KR20030075947A

KR20030075947A - 신 혈관형성을 억제하는 물질

Info

Publication number: KR20030075947A
Application number: KR1020020015490A
Authority: KR
Inventors: 이성진; 지승택; 고용송
Original assignee: 제네티카 주식회사
Priority date: 2002-03-19
Filing date: 2002-03-19
Publication date: 2003-09-26

Abstract

본 발명은 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose는 내피세포 성장호르몬 (vascular endothelial growth factor, VEGF)과 그 수용체인 KDR/Flk-1 또는 Flt-1간의 결합을 저해하며, 내피세포 성장호르몬, endothelial cell growth supplement (ECGS) 및 basic fibroblast growth factor (bFGF)에 의해 유도되는 내피세포의 성장을 저해하며, 기존혈관에는 영향을 주지 않으면서 인간 암세포에 의해 유도되는 신 혈관형성 (angiogenesis)을 억제하여 효과적으로 신 혈관형성을 억제하는 활성을 갖고 있어, 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose 및 이를 함유하는 약학적 조성물은 암, 류마티스 관절염 및 당뇨성 실명증 등과 같은 신 혈관형성이 필수적으로 요구되는 질병의 치료 및 예방학적 용도로 사용할 수 있다.

Description

신 혈관형성을 억제하는 물질{Angiogenesis inhibitor}

본 발명은 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose 및 이를 함유하는 약학적 조성물의 암, 류마티스 관절염 및 당뇨성 실명증 등과 같은 신 혈관형성 (angiogenesis)이 필수적으로 요구되는 질병의 치료 및 예방학적 용도에 관한 것이다.

신 혈관형성이란 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 일련의 과정으로, 배 발생, 상처 치유와 같은 정상적인 상태에서는 정상적인 상황에서는 신 혈관형성의 유도물질과 억제물질이 상호 정교하게 작용하여 조절되지만 (Loitta, L. A. et al. (1991) Cell64, 327), 암세포의 성장과 전이, 류마티스 관절염 및 당뇨성 실명증등의 여러 질병에서는 신 혈관형성이 조절되지 못하고 지속적으로 일어나게 된다 (Kohn, E. C. et al. (1995) Proc. Natl Acad. Sci. USA92, 1307; Folkman, J. et al. (1987) Science235, 442; Risau, W. (1997) Nature386, 671). 특히, 암세포는 신 혈관형성을 통해 원활하게 영양분을 공급받고 다른 장기로 전이하기 때문에, 신 혈관형성은 암의 성장과 전이에 필수적이다 (Hanahan, D. et al. (1996) Cell86, 353; Skobe, M., et al. (1997) Nature Med. 3, 1222). 실제 여러 종류의 인간 암에서, 암조직에 형성된 모세혈관의 밀도와 암의 전이 가능성간에는밀접한 상관관계가 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 연구 결과들은, 신 혈관형성 저해물질들은 신 혈관형성이 지속적으로 일어나는 암, 류마티스 관절염 및 당뇨성 실명증등의 여러 질병의 치료제 및 예방제로 유용하게 사용될 수 있음을 제시하고 있다.

현재까지 많은 혈관형성 유도 인자들이 밝혀졌지만 (Bussolino, F., et al. (1997) Trends Biochem. Sci. 22, 251), 그 중에서 내피세포 성장호르몬 (vascular endothelial growth factor, VEGF)과 basic fibroblast growth factor (bFGF)는 내피세포의 증식을 촉진하고 생체내에서 신 혈관형성을 촉진하며 암조직에서 발현되는 것이 밝혀졌다. 내피세포 성장호르몬은 내피세포의 표면에만 특이적으로 발현되는 수용체인 Flt-1과 KDR/Flk-1에 결합하여 (Millauer, B., et al. (1993) Cell72, 835; De Vries, C., et al. (1992) Science255, 989) 강력하고 특이적으로 내피세포의 증식을 촉진한다 (Gospodarowicz, D., et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA86, 7311).

또한, 내피세포 성장호르몬이 in vivo에서 암의 진행과 관련된 신 혈관형성에 필수적임이 내피세포 성장호르몬의 중화 단일항체(neutralizing monoclonal antibody)와 soluble Flt-1 수용체의 발현에 의한 암 세포의 성장 저해(Plouet, J., et al. (1989) EMBO J.8, 3801; Kim, K. J., et al. (1993) Natrue362, 841; Goldman, C. K., et al. (1998) Proc. Natl. Acad, Sci. USA95, 8795) 등의 연구에 의해 입증되었다. 따라서, 내피세포 성장호르몬과 그 수용체간의 결합을 저해하는 물질은 내피세포 성장호르몬이 유도하는 신 혈관형성을 저해할 수 있을 뿐만 아니라, 암세포의 성장과 전이도 저해할 수 있을 것이다 (Martiny-Baron, G. et al. (1995) Curr. Opin. Biotechnol.6, 675).

이에 본 발명자들은 전통 한약재로부터 인간 내피세포 성장호르몬과 그 수용체간의 결합을 억제하는 길항제를 찾기 위하여 연구 조사하였고, 그 결과 작약(Paeoniae radix)의 추출물로부터 내피세포 성장호르몬 수용체 결합에 대한 길항 활성을 갖는 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose를 단리하는데 성공하였고, 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose가 내피세포 성장호르몬, endothelial cell growth supplement (ECGS) 및 basic fibroblast growth factor (bFGF)에 의해 유도되는 내피세포의 성장을 저해하며, 기존혈관에는 영향을 주지 않으면서 인간 암세포에 의해 유도되는 신 혈관형성 (angiogenesis)을 효과적으로 억제하는 활성을 갖고 있음을 규명하였다. 당해 기술분야에서는 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose는 알파-글루코시데이즈의 활성을 저해하고 암세포의 증식을 억제하고 세포자살을 유도하는 효과 (Cannell, R. J., et al. (1988) Biochem. J.255, 937; Oh, G. S., et al. (2001) Cancer Lett.174, 17; Pan, M. H., et al. (1999) Eur. J. Pharmacol.381, 171)가 이미 알려져 있으나, 내피세포 성장호르몬 수용체 결합에 대한 길항작용 및 신 혈관형성 억제활성은 본 발명자들에 의해 처음 보고되는 것이다.

본 발명의 목적은 내피세포 성장호르몬과 그 수용체간의 결합을 억제하는 길항활성을 갖고 있으며, 내피세포 성장호르몬 및 기타 다른 내피세포의 증식을 유도하는 호르몬에 의해 유도되는 내피세포 증식을 억제하고, 기존혈관에는 영향을 주지 않으면서 인간 암세포에 의해 유도되는 신 혈관형성을 효과적으로 억제하는 활성을 갖음으로써, 신 혈관형성을 억제하는 활성을 갖는 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은, 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose 또는 상기 물질과 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 함유하는 약학적 조성물을 제공하고, 이들을 이용해 내피세포 성장호르몬 활성저해 또는 신 혈관형성을 억제함으로써 암, 류마티스 관절염 및 당뇨성 실명증 등과 같은 신 혈관형성이 필수적으로 요구되는 질병의 예방 및 치료에 유용한 약학적 조성물을 제공함에 그 목적이 있다.

제 1도는 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose가 내피세포 성장호르몬과 내피세포 성장호르몬 수용체인 KDR/Flk-1간의 결합을 농도 의존적으로 저해함을 보여주는 결과이고

제 2도는 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose의 내피세포 성장호르몬과 내피세포 성장호르몬 수용체인 Flt-1간의 결합을 농도 의존적으로 저해함을 보여주는 결과이고

제 3도는 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose가 내피세포 성장호르몬에 의해 유도되는 내피세포 증식을 억제함을 보여주는 결과이고

제 4도는 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose의 내피세포 성장호르몬에 의해 유도되는 내피세포 증식에 미치는 영향을 보여주는 결과이고

제 5도는 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose가 ECGS에 의해 유도되는 내피세포 증식을 억제함을 보여주는 결과이고

제 6도는 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose가 bFGF에 의해 유도되는 내피세포 증식을 억제함을 보여주는 결과이고

제 7도는 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose가 인간 암세포의 증식에 미치는 영향을 보여주는 결과이고

제 8도는 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose가 인간 암세포에 의해 유도되는 신 혈관형성을 억제함을 보여주는 결과이다.

본 발명은 내피세포 성장호르몬과 그 수용체간의 결합을 억제하고, 내피세포 성장호르몬 및 기타 다른 내피세포의 증식을 유도하는 호르몬에 의해 유도되는 내피세포 증식을 억제하고, 기존혈관에는 영향을 주지 않으면서 인간 암세포에 의해 유도되는 신 혈관형성을 효과적으로 억제하고 신 혈관형성을 억제하는 활성을 갖는 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose와 이것을 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose는 화학식 1의 구조를 가진다.

화학식 1

본 발명의 내피세포 성장호르몬과 그 수용체간의 결합을 억제하는 길항활성을 갖고 있고 신 혈관형성을 억제하는 활성을 갖는 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose는 통상적인 추출공정 및 순상 또는 역상 크로마토그래피에 의해 작약으로부터 단리되며, 또한 탄닌산 (tannic acid)으로부터 통상의 methanolysis와 순상 또는 역상 크로마토그래피에 의해 대량으로 생산할 수 있다.

1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose는 내피세포 성장호르몬과 그 수용체인 KDR/Flk-1 또는 Flt-1간의 결합을 농도의존적이고 효율적으로 저해하며, 내피세포 성장호르몬, ECGS 및 bFGF등의 내피세포의 증식을 촉진하는 물질들에 의해 유도되는 내피세포의 증식을 효율적으로 저해하나, 암세포와 같은 내피세포 이외의 세포증식에는 별 영향을 주지 않으며, 기존혈관에는 영향을 주지 않으면서 인간 암세포에 의해 유도되는 신 혈관형성을 효과적으로 억제하는 바, 부작용없이 신 혈관형성 억제 목적의 치료제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose 또는 상기 물질과 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 함유하는 약학적 조성물을 신 혈관형성이 비정상적으로 지속되는 암, 류마티스 관절염 및 당뇨성 실명증 등을 나타내는 포유동물 또는 전기 병징을 나타내거나 나타낼 가능성이 있는 포유동물에 경구 또는 비경구 투여등과 같은 공지의 방법으로 투여해 신 혈관형성을 억제함으로써, 암, 류마티스 관절염 및 당뇨성 실명증 등과 같은 신 혈관형성이 필수적으로 요구되는 질병의 치료 및 예방하는 효과를 나타내게 된다.

한편, 본 발명의 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose의 유도체들도 본 발명의 범주에 속한다는 것은 자명하며, 이 유도체들도 내피세포 성장호르몬과 그 수용체간의 결합을 억제하거나 내피세포의 증식을 저해하거나 또는 신 혈관형성을 억제하는 한, 암, 류마티스 관절염 및 당뇨성 실명증 등과 같은 신 혈관형성이 필수적으로 요구되는 질병의 치료제 및 예방제로 이용될 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 실시예들에 의해 설명하고자 하나 하기 실시예들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose의 단리

작약(생산지 : 경북 의성, 판매원 : 영주농협)을 건조약재의 상태로 서울 양재동 소재 농협 하나로 클럽에서 8kg 구입하여 분쇄한 다음 추출용 재료로 사용하였다. 작약 건조약재와 메탄올(methanol)을 각각 1 : 3(W/V)의 비율로 섞어 7일 동안 냉침하여 248g 추출한 후, 여과종이 필터을 이용하여 여과한 후 여과액을 감압농축기로 40℃에서 농축하여 184g을 얻었다. 농축물 184g을 70% 메탄올로 다시 녹인 후, 극성도에 따라 4가지 용매 (헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물)를 이용하여순차적으로 추출하여 감압농축기를 사용하여 40℃에서 농축하였으며, 물층은 동결건조기를 이용하여 동결건조하여 추출물 시료로 사용하였다.

에틸아세테이트 추출물 14.4g 중 77 mg을 주입하여 고속 액체 크로마토크래피(High performance liquid chromatography, AKTA explorer 10, Amersham Pharmacia사)의 실리카 컬럼(23 × 250 mm, DAISO사)에 이동상 용매로 (사이클로헥산-아이소프로판올 (0 : 20 -> 20 : 80))의 농도를 변화시키면서 시험관에 17 ml을 받아 36개의 분획물을 얻어 농축기(speed vac)를 이용하여 감압 농축 시킨 후에 분획물 시료로 사용하였다. 분리된 분획들 중 가장 효과가 좋은 18번째 분획을 같은 조건으로 반복해서 얻은 후 농축기를 이용하여 감압농축하여 모았다. 모은 18번째 분획을 고속액체크로마토크래피(Waters Delta 600)의 실리카 젤(23 × 250 mm, DAISO사)에 100 mg을 주입한 후 이동상 용매인 사이클로헥산과 아이소프로필알콜 농도를 변화(100 : 0 -> 0 : 100) 시키면서 시험관에 받아 5개의 분획물을 얻어 농축기(speed vac)를 이용하여 감압농축 시킨 후에 분획물 시료를 모았다.

실험을 통해 활성이 가장 좋은 5번 분획을 고속액체크로마토크래피(Waters Delta 600)의 프리펙 컬럼(Prepak C₁₈cartridge, 19 × 300 mm, Waters사)에 100 mg을 주입한 후 이동상 용매인 물과 아세토나이트릴(acetonitrile)의 농도를 변화(100 : 0 -> 0 : 100)시키면서 시험관에 받아 3개의 분획물 중 가장 활성이 높은 두 번째 분획을 모아 농축기(speed vac)를 이용하여 감압농축 시킨 후에 단리된 순수물질을 53 mg 확보하였고, 핵자기 공명스펙트럼과 질량 분석기로 분석한 결과단리된 물질이 1,2,3,4,6-Penta-O-galloyl-beta-D-glucose임을 확인하였다.

작약으로부터 단리된 1,2,3,4,6-Penta-O-galloyl-beta-D-glucose는 20 mg/ml로 DMSO에 녹여 -20℃에 보관하였다. 이하 본 발명의 조성물의 신 혈관형성 억제작용을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

[실시예 2] 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose의 내피세포 성장호르몬과 내피세포 성장호르몬 수용체인 KDR/Flk-1간의 결합저해 활성 검정

1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose의 인간 내피세포 성장호르몬과 그 수용체인 KDR/Flk-1간의 결합저해 활성을 검정하기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다. 인산염 완충용액에 녹인 인간 내피세포 성장호르몬 (VEGF₁₆₅)를 96 well 엘리자 용기에 고정 (80 ng/well) 시키고, 3% 알부민과 0.05% Tween 20이 든 인산염 완충용액으로 상온에서 2시간 동안 처리한 후에 용액 A (1% 알부민이 든 M 199)에 30 ng/ml의 KDR/Fc (R&D Systems)와 여러 농도의 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose가 들어 있는 혼합물을 넣어 상온에서 2시간 방치 한 후 결합되지 않은 KDR/Fc를 인산염 완충용액으로 3분간 3회 씻어 준 후, 용기에 결합되어 있는 KDR/Fc를 peoxidase가 결합된 항 인간 IgG 항체 (Sigma)를 사용한 면역반응측정법을 이용해 측정하였다.

KDR/Fc의 비특이적 결합(non-specific binding)은 80 ㎍/ml의 VEGF₁₆₅를 30 ng/ml의 KDR/Fc와 같이 배양하여 결정하였다.

제 1도에서 보듯이, 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose는 내피세포성장호르몬과 그 수용체인 KDR/Flk-1간의 결합을 농도 의존적이며 효과적으로 저해하였으며 약 1.6 ㎍/ml의 농도에서 50%를 저해하였다.

[실시예 3] 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose의 내피세포 성장호르몬과 내피세포 성장호르몬 수용체인 Flt-1간의 결합저해 활성 검정

1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose의 내피세포 성장호르몬과 또 다른 수용체인 Flt-1간의 결합저해 활성을 검정하기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다. 인산염 완충용액에 녹인 단백질A(Roche)를 96 well 엘리자 용기에 고정 (100 ng/well) 시키고, 3% 알부민이 든 인산염 완충용액으로 상온에서 2시간 처리한 후에 용액 A에 15 ng/ml의 Flt-1 (R&D Systems), 1.5 ng/ml의 바이오틴으로 표지된 VEGF₁₆₅와 여러 농도의 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose가 들어 있는 혼합물을 넣어 상온에서 2시간 방치 한 후 결합되지 않은 바이오틴으로 표지된 VEGF₁₆₅를 인산염 완충용액으로 3분간 3회 씻어 준 후, 용기에 결합되어 있는 바이오틴으로 표지된 VEGF₁₆₅를 peoxidase가 결합된 스트렙타비딘 (Roche)을 사용한 면역반응측정법을 이용해 측정하였다.

제 2도에서 보듯이, 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose는 내피세포 성장호르몬과 그 수용체인 Flt-1간의 결합을 농도 의존적이며 효과적으로 저해하였으며 약 1.5 ㎍/ml의 농도에서 50%를 저해하였다. 이상의 실시예 2 및 3은, 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose는 내피세포 성장호르몬과 그 수용체인 KDR/Flk-1과 Flt-1간의 결합을 효과적으로 저해함을 알 수 있었다.

[실시예 4] 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose의 내피세포 성장호르몬에 의해 유도되는 내피세포 증식 억제 검정

신혈관형성이 일어날 때 내피세포 성장호르몬에 의한 내피세포 증식이 중요함으로, 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose의 내피세포 성장호르몬에 의한 내피세포 증식을 억제하는 활성을 검정하기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다. 사람의 태반에서 얻은 혈관내피세포인 HUVE 세포를 M199배지에 bFGF (3 ng/ml), heparin (5 U/ml), 1% 페니실린/ 스트렙토마이신과 20% 우태아혈청(fetal bovine serum)이 있는 배양액에서 5% 이산화탄소 농도로 조절되는 배양기에서 배양하였다. 24개의 웰이 있는 플레이트(24-well plate)에 웰 당 2 × 10⁴ 개의 세포를 주입 한 후 24시간 후에 1% 우태아혈청이 들어 있는 M199 배지로 갈아주었다. 6시간 배양 후에 1% 우태아혈청, 내피세포 성장호르몬 (10 ng/ml)과 여러 농도의 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose가 들어 있는 M199 배지로 갈아 주고 72시간 배양후에 살아 있는 내피세포의 수를 현미경을 이용해 헤아렸다.

제 3도에서 보듯이, 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose는 내피세포 성장호르몬에 의해 유도되는 내피세포 증식을 농도 의존적이며 효과적으로 저해하였다.

1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose의 내피세포 성장호르몬에 의한 내피세포 증식을 억제하는 활성을 검정하기 위해 XTT를 이용한 실험도 실시하였다. 96웰 플레이트에 웰 당 10⁴ 개의 세포를 주입한 후 M199배지에 bFGF (3 ng/ml), heparin (5 U/ml), 1% 페니실린/ 스트렙토마이신과 20% 우태아혈청이 있는 배양액에서 24시간 동안 키우고 나서, 5% 우태아혈청, 내피세포 성장호르몬 (10 ng/ml)과 여러 농도의 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose가 들어 있는 M199 배지로 갈아 주고 72시간 배양후에 XTT (Roche)를 가하고 일정 시간 배양한 후에 살아 있는 내피세포의 수를 결정하였다.

제 4도에서 보듯이, 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose는 내피세포 성장호르몬에 의해 유도되는 내피세포 증식을 농도 의존적이며 효과적으로 저해하였으며, 이러한 결과는 제 3도의 결과 및 실시예 2 및 3에서 보여준 결과와 더불어, 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose는 내피세포 성장호르몬과 그 수용체인 KDR/Flk-1과 Flt-1간의 결합을 저해함으로써 내피세포 성장호르몬에 의해 유도되는 내피세포 증식을 저해하고 있음을 보여주고 있다.

[실시예 5] 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose의 내피세포 증식 억제 검정

내피세포 성장호르몬 이외의 다른 호르몬에 의한 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose의 내피세포 증식 억제 활성을 알아보기 위해 내피세포 성장호르몬 대신에 endothelial cell growth supplement (ECGS, 3 ㎍/ml)와 heparin (25 U/ml) 또는 bFGF (5 ng/ml)와 heparin (5 U/ml)을 사용해 실시예 4와 같은 방법으로 실시하였다.

그 결과, 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose는 ECGS (제 5도)와 bFGF (제 6도)에 의해 유도되는 내피세포 증식을 효과적으로 저해하였다. 이러한 결과는 실시예 4의 결과와 더불어, 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose는내피세포 성장호르몬 뿐만 아니라 ECGC 또는 bFGF에 의해 유도되는 내피세포 증식도 효과적으로 저해하고 있음을 보여주고 있다.

[실시예 6] 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose가 내피세포이외의 세포 성장에 미치는 영향검정

1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose에 의한 세포 증식 저해 효과가 내피세포 특이적인지를 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다. 인간 암세포인 HT 1080과 LNCaP을 RPMI 1640 배지에 1% 페니실린/스트렙토마이신과 10% 우태아혈청이 있는 배양액에서 5% 이산화탄소 농도로 조절되는 배양기에서 배양하였다. 96웰 플레이트에 웰 당 5 × 10³ 개의 세포를 주입한 후 24시간 동안 키우고 나서, 1% 우태아혈청과 여러 농도의 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose가 들어 있는 RPMI 1640 배지로 갈아주고 72시간 배양 후에 XTT를 가하고 일정 시간 배양한 다음 살아 있는 내피세포의 수를 결정하였다.

제 7도에서 보듯이, 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose는 인간 암세포의 증식을 조금은 억제하였으나 실시예 4 및 5에서 보여준 내피세포 증식저해에 비해 증식 억제효과가 미미하였다. 이러한 결과들은, 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose는 인간 내피세포의 증식을 선택적이고도 효율적으로 저해함을 시사하고 있다.

[실시예 7] 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose가 인간 암세포에 의해 유도되는 신 혈관형성 억제능력 검정

인간 암세포 (HT 1080) 의해 유도되는 신 혈관형성이 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose에 의해 저해되는지에 대한 여부를 달걀 CAM(chorioallantoic membrane)을 이용한 실험을 통하여 알아 보았다. 유정란을 37℃ 배양기에 넣고 2일간 배양시킨후, 3 ml의 알부민을 제거하고 4일후에 3cm x 3 cm 정도의 달걀 껍질을 제거해 창을 만든 후 계속 배양하였다. 1.2 × 10⁵개의 인간 fibrosarcoma (HT1080) 및 13.5 ㎍의 Type Ⅰ 콜라젠 (Rat tail, Becton Dickinson, USA)과 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose를 9 microliter의 부피에 섞어 1/4 조각의 Thermanox 디스크에 점적하여 상온에서 콜라젠 스폰지를 제작한다음, 이를 10일배 달걀의 CAM에 얹어 3일간 배양하고 점적된 샘플로 유도되는 혈관의 수를 결정하였다. 실험은 각각의 샘플당 12-17개의 달걀을 이용하여 실시하였다.

제 8도에서 보듯이, 인간 암세포가 존재하는 경우에는 42.8개의 혈관이 콜라젠 스폰지쪽으로 새롭게 형성되었지만 콜라젠만 존재할 때는 6.6개의 새로운 혈관이 형성되었다. 이는 암세포가 주변의 기존혈관에서 콜라젠 스폰지쪽으로 신 혈관형성을 잘 유도하고 있음을 나타낸다. 또한, 달걀당 0.5와 1 ㎍의 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose가 암세포와 같이 존재할 때는 기존혈관에는 영향을 주지 않으면서 인간 암세포에 의해 유도되는 신 혈관형성을 효과적으로 저해하여 부작용없이 암 치료제로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose 또는 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose을 포함하는 약학적 조성물들은 내피세포 성장호르몬과 그 수용체인 KDR/Flk-1 또는 Flt-1간의 결합을 효율적으로 저해하며, 내피세포의 증식을 촉진하는 물질들에 의해 유도되는 내피세포의 증식을 효율적으로 저해하고, 기존혈관에는 영향을 주지 않으면서 암세포에 의해 유도되는 신 혈관형성을 효과적으로 억제하는 바, 부작용없이 신 혈관형성을 억제함으로써 신 혈관형성이 비정상적으로 지속되는 암, 류마티스 관절염 및 당뇨성 실명증 등의 질환을 치료 또는 예방하는데 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 1의 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose 및 그의 유도체를 유효성분으로 하는 내피세포 성장호르몬과 그 수용체인 KDR/Flk-1 또는 Flt-1간의 결합 길항제.

화학식 1
화학식 1의 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose 및 그의 유도체를 유효성분으로 하는 신 혈관형성 억제제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 화학식 1의 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose 및 그의 유도체를 유효성분하며, 신 혈관형성과 관련된 암, 류마티스 관절염 및 당뇨성 실명증 등과 같은 질병의 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물.
제3항에 있어서, 화학식 1의 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose 및그의 유도체에 더하여 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 신 혈관형성과 관련된 암, 류마티스 관절염 및 당뇨성 실명증 등과 같은 질병의 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물.