NO885269L - Proteinholdige sammensetninger. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører protein og proteinholdige sammensetninger som utviser anti-svulst og/eller anti-virale effekter.

Hvite blodceller innbefatter, blant andre komponenter T- og B-celler (lymfocytter). Av virusene som er kjent for å infisere T-celler er viruset som er av stor medisinsk betydning blant disse HIV-I, som er et retrovirus, som i den senere tid er blitt identifisert som det viruset som er ansvarlig for "Acquired Immune Deficiency Syndrome" eller AIDS. Det er blitt vist at HIV-I, som er innbefattet i AIDS, kan infisere T-cellene i blodet og til slutt ødelegge disse. Tg-suppressorcellene er ikke utsatt for slike infeksjoner.

Andre medisinsk viktige virale infeksjoner innbefatter infektuøs mononukleose forårsaket av Epstein-Barr virus (EBV), og influensa forårsaket av forskjellige influensa-virustyper.

AIDS-viruset er selvfølgelig et spesielt akutt medisinsk problem for tiden, på grunn av det ikke enda finnes noen generelt tilgjengelig effektiv motgift som leger. AIDS-viruset kan infisere T-cellene i blodet til en pasient og ligge hvilende deri i lengre tid. Når derimot en faktor utløser deres replikasjon, ødelegger de fort vertens T-celler, helt til de ikke lenger kan utføre deres immun-funksjon rettet mot kroppens inntrengere.

Forskere har i den senere tid Identifisert og isolert bakterielt-avledete proteiner nå referert til som bakteriociner. Disse proteinene blir produsert av en mengde forskjellige bakterier, både Gram-positive og Gram-negative, og blir oppkalt etter stammen som produserer disse. Bakteriociner reagerer med spesifikke bakterielle stammer som vanligvis er nært beslektet med stammen som produserer disse og forhindrer formeringen ved å drepe disse. Bakteriociner blir produsert ved vekst og deling av de bakterielle cellene i nærvær av en inducer som fremmer ekspresjonen og/eller utskillingen av en mengde proteiner og blant disse er bakteriocinproteinene.

En hensikt med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte for påvisning av viralt infiserte pattedyrceller .

En annen hensikt med denne oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte for påvisning av ondartede pattedyrceller.

En annen hensikt med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe stoffer og sammensetninger som kan bli anvendt i terapien av forskjellige viralt induserte infeksjoner og sykdommer.

En annen hensikt med denne oppfinnelsen er å tilveiebringe stoffer og sammensetninger som kan bli anvendt i terapi av ondartede vekster.

Foreliggende oppfinnelse er basert på observasjonen av at et protein eller proteinholdige sammensetninger tilveiebragt ved dyrking av bakterielle celler i nærvær av en bakteriocin-produserende eller stimulerende inducer, og ekstrahering og i det minste delvis rensing av den proteinholdige sammensetningen derfra, utviser anti-viral og/eller anti-svulst-aktivitet på pattedyrceller. Proteinet eller den proteinholdige sammensetningen kan inneholde bakteriociner. På grunn av sammensetningen som først blir preparert på denne måten inneholder bakteriociner og er aktiv anti-viralt og anti-tumorgenisk, kan den først bli renset for å fjerne vesentlig hele bakteriocinkomponenten og det resulterende proteinet eller den modifiserte proteinholdige sammensetningen utviser minst en slik aktivitet på pattedyrceller i vesentlig mengde.

Anvendt heri betyr betegnelsen "ondartet" "ha egenskapen av lokalt inntrengende og ødeleggende vekst og metastasis", dvs. som definert i Stedman's Medical Dictionary, 24th edition, Williams & Wilkins, Baltimore, London, 1982.

Dermed skal betegnelsen "viralt Infiserte pattedyrceller" slik det blir anvendt heri utelukke viralt infiserte tumorlgene eller ondartede celler; dvs. at de viralt infiserte pattedyrcellene som referert til heri har selvbegrensende vekst som er, umiddelbart, ikke karakteristisk for ondartede celler.

I henhold til foreliggende oppfinnelse er en eller flere proteiner eller proteinholdige sammensetninger tilveiebragt for anvendelse ved behandling av viralt infiserte pattedyrceller og/eller tumorlgene pattedyrceller.

Innenfor rammen av oppfinnelsen er det også tilveiebragt en fremgangsmåte for påvisning av veksten av viralt infiserte ikke-ondartede pattedyrceller og ondartede pattedyrceller som innbefatter reagering av disse cellene med proteinet eller den proteinholdige sammensetningen Ifølge foreliggende oppfinnelse for å selektivt oppdage de viralt infiserte eller ondartede cellene.

Det aktive ingredienset til de proteinholdige sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan være et enkeltprotein, eller et eller flere assosierte proteiner. Det er oppdaget at det aktive ingredienset(ene) i disse sammensetningene reagerer selektivt med de viralt infiserte cellene eller de ondartede cellene. Hensiktsmessige doser av proteinet eller de proteinholdige komposisjonene dreper selektivt de viralt infiserte cellene eller de ondartede cellene, etter som, mens de normale friske cellene ikke blir vesentlig påvirket.

De proteinholdige sammensetningene som er nyttige i oppfinnelsen kan Inneholde en bakteriocin-komponent. Sammensetningene, ifølge en fremgangsmåte ifølge denne prepareringen, blir dannet sammen med bakteriocinene. Slike bakterlocln- preparater er, i mange tilfeller, de samme som de som på en diskrimerende måte dreper eller inhiberer veksten av forskjellige kreftceller såsom fibrosarkomer, akutt lymfoblas-tisk leukemi (ALL), halskarsinoma, adenokarsinoma, squamos celle-karsinoma, kronisk myelogen leukemi, prolymfocytisk leukemi, mastocytoma og mange andre. Spesifikke eksempler på bakteriociner, som kan bli produsert sammen med det aktive ingrediens eller ingrediensene ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter pyociner, vibriociner, mycobakteriociner og kolleiner. Dets gjenværende nærvær ser ikke ut til å være skadelig. Proteinholdige sammensetninger som er vesentlig fri for bakteriociner utviser anti-svulst og/eller anti-viral aktivitet.

Viralt infiserte, ikke-ondartede pattedyrceller kan bli påvist ifølge denne oppfinnelsen ved behandling av disse cellene med proteinet eller de proteinholdige sammensetningene som beskrevet heri. Celler infisert med virus kan bli påvist ved celledød av slike celler behandlet med proteinet eller proteinholdige sammensetninger som beskrevet heri.

I tillegg kan ondartede pattedyrceller bli påvist i henhold til denne oppfinnelsen ved behandling av cellene med proteinet eller de proteinholdige sammensetningene som beskrevet heri. Spesielt kan ondartede celler bli påvist ved celledød av slike celler behandlet med proteinet eller de proteinholdige sammensetningene som beskrevet heri.

Det er antall fremgangsmåter som er kjent for fagmannen innenfor dette fagområdet, som på en effektiv måte kan bli anvendt for å påvise viralt infiserte, ikke-ondartede celler og ondartede celler behandlet med sammensetningene ifølge denne oppfinnelsen. Disse innbefatter, men er Ikke begrenset til bindingsanalyser (enzymbundet, fluorescerende eller radiobinding), og metabolske opptaksanalyser innbefatter opptaket av triturert tymidin og flow-cytometri.

De proteinholdige sammensetningene kan bli preparert ved hjelp av kjente standardteknikker for bakteriell dyrking ved anvendelse av en bakteriestamme som kan produsere bakteriocinet. Bakteriene blir dyrket i en fermentor til eksponensiell fase. Induksjon følger, ved anvendelse av et egnet kjemisk eller fysisk middel, som vil forårsake at de fleste cellene syntetiserer mange proteiner som var blitt under-trykket før Inducerbehandlingen. Disse cellene (90-99$ av disse), vil under egnede induksjonsbetingelser også synteti-sere bakterlocln. Et eksempel på en egnet inducer er mitomycin C, i en styrke på omtrent 0,5 mikrogram pr. milliliter. Andre inducere er kjent og mye anvendt innenfor fagområdet, og innbefatter anvendelse av UV-lys og egnede redoksbeting-elser. Cellene blir deretter inkubert. Når det gjelder noen kulturer blir proteinene utskilt inn i dyrkningsvekst-mediumet. I andre tilfeller frigjør ikke kulturene proteinene slik at celleveggen må bli ødelagt. Dette kan bli utført under trykk (137900 KPa for eksempel) ved anvendelse av en French trykkcelle. Den urene proteinholdige sammensetningen kan bli separert fra celle debriet ved sentrifugering og er dermed i supernatantvæsken.

Etter at supernatanten er utvunnet, blir standard biokjemiske separasjonsprosesser anvendt for å rense den proteinholdige sammensetningen. For eksempel blir et salt fortrinnsvis først anvendt såsom ammoniumsulfat i forskjellige konsentrasjoner. Gjenværende ammoniumsulfat blir deretter fjernet ved dialyse mot vann. Når den ønskede proteinholdige sammensetningen skal inneholde bakterlocln, kan det suspenderte presipitatet som inneholder den proteinholdige sammensetningen bli kromatogra-fert på en kolonne såsom Sephadex DEAE-A50, en svak kation-bytter, og dens forskjellige proteiner separert ved registrering av absorbansen ved 280 nm. Aktive fraksjoner kan bli bestemt fra de proteinene som her blir separert på denne måten, og selektert på basis av effektiviteten til aliquoter derav som dreper bakteriecellene, dvs. indikatorstammen, kjent for å være følsom overfor bakteriocinkomponenten til den proteinholdige sammensetningen. Aktive proteinfraksjoner blir deretter slått sammen. Ytterligere rensing kan bli utført ved høy utbytte vaeskekromatograf i (HPLC) basert på ladningen til proteinene. De forskjellige toppene som blir tilveiebragt ved registrering av absorbansen ved 280 nm kan bli separert og undersøkt påny for aktivitet overfor indikatorstammen. Den endelige renheten til den proteinholdige komposisjonen kan bli bestemt ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE).

Når det ønskede endelige proteinet eller den proteinholdige sammensetningen er vesentlig fri for bakteriocin, kan en størrelseeksklusjonskolonne såsom AcA54 bli anvendt isteden-for Sephadex DEAE-A50, etterfulgt av at den aktive fraksjonen, målt ved bakteriocinaktivitet, utsettes for ione-byttekromatografi på, for eksempel, en DEAE-TRISACRYL-M ionebyttekolonne. Dette separerer det aktive proteinet eller det proteinholdige materialet fra bakteriocinet. Deretter blir den aktive fraksjonen bestemt ved aktiviteten mot maligne pattedyrceller, f.eks. ved tritiert tymidinopptak-målinger. Deretter kan ytterligere rensing av det aktive proteinet eller det proteinholdige materialet bli tilveiebragt ved HPLC-SEC (størrelseeksklusjonskromatografi). Den aktive fraksjonen blir igjen bestemt ved aktiviteten mot ondartede pattedyrceller.

Seleksjon, isolasjon og rensing av den proteinholdige sammensetningen for anvendelse i foreliggende oppfinnelse er kjent innenfor fagområdet. Proteinproduksjon og screening-fremgangsmåter som er rutinemessige som beskrevet ovenfor, vil tilveiebringe en protein eller proteinholdig sammensetning som er aktiv overfor viralt infiserte pattedyrceller og/eller overfor tumorlgene pattedyrceller.

Den resulterende proteinholdige sammensetningen har vist seg å være aktiv overfor tumorlgene pattedyrceller. Den inneholder bare spor av gjenværende bakteriocinmengder, og viser minimal antibakteriell aktivitet. Den separerte bakteriocin-inneholdende fraksjonen viser derimot sterk antibakteriell aktivitet, som jo er ventet, men ikke noen signifikant anti-tumorigen aktivitet.

Den proteinholdige sammensetningen som er nyttig I foreliggende oppfinnelse, inneholdende ikke-separert bakteriocin, bør bli anvendt i relativt små mengder, for å være sikker på å unngå problemer når det gjelder toksisitet. I toksisitets-studier utført på mus, var den effektive gjentatte mikro-gramsdosen pr. dyr 100$ effektiv uten noen toksisk effekt på musen. Med en økning i konsentrasjonen av sammensetningen, fremkom toksisitet. Med mus av C3H/J-stammen var 80 til 100 mikrogram pr. mus dødelig. Med andre musespesies, såsom C3DX2F1/J-hybrider, ble en 10-ganger større motstand enn for C3H/J-mus tilveiebragt, og toksisitet ble oppnådd ved 1000 mikrogram pr. mus.

Egnede doseringer av proteinet eller den proteinholdige sammensetningen for administrering til pattedyr er i området på fra omtrent 0,1 mikrogram til 500 mikrogram pr. kilogram kroppsvekt, fortrinnsvis fra omtrent 5 til omtrent 100 mikrogram pr. kilogram kroppsvekt, av pattedyrpasienten. Gjentatte doser av størrelsen kan bli administrert. Det er foretrukket at sammensetningen ble satt til en gitt lymfo-cyttpopulasjon for å oppnå et forhold på IO-<5>ng til 10 ng proteinholdig sammensetning pr. målcelle, mest foretrukket er IO-<4>ng til 1 ng pr. målcelle. Doseringsstørrelsen for å drepe viralt infiserte celler er betraktelig mindre enn dosen som er nødvendig for å behandle kreftceller.

Den proteinholdige sammensetningen ifølge oppfinnelsen som ikke inneholdt noe signifikant gjenværende bakteriocin utviste ikke toksisitet under den terapeutiske doseringen, dvs. 10 mikrogram pr. mus.

Doseringer og konsentrasjonen for dreping av ondartede celler med den vesentlig bakteriofrie sammensetningen er essensielt lik doseringene og konsentrasjonene til den proteinholdige sammensetningen som inneholder ikke-separert bakteriocin som beskrevet ovenfor, både for in vivo og in vitro testing.

Fremgangsmåten for administrering av proteinene og de proteinholdige sammensetningene ifølge oppfinnelsen vil innvirke doseringsformen av sammensetningen. På grunn av sammensetningene innbefatter proteiner og kan bli fordøyd av maveenzymene, og også på grunn av at sammensetningene fortrinnsvis blir anvendt til angriping av lymfocytter, blir sammensetningene fortrinnsvis preparert som oppløsninger for administrasjon ved injeksjon. Dermed blir foretrukne bærere bufret i saltholdig i vandig media. Slike oppløsninger blir formulert i henhold til standard praksis innenfor fagområdet. Andre fremgangsmåter for administrering som er egnede for å forsikre at det aktive materialet når målsetet i dets aktive tilstand kan også bli anvendt, og vil bli bestemt innenfor fagområdet. Eksempler på slike administreringsformer innbefatter, men er ikke begrenset til, kontrollerte eller langvarig frigjøringssammensetninger.

Oppfinnelsen blir illustrert i følgende spesifikke eksempler:

Eksempel 1 - Preparering av proteinholdlg sammensetning

Til tohundre liter hjerne hjerte-infusjonsmedlum (BHI) (DIfco Labs, Detroit, Mich.) ble et inokulum av den bakterielle produserstammen E. coli HSC-10 som var dyrket over natt tilsatt. Kulturen ble dyrket ved 37" helt til den bakterielle veksten oppnådd eksponensiell fase. En inducer, dvs. Mitomycin C i en mengde på 0,5 mikrogram pr. ml ble deretter satt til kulturen og dyrkingen ble fortsatt 1 4-5 timer til.

Det resulterende mediet ble spunnet på en Sharples sentri-fuge, 1 90 minutter, for å dannet et supernatantmedium som ble kastet, og en pellet av fast og seml-fast stoff. Pelleten hadde en våtmasse på 505g. Det cellulære stoffet innenfor pelleten ble deretter ødelagt ved anvendelse av en French trykkcelle og det resulterende stoffet ble suspendert i 1$ av dets opprinnelige volum Tris (0,05 M, pH 7,8). Den resulterende suspensjonen ble spunnet, og debri-pelleten ble kastet. Supernatantstoffet som ble tilveiebragt på denne måten, inneholdende lysatet som inneholdt den rå proteinholdige sammensetningen, ble opparbeidet og renset som beskrevet nedenfor i eksempel 2.

Eksempel 2 - Rensing av protelnholdig sammensetning Supernatanten inneholdende den rå proteinholdige sammensetningen tilveiebragt i eksempel 1 (dvs. det rå lysatet, sammensetning 1) ble befridd for proteiner bortsett fra de bakteriocidisk aktive komponentene ved ammoniumsulfatpresipi-tering ved forskjellige konsentrasjoner. Bakteriocin var tilstede i de proteinholdige sammensetningene som ble tilveiebragt, oppdaget ifølge den bakteriedrepende aktiviteten derav.

Proteinet som ble utsaltet ved en konsentrasjon på 35-50$ ammoniumsulfat ble holdt tilbake, og supernatanten kastet. Materialet i presipitatet ble resuspendert, dlalysert mot vann og spunnet ved 46.000xg, for å tilveiebringe protelnholdig sammensetning 2. Den resulterende supernatanten ble lagret ved -20°C før påfølgende rensing.

Etter tining ble den frosne supernatanten utsatt for kromato-grafi ved anvendelse av Sephadex - DEAE A-50 og samlet i separate fraksjoner ved anvendelse av en gradient på 0,0-1,0 M NaCl i 0.01M Tris, pH 8,2 som eluer ingsmiddel og registrering av absorbans ved 280 nm.

Fraksjoner av interesse ble deretter slått sammen for å tilveiebringe protelnholdig sammensetning 3, heri etter betegnet HSC-10, og testet for bakteriedrepende aktivitet overfor indikatorstamme E. coli Y10 ved anvendelse av turbiditetstesten. Indikatorstammen ble spesifikt dyrket over natt i hjernehjerte-infusjonsmedium ved 370 C og anvendt som inokulum for å tilveiebringe eksponsiell vekst til et spesifikt celleantall. Disse bakteriene ble blandet med to-ganger fortynninger av den delvis rensede proteinholdige sammensetningen som beskrevet ovenfor og hemming av veksten til indikatorstammen ble registrert spektrofotometrisk. Vekstresponskurver ble dannet ved hjelp av disse turbiditets-målingene og fra disse ble de letale enheter/ml til de forskjellige sammensetningene beregnet i lys av den kjente konsentrasjonen til den protelninneholdende sammensetningen satt til det kjente antallet celler av indikatorstammen i mediet. LU50, letale enheter pr. ml av de forskjellige sammensetningene som er nødvendig for å drepe 50$ av indi-kator stammepopulasj onen, er vist i og diskutert med referanse til tabell 1 nedenfor.

Ytterligere rensing av de sammenslåtte fraksjonene ble utført ved anvendelse av høy utbytte væskekromatografi (HPLC) og de fraksjonene som utviste en absorbanstopp ved 280 nm, ble samlet, Indikerende proteinholdige egenskaper ble slått sammen for å tilveiebringe protelnholdig sammensetning 4, og aliquoter derav utsatt for den samme turbiditetstesten som beskrevet ovenfor.

Mengden av bakteriedrepende aktivt protelnholdig materiale utvunnet ved hvert trinn i fremgangsmåten beskrevet ovenfor og den bakteriedrepende aktiviteten til de mengdene er ført opp i tabell 1 nedenfor:

Man merker seg at mengden av aktivt protein avledet fra kulturlysatet er bare omtrent 0,10$ av den opprinnelige vekten til lysatet, som tyder på at store volumer av bakterier blir dyrket for å danne de nødvendige mengdene av den proteinholdige sammensetningen. Fremgangsmåten for rensingen som er foretrukket heri var tilstrekkelig for å etablere en rensningsfaktor, basert på den bakteriedrepende aktiviteten til et protein som er en komponent av den proteinholdige sammensetningen, på 930 hvorpå bare 0,63 jjg av den proteinholdige sammensetningen er nødvendig for å hemme veksten av 50$ av indikatorstammepopulasjonen. Fraksjonen som blir isolert for ytterligere studier i eksemplene 4, 5 og 6, og referert til nedenfor som HSC-10 er testmateriale 3 fra tabell I.

Eksempel 3 - Preparering av protelnholdig materiale vesentlig fri for bakteriocin

Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Coomassi Brilliant blå G250 farvebindingsanalysen til Bradford (Bio-Rad). Vann som blir anvendt i alle oppløsningene var destillert og sendt igjennom et Nanopure system (Millipore) og hadde en konduk-tivitetsverdi på 18,3 ohms/cm.

En del av 35-50$ ammoniumsulfatfraksjonen til E. coil HSC10 råcellulaere lysater (fraksjon 2 i tabell 1, eksempel 2) i 20 mM TRIS-HCL pH 7,4 ble tint og med en gang behandlet med 100 mM fenylmetansulfonylfluorid (PMSF) (Sigma) i 95$ etanol (Pharmaco), for å inhibere proteaseaktiviteten, slik at den endelige konsentrasjonen av PMSF i oppløsningen var 1 mM.

PMSF-behandlede proteiner (1 til 1,5 g/30 til 35 mL) ble applisert på en 95 x 2,6 cm kromatograf ikolonne med lavt trykk (LKB-Pharmacia) pakket med 450 mL AcA54 (IBF produkter) og ekvilibrert med 50 mM TRIS-HC1 pH 7,4 (LKB Ultrograde). Proteinene ble eluert isokratisk med ekvilibreringsbuffer ved en strømningshastighet på 40 mL/t (ISCO Tris Pump). Eluatet ble registrert ved 280 nm (0 til 2 AUFS) (ISCO UA-5) Absorbans/fluorescens-detektor) og 6 mL fraksjoner ble samlet (ISCO Retriever II Fraksjonskollektor).

De aktive fraksjonene ble Identifisert ved analysering for den antibakterielle virkningen av Bacteriocin HSC10 som koelueres fra AcA54-kolonnen med det cytotoksiske proteinet av interesse. De fraksjonene som viser inhibering av E. coil Y10 vekst ved 1/1000 eller større fortynninger ble slått sammen og dlalysert 1 Spectra/Por3 poser (Spectrum Medical Industries) i 24 timer mot 4 L vann. Det dialyserte materialet ble frysetørret og pelleten resuspendert i vann.

Det resuspenderte proteinet ble applisert på en 25 x 2,5 cm kolonne med lavt trykk (Altex) pakket med 100 mL DEAE-TRISACRYL-M (IBF-produkter) ekvilibrert med 20 mM TRIS-HC1 pH 8,0 (LKB Ultrograde). Rett etter appliseringen ble strøm-ningen stansen i 15 minutter for at proteinet skulle bli bundet til pakkematerialet. Kolonnen ble deretter utviklet 1 time isokratisk med ekvilibreringsbuffer etterfulgt av en lineær gradient med 0 til 0,35 M natriumklorid (Aldrich 99+$) i ekvilibreringsbuffer ved en strømningshastighet på 40 mL/t (ISCO Tris Pump). Elueringen ble registrert ved 280 nm (0 til 0,5 AUFS) (ISCO UA-5 Absorbans/fluorescens detektor) og 6 mL fraksjon ble samlet (ISCO Retriever II Fraksjonskollektor). Natriumkloridkonsentrasjonen til gradienten ble registrert med et YSI Modell 32 konduktansmeter og en Beckman industri-ell strømningscelle kalibrert med en serie på 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,6 og 0,8M natriumklorid/20 mM TRIS-HC1 pH = 8,0 standarder (LKB-Ultrograde).

Bakteriocin HSClO-inneholdende fraksjoner ble Identifisert ved bakteriell flekktestlng. De fraksjonene som viste E. coil Y10 vekstinhibering ved 1/1000 eller større fortynninger ble slått sammen, dlalysert mot 2 L 50 mM ammoniumbikarbonat (Fisher Cert.) og lagret, frysetørret ved —20°C.

Aktive fraksjoner med 1 ng protein pr. celle ble analysert for anti-tumorigenisk aktivitet ved interaksjon med HL-60 humane myelogene celler (ATCC) med inkubasjon i 24 timer ved 37°C, 5$ C02(Matheson) i RPMI 1640 (GIBCO) med 10$ FCS (GIBCO) ved 1 ng/celle.<3>H-tymidin ble deretter tilsatt i 4 timer mens inkuberingen ble fortsatt som ovenfor. Fraksjoner som inhiberte over 75$ ble slått sammen og dlalysert mot 4 L 50 mM ammoniumbikarbonat i 24 timer (Fisher Cert.). Prøvene ble frysetørret og tatt opp i fosfatbufret saltvann (PBS) ved pH 6,9, 0,2 g kallumklorld (Aldrich 99-$), 0,2 g monobaslsk kallumfosfat (Aldrich 99+$), 2,16 g dibasisk natriumfofsfat (Aldrich 99+$), 8 g natriumklorid (Aldrich 99+$)/Litre Nanopure vann pH med konsentrert HC1 (Fischer ACS reagens).

De samme sammenslåtte aktive fraksjonene ble også utsatt for antibakteriell aktivitetstesting, for å kvantifisere gjenvær ende bakteriocin. Det ble funnet at en konsentrasjon på 21,4 mikrogram pr. ml av denne fraksjonen var nødvendig for å inhibere 50$ bakteriell vekst, sammenlignet med en konsentrasjon på 0,12 mikrogram pr. ml av materialet før DEAE-TRISACRYL-M kolonnebehandling.

De resuspenderte proteinene (20 til 40 mg) ble injisert i en 60 x 2,15 cm TSK G3000SW EPLC størrelseeksklusjonskolonne (Phenomenex) ekvilibrert med PBS, pH 6,9. (HPLC system refrigerated Water Wisp Auto-injektor, LKB 2152 HPLC kontrol-lerer, 2 LKB 2150 HPLC titanpumper, LKB 2210 2-kanalregistre-rer, LKB 2151 variabel bølgelengdedetektor og LKB 2211 suprac fraksjonssamler. Dette systemet separerer proteiner ved molekylvekt. Proteiner med molekylvekter i det omtrentelige området 3.000-150.000 ble eluert isokratisk med ekvili-breringsbufferen ved en strømningshastighet på 3,5 mL/min (25 bar trykk) og ble registrert ved 280 nm (0-0,16 AUFS) mens 7 mL fraksjoner ble oppsamlet.

Aktive fraksjoner ble identifisert ved<3>H-tymidinanalyse, slått sammen, dlalysert mot 2 L 50 mM ammoniumbikarbonat (Fisher Cert) i 24 timer og frysetørret.

Før anvendelse ble kolonnen kalibrert, ved anvendelse av standardproteiner med kjent molekylvekt (Aldridge). Den proteinholdige sammensetningen som ble eluert ut av kolonnen hadde en molekylvekt på omtrent 70.000 i henhold til standard kalibreringseksperimentet. Denne sammensetningen viste seg å ha høy anti-tumorigenisk aktivitet. Mere spesifikt utviste denne sammensetningen en IC50(konsentrasjon som inhiberer 50$ av tumorigenisk cellevekst) på 0,3 nanogram pr. celle. Denne aktivitetstesten ble utført som beskrevet ovenfor, ved å bestemme hvor mye tritiert tymidin de tumorigeniske humane lymfocyttcellene hadde tatt opp.

Eksempel 4 - Selektiviteten til Colicin HSC- 10 når det gjelder identifisering av viralt infiserte leukocytter in vi tro

Lymfocytter tilveiebragt fra 14 forskjellige AIDS-pasienter ble anriket på Ficoll-Paque (Pharmacia Fine Chemicals, Dorval, Quebec), tellet og fordelt 1 eksperimentelle grupper og kontrollgrupper. Colicin HSC10, ekstrahert og renset som beskrevet ovenfor, ble fortynnet i trisbuffer ved pH 7,4 og satt til den eksperimentelle lymfocyttpopulasjonen, og fremkom til et forhold på IO-<5>til 10~<2>ng HSC-10 pr. målcelle. Kontrollpopulasjonen mottok bare trisbuffer-fortynningsmiddelet.

De to cellepopulasjonene ble fordelt i mikrobrønner og dyrket over natt i nærvær av<3>H-tymidin ved 37"C i nærvær av 5$ COg fuktet luft. Deretter ble cellene høstet, -tymidin i overskudd ble vasket bort og sendt gjennom en scintillasjons-teller for å beregnet opptaket av radioaktivitet som reflek-terer cellemetabolisme og vekst. Effekten av HSC-10 ble beregnet ved $ reduksjon av disintegrasjoner pr. minutt (dpm) i den HSC-10 behandlete gruppen sammenlignet med kontrollgruppene .

I et parallelt eksperiment ble HSC-10 satt til lymfocytter tilveiebragt fra 9 friske individer og sammenlignet via<3>H-tymidinopptakstesten, mens friske kontroll-lymfocytter bare utsatt for tris-buffer som var anvendt som et fortynnings-middefor HSC-10.

En tredje gruppe bestående av tre pasienter i høyrisiko AIDS-gruppen (f.eks. hemofili) ble testet, selv om tilstedeværelse av AIDS 1 disse pasientene ikke var blitt bekreftet. Disse pasientene ble bekreftet å være friske ved testing et og halvt år senere.

<3>H-tymidinopptaket i hver av de tre gruppene ble målt som en prosent av kontrollgruppen, som i hvert tilfelle var pasi-

enter eller normale personer i de respektive gruppen uten HSC-10-behandling.

I de anvendte konsentrasjonene utviste HSC-10 de effektene på det antallet HIV-I infiserte (AIDS) lymfocytter fra AIDS-pasienter eller normale, og på lymfocyttene fra AIDS-antatte og friske, normale Individer som vist i tabell II nedenfor:

<*>Som beskrevet ovenfor var fire tester fra prøve fra individer i "normal"-gruppen kjent for ikke å ha AIDS-viruset, følsomme overfor HSC-10 i -tymidin inhiberingstesten, som indikerer en viral infeksjon. Alle disse "falske-posltive" Individer ble senere bekreftet å ha andre virale infeksjoner ved<3>H-tymidinopptak og to individer ved 2-5 A syntetase-testen. Den sistnevnte testen beskrevet i Journal of Infect-lous Diseases, Read, S.E., et al Sept./85, er veldig kjent og akseptert innenfor fagområdet for tidlig diagnostikk av virale infeksjoner. I den sistnevnte studien, i henhold til en forbigående viral infeksjon, viste en av "falske-positive" pasientene stimulering, i motsetning til lnhlbering av<3>H-tymldin.

Ut i fra de femten testene utført på AIDS-pasienter, viste 53$ en lnhlbering av tymidinopptak, mens 13$ viste grenseinhibering. Derimot ut i fra de fjorten testene utført på normale individer, viste 57$ en effektiv stimulering av tymidinopptak, mens 14$ viste grenseinhibering, og bare 29$

(4 ut av 14) viste lnhlbering.

Ingen av de tre mistenkte AIDS-paslentene viste følsomhet overfor HSC-10. Ved denne testingen bekreftet tester og observasjoner at ingen av disse pasientene bar AIDS-viruset.

En fantastisk effekt kan bli observert fra resultatene presentert i Tabell II. Antallet AIDS-lymfocytter som utviser opptak av radioaktivitet er betraktelig redusert når HSC-10 er introdusert. For det andre, vekst av normale lymfocytter utsatt for de samme konsentrasjonene av HSC-10 ser Ikke ut til å være svekket (71$). Mere interessant er det at 57$ av de normale lymfocyttene som ble utsatt for HSC-10 utviste en økning i radioaktivitetstelling sammenlignet med de ubehand-lede. Dette er et tegn på stimulering av veksten av normale lymfocytter, en respons som antageligvis vil tillate at et vesentlig antall pasienter behandlet med HSC-10 får større immunitet overfor andre infeksjoner som angriper AIDS-pasienter.

For å identifisere målet for HSC-10-angripning på AIDS-infiserte lymfocytter mere spesifikt, ble monoklonale antistoffer anvendt. Det er kjent at forholdet mellom undergruppehjelper-induserer (T4) celler og undergruppe-suppressor (Tg) celler som interferer med immunresponsen til AIDS-pasienter, dvs. T4/Tg-forholdet, er redusert i AIDS-pasienter - se Evatt et al., New England Journal of Medicine, 1985 Vol. 313, side 483. Undergruppehjelper-induserer-celler (T4) som aktiverer immunresponsene og som derfor er livsnød-vendige komponenter for kroppens forsvar, blir infisert med EIV-I virus og deres funksjon er svekket eller ikke-eksisterende. Eksperimenter blir derfor utført hvori spesifikke monoklonale antistoffer overfor T-celler (New England Nuclear, Catalogue no. NEN-038) og til Tg-celler (New England Nuclear, Catalogue no. NEI-039) ble anvendt for å beregne tilstedeværelse og antallet av T4og Tg-lymfocytter etter HSC-10-behandling av lymfocytter avledet fra en AIDS-pasient.

Det ble oppdaget at antallet undergruppe Tg-suppressor-lymfocytter forble uforandret etter HSC-10-behandling mens antallet av de infiserte T4-cellene ble betraktelig redusert. Spesifikt ble testen utført ved anvendelse av spesifikke monoklonale antistoffer til T4og Tg-celler, beskrevet ovenfor, fremstilt ved en fremgangsmåte med navn Hybridoma-teknikk. Denne teknikken blir mye anvendt innenfor fagområdet .

Monoklonale antistoffer til T4eller Tg, fremstilt på denne måten, blir merket med en fluorescensforbindelse (f.eks. fluorescein isotiocyanat) som kan bli påvist på grunn av fluorescensen av farven under ultrafiolett lys.

T4og Tg-celler blir deretter assosiert med deres respektive fluorescens-antistoffer og telt under ultrafiolett lys.

Hver av AIDS-pasientene som ble testet viste tilstedeværelse av HSC-10, en reduksjon på mellom 14-21$ 1 T^lymfocytter. Deres Tg-lymfocytter var enten Ikke påvirket i det hele tatt eller nominelt stimulert eller inhibert.

Dermed, ifølge den spesifikke utformingen beskrevet heri, er blitt vist at den proteinholdige sammensetningen, HSC-10, er effektiv når det gjelder redusering av antallet viralt infiserte T-lymfocytter. Mere spesifikt er anvendbarheten av denne sammensetningen etablert når det gjelder redusering av antallet T-celler uten noen korresponderende skade heller stimulering av normale T-celler.

Eksempel 5

Effekten av HSC-10 på AIDS-pasientenes lymfocytter og likeledes lymfocytter infisert med andre virus såsom hals-betennelse-lnfluenase og infeksiøs mononukleose kan bli bestemt ved flow-cytometri ved anvendelse av teknikker som ligner de som er beskrevet i IRCS Medical Science, 11, 236-237 (1983).

Generelt innbefatter fremgangsmåten analyse av DNA-innholdet i hver celle i en gitt prøve, for å bekrefte prosenten av eksisterende celler, ved et gitt tidspunkt, i en spesifikk fase av cellesyklusen. På grunn av HSC-10 kan påvirke følsomme celler ved degradering av DNA som resulterer i nukleotidmangel, kan et økende antall av behandlede celler med lite DNA bli detektert ved flow-cytometri. Celler følsomme overfor HSC-10 og behandlet dermed vil vanligvis akkumulere innenfor "pre-G^"-kanalene når resultatene er plottet på et histogram som tilkjennegir reduserende DNA-innhold, på grunn av DNAet til disse cellene er degradert.

Lymfocytter tilveiebragt fra pasienter tidligere diagnosti-sert med infeksiøs mononukleose, (ved infeksjon med Epstein-Barr-virus) ble isolert ved Ficoll-Paque (Pharmacia Fine Chemicals, Montreal) og farvet med propidiumjodid. HSC-10, ekstrahert og renset som i eksempel 1, ble satt til en prøve av de isolerte lymfocyttene. Cellefluorescens ble deretter målt 1 løpet av vekstsyklusen i et flow-cytometer (FCM). Lymfocytter som skulle bli testet, hvor det ikke var tilsatt HSC-10, ble anvendt for kalibrere Gg/G^-fasecellene i forhold til standarden. Det totale celleantallet testet ble tilveiebragt fra numeriske datautskrifter. Prosent av det totale ble beregnet for cellene tilstede i "pre-G^" og Gø/G^-fasene ved integrering av cellene under toppen. De endelige resultatene ble uttrykt etter subtraksjon eller addisjon av prosentfor-andringen som oppsto i celleantallet til kontrollene, dvs. de viralt infiserte cellene som ikke var blitt utsatt for HSC-10.

Resultatene er presentert i tabell III.

Ni tester ble utført på syv Individer. Fem ut av syv pasienter utviste en akkumulering av celler 1 "pre-G^"-fasen, som dermed viste følsomheten til cellene overfor HSC-10 (refererer til kolonne 3). Fire ut av de syv testede pasientene viste på deres histogrammer en reduksjon i celler fra Gq/ G±-fasen (refererer til kolonne 5). Som en oppsummering, i 78$ av testene, utviste pasientprøvene følsomhet overfor HSC-10.

Eksempel 6

Fire pasienter kategorisert som normale 1 den første seksjon 1 eksempel 4 og som så ut til å ha omgangssyke ut i fra de kliniske symptomene, viste seg å ha en forbigående positiv med HSC-10. Disse pasientene ble deretter testet positive for tilstedeværelse av 2-5A syntetase, nærværet av dette indikerer en viral infeksjon (J. Infectious Diseases, Read, S.E., et al, Sept./85). Etter en tilstrekkelig lang periode for å bli helbredet fra omgangssykesymptomene, ble disse pasientene på ny testet for HSC-10-følsomhet og de viste seg å være negative. En tentativ konklusjon som kan bli trukket fra disse resultatene er at minst noen virale infeksjoner blir påvirket av HSC-10.

Eksempel 7 - In vivo testing av den vesentlige bakteriocinfrie proteinholdige sammensetningen

Effekten av den vesentlig bakteriocinfrie proteinholdige sammensetningen, som fremstilt i eksempel 3, på svulstceller i mus ble undersøkt. Femten 20-25 gram mus (C3H/J) ble hver injisert intravenøst med IO<4>metastaserende celler. En eksperimentell gruppe på 5 mus ble deretter injisert intra-peritonealt med 10 pg av den proteinholdige sammensetningen vesentlig fri for bakteriocin ifølge foreliggende oppfinnelse. En annen eksperimentell gruppe på 5 mus ble Injisert med 10 >jg HSC-10. Kontrollgruppen på 5 mus fikk bare buffer. Cellene ble dyrket i tre uker hvorpå musene ble drept. Lungene fra alle 15 mus ble fjernet og foki ble telt. Hvert fokus representerer veksten av en kreftcelle. Prosentfor-skjellen i antallet foki mellom kontrollgruppen og behand-lingsgruppen er prosent lnhlbering av svulstcellene med HSC-10 eller med den proteinholdige sammensetningen vesentlig fri for bakteriocin. Det var en større enn 90$ reduksjon av foki i begge eksperimentelle gruppene sammenlignet med kontrollen.

Eksempel 8 - In vitro testing av den vesentlig bakteriocln-frie proteinholdige sammensetningen

Kreftceller fra den myelogene cellelinjen HL-60 ble dyrket i RPMI-1640 (Difco) medium og supplementert med 10$ føtalt kalveserum (Difco) og 5$ CO2ved 37°C. Cellene ble deretter vasket og suspendert 1 friskt medium, telt og fordelt i eksperimentelle grupper og kontrollgrupper. Hver gruppe eller populasjon innbefattet omtrent 4 x IO<5>celler. Den proteinholdige sammensetningen, fremstilt som beskrevet i eksempel 3 ovenfor, ble fortynnet 1 Trls-buffer ved pH 7,4 og satt til den eksperimentelle cellepopulasjonen for å fremkomme ved et forhold på 2, 1,5, 0,5 og 0,25 ng protein pr. celle. Kontrollpopulasjonen fikk bare tris-buffer fortynningsmiddel. De cellepopulasjonene ble fordelt i mikrobrønner med 8 x IO<4>celler og dyrket over natt 1 nærvær av<3>H-tymidin ved 37°C 1 nærvær av 5$ COg fuktet luft. Deretter ble cellene høstet, vasket fri for<3>H-tymidin i overskudd og telt 1 en scintll-lasjonsteller for å beregne opptaket av radioaktivitet som gjenspeiler cellemetabollsme og vekst. Effekten av den modifiserte proteinholdige sammensetningen ble beregnet ved en prosent reduksjon av sintegrasjoner pr. minutt (DPM) i de behandlete gruppene 1 forhold til kontrollgruppene.

Prosent-forskjellen mellom DPMene til kontrollene og DPMene til den eksperimentelle populasjonen er en Indikasjon på effektiviteten som den modifiserte proteinholdige sammensetningen har når det gjelder dreping av ondartede celler.

Det ble funnet at mindre enn 0,3 ng protein pr. celle av den modifiserte proteinholdige sammensetningen vesentlig fri for bakteriocin var tilstrekkelig for å drepe 50$ av cellepopulasjonen.

Resultatene rapportert og presentert heri indikerer at testsammensetningene inneholder en eller flere proteiner som er anti-tumorigeniske og sannsynligvis også anti-virale, og har evnen til å overvinne virus såsom HIV-I. Proteinet eller proteinene som utgjør det aktive ingrediens eller ingrediensene kan bli produsert ved indusering av proteinekspresjon og utskilling av bakterielle celler, under innvirkning av indusere vanligvis anvendt for indusere bakteriocindannelse. Resultatene ovenfor viser at det aktive proteinet eller proteinene, både anti-virale og anti-tumorigeniske, er nærværende sammen med bakteriocinproteinet når de blir produsert ved hjelp av en slik bakteriell celledyrkings-metode, f.eks. i sammensetninger såsom HSC-10. Anti-tumorigenisk aktivitet er demonstrert å være tilstede i den proteinholdige sammensetningen hvori bakteriocinene i vesentlig grad var blitt fjernet.

På grunn av at den for tiden foretrukne fremgangsmåten for fremstilling av det anti-viralt aktive eller anti-tumorigenisk aktive proteinet eller proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse er som beskrevet heri, dvs. ved dyrking av hensiktsmessige bakterielle celler under bakterlocininduser-ende betingelser, isolering av de proteinholdige sammensetningene produsert på denne måten, separering av bakteriociner derfra, utvinning av individuelle proteiner fra de resulterende proteinholdige sammensetningene, og testing ved in vitro og/eller in vivo fremgangsmåter for å identifisere anti-tumorgeniske og/eller anti-virale proteiner derfra, er det antatt at andre fremgangsmåter for fremstilling kan bli anvendt. Når den rutinemessige rensingen for å isolere individuelle proteiner, og den rutinemessige testingen for aktivitet er blitt avsluttet, kan proteinene av interesse bli fremstilt ved hjelp av andre kjente fremgangsmåter som er hensiktsmessige for deres bestemte karaktertrekk. Ut i fra studiene av deres aminosyresekvenser, kan rutinemessig trinnvis syntese av disse ved sekvensiell kobling av amino-syrer, eller korte peptidkjeder med hensiktsmessig sekvens, bli utført, f.eks. ved anvendelse av fast fase Merrifield-teknikk hvori en fast aktivert gel blir anvendt som bærer. Alternativt, ut i fra kjennskapen til aminosyresekvensen til proteinet eller proteinene av interesse, kan genetiske omkonstrueringsteknikker bli fremsatt og utført. Dermed kan hensiktsmessige DNA-sekvenser bli satt inn via et rekombinant plasmid inn i en ekspresjonsbærer, f.eks. et hvilket som helst ekspresjonssystem som er kompatibel med proteinet som skal bli uttrykt, ifølge kjente teknikker innenfor fagområdet. Det aktive proteinet eller proteinene som blir produsert på denne måten kan bli sammenlignet når det gjelder identitet med de som blir produsert ved fremgangsmåtene beskrevet i detalj og eksemplifisert deri, for å forsikre at det samme materialet er blitt produsert.

Proteinet eller proteinsammensetningen ifølge oppfinnelsen kan selv om det kan bli tilveiebragt sammen med bakteriociner ved indusert bakteriell cellefermentering som beskrevet, bli produsert ved bruk av andre uavhengige fremgangsmåter. De utgjør distinkte, nye sammensetninger, uavhengig av deres fremgangsmåte for fremstilling.

Claims (10)

1. Protelnholdig sammensetning med minst en av anti-viral aktivitet og anti-tumorigenisk aktivitet, karakterisert ved at den hovedsakelig består av minst et protein, og kan bli tilveiebragt ved en fremgangsmåte som innbefatter dyrking av bakterielle celler, fortrinnsvis E. coli-celler, i nærvær av en inducer, fortrinnsvis en inducer til bakteriocin-syntese, mere foretrukket er mitomycin C, ekstrahering av den proteinholdige blandingen fra dyrknings-mediet, og utvinning av den resulterende aktive proteinholdige sammensetningen slik tilveiebragt derfra.

2. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at den vesentlig er fri for bakteriociner.

3. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at den kan bli eluert fra en størrelseseparasjons-kromatografikolonne ved en posisjon som korresponderer med elueringen av et protein med en molekylvekt på omtrent 70.000 dalton.

4. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at den innbefatter et bakteriocin, valgt fra pyociner, vibriociner, mykobakteriociner og kolleiner.

5. Fremgangsmåte for lnhlbering av veksten av viralt infiserte pattedyrceller, fortrinnsvis hvite blodceller infisert med et virus valgt fra HIV-I-viruset, smittsom mononukleosevirus og influensaviruser, aller helst T-celler Infisert med HIV-I-viruset, eller ondartede pattedyrceller, karakterisert ved at man behandler nevnte celler med en vekstinhiberende og/eller drepende mengde av den proteinholdige sammensetningen ifølge krav 1.

6. Fremgangsmåte for lnhlbering av veksten av ondartede pattedyrceller, fortrinnsvis celler som er tilstede i en biologisk prøve tilveiebragt fra et pattedyrlegeme, karakterisert ved at man behandler nevnte celler med en vekstinhiberende og/eller drepende mengde av den proteinholdige sammensetningen ifølge krav 1, foretrukket er en mengde i omtrentelig område på IO- <5> nanogram til 10 nanogram pr. celle, mest foretrukket er IO- <4> nanogram til 1 nanogram pr. celle.

7. Farmasøytisk sammensetning som er nyttig til lnhlbering av veksten av og dreping av ondartede pattedyrceller og/eller viralt infiserte pattedyrceller, karakterisert ved at den innbefatter en protelnholdig sammensetning ifølge krav 1 blandet sammen med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel.

8. Farmasøytisk sammensetning som er nyttig til lnhlbering av veksten av og dreping av ondartede pattedyrceller, karakterisert ved at den innbefatter administrering dertil av en effektiv mengde av den proteinholdige sammensetningen ifølge krav 2 blandet sammen med et farmasøy-tisk akseptabelt fortynningsmiddel.

9. Fremgangsmåte for detektering av viralt-infiserte ikke-ondartede pattedyrceller, karakterisert ved at man kontakter nevnte celler med den proteinholdige sammensetningen ifølge krav 1.

10. Fremgangsmåte for detektering av ondartede pattedyrceller, karakterisert ved at man kontakter nevnte celler med den proteinholdige sammensetningen ifølge krav 2.