JPS6045598A - トリチウム化サイモシンβ４による免疫定量法 - Google Patents
トリチウム化サイモシンβ４による免疫定量法Info
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- JPS6045598A JPS6045598A JP59068948A JP6894884A JPS6045598A JP S6045598 A JPS6045598 A JP S6045598A JP 59068948 A JP59068948 A JP 59068948A JP 6894884 A JP6894884 A JP 6894884A JP S6045598 A JPS6045598 A JP S6045598A
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- C07K14/57581—Thymosin; Related peptides
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
胸腺によって作られるホルモン様物質は以前からＴ−リ
ンパ球の機能と成熟を調整すると考えられてきた。今日
では胸腺因子と推定されろ多くの因子が単離され、その
生物学的活性が報告されている（たとえば米国特許第４
．０９７．１２７号参照）。
ンパ球の機能と成熟を調整すると考えられてきた。今日
では胸腺因子と推定されろ多くの因子が単離され、その
生物学的活性が報告されている（たとえば米国特許第４
．０９７．１２７号参照）。
この種の因子のひとつとして、ペプチドであるサイモシ
ンβ４が胸腺から単離され、そのアミノ酸配列も決定さ
れている（米国特許第４，２９７．２７６号参照〕。
ンβ４が胸腺から単離され、そのアミノ酸配列も決定さ
れている（米国特許第４，２９７．２７６号参照〕。
サイモシンβ４は、免疫機能のｉｎ ｖｉｖｏおよびｉ
ｎ ｖｉｔｒｏの両アッセーにおいて免疫応答を改変す
ることが報告されてきた。最近の生物学的研究では、サ
イモシンβ４（以下β４とい５）が胸腺以外の組織にも
かなりの量存在すること、またこのペゾチＶが培養ラッ
ト腹腔マクロファージによつて特異的に合成されること
も明らかにされた。
ｎ ｖｉｔｒｏの両アッセーにおいて免疫応答を改変す
ることが報告されてきた。最近の生物学的研究では、サ
イモシンβ４（以下β４とい５）が胸腺以外の組織にも
かなりの量存在すること、またこのペゾチＶが培養ラッ
ト腹腔マクロファージによつて特異的に合成されること
も明らかにされた。
すなわち、生理学的レベルでのこのペゾチＶを検出でき
る放射免疫定量法に使用するため、β４に特異的な抗体
やβ４由来の放射標識リガンｒの利用が重要になってき
た。これは、自己免疫性または硬化性疾患たとえば脱随
疾患の患者の血中における循環β４レベルは正常のベー
スラインレベル以下に低下しているという初期的観察か
らみてもその重要性は明らかである。この事実は、この
種の疾患における破壊相でのβ４の放出が、同時にこの
ペプチドに対する自己抗体の産生を起こすことを反映し
ているものと考えられる。すなわち、β４の放射免疫定
量法は、この種の疾患の早いステージでの発見のための
スクリーニング用として、またその進行および治療に対
する反応を監視するために有用であろう。
る放射免疫定量法に使用するため、β４に特異的な抗体
やβ４由来の放射標識リガンｒの利用が重要になってき
た。これは、自己免疫性または硬化性疾患たとえば脱随
疾患の患者の血中における循環β４レベルは正常のベー
スラインレベル以下に低下しているという初期的観察か
らみてもその重要性は明らかである。この事実は、この
種の疾患における破壊相でのβ４の放出が、同時にこの
ペプチドに対する自己抗体の産生を起こすことを反映し
ているものと考えられる。すなわち、β４の放射免疫定
量法は、この種の疾患の早いステージでの発見のための
スクリーニング用として、またその進行および治療に対
する反応を監視するために有用であろう。
本発明はサイモシンβ４の放射免疫定量法に関する。こ
の種の定量に用いられる抗体は丈イモシンβ４を慣用の
免疫原キャリアー材料に共有結合させて誘導される免疫
原を製造することにより得るのが便利である。本発明の
実施に必要なサイモシンβ４の供給源は狭い範囲に限定
されるものではない。適当なサイモシンβ４としては、
哺乳類動物供給源から得られる分画５由来のものを使用
できる。たとえば、ヒト、ウシ、ヒツジまたはブタの分
画５プレバレージヨンから得られるサイモシンβ、を使
用できる。これは、各種補乳類動物種に由来するサイモ
シンβ４のアミノ酸配列の相同性によるものと考えられ
る。
の種の定量に用いられる抗体は丈イモシンβ４を慣用の
免疫原キャリアー材料に共有結合させて誘導される免疫
原を製造することにより得るのが便利である。本発明の
実施に必要なサイモシンβ４の供給源は狭い範囲に限定
されるものではない。適当なサイモシンβ４としては、
哺乳類動物供給源から得られる分画５由来のものを使用
できる。たとえば、ヒト、ウシ、ヒツジまたはブタの分
画５プレバレージヨンから得られるサイモシンβ、を使
用できる。これは、各種補乳類動物種に由来するサイモ
シンβ４のアミノ酸配列の相同性によるものと考えられ
る。
また、公知のベゾチＶ合成法で得られるサイモシンβ４
の使用も好ましい。サイモシンβ４の合成は、たとえば
米国特許第４．２９７．２７６号に記載されている。
の使用も好ましい。サイモシンβ４の合成は、たとえば
米国特許第４．２９７．２７６号に記載されている。
本明細書において用いられる「免疫原キャリアー材料」
の語は宿主動物に免疫原性応答を独立に誘発する性質を
意味し、サイモシンＩ？４の遊離カルボキシル、アミノ
またはヒドロキシル基と免疫原キャリアー材料の相当す
る基との間にペプチドまたはエステル結合を介して直接
、または慣用される二官能性連結基を介してサイモシン
β４と共有結合により結合できる物質である。
の語は宿主動物に免疫原性応答を独立に誘発する性質を
意味し、サイモシンＩ？４の遊離カルボキシル、アミノ
またはヒドロキシル基と免疫原キャリアー材料の相当す
る基との間にペプチドまたはエステル結合を介して直接
、または慣用される二官能性連結基を介してサイモシン
β４と共有結合により結合できる物質である。
、免疫原キャリアー材料へのサイモシンβ、の共有結合
による連結は、本技術分野において公知の方法によって
実施できる。たとえば、共有結合による直接的連結は、
カップリング剤としてカルボジイミド好ましくはジシク
ロへキシルカルだジイミドまたは１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを用いて行
われる。
による連結は、本技術分野において公知の方法によって
実施できる。たとえば、共有結合による直接的連結は、
カップリング剤としてカルボジイミド好ましくはジシク
ロへキシルカルだジイミドまたは１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを用いて行
われる。
この直接的結合工程は、わずかに酸性のメジウムたとえ
ば約３〜６．５の一範囲、とくに好ましくは−」約４〜
６．５の範囲のメジウムを用いて行うのが望ましい。
ば約３〜６．５の一範囲、とくに好ましくは−」約４〜
６．５の範囲のメジウムを用いて行うのが望ましい。
連結を行うのに適当な二官能性基としてはｃ２〜フジア
ルカナールたとえばグルタルアルデヒドが適当である。
ルカナールたとえばグルタルアルデヒドが適当である。
この別法の態様における連結は、Ａｖｒａｍｅａｓの報
告（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＋ ６ ： ４
３ ｒ１９、！Ｓ９）における条件を用いて行うのが便
利である。
告（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＋ ６ ： ４
３ ｒ１９、！Ｓ９）における条件を用いて行うのが便
利である。
生成した免疫原はさらに精製することなくそのまま使用
できる。また、必ずしも必要ではないが、透析に付して
未反応サイモシン１４およびカップリング剤を除去して
もよい。
できる。また、必ずしも必要ではないが、透析に付して
未反応サイモシン１４およびカップリング剤を除去して
もよい。
本発明の免疫原の製造に使用できる適当な免疫原キャリ
アー材料としては、タンパク質；天然または合成？リマ
ー化合物た′とえばポリリジンまたはアミノ酸のコポリ
マー；ポリサッカライダ等を挙げることができる。
アー材料としては、タンパク質；天然または合成？リマ
ー化合物た′とえばポリリジンまたはアミノ酸のコポリ
マー；ポリサッカライダ等を挙げることができる。
本発明の免疫原の製造に際し免疫原キャリアー材料とし
て使用されるタンパク質の同一性は必須ではない。適当
なタンパク質の例には、哺乳類の血清タンパク質たとえ
ばヒトγ−グロブリン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清
アルブミン、メチル化ウシ血清アルブミン、ウサギ血清
子ルプミン、ウシγ−グロブリンおよびウマγ−グロ７
” リｙ、または非哨乳類タンパク質たとえばヘモシア
ニンとくにキーホール・リンペット（Ｋｅｙｈｏｌｅ
ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（ＫＬＨ，）が包含さｈる
。他の適当なタンパク質は、本技術分野における熟練者
には公知のとおりである。
て使用されるタンパク質の同一性は必須ではない。適当
なタンパク質の例には、哺乳類の血清タンパク質たとえ
ばヒトγ−グロブリン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清
アルブミン、メチル化ウシ血清アルブミン、ウサギ血清
子ルプミン、ウシγ−グロブリンおよびウマγ−グロ７
” リｙ、または非哨乳類タンパク質たとえばヘモシア
ニンとくにキーホール・リンペット（Ｋｅｙｈｏｌｅ
ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（ＫＬＨ，）が包含さｈる
。他の適当なタンパク質は、本技術分野における熟練者
には公知のとおりである。
本発明の免疫原は宿主動物に好ましくはアジュパントを
用いて注射して、サイモシンβ４に′特異的な抗体の生
成を誘発するのに使用できる。長期間にわたって反復注
射して力価を改善することもできる。この目的に適当な
宿主動物としては、ウナギ、ウマ、ヤギ、モルモット、
ラット、ウシ１、ヒツジ等を挙げることができる。得ら
れる抗血清はサイモシンβ４と選択的に複合体を形成で
きる抗体！含有する。本発明の放射免疫定量法に用いら
れる放射性リガンドはトリチウム化すイ阜ンンβ。
用いて注射して、サイモシンβ４に′特異的な抗体の生
成を誘発するのに使用できる。長期間にわたって反復注
射して力価を改善することもできる。この目的に適当な
宿主動物としては、ウナギ、ウマ、ヤギ、モルモット、
ラット、ウシ１、ヒツジ等を挙げることができる。得ら
れる抗血清はサイモシンβ４と選択的に複合体を形成で
きる抗体！含有する。本発明の放射免疫定量法に用いら
れる放射性リガンドはトリチウム化すイ阜ンンβ。
である。この種のトリチウム化は木技術分野において公
知の方法を用いて実施できる。好ましい方法としては、
Ｍａｒｇｏｌｉｓの方法（Ａｎａｌ−Ｂｉｏｃｈｅｍ＋
。
知の方法を用いて実施できる。好ましい方法としては、
Ｍａｒｇｏｌｉｓの方法（Ａｎａｌ−Ｂｉｏｃｈｅｍ＋
。
５０：６０２，１９７２）を用い、ホルムアルデヒドの
存在下にサイモシンβ４のリジン残基を還元アルキル化
してトリチウム化する方法がある。
存在下にサイモシンβ４のリジン残基を還元アルキル化
してトリチウム化する方法がある。
得うれたトリチウム化サイモシンβ４をついで、高圧液
体クロマトグラフィーにより再精製するのが好ましい。
体クロマトグラフィーにより再精製するのが好ましい。
本発明の実施にあたっては、各種の定量法が採用できる
。−態様においては、定量すべきサンプルの既知量、サ
イモシンＩ４特異的抗体および標識サイモシンβ４を混
合して、放置する。木技術分野において公知の方法、す
なわち、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール、
過剰もしくし１不溶性支持体に結合させた第二抗体、デ
キストラン被覆チャーコール等で処理して、非結合試薬
力・ら抗体−抗原複合体を分離する。結合または非結合
相における標識サイモシンβ４の濃度を測定し、観察さ
れた標識成分のレベルをそれ自体公知の方法で標準曲線
と比較してサンプル中のナイモシン／ｉ？４含量を決定
する。適当な標準曲線は、既知量のサイモシンβ４を固
定量の標識サイモシンβ４およびサイモシンＩ４特異的
抗体と混合し、各既知量に対する結合割合を測定するこ
とにより得られる。
。−態様においては、定量すべきサンプルの既知量、サ
イモシンＩ４特異的抗体および標識サイモシンβ４を混
合して、放置する。木技術分野において公知の方法、す
なわち、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール、
過剰もしくし１不溶性支持体に結合させた第二抗体、デ
キストラン被覆チャーコール等で処理して、非結合試薬
力・ら抗体−抗原複合体を分離する。結合または非結合
相における標識サイモシンβ４の濃度を測定し、観察さ
れた標識成分のレベルをそれ自体公知の方法で標準曲線
と比較してサンプル中のナイモシン／ｉ？４含量を決定
する。適当な標準曲線は、既知量のサイモシンβ４を固
定量の標識サイモシンβ４およびサイモシンＩ４特異的
抗体と混合し、各既知量に対する結合割合を測定するこ
とにより得られる。
次に本発明を以下の実施例により、さらに詳細に説明す
る。
る。
ヱ（其
免疫原の調製： ７！？、−ＫＬＨ抱合体をグルタル了
ルデヒＶ架橋法によって合成した。β４２ｍ９とＫＬＨ
１８１ｎｙを０，１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，２）２
ｍｌに室温で溶解した。インキュベーション混合物には
、Ｘｕら（Ｐ、Ｎ、八、８．ＵＳＡ、７９ ： ４００
６ 。
ルデヒＶ架橋法によって合成した。β４２ｍ９とＫＬＨ
１８１ｎｙを０，１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，２）２
ｍｌに室温で溶解した。インキュベーション混合物には
、Ｘｕら（Ｐ、Ｎ、八、８．ＵＳＡ、７９ ： ４００
６ 。
１９８２）の方法に従って［３５Ｂ 〕メチオニンで生
合成的に標識しＨＰＬＣで精製したβ４５０．［１１０
０ｃｐも加えた。ついでグルタルアルデヒドをインキュ
ベーション管に加え、最終濃度を０．６容量％とした。
合成的に標識しＨＰＬＣで精製したβ４５０．［１１０
０ｃｐも加えた。ついでグルタルアルデヒドをインキュ
ベーション管に加え、最終濃度を０．６容量％とした。
抱合の割合はインキュベーション混合物の一部を取り、
β４に伴う放射能をセファデックス０１００カラムによ
り高分子生成物と分離してモニターした。異冨量のタン
パク沈殿を生成しないで有意なレベルの抱合（約２５％
）を達成するには、冨温６時間の条件で十分と思われた
。次にインキュベーション混合物を透析管に移し、４℃
で一夜、リン酸塩緩衝食塩液（ＰＢＳ ）０．５４に対
して２回透析した。透析生成物ｔついでフロイントの了
シュパンｌ−（Ｇｉｂｃｏ ）で乳化してそのまま免疫
処置に使用した。
β４に伴う放射能をセファデックス０１００カラムによ
り高分子生成物と分離してモニターした。異冨量のタン
パク沈殿を生成しないで有意なレベルの抱合（約２５％
）を達成するには、冨温６時間の条件で十分と思われた
。次にインキュベーション混合物を透析管に移し、４℃
で一夜、リン酸塩緩衝食塩液（ＰＢＳ ）０．５４に対
して２回透析した。透析生成物ｔついでフロイントの了
シュパンｌ−（Ｇｉｂｃｏ ）で乳化してそのまま免疫
処置に使用した。
免疫処置二フロイント完全アジュバントで乳化した抱合
体１ ｍｙを、雄性ニュージーランＶ白色つＶ′ギ（Ｈ
ａｒａ ）に多重（６０〜４０）皮肉注射して免疫処置
した。５週後、この動物に、フロインぜ不完余丁シュバ
ンドで乳化した抱合体り、８７ｎｙを同一経路でブース
ター投与した。抗体力価の減衰に応じて後者のプロトコ
ールに従い、サラニブ−スター投与が行われた。動物は
常法により耳静脈から採血された。
体１ ｍｙを、雄性ニュージーランＶ白色つＶ′ギ（Ｈ
ａｒａ ）に多重（６０〜４０）皮肉注射して免疫処置
した。５週後、この動物に、フロインぜ不完余丁シュバ
ンドで乳化した抱合体り、８７ｎｙを同一経路でブース
ター投与した。抗体力価の減衰に応じて後者のプロトコ
ールに従い、サラニブ−スター投与が行われた。動物は
常法により耳静脈から採血された。
放射性リガンドの調製：？イモシンβ４ （３００ｒｎ
ｙ）ヲ上述のＭａｒｇｏｌｉｓの方法に従い、ホルムア
ルデヒげと計２５ｍｃｉの〔３Ｈ〕水素化ホウ素ナトリ
ウム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−８ｅａｒｌｅ １６Ｃｉ ／
ｍ ｍｏｌ ）の存在下にリジン残基な還元アルキル
化してトリチウム化した。この放射性ペプチ「を以下の
方法によりＨＰＬＣで再精製した。すなわち、抗血清で
は選択的に沈殿できるが非免疫血清では沈殿を化じない
放射能を含むＨＰＬＣカラムからの両分を適宜プールし
、以下のＲＩＡにおける結合りがンドとして使用した。
ｙ）ヲ上述のＭａｒｇｏｌｉｓの方法に従い、ホルムア
ルデヒげと計２５ｍｃｉの〔３Ｈ〕水素化ホウ素ナトリ
ウム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−８ｅａｒｌｅ １６Ｃｉ ／
ｍ ｍｏｌ ）の存在下にリジン残基な還元アルキル
化してトリチウム化した。この放射性ペプチ「を以下の
方法によりＨＰＬＣで再精製した。すなわち、抗血清で
は選択的に沈殿できるが非免疫血清では沈殿を化じない
放射能を含むＨＰＬＣカラムからの両分を適宜プールし
、以下のＲＩＡにおける結合りがンドとして使用した。
選択的にプールされたりがンＶの放射能は約Ｏｊ Ｃｉ
／ ｍ ｍｏ：Ｌであった。この放射性生成物を以下
「トリチウム化β４」と呼ぶ。
／ ｍ ｍｏ：Ｌであった。この放射性生成物を以下
「トリチウム化β４」と呼ぶ。
放射免疫安置法： ＰＢＳ ２０μ形にトリチウム化β
４（７，５［１［１ｅｐｍ）をとり、氷上に置いたＥｐ
ｐｅｎ−ｄ○ｒｆミクロフユージ管ｊ（加えた。これに
サンプルまたは標章液を加え、ついで抗血清２０ ｕｅ
を加えた。ついで、氷冷ｔ、たＰＢＣ： Ｋより最終容
量を５００紹に調整した。４°Ｃで１８時間インキュベ
ーションを行ったのち、６管に飽和硫酸アンモニウム５
００μ−〇を加えて免疫複合体を沈殿させた。１時間後
に管を１５．６ ｎ ＯＸ Ｆで３０分間遠心分離し、
上澄液を吸引して除去ｌ−た。ペレットヲギＨ３０［１
ｍｌ中に２時間で可溶化したのち、シンチｌ／−ジョン
バイアルに定量的に移してカウントした。定量液中の標
準精製β４５〜３５０ｐｍｏｌｅの範囲でＲＩＡによる
定量が可能であった。
４（７，５［１［１ｅｐｍ）をとり、氷上に置いたＥｐ
ｐｅｎ−ｄ○ｒｆミクロフユージ管ｊ（加えた。これに
サンプルまたは標章液を加え、ついで抗血清２０ ｕｅ
を加えた。ついで、氷冷ｔ、たＰＢＣ： Ｋより最終容
量を５００紹に調整した。４°Ｃで１８時間インキュベ
ーションを行ったのち、６管に飽和硫酸アンモニウム５
００μ−〇を加えて免疫複合体を沈殿させた。１時間後
に管を１５．６ ｎ ＯＸ Ｆで３０分間遠心分離し、
上澄液を吸引して除去ｌ−た。ペレットヲギＨ３０［１
ｍｌ中に２時間で可溶化したのち、シンチｌ／−ジョン
バイアルに定量的に移してカウントした。定量液中の標
準精製β４５〜３５０ｐｍｏｌｅの範囲でＲＩＡによる
定量が可能であった。
ＲＩＡ用サンプルの調製：動物を二酸化炭素窒息により
層殺し、組織を取って直ちに凍結した。
層殺し、組織を取って直ちに凍結した。
定量に際ｌ、て、氷冷ＰＢＳ１００ｍ６に浸漬し、ポリ
トロンホモジナイ’ｄ’ −（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ）
で粉砕した。４°Ｃにおいて３０分間、３０．０００ｘ
ｐで遠心分離し、上澄液の一部について直接、免疫反応
性β４含量を定量した。一部の例については高速上澄液
の残部を、あらかじめＰＢＳで平衡化した２木連結の５
ｅｐ−Ｐｅｋ Ｃ−１８カートリツジ（Ｗａｔｅｒｓ
Ａｓ５ｏｃｉａ’ｔｅｓ ）を通過させた。カートリ弓
・ ツジなＰＢＳで洗浄後、β４を０．２Ｍピリジン−１，
０Ｍギ酸中３０％ゾロパ／ −ル（ｐＨ３，０） カラ
なる溶液でＨａｎｎａｐｐｅ：Ｌら（工５ｏｌａｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓｆｒｏｍ ｃａｌｆ ｔｈ
ｙｍｕｓ、 Ｂｉｏｃｈｉｍ＋Ｂｉｏｐｈｙｓ＋Ｒｅｓ
＋Ｃｏｍｍ、、１０４：２６６．１９８２）の記載に従
って溶出した。このサンプルを２つに分け、それぞれを
５ａｖａｎｔ ５ｐｅｅｄ Ｖａｃ ｄ縮型で乾燥した
。一方のサンプルについては免疫反応性β４含１−を定
量し、第二のサンプルはＩ’［ＰＬＣに付してβ４の合
計をアミノ酸分析によって測定した。ＲＩＡに用いた条
件下における放射性リガンドの完全性を評価するために
、粒組織抽出液と５ｅｐ−Ｐａｋ梢製′＃Ｊ質の両者を
、トリチウム化β４とともにインキュベートし、ついで
放射性物質をＨＰＬＣで分析した。
トロンホモジナイ’ｄ’ −（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ）
で粉砕した。４°Ｃにおいて３０分間、３０．０００ｘ
ｐで遠心分離し、上澄液の一部について直接、免疫反応
性β４含量を定量した。一部の例については高速上澄液
の残部を、あらかじめＰＢＳで平衡化した２木連結の５
ｅｐ−Ｐｅｋ Ｃ−１８カートリツジ（Ｗａｔｅｒｓ
Ａｓ５ｏｃｉａ’ｔｅｓ ）を通過させた。カートリ弓
・ ツジなＰＢＳで洗浄後、β４を０．２Ｍピリジン−１，
０Ｍギ酸中３０％ゾロパ／ −ル（ｐＨ３，０） カラ
なる溶液でＨａｎｎａｐｐｅ：Ｌら（工５ｏｌａｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓｆｒｏｍ ｃａｌｆ ｔｈ
ｙｍｕｓ、 Ｂｉｏｃｈｉｍ＋Ｂｉｏｐｈｙｓ＋Ｒｅｓ
＋Ｃｏｍｍ、、１０４：２６６．１９８２）の記載に従
って溶出した。このサンプルを２つに分け、それぞれを
５ａｖａｎｔ ５ｐｅｅｄ Ｖａｃ ｄ縮型で乾燥した
。一方のサンプルについては免疫反応性β４含１−を定
量し、第二のサンプルはＩ’［ＰＬＣに付してβ４の合
計をアミノ酸分析によって測定した。ＲＩＡに用いた条
件下における放射性リガンドの完全性を評価するために
、粒組織抽出液と５ｅｐ−Ｐａｋ梢製′＃Ｊ質の両者を
、トリチウム化β４とともにインキュベートし、ついで
放射性物質をＨＰＬＣで分析した。
ペプチドのＨＰＬＣ！分析：ホモジネートをＲ１，Ａの
ために調製したサンプルの場合と同様にして５ｅｐ−Ｐ
ａｋ Ｃ１８カートリツジを通してＨＰＬＣ用に調製し
た。ＨＰＬＣ分離はＡｌ：ｔｅｘ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅ
ｒｅ ＯＤ８５μ（０，４５Ｘ ２５ｃＩｒＬ）カラム
上で実施した。ペプチドを肌２Ｍぎりジン′：１Ｍギ酸
中１−プロア９ノールの直線勾配（０〜４０％プロパツ
ール、０．６ｍＡ’／分で２１０分）で溶出し、タンｄ
り分解酵素消化生成物の分離の場合はプロパツールの代
わりにアセトニトリルを用いた。ペゾチＶは５ｔｅｉｎ
＆Ｍｏｓｃｈｅｒａ（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎ
ｃｅ １ｉｑｕｌ ｃｈｒｏｍａｔｏ−ｇｒａｐｈ ａ
ｎｄ ｐｉｃｏｍｏｌｅ−１ｅｖｅｌ ｄｅｔｅｃｔｉ
ｏｎＯｆｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
、 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、。
ために調製したサンプルの場合と同様にして５ｅｐ−Ｐ
ａｋ Ｃ１８カートリツジを通してＨＰＬＣ用に調製し
た。ＨＰＬＣ分離はＡｌ：ｔｅｘ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅ
ｒｅ ＯＤ８５μ（０，４５Ｘ ２５ｃＩｒＬ）カラム
上で実施した。ペプチドを肌２Ｍぎりジン′：１Ｍギ酸
中１−プロア９ノールの直線勾配（０〜４０％プロパツ
ール、０．６ｍＡ’／分で２１０分）で溶出し、タンｄ
り分解酵素消化生成物の分離の場合はプロパツールの代
わりにアセトニトリルを用いた。ペゾチＶは５ｔｅｉｎ
＆Ｍｏｓｃｈｅｒａ（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎ
ｃｅ １ｉｑｕｌ ｃｈｒｏｍａｔｏ−ｇｒａｐｈ ａ
ｎｄ ｐｉｃｏｍｏｌｅ−１ｅｖｅｌ ｄｅｔｅｃｔｉ
ｏｎＯｆｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
、 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、。
７９ニア、１９８１）の記載に従し・、フロレスカミン
と反応させたのち、螢光によって検出した。
と反応させたのち、螢光によって検出した。
アミノ酸分析二アミノ酸分析はペプチドを５．７Ｍ −
ＨＣＪ！により１５０℃で１時間加水分解したサンプル
について、０−フタルアルデヒぜ螢光検出の使用に適合
させた改良Ｇｌｅｎｃｏ ＭＭアナライデーを用いて実
施した。
ＨＣＪ！により１５０℃で１時間加水分解したサンプル
について、０−フタルアルデヒぜ螢光検出の使用に適合
させた改良Ｇｌｅｎｃｏ ＭＭアナライデーを用いて実
施した。
タンパク質分解酵素消化：ナンプルを０．１ＭＮＨ，Ｉ
（Ｃｏ３．２餌ＥＤＴＡ中、ｐＨ７，８にお−１て、Ｓ
＋ａｕｒｅｕｓ■８プロテアーゼてより、２５℃で１５
時間消化した。ＴＰＣＫ−トリプシンによる消化は０．
４Ｍピリジン（ｐＨ，７，５）中、２５°Ｃで１５時間
実施した。
（Ｃｏ３．２餌ＥＤＴＡ中、ｐＨ７，８にお−１て、Ｓ
＋ａｕｒｅｕｓ■８プロテアーゼてより、２５℃で１５
時間消化した。ＴＰＣＫ−トリプシンによる消化は０．
４Ｍピリジン（ｐＨ，７，５）中、２５°Ｃで１５時間
実施した。
は前述のようにグルタルアルデヒド架橋法により合成し
た。この抗原で免疫処置した動物はすべて、この研究の
結合種として用いたトリチウムイビβ４リガンドに対し
抗体力価を生じた。Ｒ１と命名した１種の抗血清をその
高力価により選択し、すべての実験に使用した。
た。この抗原で免疫処置した動物はすべて、この研究の
結合種として用いたトリチウムイビβ４リガンドに対し
抗体力価を生じた。Ｒ１と命名した１種の抗血清をその
高力価により選択し、すべての実験に使用した。
抗血清の特性：Ｒ１抗血清のエピトーフ特異性の決定に
は２種の操作を用いた。第一（・まトリチウ”ム化β４
を８．ａｕｒｅｕｓ ’Ｖ ８からプロテアーゼで消化
して特性ペプチド（第１図参照）を生成させ、これをＨ
ＬＰＣで単離しく第２図）、アミノ酸分析で同定した。
は２種の操作を用いた。第一（・まトリチウ”ム化β４
を８．ａｕｒｅｕｓ ’Ｖ ８からプロテアーゼで消化
して特性ペプチド（第１図参照）を生成させ、これをＨ
ＬＰＣで単離しく第２図）、アミノ酸分析で同定した。
トリチウム化β４のこれらの断片を、免疫または前免疫
血清とインキュベートし、ついで抗原−抗体複合体を沈
殿させ、前述したと同様に放射性含量をカウントした。
血清とインキュベートし、ついで抗原−抗体複合体を沈
殿させ、前述したと同様に放射性含量をカウントした。
Ｒ１抗血清はＩ（ＰＬＯ像（第２図）の２領域からカウ
ントされる。これらの領域は、残基１１〜３２と、アミ
ノ酸１〜Ｂおよび１１〜２１の２種のβ４断片の混合物
からなるベデチＶ（第１図、第２図）に相当する。免疫
反応性の主ピークはクロマトグラムの異種領域に認めら
れたことおよび放射性（すなわち含リジン）断片の入が
この操作で検討されていることから、β４分子の抗原決
定基をさらに明確にするため、第二のアプローチを採用
した。完全なトリチウム化β４の結合を非放射性β、か
ら誘導されたペプチド断片の各種競合濃度での存在下に
定量的に測定した（第６図）。これらのペプチドの生成
に用いられた操作は前述したとおりで、そのすべての配
列を第１図に示した。アミノ末端ペプチド１〜８．１〜
１１および１〜１４はすべて同程度の、β４抗血清に対
する交叉反応水した（第６、図）。
ントされる。これらの領域は、残基１１〜３２と、アミ
ノ酸１〜Ｂおよび１１〜２１の２種のβ４断片の混合物
からなるベデチＶ（第１図、第２図）に相当する。免疫
反応性の主ピークはクロマトグラムの異種領域に認めら
れたことおよび放射性（すなわち含リジン）断片の入が
この操作で検討されていることから、β４分子の抗原決
定基をさらに明確にするため、第二のアプローチを採用
した。完全なトリチウム化β４の結合を非放射性β、か
ら誘導されたペプチド断片の各種競合濃度での存在下に
定量的に測定した（第６図）。これらのペプチドの生成
に用いられた操作は前述したとおりで、そのすべての配
列を第１図に示した。アミノ末端ペプチド１〜８．１〜
１１および１〜１４はすべて同程度の、β４抗血清に対
する交叉反応水した（第６、図）。
これらのＮ末端ペゾチＶはトリチウム化β４リガンげの
２５％置換を生じるのに約３５０ピコモルを要したのに
対し、標品β４では同程度の置換を与えるのにわずか１
５ぎコモルを要するにすぎなかつだ（第３図）。他の断
片、残基２２〜６２も有意な交叉反応性を示したが、リ
ガンＶの２５％置換には、このペプチド約６５０ピコモ
ルを弄した（第３図〕。残基２０〜３１からなるペプチ
ドはきわめて弱い交叉反応性を示したにすぎなかったし
、また他の５種の断片、９〜２１．２６〜６１．３２〜
６８．３６〜４３および３８〜４ろは定量ナンプル中１
．２ナノモルまでの限界では交叉反応性を示さなかった
（第６図）。
２５％置換を生じるのに約３５０ピコモルを要したのに
対し、標品β４では同程度の置換を与えるのにわずか１
５ぎコモルを要するにすぎなかつだ（第３図）。他の断
片、残基２２〜６２も有意な交叉反応性を示したが、リ
ガンＶの２５％置換には、このペプチド約６５０ピコモ
ルを弄した（第３図〕。残基２０〜３１からなるペプチ
ドはきわめて弱い交叉反応性を示したにすぎなかったし
、また他の５種の断片、９〜２１．２６〜６１．３２〜
６８．３６〜４３および３８〜４ろは定量ナンプル中１
．２ナノモルまでの限界では交叉反応性を示さなかった
（第６図）。
抗血清の特異性をさらに検討するため、Ｒ１抗血清への
トリチウム化β４の結合を置換する能力を各種ペプチド
について調べた。胸腺ホルモンα１を含めた、試験した
多くのベプチＶおよびタンパク質中、指示した濃度まで
でβ４抗血清と交叉反応性を示すものはなかった（第１
表）。
トリチウム化β４の結合を置換する能力を各種ペプチド
について調べた。胸腺ホルモンα１を含めた、試験した
多くのベプチＶおよびタンパク質中、指示した濃度まで
でβ４抗血清と交叉反応性を示すものはなかった（第１
表）。
第１表
各種ペプチド、タンパク質のβ４抗血清との交叉反応性
競合物質 交叉反応性（％）
ナイモシンβ４（ウシ）１００％（７５ｐｍｏｌｅ）酸
化ナイモンンβ４（ウシ）９６％（７５ｐｍｏｌｅ）ナ
イモシンα、（ウシ） ０％（２０ｎｍｏｌｅ）ウシ血
清アルブミン ０％（５６ｎｍｏｌｅ）インシュリン
０％（２０ｎｍｏｌｅ）トランスフェリン ０％（１０
ｎｍｏｌｅ）副腎皮質向性ホルモン ０％（１０ｎｍｏ
ｌｅ）胸腺刺激ホルモン ０％（２０ｎｍｏｌｅ）β４
分子内に含まれるメチオニンは過酸化水素で容易に酸化
できる。さらにβ、を合成する細胞に由来する抽出物は
正常な還元分子のほかに、β、のメチオニルスルホキシ
ド型分子を含有する。すなわち、Ｒ１抗血清が天然のβ
４と酸化型β４を識別しないことに留意すべきである（
第１表）。
化ナイモンンβ４（ウシ）９６％（７５ｐｍｏｌｅ）ナ
イモシンα、（ウシ） ０％（２０ｎｍｏｌｅ）ウシ血
清アルブミン ０％（５６ｎｍｏｌｅ）インシュリン
０％（２０ｎｍｏｌｅ）トランスフェリン ０％（１０
ｎｍｏｌｅ）副腎皮質向性ホルモン ０％（１０ｎｍｏ
ｌｅ）胸腺刺激ホルモン ０％（２０ｎｍｏｌｅ）β４
分子内に含まれるメチオニンは過酸化水素で容易に酸化
できる。さらにβ、を合成する細胞に由来する抽出物は
正常な還元分子のほかに、β、のメチオニルスルホキシ
ド型分子を含有する。すなわち、Ｒ１抗血清が天然のβ
４と酸化型β４を識別しないことに留意すべきである（
第１表）。
細胞抽出物からの［３５ｓ ］メチオニン標識β４の沈
殿：抗血清の特異性およびさらに重要なβ４の生合成を
研究するための道具としてのその利用性の両者を試験す
るため、抗体がマクロファージ抽出物から放射性標識β
４の有意な量を沈殿させるかどうかを調べる実験を行っ
た。第４図に示したように、抗血清β、の溶出部位に相
当するＨＰＬＣ領域から特異的に放射能を沈殿させろ。
殿：抗血清の特異性およびさらに重要なβ４の生合成を
研究するための道具としてのその利用性の両者を試験す
るため、抗体がマクロファージ抽出物から放射性標識β
４の有意な量を沈殿させるかどうかを調べる実験を行っ
た。第４図に示したように、抗血清β、の溶出部位に相
当するＨＰＬＣ領域から特異的に放射能を沈殿させろ。
この血清は同一条件下にクロマトグラムの他の領域では
特異的カウントを沈殿させない。他の実験では酸化型β
４の沈殿も認めている。さらに、ＨＰＬＣに先立っての
粗マクロファージ抽出物から生合成的に標識さｈたβ４
の沈殿も示されている。
特異的カウントを沈殿させない。他の実験では酸化型β
４の沈殿も認めている。さらに、ＨＰＬＣに先立っての
粗マクロファージ抽出物から生合成的に標識さｈたβ４
の沈殿も示されている。
例２
β４の放射免疫定量：β４の放射免疫定量なＨＰＬＣ精
製トリチウム化β４を結合リガンドとして使用して構成
した。定量条件およびトリチウム化β４の合成、精製に
ついては例１に詳述したとおりである。ｎ工Ａはナンゾ
ル中β４５〜１００ピコモルの範囲で直線性を示すこと
、また最小検出限界は約５ピコモルであることが明らか
にされた〔第５図〕。β４Ｂ工ＡのＢｏ ／ Ｂｘプロ
ットも参考に示す（第５Ａ図）。この検出範囲はラット
組織の１番の定量にきわめて適当で（下記参照）、リガ
ンＶのヨーＶ化は必要ないように思われた。これらの定
量条件下にはトリチウム化β４の分解はほとんど入られ
ず、また各種組織（脳、肺臓、胸腺および肺臓）による
トリチウム化リガンドの分解能には検知できるような定
量的差違は認められなかった。さらに対照として、脳の
粗抽出物の稀釈系列を作成し、そのβ４含量をＰ工Ａに
よって定量した（第５Ｂ図）。脳の免疫反応性β４含量
について得られた値は、標品β４の標準曲線によく合致
することが明らかである（第５Ｂ図）。これから、脳の
粗抽出物中に存在するβ４以外の物質で本定量を妨害す
るものはないことがわかる。さらに、全組織のサンプル
について６稀釈系列で免疫反応性β４を分析したところ
、膵臓と腸を除いて、各稀釈度で得られた結果は標準曲
線の傾斜と平行した。
製トリチウム化β４を結合リガンドとして使用して構成
した。定量条件およびトリチウム化β４の合成、精製に
ついては例１に詳述したとおりである。ｎ工Ａはナンゾ
ル中β４５〜１００ピコモルの範囲で直線性を示すこと
、また最小検出限界は約５ピコモルであることが明らか
にされた〔第５図〕。β４Ｂ工ＡのＢｏ ／ Ｂｘプロ
ットも参考に示す（第５Ａ図）。この検出範囲はラット
組織の１番の定量にきわめて適当で（下記参照）、リガ
ンＶのヨーＶ化は必要ないように思われた。これらの定
量条件下にはトリチウム化β４の分解はほとんど入られ
ず、また各種組織（脳、肺臓、胸腺および肺臓）による
トリチウム化リガンドの分解能には検知できるような定
量的差違は認められなかった。さらに対照として、脳の
粗抽出物の稀釈系列を作成し、そのβ４含量をＰ工Ａに
よって定量した（第５Ｂ図）。脳の免疫反応性β４含量
について得られた値は、標品β４の標準曲線によく合致
することが明らかである（第５Ｂ図）。これから、脳の
粗抽出物中に存在するβ４以外の物質で本定量を妨害す
るものはないことがわかる。さらに、全組織のサンプル
について６稀釈系列で免疫反応性β４を分析したところ
、膵臓と腸を除いて、各稀釈度で得られた結果は標準曲
線の傾斜と平行した。
この操作の有用性を証明するため、最後に、各サンプル
についてβ４含量を放射免疫定量法とＨＰＬＣで同時に
実施した（第２表）。この別個の２方法により得られた
値は、きわめてよく一致した（第２表）。
についてβ４含量を放射免疫定量法とＨＰＬＣで同時に
実施した（第２表）。この別個の２方法により得られた
値は、きわめてよく一致した（第２表）。
Ｂ工Ａをラット組織の粗抽出物に適用したところ、全ケ
ンプルで検知可能なレベルの免疫反応性！４が認められ
た（第６表）。これらの組織における標品β４の存在は
、また、ＨＰＬＣによって示されている（第２図）。
ンプルで検知可能なレベルの免疫反応性！４が認められ
た（第６表）。これらの組織における標品β４の存在は
、また、ＨＰＬＣによって示されている（第２図）。
第２表
各種組織サンプル中のβ４０ＨＰ Ｔ、Ｃ法およびＲＩ
Ａ法による定量値の比較 組 織 サンプル中！４含量（ｎ、ｍｏｌｅ）ＨＰＬＣ
Ｅ工Ａ 腎臓 ２．４８ ３．７１±０．２４ （４）肝臓 ３
．０５ ２．２９±０．１８（６）肺臓 １５．４４
１２．９６±２．６０（４）臭覚器上皮 １．８９ ２
．２７±０．２１（４）骨髄 １．２９ １．４１士肌
１ろ（４）皮膚 ３．４１ ３．６８±０．３７（４）
脳 ７．１０ ８．１０±１．２４（６）牌１１ｉ ３
３−６３ ３７．２７±４．２５（６）胸腺 ９．１２
８．２６±１．０７（６）第 ６ 表 ラット各種組織における免疫反応性β、レベルの比較 腎臓 ４４±６．７ （４） 腸 １４５±３７−６（６，）３Ｂ±８．９（４）＊肝
臓 ４１±４．６ （６） 肺臓 ２０３±２３．６ （６） 臭覚器上皮 １２６±２１．２（４） 骨髄 ５５±７．５ （４） 精巣 ４４±４．３ （６） 心臓 １９±３．１ （４） 皮膚 ２７士６．４ （４） 脳 ６４±６．４ （６） 筋肉 ８±１．２’ （４） 膵臓 １００±２４．３（６）７６±１０．１（４）＊
肺臓 ４４８±６７ （６） 胸腺 ２１４±３５ （６） 筋肉組織はとくにβ４が少ないように思われ、一方、肺
臓は常にこのペゾチＶが最も豊富な組織であった（第６
表）。他の大部分の組織のβ４含量はほぼ等しく、湿重
量１ｇあたり４０〜６０μｇのβ４が検出された。しか
しながら、肺臓、胸腺および臭覚型上皮でのβ４含量は
それぞれ１ｇあたり２０３．２１４および１２６μｓと
高い値を示した（第ろ表）。２種の臓器、腸および膵臓
では免疫反応性β４含量は高値を示したが、前に観察さ
れたＨＰＬＣによる結果と相関しなかった（第６表）。
Ａ法による定量値の比較 組 織 サンプル中！４含量（ｎ、ｍｏｌｅ）ＨＰＬＣ
Ｅ工Ａ 腎臓 ２．４８ ３．７１±０．２４ （４）肝臓 ３
．０５ ２．２９±０．１８（６）肺臓 １５．４４
１２．９６±２．６０（４）臭覚器上皮 １．８９ ２
．２７±０．２１（４）骨髄 １．２９ １．４１士肌
１ろ（４）皮膚 ３．４１ ３．６８±０．３７（４）
脳 ７．１０ ８．１０±１．２４（６）牌１１ｉ ３
３−６３ ３７．２７±４．２５（６）胸腺 ９．１２
８．２６±１．０７（６）第 ６ 表 ラット各種組織における免疫反応性β、レベルの比較 腎臓 ４４±６．７ （４） 腸 １４５±３７−６（６，）３Ｂ±８．９（４）＊肝
臓 ４１±４．６ （６） 肺臓 ２０３±２３．６ （６） 臭覚器上皮 １２６±２１．２（４） 骨髄 ５５±７．５ （４） 精巣 ４４±４．３ （６） 心臓 １９±３．１ （４） 皮膚 ２７士６．４ （４） 脳 ６４±６．４ （６） 筋肉 ８±１．２’ （４） 膵臓 １００±２４．３（６）７６±１０．１（４）＊
肺臓 ４４８±６７ （６） 胸腺 ２１４±３５ （６） 筋肉組織はとくにβ４が少ないように思われ、一方、肺
臓は常にこのペゾチＶが最も豊富な組織であった（第６
表）。他の大部分の組織のβ４含量はほぼ等しく、湿重
量１ｇあたり４０〜６０μｇのβ４が検出された。しか
しながら、肺臓、胸腺および臭覚型上皮でのβ４含量は
それぞれ１ｇあたり２０３．２１４および１２６μｓと
高い値を示した（第ろ表）。２種の臓器、腸および膵臓
では免疫反応性β４含量は高値を示したが、前に観察さ
れたＨＰＬＣによる結果と相関しなかった（第６表）。
しかしながら、５ｅｐ−Ｆ’ａｋで精製後の腸および膵
臓ＲＩＡ値は大部分の組織および臓器で認められた範囲
に低下していた（第６表）。したがって、腸および膵臓
にはトリチウム化β４に対するタンパク分解活性が存在
するものと考えられる。しかしながらこの点については
明確にされていな、し・。前述したように腸および膵臓
の抽出物の稀釈系列ではｆａｔ非直線性で、（ｂ）標準
曲線と有意に傾斜の異なる免疫反応性β４の曲線を生じ
ることは、なんらかの形の定量阻害があるものと考えら
れる。したにある種の精製が必要であろう。
臓ＲＩＡ値は大部分の組織および臓器で認められた範囲
に低下していた（第６表）。したがって、腸および膵臓
にはトリチウム化β４に対するタンパク分解活性が存在
するものと考えられる。しかしながらこの点については
明確にされていな、し・。前述したように腸および膵臓
の抽出物の稀釈系列ではｆａｔ非直線性で、（ｂ）標準
曲線と有意に傾斜の異なる免疫反応性β４の曲線を生じ
ることは、なんらかの形の定量阻害があるものと考えら
れる。したにある種の精製が必要であろう。
第１図はトリチウム化β４をＳ、 ａｕｒｅｕｓ Ｖ
８由来のプロテアーゼでダイジェストした後得られた・
特徴的なペプチドのアミノ酸分析を示す。 第２図は免疫血清でインキュベートした場合の放射性ペ
プチドのＣＰＭを示す。 第６図は非放射性β４由来の種々の競争的濃度のペプチ
ドフラグメントの存在におけるそこなわれていないトリ
チウム化β４とβ４抗血清との結合を示す。 第４図はマクロファージ抽出物からの放射性標識β４に
対する抗体の結合を示す。 第５図ばβ４に対する放射免疫分析が５〜Ｉ ＤＯｐＭ
ＯＬＥの範囲で直線であることを示す。なお、右上のグ
ラフはＡ放射免疫分析に対するＢＯ／Ｂχプロットを示
し、左下のグラフは標品β４に対する標準曲線と比べた
層粒抽出物の連続稀釈液中のβ４含量を示す。 手続補正書（方式） 昭和４２年を月−＞７日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和２否２年特許願第 １；？Ｆ（１−？ 号２、発明
の名称 ）１）そβつｂスし唱（〉ゾ）く／３ψ討つ免＊Ｌ＊＊
３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日イ」 昭和１２年２月９７日 ６、補正により増加する発明の数
８由来のプロテアーゼでダイジェストした後得られた・
特徴的なペプチドのアミノ酸分析を示す。 第２図は免疫血清でインキュベートした場合の放射性ペ
プチドのＣＰＭを示す。 第６図は非放射性β４由来の種々の競争的濃度のペプチ
ドフラグメントの存在におけるそこなわれていないトリ
チウム化β４とβ４抗血清との結合を示す。 第４図はマクロファージ抽出物からの放射性標識β４に
対する抗体の結合を示す。 第５図ばβ４に対する放射免疫分析が５〜Ｉ ＤＯｐＭ
ＯＬＥの範囲で直線であることを示す。なお、右上のグ
ラフはＡ放射免疫分析に対するＢＯ／Ｂχプロットを示
し、左下のグラフは標品β４に対する標準曲線と比べた
層粒抽出物の連続稀釈液中のβ４含量を示す。 手続補正書（方式） 昭和４２年を月−＞７日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和２否２年特許願第 １；？Ｆ（１−？ 号２、発明
の名称 ）１）そβつｂスし唱（〉ゾ）く／３ψ討つ免＊Ｌ＊＊
３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日イ」 昭和１２年２月９７日 ６、補正により増加する発明の数
Claims (3)
- （１）トリチウム化サイモシンβ４
- （２） サンプルを既知量のトリチウム化サイモシンβ
いおよびサイモシンβ４と選択的に複合体を形成する抗
体と混合し、生じた抗原−抗体複合体を未反応トリチウ
ム化サイモシンβ４から分離し、′４！ｉ会体中のトリ
チウム化サイモシンβ４の結合割合を測定し、その結合
割合を標準曲線と比較してサンプル中に存在するサイモ
シンβ４の量を決定することを特徴とするサンプル中の
サイモシンβ４の定量方法 - （３）抗体はアミノ酸１〜８およびアミノ酸２２〜ろ２
に相当するサイモシン／４分子上のエピトープを認識す
る特許請求の範囲第２項記載の方法（４）サンプルは少
なくともアミノ酸１〜８の配列を含有する１種または２
種以上のナイモシンβ４断片からなる特許請求の範囲第
２項記載の方法（５） サンプルは少なくともアミノ酸
２２〜ろ２の配列を含有する１種または２種以上のサイ
モシンβ４断片からなる特許請求の範囲第２項記載の方
法
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US48238383A | 1983-04-07 | 1983-04-07 | |
| US482383 | 1983-04-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6045598A true JPS6045598A (ja) | 1985-03-12 |
Family
ID=23915844
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59068948A Pending JPS6045598A (ja) | 1983-04-07 | 1984-04-06 | トリチウム化サイモシンβ４による免疫定量法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0121912A1 (ja) |
| JP (1) | JPS6045598A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4543340A (en) * | 1983-04-07 | 1985-09-24 | George Washington University | Radioimmunoassay of thymosin β4 |
| FR2601678B1 (fr) * | 1986-07-18 | 1989-11-24 | Inst Nat Sante Rech Med | Peptides comprenant la sequence seryl-aspartyl-lysyl-prolyle, procede pour l'extraction du tetrapeptide correspondant, et applications, notamment a la protection de la moelle osseuse au cours de traitements anticancereux par la chimiotherapie |
| EP0388974A3 (de) * | 1989-03-23 | 1992-01-08 | Henning Berlin Anlagen GmbH | Verfahren zur Früherkennung von Änderungen des Immunstatus des Menschen |
| US5831033A (en) * | 1997-02-14 | 1998-11-03 | Children's Medical Center Of Boston | Human thymosin β15 gene, protein and uses thereof |
| US5663071A (en) * | 1996-06-17 | 1997-09-02 | Children's Medical Center Corporation | Human thymosin β 15 gene, protein and uses thereof |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4264571A (en) * | 1979-01-22 | 1981-04-28 | George Washington University | Radioimmunoassay of thymosin α1 |
-
1984
- 1984-04-06 EP EP84103815A patent/EP0121912A1/de not_active Ceased
- 1984-04-06 JP JP59068948A patent/JPS6045598A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0121912A1 (de) | 1984-10-17 |
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