KR100292826B1

KR100292826B1 - 백합조개(meretrixlusoria)로부터단리되는항바이러스성갈락탄설페이트다당질

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Publication number: KR100292826B1
Application number: KR1019980000907A
Authority: KR
Inventors: 김영식; 장일무
Original assignee: 김영식
Priority date: 1998-01-14
Filing date: 1998-01-14
Publication date: 2001-09-03
Also published as: KR19990065569A

Abstract

본 발명은 한국산 백합 조개(Meretrix lusoria)로부터 분리한 항바이러스 활성을 지닌 신규한 갈락탄 설페이트 (galactan sulfate) 다당질에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 후천성 면역결핍 바이러스 (HIV-1) 표면의 당단백질 gp120 과 숙주세포 막 단백질 CD4 사이에 상호작용을 강력히 저해함으로써 바이러스의 증식을 억제하는 베타 D-갈락탄 설페이트 다당질 및 한국산 백합조개로부터 프로테아제 등을 이용하여 백합 조개 엑기스를 만들고 이로부터 갈락탄 설페이트를 분리·정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

백합 조개(Ｍｅｒｅｔｒｉｘｌｕｓｏｒｉａ)로부터 단리되는 항바이러스성 갈락탄 설페이트 다당질

본 발명은 한국산 백합 조개로부터 분리한 항바이러스 활성을 지닌 신규한 갈락탄 설페이트 (galactan sulfate) 다당질에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 후천성 면역결핍 바이러스 (HIV-1) 표면의 당단백질 gp120 과 숙주세포 막 단백질 CD4 사이에 상호작용을 강력히 저해함으로써 바이러스의 증식을 억제하는 베타 D-갈락탄 설페이트 다당질 및 한국산 백합조개로부터 프로테아제 등을 이용하여 백합 조개 엑기스를 만들고 이로부터 갈락탄 설페이트를 분리·정제하는 방법에 관한 것이다.

바이러스는 숙주세포와 밀접한 관련이 있기 때문에 퇴치하기가 어려운 것으로 받아들였지만 최근 항바이러스제가 개발되어 임상에 사용되고 있다. 이러한 항바이러스제를 플레이크 검색법을 이용하여 스크리닝 함에 따라 황산 다당질이 특정의 바이러스 증식에 저해효과를 나타낸다는 사실이 보고되면서 많은 종류의 다당질에 대한 연구가 활발해졌다.

다당질의 항바이러스 효과는 숙주세포의 바깥쪽에 작용함으로써 기인되는 것이라는 생각이 주를 이루어 다당질에 대한 연구가 주목을 받지 못하였지만 그 중에서 특정한 구조로 구성된 다당의 경우에는 DNA- 나 RNA-바이러스 감염을 저해할 수 있거나, 감염된 세포의 안쪽이나 바깥쪽 모두에 작용할 수 있는 것도 있다.

이러한 다당질의 대표적인 것으로 덱스트란 설페이트(dextran sulfate)와 헤파린(heparin)이 있다. 그러나, 임상시험에서 덱스트란 설페이트는 독성을 나타내는 것으로 확인되었고 HIV-1 바이러스에 감염된 세포의 접합 (fusion)을 막는 문제점이 있으며, 헤파린은 항응고제가 제1차적 약물이기 때문에 이를 상용하는데 난점이 있다.

또 다른 예로는 해조류에서 추출하여 많이 사용되고 있는 카라기난(carrageenan) 과 퓨코이단(fucoidan)이 있다. 카라기난은는 카파(kappa, κ)와 람다(lamda, λ)의 형태로 크게 나누어지며 기본적인 골격의 구조는 4-설페이트-β-D-갈락토피라노실 (1→4)-α-D-갈락토스 연결(1→3)[4-sulfate-β-D-galactopyranosyl (1→4)-α-D-galactose linked (1→3)]의 κ형과 2-설페이트-β-D-갈락토피라노실 (1→4)-α-D-갈락토스 연결(1→3) [2-sulfate-β-D-galactopyranosyl (1→4)-α-D-galactose linked (1→3)]의 λ 형으로 나눌 수 있다. 카라기난이 포함하고 있는 갈락토스는 무수(anhydro)형일 수도 있고, 설페이트기가 두 개 존재한다. 카라기난이 항바이러스 활성을 보이는 기전은 바이러스 입자가 숙주세포 표면에 붙는 것을 막는 것으로 이해할 수 있으며, 카라기난의 경우에는 바이러스에 감염된 세포에 의해서 흡수(uptake)될 수 있어 세포 내에서 바이러스의 감염을 저해할 수 있다. 그러나 상기 물질 대부분이 조류 계통이지만 항상 섭취할 있는데는 문제가 있을 수 있다.

이에, 본 발명자는 상용가능하고 강한 항바이러스 활성을 가지는 다당질을 분리하기 위하여 식품으로 이용하는 조개류로부터 황산 다당 (sulfated polysaccharide)을 분리·정제하는 연구를 하던 중, 베타 D-갈락탄 설페이트 다당질을 풍부히 포함하고 있는 한국산 백합 조개 엑기스를 제조하고 그 백합 조개 엑기스로부터 갈락탄 설페이트 다당질을 분리·정제하여 상기 물질의 특성을 결정하고 또한 상기 다당질이 HIV-1 표면 당단백질 gp120 과 숙주세포 막 단백질CD4 의 상호작용을 저해함으로써 바이러스와 숙주세포의 접합을 방해할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 항 바이러스성 갈락탄 설페이트 다당질 및 한국산 백합조개로부터 프로테아제 등을 이용하여 백합 조개 엑기스를 만들고 이로부터 갈락탄 설페이트 다당질을 분리·정제하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

도 1은 백합 조개로부터 분리한 다당질을 가수분해한 후 설페이트(sulfate) 기를 분석한 이온-크로마토그래피(ion-chromatography)를 나타낸 것이며,

A : 설페이트 이온 표준품 10ppm 주입 ;

B : 갈락탄 설페이트 다당질을 가수분해 후 50ppm 주입 ;

도 2는 백합 조개로부터 분리한 다당질의 적외선 분광스펙트럼을 나타낸 것이며,

도 3a는 다당질의 1차원 핵자기공명 스펙트럼을 0ppm에서 6.0ppm까지 나타낸 것이며,

도 3b는 도 3a 중 3.3ppm부터 5.7ppm까지를 확장하여 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항바이러스 활성을 가지는 갈락탄 설페이트 다당질을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 갈락탄 설페이트 다당질을 한국산 백합 조개로부터 분리·정제하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에서는 한국산 백합 조개로부터 프로테아제 등을 이용하여 갈락탄 설페이트 다당질을 분리하고 암모니움 염을 이용한 복합체를 만들어 정제한다.

또한, 본 발명은 상기 갈락탄 설페이트 다당질을 유효성분으로 하는 항바이러스제용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 항바이러스제는 바이러스 감염성 질환 및 후천성 면역결핍 질환의 예방제, 치료제 및 치료보조제로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

한국산 백합 조개로부터 다음과 같은 방법으로 백합 조개 엑기스를 제조하고 그로부터 갈락탄 설페이트 다당질을 분리·정제한다.

식용 백합 조개의 겉껍질을 떼어낸 다음 아세톤, 헥산, 톨루엔 등의 유기용매로 처리하여 지방을 제거하고 건조시켜 딱딱하게된 조직을 분쇄기를 이용하여 잘게 부수고 체를 통과시켜 일정한 크기의 분말을 얻는다. 분말을 pH 8.0 - 9.0 범위를 유지할 수 있는 완충용액 또는 1 - 5 N NaOH 용액에서 현탁시킨다. pH를 약알칼리로 유지시킨 완충용액을 사용한 이유는 단백질을 제거하기 위해 사용되는 프로테아제인 알칼라제의 최적 pH가 약알칼리이기 때문이다.

단백질을 제거하는 방법에는 수산화나트륨(NaOH)을 사용하는 방법과 프로테아제를 사용하는 방법이 있다.

프로테아제인 알칼라제는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)로 부터 생산되며 모든 종류의 단백질을 분해시킬 수 있는 프로테아제로서 활성도는 0.6AU/g이다. 주효소는 섭틸리진 (subtilisin) A로 엔도프로테아제의 일종이다. 최적 반응온도는 기질에 따라서 50 - 70^oC이고 최적 pH는 6.5 - 9.0이다. 반응시간은 24시간에서 48시간 정도에서 대부분의 단백질이 소화된다. 알칼라제 이외에도 프로테아제로 파파인 프로테아제를 사용할 수 있으나, 경제성면에서 알칼라제가 가장 유리하다. 효소반응 후 상등액에 5% 트리클로로아세트산 (TCA)을 처리하여 남아 있는 단백질 및 핵산을 침전시킨다. 침전물을 원심분리한 후 고분자 탄수화물이 녹아 있는 상등액에 알코올을 넣어 하룻밤 방치시킨 후 침전물을 다시 모은다. 알코올에 대한 용해도 차에 의해서 분획을 할 수 있다. 상기와 같은 과정으로 갈락탄 설페이트 다당질을 포함하는 백합 조개 엑기스를 제조한다.

상기 과정으로 얻은 침전물에 포함되어 있는 산성당을 정제하기 위하여 삼급 및 사급 암모니움염을 이용하여 정제할 수 있다. 사급 암모니움염으로는 세틸피리디움 클로라이드 (세타블론, cetylpyridinium chloride)나 트리메틸아민 클로라이드(trimethylamine chloride)가 이용될 수 있다. 암모니움 염과 침전시켜 침전물을 강염으로 용해시키고 이것을 알코올에 의해서 재침전시킬 경우 정제된 갈락탄 설페이트 다당질을 얻을 수 있다.

또한 다당질에 결합되어 있는 결합 단백질을 제거하기 위하여 수산화나트륨(NaOH) 용액과 나트륨 보로하이드라이드를 이용하여 β-일리미네이션(β-elimination) 반응을 수행한다. 반응후 수산화나트륨이 강알칼리 용액이기 때문에 강염산을 이용하여 중화시켜야 한다. 이를 알코올을 이용하여 침전시키고 침전물을 감압건조하여 갈락탄 설페이트 다당질을 정제한다.

상기 과정에 의해 한국산 백합 조개로부터 분리·정제한 다당질의 구조를 분석하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

우선, 아가로스 겔(agarose gel) 전기영동을 수행한 결과 1개의 점으로 나타났고 또한 바이오-겔(Bio-Gel) P-100 칼럼에서 대칭 모양으로 분획되어 본 발명의 다당질이 순수하게 정제되었음을 알 수 있었다.

일반 중성당의 함량은 페놀-황산법을 이용하여 측정하였고, 산성당은 카르바졸법에 의하여 정량하였으나 산성당은 확인되지 않았기 때문에 우론산이 없음을 알 수 있었다. 또한, 탈아세틸화후 아세틸화를 시켜도 핵자기 공명에서 아세틸기가 확인되지 않아 아미노당이 없음을 알 수 있었다.

당의 조성은 가수분해후 박층크로마토그라피를 이용하여 분석하였을 때 갈락토오스만을 확인할 수 있었다. 메타놀리시스(methanolysis)후에 GC-MS를 이용하여 조성당을 분석하고, 가수분해 후 형광기를 환원당 말단에 결합시켜 표준품과 분석한 결과 당의 구성성분은 갈락토오스로 이루어져 있음을 알 수 있었다.

설페이트기의 존재 유무는 이온 크로마토그라피를 이용하여 분석하였고 적외선 분광기와 핵자기공명을 이용하여 확인하였다. 그 결과 설페이트의 존재를 확인할 수 있었다.

또한 당의 결합 위치는 핵자기공명을 이용하여 분석하였다.

본 발명의 갈락탄 설페이트 다당질의 구조를 분석한 결과 β-D-갈락토스-2-O-설페이트 (β-D-galactose-2-O-sulfate) 와 β-D-갈락토스-2,6-O-설페이트 (β-D-galactose-2,6-O-sulfate) 가 연속적으로 이루어진 형태로 구성되어 있고 평균분자량은 25,000 달톤(dalton) 정도로서 약 100개의 당의 사슬로 연결되어 있으며 그 연결 형태는 →4)-β-D-갈락토오스-2-O-설페이트(1→4)-β-D-갈락토오스-2,6-O-설페이트(1→ 임을 확인하였다. 한국산 백합 조개로부터 분리한 일반적인 갈락탄 설페이트 다당질의 구조는 하기 화학식 1에 나타난 바와 같다.

상기 화학식 1에서 R₁, R₂및 R₃는 각각 SO₃ ^-또는 H 이며, n 은 약 100이다.

본 발명의 베타-D-갈락탄 설페이트 다당질은 식품에서 정제된 것이기 때문에 수시로 섭취가 가능한 잇점이 있다.

상기의 베타-D-갈락탄 설페이트 다당질의 항바이러스 효과를 측정하기 위하여, CD4⁺HeLa 세포와 vPE 16 바이러스의 융합 분석법(Fusion assay)을 수행하였다. 면역결핍 바이러스에 대한 항바이러스제에 대한 검색 방법으로 여러 가지가 있지만 본 발명에서는 HIV-1의 외피 단백질인 gp120 과 숙주세포 막 단백질인 CD4 사이의 상호 작용을 저해하는 정도를 측정하는 방법으로 항바이러스 활성을 확인하였다. 그러나, HIV-1 을 그대로 사용하는 것은 상당한 위험에 노출되는 것이기 때문에 유전자 재조합 바이러스 vPE16 과 CD4⁺Hela 세포 사이의 상호작용을 측정하였다. vPE16 은 당단백질 gp160 을 발현하며 이것은 바이러스 외피에서 gp120 와 gp41 로 나누어진다. 본 발명의 다당질은 농도 의존적으로 세포의 접합을 저해시키는 것을 확인할 수 있었다.

상기 항바이러스제는 바이러스 감염성 질환 및 후천성 면역결핍 질환의 예방제, 치료제 및 치료보조제로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 항바이러스제에 대하여 독성 실험을 다음과 같이 수행하였다. 활성물질을 물에 녹여 이를 마우스(군당 5 마리)에 각각 투여한 후 14일 동안 관찰하여 사망률을 측정하였다. 이 때 상기 갈락탄 설페이트 다당질은 1 g/kg, 500 mg/kg, 250 mg/kg, 125 mg/kg, 62.5 mg/kg 의 5단계로 투여하였고 50% 치사량은(LD50) 1 g/kg 이상이었다.

본 발명의 항바이러스제용 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조할 수 있다.

이 때 제제 형태는 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑기스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있으며, 분산제, 현탁제 또는 안정화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 인체 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 1일에 1 - 1500 mg 정도를 투여하나 200 - 800 mg 정도를 투여하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 단위투여형 제제는 전술한 유효량 범위를 고려하여 본 발명의 활성물질을 5 - 500 mg 의 함량이 되도록 제조한다. 바람직하게는 50 - 300 mg 을 함유하도록 제형화하는 것이 좋다. 이렇게 제형화된 단위투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나, 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있으며, 바람직하기로는 하루에 1회 내지 3 회 투여할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 갈락탄 설페이트 다당질을 유효성분으로 하는 기능성 식품 또는 식품 첨가제를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 갈락탄 설페이트 다당질을 유효성분으로 하는 기능성 음료 또는 음료 첨가제를 제공한다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

1. 백합 조개 엑기스의 제조 및 갈락탄 설페이트의 분리·정제.

<실시예 1> 백합 조개 엑기스의 제조.

신선한 백합을 수산물 시장에서 구입하여 겉껍질을 떼어낸 후 지질 성분을 제거하기 위하여 내용물을 아세톤(acetone)에 이틀동안 방치후 실온에서 말렸다.

시료 15 g (건조중량)을 각각 0.05 M 탄산염 완충액(pH 9.0) 150 mL에 넣고 내열성 프로테아제의 일종인 알칼라제 2.5 mL를 가하여 60℃ 에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 최종 농도가 5%가 되도록 트리클로로아세트산을 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 방치한 후 8000 RPM 으로 원심분리하여 상등액을 모은다음, 상등액에 1% 초산 칼륨염 (potassium acetate)를 함유한 알코올을 3배 부피로 첨가하여 침전시키고 건조시켜 백합 조개 엑기스를 제조하였다.

<실시예 2> 백합 조개 엑기스로부터 다당질의 정제.

상기 실시예 1에서 얻은 조생성물을 물에 녹여 녹지 않은 물질을 원심분리로 제거한 후 5% 세틸피리디움 클로라이드(cetylpyridinium chloride)를 1/4 부피로 첨가하여 복합체를 만들어 침전시켰다. 침전물을 원심분리하여 2.5 M 염화나트륨에 녹여 다시 알코올로 침전시켜 정제하였다. 정제한 시료를 다시 소량의 물에 녹여 투석시킨 후 동결건조시켜 다당질을 정제하였다.

<실시예 3> 결합단백질의 제거.

다당질에 결합된 결합단백질을 제거하기 위하여 β-일리미네니션(β-elimination)반응을 수행하였다. 상기 실시예 2에서 정제된 다당질 75 mg 을 4 mL의 물에 녹이고 1 mL의 1.2 M 수산화나트륩과 0.9 M의 나트륨 보로하이드라이드(NaBH₄)를가하여 21시간 동안 25℃에서 반응시켰다. 반응후 pH를 1.2 M 염산으로 맞춘 후 4배의 에틸알코올을 가하여 냉장고에 방치하여 침전을 모았다. 침전을 P₂O₅하에서 감압건조시켰다.

2. 다당질의 구조 분석

<실시예 4> 다당질의 메틸화와 메타놀리시스에 의한 당조성 분석.

상기 실시예 3에서 분리한 다당질을 건조시킨 후 0.2mL 의 DMSO 에서 초음파처리 후 30분간 방치하였다. 수산화나트륨-DMSO 현탁액 0.2mL 과 CH₃I 0.03∼0.1mL 을 넣고 다시 초음파처리와 볼텍스(vortex) 후 물로 희석하였다. 같은 양의 클로로포름(chloroform)으로 메틸(methyl)화 시킨 당을 추출하였다. 원심분리 후 유기층을 물로 세 번 씻은 후 질소하에서 건조시켰다. 건조시킨 메틸화된 당을 88% 개미산 0.5mL, 물 0.1mL, 트리플로로아세트산 0.05mL의 혼합용매를 넣고 질소가스(N₂₎로 치환시킨 후 마개를 막아 100℃에서 가수분해시켰다. 감압하에서 0.2mL NaBH₄(0.03N 수산화나트륨을 포함하는 30% 메탄올 5 mg/mL)를 넣고 16시간 상온에서 방치하고 빙초산을 20 μl 넣고 감압건조 시킨 후 메타놀릭(methanolic) HCl 1mL를 넣은 후 회전, 농축시켰다. 부분적으로 메틸레이티드 알디톨(methylated alditol) 에 5 mg/mL 의 4-N,N'-디메틸아미노피리딘(dimethylaminopyridine) 을 함유한 0.15mL의 아세토니트릴(acetonitrile) 과 0.05mL 피리딘(pyridine), 0.15mL의 아세트산 무수물(acetic anhydride)을 넣고 실온에서 2∼4시간 방치후 물 2∼3mL 을 넣은 후 클로로포름으로 추출하여 물로 세척하고 다시 건조시켜 사용하였다. 부분적으로 메틸레이티드 알디톨 아세테이트(methylated alditol acetate)를 1 nmol/μl로 녹여서 이중 1-2 μl를 GC-MS 에 주입하여 분석하였다. 메타놀리시스결과 GC-MS 분석에서 백합 조개의 다당이 갈락토오스로 구성된 것을 확인하였고 부분적으로 메틸화시킨 알디톨 유도체의 분석 결과 2,3,5,-메틸 갈락토오스의 확인으로 4번의 히드록시(-OH)기가 이웃의 1번 갈락토오스 히드록시기와 결합을 하고 있는 것으로 결론지었다.

<실시예 5> 고속액체크로마토그래피를 이용한 당조성분석.

수 마이크로그람의 시료를 6N 염산의 100ul 에 녹여 6시간 동안 98℃에서 가열하고 또한 같은 양의 시료를 2.5N 트리플로로아세트산에 녹여 2.5시간 동안 가열하여 분해시켰다. 아미노당은 0.45 um 막을 통과시킨 후 고속액체크로마토그래프에서 분석하였다. 중성당은 Sep-Pak Light Accel Plus (QMA+CM) 을 통과시킨 후의 액체를 분석하였다. 칼럼은 TSK 겔(gel) SCX (4.6 mm × 150 mm) 와 쇼덱스 슈가(Shodex Sugar) SP0810 (8.0 mm × 300 mm)을 이용하여 각각 분리하였다. 칼럼을 통과하여 나온 용출액을 1% 2-시아노아세트아마이드(cyanoaceteamide)와 반응시켜 형광기 검출기를 이용하여 여기(excitation) 파장 331 nm, 방출(emission)파장 383 nm에서 분석하였다. 이 때 분석 결과에서 아미노당은 전혀 검출되지 않았다. 중성당의 경우는 갈락토스만 확인되어 시료 자체의 구성당은 갈락토오스라고 결론을 지었다.

<실시예 6> 박층크로마토그라피를 이용한 당조성 분석.

2∼5mg 의 시료를 2N 트리플로로아세트산에 녹여 질소 가스로 내용물을 치환시킨후 100℃에서 3시간 동안 가스분해시킨 후 원심분리후에 침전을 제거하고 상층액을 모아 감압하에 날려보냈다. 건조 잔사를 증류수 500μl에 녹여서 박층크로마토그라피를 실시하였다. 부타놀:빙초산:에테르:물 = 9:6:3:1로 포화시킨 챔버내에서 실시하였다. 약 1시간 전개시켜 플레이트를 공기중에서 말린 후 아닐린-프탈레이트 용액으로 분무시켜 100℃에서 10분간 가온하여 나타나는 반점을 표준품과 확인하여 비교하였다. 나타나는 점은 주황색의 갈락토오스 이외에는 전혀 나타나지 않아 구성당은 갈락토오스임을 입증할 수 있었다.

<실시예 7> 이온 크로마토그래피(Ion-chromatography)를 이용한 설페이트기의 분석.

1mg의 다당질에 6N 염산용액 50μl를 넣고 질소가스하에서 2.5시간 100℃에서 가열한 후 10분간 1800g 에서 원심분리하였다. 50℃에서 용액을 증발시킨 후 50% 메탄올 100μl를 가한 후 40℃ 에서 농축시켰다. 200μl의 물에 녹여 이중 50μl를 칼럼에 주입하였다. 이온 크로마토그래피의 조건은 TSK 겔 IC-anion PW (4.6 mm i.d. × 50 mm), 서프레서 칼럼(suppressor column)은 Dowex 50W-X8 (H⁺) (5.0 mm i.d. × 200 mm)의 칼럼을 사용하였고, 30℃ 에서 크로마토그래피를 수행하였다. 1.42mM Na₂CO₃+ 1.5mM Na₂CO₃의 이동상을 이용하고 유속 속도는 1.0 ml/분, 검출기는 컨덕터메트리(conductometry)를 사용하였다. 이 때 정확히 설페이트의 이온 피크가 검출되었다.

<실시예 8> 구성당의 절대 배열 (Absolute configuration) 분석.

5 mg의 당에 0.25 ml의 2N 염산을 가하고 밀봉하여 100℃ 에서 4시간 가열하였다. 가수분해시킨 당과 D-갈락토오스 및 L-갈락토오스를 에틸아세테이트/피리딘/물 (8/2/1) 의 혼합용매로 포화시킨 전개조에서 박층크로마토그래피를 이용하여 전개시켰다. 전개 후 박층막을 건조하여 0.1 % 갈락토오스 옥시데이즈(galactose oxidase) 와 0.01 % 퍼옥시데이즈(peroxidase)(pH 5.2 아세테이트 완충액)로 분무하였다. 다음 0.2% 디아니시딘(dianisidine) 알코올 용액을 분무하였다. 이 때 크로마토그라피 플레이트위에 푸른색이 나타남으로써 D-갈락토오스로 구성되어 있는 것이 확인되었다.

<실시예 9> 분광법을 이용한 당구조분석.

적외선 분광기(Jasco FT-IR 230)를 이용하여 적외선 분광을 실시하였다. 또한 약 5 mg의 시료를 99.96%의 중수(D₂O) 에 녹여서 고자장 핵자기공명 (NMR)을 이용하여 구조를 분석하였다. NMR 은 JEOL사 제품으로 VAX32 컴퓨터가 연결된 500 MHz 스펙트로미터를 사용해서 실시하였다. 케미칼 시프트는 내부 표준물질인 3-트리메틸실릴 [²H₄]프로피온산 나트륨염에 대해서 ppm으로 나타내었다. 이차원 COSY, DQF (double quantumn-filtered) COSY 와 TQF (triple quantumn-filtered) COSY 역시 수행되어졌다.

적외선(IR) 분광을 확인한 결과 IR 패턴에서 780∼820 cm^-1인 곳에서 설페이트기의 확인이 가능하였다(도 1참조).

전체 다당의¹H-NMR 분석에서 우선 갈락토오스β 아노머릭 1번 수소의 케미칼 시프트가 4.83 ppm 에서 doublet 으로 관찰되고, H-2는 triplet 으로 4.45 ppm 에서 관찰되었다. H1 과 H2 의 결합(coupling)은 2-D COSY NMR 에서 알 수 있었다. H-2 의 다운필드 시프트(downfield shift)가 나타나 2-O-설페이트기로 치환되어 있음을 알려준다(설페이트기의 치환이 없을 때는 3.3 ppm). 특히, 베타 구조의 형태를 유지하고 있다는 증거는 H1과 H2의 결합상수가 7.8 Hz인 점에서 알 수 있다 (보통 알파는 4 Hz). H4는 H3와 H5에 의해서 결합되는 것으로 볼 때 multiplet 으로 나타난다. H-3의 케미칼 시프트가 H-2와 H-4의 결합되는 것으로 볼 때 3.95 ppm에서 확인되고 있다. TQF NMR 실험에서 H-5와 H-6a 및 H-5와 H-6b가 결합하는 것을 알 수 있다. 따라서, 4.2 ppm에서 관찰할 수 있는 스펙트럼은 H-6 라고 예측할 수 있다. 그런데, H-6가 다운필드(downfield)된 점은 설페이트기가 -CH₂OH 에 치환된 것이라고 볼 수 있다(도 2참조).

이러한 결과를 종합해 볼 때 백합 조개로부터 분리·정제한 다당질은 일반적인 구조가 갈락토오스-β(1→4)-갈락토오스-2-O-설페이트 또는 갈락토오스-β(1→4)-갈락토오스-2, 6-O-설페이트로 구성된 다당질로 결론지을 수 있다.

3. 항바이러스 검색

<실시예 10> 접합 저해 분석.

사용된 시료는 1 mg/mL 의 농도로 조제하여 0.22μm의 필터를 통과시켰다. 표면에 CD4 단백질을 갖고 있는 CD4 양성 헬라(HelLa) 세포를 함스(Ham's) 배지에서 키웠다. 배지의 성분으로는 열처리한 갓 태어난 송아지 혈청, 100 units/mL 페니실린 G, 100 μg/mL 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate), NaHCO₃(1.176g/L)을 첨가하였다. 유전자 재조합 바이러스 vPE 16은 표면에 외피단백질 gp120 와 gp41 을 발현하는 우두 바이러스를 이용하여 제조하였다. vPE의 스톡(stock) 은 vPE 16이 감염된 베로(vero) 세포의 상등액을 모아 사용하였다. 상등액의 바이러스 타이터(titer) 는 플라그 분석법(plaque assay)을 이용하여 결정하였다. 바이러스 원액은 -80℃에 보관해서 사용하였다. 분석방법을 요약하면 대수기에 있는 CD⁺헬라 세포 (2×10⁵세포/mL)를 12 웰 플레이트(well plate)에 깔고 3일 후에 신선한 배지로 플레이트위에 붙지 않은 세포를 씻어냈다. 상기의 검체가 있는 0.2 mL의 배지를 넣고 30 분간 배양한 후 희석시킨 vPE 16 (7.3 × 10²PFU) 10μL를 넣고 30분간 더 배양시켰다. 이 때 0.8 mL의 배지를 넣고 16∼20 시간 후에 현미경하에서 접합 형성 (syncytia formation)을 관찰하였다.

접합(Fusion )계수와 접합저해의 비율은 하기 수학식 1 및 수학식 2에 의해서 구했다.

이 때 FI₁은 검체의 접합계수이고 FI₂은 대조군의 접합계수이다.

접합 분석의 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

갈락탄 설페이트에 의한 gp120 과 CD4 의 접합 저해.

시료	농도(μg/ml)	접합 계수	%접합저해
대조군	-	1.0	0
갈락탄 설페이트	50	0.725	23.5
	100	0.464	40.1
	200	0.343	55.8
덱스트란 설페이트	100	0.274	64.8
덱스트란 설페이트	200	0.042	94.6

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 백합 조개로부터 분리한 갈락탄 설페이트 다당질이 농도 의존적으로 세포의 접합을 저해시키는 것을 알 수 있었고, 200μg/ml의 농도에서는 56%의 저해를 관찰할 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 한국산 백합 조개로부터 갈락탄 설페이트 다당질을 분리하여 이를 유효 성분으로 하는 항바이러스제를 제공하는 것으로, 본 발명의 갈락탄 설페이트 다당질은 바이러스와 숙주세포의 접합을 억제하는 항바이러스 활성이 매우 우수하여 바이러스 감염에 의한 질환 등의 예방제나 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

또한 식품으로 바로 섭취가능한 백합 조개로부터 유래된 것이기 때문에 상용이 용이한 장점이 있다.

Claims

항바이러스 활성을 가지는 갈락탄 설페이트 다당질.
프로테아제를 효소원으로 사용하여 백합 조개 건조물을 분해시켜 얻는 백합 조개 엑기스.
프로테아제를 효소원으로 사용하여 50 - 70^oC의 온도조건에서, pH 6.5 - 9.0의 완충용액에서 백합 조개 건조물을 분해시켜 얻는 것을 특징으로 하는 백합 조개 엑기스의 제조 방법.
백합 조개 엑기스로부터 암모늄 염을 이용한 복합체를 만들어 침전시킨 다음 물에 녹여 투석하고 수산화나트륨을 이용하여 결합 단백질을 제거하는 것을 특징으로 하는 갈락탄 설페이트 다당질의 정제방법.
제 1항의 갈락탄 설페이트 다당질을 유효 성분으로하는 바이러스 감염 질환 또는 후천성 면역결핍 질환에 사용되는 약학적 조성물.
제 1항의 갈락탄 설페이트 다당질을 유효 성분으로 하는 기능성 식품 또는 식품 첨가제.