206预处理后对PI3K/Akt/eNOS通路的作用：A为加入LY294002或MK-2206后p-Akt和p-eNOS蛋白的表达水平；B为p-Akt/Akt的表达比率；C为p-eNOS/eNOS的表达比率。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
(1)药材
姜黄饮片于2016年8月购于四川新荷花中药饮片有限公司，经成都中医药大学药用植物研究室鉴定为姜科姜黄属植物姜黄(Curcuma longa L.)的干燥根茎。
(2)试剂
柱层析硅胶，200～300目(试剂级)，购于烟台化工学院；
中压液相色谱仪：Búchi Gradient Former B-687，Rp C18，43-60μm；
Zorbax SB-C18(250×9.4mm,5μm)，半制备型柱；
GF254硅胶制备薄层，购于烟台江友硅胶开发有限公司；
石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等分析纯试剂，购于成都科隆化学品有限公司。
(3)主要仪器
Agilent 1220高效液相色谱仪(美国安捷伦)；
Bruker TIMS-TOF-MS高分辨飞行时间质谱(美国Bruker)；
Bruker-AVIIIHD-600、Bruker-AVIIIHD-600核磁共振仪(美国Bruker)；
Agilent Cary 600FT-IR红外光谱仪(美国安捷伦)；
Shimadzu UV-260紫外-可见分光光度仪(日本Shimadzu)；
安东帕MCP 200旋光测定仪(奥地利安东帕)；
BP211D十万分之一电子天平(瑞士Sartorius)；
R-210旋转蒸发器(瑞士BUCHI)；
DZG-6050型真空干燥箱(上海森信)。
实施例1、本发明化合物[(+)-(1S,7S,9E)-bisabola-2(3),4(15),9(10)-trien-11-ol,(+)-(1S,7S,9E)-没药烷-2(3),4(15),9(10)-三烯-11-醇]的制备
1)成分的分离纯化
①药材的提取：取姜黄干燥饮片50kg，用95％乙醇浸泡过夜，然后采用95％乙醇加热回流提取，姜黄干燥饮片与95％乙醇的重量体积比为1:(8～24)kg/L，提取3次，第一次提取3h，第二次提取2h，第三次提取1.5h，将滤液减压浓缩，得到姜黄提取物；将姜黄提取物用水混悬，姜黄提取物与水的重量体积比为7:20kg/L；然后混悬液依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到姜黄石油醚萃取部位和乙酸乙酯萃取部位(乙酸乙酯浸膏)；姜黄提取物与石油醚的重量体积比为7:20～60kg/L，姜黄提取物与乙酸乙酯的重量体积比为7:20～60kg/L。
②硅胶柱层析：采用硅胶柱色谱(150cm×22cm)对步骤①所得的姜黄乙酸乙酯部位(3kg)进行色谱分离，分别依次用石油醚-乙酸乙酯系统(1:0、7:3、4:6、0:1，v/v)和乙酸乙酯-甲醇系统(1:1、0:1，v/v)进行梯度洗脱，洗脱条件如表1所示。合并各梯度洗脱液，分别减压浓缩至稠浸膏，并依次编号为A～F，得到石油醚：乙酸乙酯＝7:3(v/v)时的洗脱液浓缩的浸膏B。
表1.硅胶柱色谱的洗脱条件
③浸膏B(500g)经硅胶柱色谱(150cm×22cm)，用二氯甲烷-乙酸乙酯系统(100:1→0:1，v/v)梯度洗脱，洗脱条件如表2所示。经薄层色谱法检视，合并主成分一致的相似洗脱馏分并减压浓缩，得16个馏分，依次编号为F1～F16。用馏分F6进一步分离纯化，馏分F6为二氯甲烷-乙酸乙酯(25:1，v/v)洗脱的部分。
表2.硅胶柱色谱的洗脱条件
④馏分F6进一步分离，经中压液相色谱(30cm×4cm)，以甲醇-水系统(30％→100％，v/v)梯度洗脱，洗脱条件如表3所示。经薄层色谱检视，合并主成分一致的相似馏分并减压浓缩，最后得到12个馏分(F6-1～F6-12)。用馏分F6-1进一步分离纯化，馏分F6-1为甲醇-水(30:70，v/v)洗脱的部分。
表3.中压液相色谱的洗脱条件
⑤馏分F6-1经过制备薄层色谱(展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1，v/v)分离得到F6-1-1与F6-1-2两个组分。用馏分F6-1-2进一步分离纯化，馏分F6-1-2为制备薄层板上Rf值较小的一个组分。
⑥F6-1-2经反相半制备高效液相色谱(洗脱剂：78％甲醇溶液，tR＝60.2min)分离得到化合物A。
2)目标化合物的鉴定
制得得到的化合物A为无色油状物。[α]25 D＝+49.0(c＝0.16,MeOH)；HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 243.1726[M+Na]+(附图1)，提示其分子组成为C15H24O(calcd forC15H24ONa，243.1725)，具有4个不饱和度。化合物的1H NMR谱(附图2)清晰地显示3个甲基信号[δH 0.83(3H,d,J＝7.0Hz)，1.23(6H,s)]，1对末端双键质子[δH 4.74(brs)和4.72(brs))]和2对双键信号[δH 6.15(1H,d,J＝10.0Hz)，5.71(1H,d,J＝10.0Hz)，5.60(m)，5.64(1H,d,J＝15.5Hz)]。13C NMR(附图3)和HSQC光谱显示有15个碳信号，包括3个甲基、4个亚甲基(1个位于δC 110.4的烯烃)、6个次甲基(4个位于δC 125.3、130.4、135.7和141.4的烯烃)和2个季碳(δC 70.1和一种烯烃在δC 144.4)。这些光谱数据表明，化合物A是一种类似于β-倍半萜烯的没药烷型倍半萜类化合物，不同的是双键的位置不同，并且在化合物A的C-11处有一个额外的羟基。通过2D NMR实验进一步确定其结构，1H-1HCOSY和HMBC谱(附图5)显示H2-5/H2-6/H-1/H-2/H-3相关，H2-15和C-3、C-4、C-5相关，证明C-2＝C-3/C-4＝C-15为共轭双键；此外，H3-14/H-7/H2-8/H-9/H-10相关，H2-8和C-1、C-7、C-9、C-10、C-14相关，H3-12、H3-13和C-10、C-11相关，结合OH-11[δH 3.43(s)]和C-10、C-11、C-12、C-13相关，确定了该化合物9、10位存在双键，C-11位被羟基取代。而9、10位上的氢耦合常数较大(15.5Hz)，此处双键的构型可以推测为E。进一步通过计算NMR、ECD和OR最终确定化合物的构型为(1S,7S)，被命名为(+)-(1S,7S,9E)-bisabola-2(3),4(15),9(10)-trien-11-ol。
因此，本发明新化合物A的化学结构得到了确定，如式II所示：
3)核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定，数据见表4。
4)核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定，数据见表4。
表4.化合物的(1H-(500MHz)和13C-(125MHz)NMR数据(Acetone-d6)
以下通过具体实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、本发明没药烷型倍半萜类化合物的舒张血管活性试验
(1)实验材料：
①药物
受试化合物A用DMSO配置成5×10-2mol/L的贮备液，-10℃保存。阳性药物(Methoxyverapamil和Phentolamine Mesylate)用纯水溶解。
②动物和细胞
SD大鼠，SPF级，雌性，体重180～220g，购自成都达硕动物科技有限公司。实验动物生产许可证号：SCXK(川)2015-030。
人脐静脉内皮细胞(HUVECs)获自中桥新洲生物科技有限公司(中国上海)。HUVECs在含有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养。
③试剂
Methoxyverapamil，Sigma公司；
Phentolamine Mesylate，Selleck公司；
Krebs-Henselei营养液(K-H液)：组成(mM):NaCl,120；KCl,4.6；KH2PO4,1.2；MgSO4,1.2；NaHCO3,25；glucose,10；CaCl2,2.5，pH 7.4；
二甲基亚砜(DMSO)，细胞培养级，100ml/瓶，Solarbio公司；
50T/48NO检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；
RIPA裂解缓冲液，上海EpiZyme生物技术有限公司；
苯甲基磺酰氟(PMSF)，碧云天生物技术有限公司；
PVDF膜，Millipore公司；
PI3K antibody，Cell Signaling Technology公司；
Phospho-PI3K antibody，Cell Signaling Technology公司；
Akt antibody，Cell Signaling Technology公司；
Phospho-Akt antibody，Cell Signaling Technology公司；
eNOS antibody，Cell Signaling Technology公司；
Phospho-eNOS antibody，Cell Signaling Technology公司；
β-actin antibody，GeneTex公司；
Omni-ECLTMFemtoLiqht化学发光试剂盒，上海EpiZyme生物技术有限公司；
LY294002，Selleck公司；
MK-2206，Selleck公司；
L-NAME，碧云天生物技术有限公司。
④实验仪器
电子天平(ESJ120-4型，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)；
肌张力传感器(JH-2型，中国北京航天医学工程研究所)；
生物机能试验系统(BL-420F型，成都泰盟科技有限公司)；
离体组织器官恒温灌流系统(HV-4型，成都泰盟科技有限公司产品)；
PL3508B6/C-V Panlab 8室器官浴系统(包括刺激电极、Panlab 8室器官浴、器官室、组织钩和Labchart Pro软件，埃德仪器国际贸易有限公司)。
(2)实验方法：
①化合物对大鼠胸主动脉环的影响
a)血管环的制备
颈椎脱臼处死大鼠，快速取出胸主动脉，并置于95％ O2+5％ CO2饱和4℃K-H液中，挤出心脏残留血块，剔除周围结缔组织，避免对离体血管牵拉、钳夹，以保证血管组织活性，剪去支旁小血管，将血管剪成3～5mm的血管环，修剪时不可剪破血管壁，以保证血管内膜完整性。血管环用两根不锈钢蹬型挂钩水平悬挂于恒温浴槽内，一端固定于浴槽内，另一端连接张力换能器，调节1g的基础张力，采用离体组织灌流模型和PowerLab数据分析系统采集和记录大鼠离体胸主动脉环等距张力的变化。浴槽内含有K-H液，温度恒定在37℃，持续通95％ O2+5％ CO2，平衡60min，每15min换37℃K-H液一次。
b)血管环活性检测
正式实验之前，血管环调节基础张力1g，稳定30min后，加入KCl(60mM)或PHE(1μM)诱导血管环收缩，当收缩张力达到坪值后，往浴槽内加入Ach(10μM)舒张血管环，连续刺激3次。每次刺激后，K-H液连续冲洗三次，每次5min，恢复到基础状态后，稳定30min。当连续的两次收缩或舒张幅度小于10％，认为血管环组织结构完整，血管环活性良好，可重复实验。
c)血管环内皮完整性检测
用PHE(1μM)收缩血管环，收缩张力达到坪值后，往槽内加入Ach(10μM)舒张血管环，若舒张幅度大于80％，认为内皮完整；若舒张幅度小于10％，认为去内皮。
d)化合物对KCl或PHE所致的主动脉环收缩反应的影响
在经过血管活性检测和内皮完整性检测后，判断血管活性良好，且对收缩刺激反应稳定后，可以开始实验。往浴槽内加入KCl(60mM)或PHE(1μM)预收缩胸主动脉环，血管收缩张力达到坪值时，累积加入5个浓度(0.25,0.75,2.5,7.5,25μM)的倍半萜单体化合物A，观察单体化合物A的浓度依赖舒张效应曲线，观察和比较不同浓度下化合物A对KCl(60mM)或PHE(1μM)预收缩血管环的舒张作用。KCl(60mM)或PHE(1μM)所致的最大收缩张力为100％，计算各浓度化合物所致的舒张百分比。以DMSO为空白组，以盐酸维拉帕米(Methoxyverapamil)作为KCl预收缩阳性组，以甲磺酸酚妥拉明(Phentolamine mesylate)作为PHE预收缩阳性组。
e)化合物对去内皮血管环的影响
在经过血管活性检测和内皮完整性检测后，判断血管活性良好，且对收缩刺激反应稳定后，可以开始实验。往浴槽内加入PHE(1μM)预收缩胸主动脉环，血管收缩张力达到坪值时，累积加入5个浓度(0.25,0.75,2.5,7.5,25μM)的倍半萜单体化合物A，观察单体化合物A的浓度依赖舒张效应曲线，观察和比较剥夺内皮后，化合物A对PHE(1μM)预收缩血管环的舒张作用与完整内皮时的差异。PHE(1μM)所致的最大收缩张力为100％，计算各浓度化合物所致的舒张百分比。
f)L-NAME对化合物舒张PHE预收缩的胸主动脉环的影响
在经过血管活性检测和内皮完整性检测，判断血管活性良好，且对收缩刺激反应稳定后，可以开始实验。往浴槽内加入L-NAME(100μM)预孵胸主动脉环30min，随后加入PHE(1μM)预收缩胸主动脉环，血管收缩张力达到坪值时，累积加入5个浓度(0.25,0.75,2.5,7.5,25μM)的倍半萜单体化合物A，观察单体化合物A的浓度依赖舒张效应曲线，观察和比较L-NAME预孵后，化合物A对PHE预收缩血管环的舒张作用与之前的差异。以PHE(1μM)所致的最大收缩张力为100％，计算各浓度化合物所致的舒张百分比。
②化合物对HUVECs分泌NO的影响
用0.25％胰酶将生长状态健康的HUVECs消化，随后加入适量培养液，用移液枪轻轻吹打细胞使细胞重悬，并转移到离心管中，细胞计数后调整细胞的数目为1×105个/ml，按每孔100μl接种在96孔板内，放入培养箱中，过夜，等待细胞贴壁。用新鲜DMEM培养液将药物配成所需浓度，于离心管中备用。吸出细胞培养液，PBS清洗细胞2遍，分为给药组和空白对照组，每组设置3个复孔，给药组分别加入100μl终浓度为12.5、25、50μM的化合物A溶液，空白对照组加入等量DMEM培养液，随后放入培养箱中培养1h。培养时间结束后，立即吸取培养液上清，终止反应，按说明书所述，使用NO试剂盒检测NO含量。
③PI3K/Akt/eNOS通路相关蛋白表达及验证
a)细胞裂解与蛋白提取
将HUVECs(5×105个/孔)接种到6孔板中并培养24h。HUVECs用化合物、LY294002、MK-2206、化合物加LY294002或化合物加MK-2206处理1h。然后，将HUVECs用冰冷的裂解缓冲液(RIPA裂解缓冲液，辅以1mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物)在冰上裂解30min。收集液体转移至1.5mL EP管中，放置于冰水浴中破碎，每管细胞破碎3min(超声10s停10s)。提前设置离心机为参数，温度为4℃，转数为12000rpm。待离心机温度达到4℃后，将裂解液放入离心15min。用移液枪小心吸取离心后EP管中上清液，取少许稀释后用Bradford方法对每个样本的蛋白浓度开始进行测定。根据标曲将所有蛋白配至同一浓度。按照4:1的比例加入配置好的5×Loding buffer，涡旋仪充分混匀后放入热循环仪100℃5min，蛋白充分变性后取出冷却。根据实验使用量进行分装，保存于-20℃的冰箱中。
b)SDS-PAGE凝胶电泳与显影
取出两块玻璃板，把它们用清洁剂浸泡一段时间后，清洗干净，自然晾干或者用吹风机吹干，然后紧密的将其固定在配套的制胶架上，即形成了制胶板。按序顺次加入去离子水、30％Acrylamide、1.5M Tris-HCl(PH 8.8)、10％ SDS于烧杯中充分混匀，再加入10％AP和TEMED后立刻摇匀，并用1mL的移液枪加入到两层玻璃板之间，而后在胶上加一层去离子水液封，37℃搁置30min，待胶凝后倒出水，板中残余的水可用滤纸吸干。按上述方法配制5％的浓缩胶并加入制胶板中，排除气泡插入梳子，常温放置待用。将制胶板放入电泳槽中固定，垂直拔出梳子，随即加入足够量的1×running buffer于槽中。向孔胶中加入每孔蛋白量为40μg的样本或预染蛋白marker。上样完成后盖好电泳槽盖，接通电源，先稳定电压为30V，持续半小时后，观察到蛋白样品位置，待跑至下层分离胶后调整电压至120V。根据marker确认目的蛋白位置，确定分离足够距离后断开电源。取出胶板小心撬开，用切胶板将含有所需目的蛋白的分离胶切开。剪取合适的PVDF膜并使用甲醇活化1min。将放入转膜液中浸润备用的海绵，PVDF膜及滤纸按顺序铺好后夹紧转膜夹，注意每层之间不能有气泡。将转膜仪放入电泳槽中，加入适量转膜液，并在另一侧放入小冰袋，盖上盖子后将电泳仪放入装有碎冰的泡沫箱中，接通电源，100V转膜2h。加入适量的TBST Buffer稀释的5％ BSA后放入PVDF膜，密封好，放入培养皿中置于摇床上，封闭1h后取出PVDF膜，用TBST洗膜，5min/次，共3次。取出PVDF膜，使用滤纸擦去多余液体后平放于抗体孵育袋中，各自加入适量提前配制好的一抗稀释液，并用封口机将孵育袋密封好，摇床上轻摇，4℃孵育过夜。重新收回孵育袋中的一抗溶液，并将膜取出放入早已清洗干净的培养皿中，培养皿中加入一些TBST溶液，将它们放到摇床上漂洗，10min/次，共3次。参照孵育一抗的过程孵育二抗，37℃孵育1h。实验完成后用TBST溶液洗膜，10min/次，共3次。避光取ECL发光液A和B，按1：1混匀倒入保鲜膜上，并将PVDF膜平铺其中反应1min，反应结束后去除残液用干净的保鲜膜包好，放入凝胶成像仪中成像。
(3)实验结果：
实验结果如图6～11所示。
图6为本发明化合物A对KCl或PHE预收缩血管环的舒张作用，图6A和B中DMSO曲线为溶剂对照组结果，Methoxyverapamil和phentolamine mesylate曲线分别作为KCl和PHE预收缩的阳性对照结果，KCl和PHE曲线为本发明化合物A对KCl和PHE预收缩影响的结果。结果表明：与溶剂对照组(DMSO)相比，化合物A在2.5×10-7mol/L、7.5×10-7mol/L、2.5×10- 6mol/L、7.5×10-6mol/L和2.5×10-5mol/L浓度下显示出对KCl(图A)或PHE(图B)预收缩的大鼠主动脉环的浓度依赖性松弛。横坐标中的M代表浓度单位mol/L。
图7为本发明化合物A对PHE诱导的完整内皮和去内皮血管环收缩张力的作用，结果表明：化合物A对完整内皮血管环(E+)的松弛作用明显强于去内皮的血管环(E-)，表明化合物A的舒张血管作用具有内皮依赖性。横坐标中的M代表浓度单位mol/L。
图8为本发明化合物A对预孵育L-NAME的血管环收缩张力的影响，结果表明：与完整内皮血管环(E+)相比，预孵育L-NAME可抑制化合物A的舒张作用，提示化合物A的舒张血管作用与NO的产生有关。横坐标中的M代表浓度单位mol/L。
图9为本发明化合物A对HUVECs中NO含量的影响，结果表明：在浓度为25μM和50μM时，化合物A可明显促进HUVECs中NO的产生。
图10为本发明化合物A激活PI3K/Akt/eNOS通路的结果，图10A为p-PI3K、p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)蛋白的表达水平，图10B为p-PI3K/PI3K的表达比率，图10C为p-Akt/Akt的表达比率，图10D为p-eNOS/eNOS的表达比率。结果表明：化合物A作用后可促进PI3K/Akt/eNOS通路磷酸化蛋白的表达，表明化合物A通过激活PI3K/Akt/eNOS通路发挥作用。
图11为本发明化合物A在HUVECs中用LY294002或MK-2206预处理后对PI3K/Akt/eNOS通路的作用，图11A为加入LY294002或MK-2206后p-Akt和p-eNOS蛋白的表达水平，图11B为p-Akt/Akt的表达比率，图11C为p-eNOS/eNOS的表达比率。结果表明：加入PI3K抑制剂LY294002或Akt抑制剂MK-2206后可抑制化合物A对PI3K/Akt/eNOS通路的激活，进一步验证化合物通过PI3K/Akt/eNOS通路发挥作用。
通过比较发现，实验中主要观察记录了药物浓度分别为2.5×10-7mol/L、7.5×10-7mol/L、2.5×10-6mol/L、7.5×10-6mol/L和2.5×10-5mol/L时的张力变化，可以观察到目标化合物A对KCl或PHE诱发的主动脉血管收缩有明显的舒张作用，经过统计分析，本发明化合物A对KCl诱导收缩的EC50值为3.56±0.63μM，阳性药Methoxyverapamil的EC50值为27.89±4.36nM；化合物A对PHE诱导收缩的EC50值为2.82±0.80μM，阳性药Phentolamine Mesylate的EC50值为25.22±8.38nM，其结果见图6。去内皮或用eNOS抑制剂L-NAME预处理后，化合物的舒张血管作用减弱，这些发现表明，目标化合物A的血管舒张作用是内皮依赖性的，并且与血管内皮细胞中NO的产生有关。蛋白免疫印迹实验表明，本发明化合物的内皮依赖性血管舒张可能是通过激活PI3K/Akt/eNOS通路，促进NO产生实现的。
EC50，半数最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect，EC50)是指能引起50％最大效应的浓度。
试验结果表明，本发明化合物具有良好的舒张血管作用，为临床上筛选和/或制备舒张血管药物提供了一种新的选择。
综上，本发明通过对姜黄提取、分离纯化，得到一种具有良好舒张血管作用的倍半萜类化合物。该化合物可用于舒张血管，为临床上筛选和/或制备舒张血管药物提供了一种新的选择。

Claims (6)

1.一种化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述化合物为如下化合物：
2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a.取姜黄药材，95％乙醇浸泡过夜后加热回流提取，提取液减压浓缩，得到姜黄提取物，将姜黄提取物用水混悬，依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到姜黄石油醚萃取部位和乙酸乙酯萃取部位；
b.取步骤a所得的姜黄乙酸乙酯部位，经硅胶柱层析，分别依次用石油醚：乙酸乙酯体积比为1:0、7:3、4:6、0:1的混合溶液和乙酸乙酯：甲醇体积比为1:1、0:1的混合溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，合并各梯度洗脱液，分别减压浓缩至稠浸膏，得到石油醚：乙酸乙酯体积比为7:3时的洗脱液浓缩的浸膏B；
c.取步骤b所得的浸膏B，经硅胶柱色谱，依次以二氯甲烷：乙酸乙酯体积比为100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、1:1、0:1的混合溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，经薄层色谱法检视，合并主成分一致的洗脱馏分并减压浓缩，得到16个馏分F1～F16；用馏分F6进一步分离纯化，馏分F6为二氯甲烷：乙酸乙酯体积比为25:1的混合溶液洗脱的部分；
d.取步骤c所得的馏分F6，经中压液相色谱，以甲醇：水体积比为30:70、35:65、40:60、50:50、70:30、100:0的混合溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，经薄层色谱检视，合并主成分一致的馏分并减压浓缩，最后得到12个馏分F6-1～F6-12；用馏分F6-1进一步分离纯化，馏分F6-1为甲醇：水体积比为30:70的混合溶液洗脱的部分；
e.取步骤d所得的馏分F6-1，经制备薄层色谱分离，展开剂为石油醚：乙酸乙酯体积比为10:1的混合溶液，得到F6-1-1与F6-1-2两个组分；用馏分F6-1-2进一步分离纯化，馏分F6-1-2为制备薄层板上Rf值小的一个组分；
f.取步骤e所得的F6-1-2，经反相半制备高效液相色谱，洗脱剂为甲醇：水体积比为78:22的混合溶液，分离纯化，取tR＝60.2min，即得权利要求1所示化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
步骤a中，所述姜黄药材与95％乙醇的重量体积比为1:8～24kg/L；和/或，所述提取的次数为3次，提取的时间为：第一次3h，第二次2h，第三次1.5h；和/或，所述姜黄提取物与水的重量体积比为7:20kg/L；和/或，所述姜黄提取物与石油醚的重量体积比为7:20～60kg/L；和/或，所述姜黄提取物与乙酸乙酯的重量体积比为7:20～60kg/L；
和/或，步骤b中，所述梯度洗脱条件如下：
；
和/或，步骤c中，所述梯度洗脱的条件如下：
；
和/或，步骤d中，所述梯度洗脱的条件如下：
。
4.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗心血管疾病的药物中的用途。
5.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备对主动脉血管收缩有舒张作用的药物中的用途。
6.一种药物，其特征在于：它是以权利要求1所述的化合物、或其药学上可接受的盐为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而得的制剂。
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