NO872223L - Bakteriociner og preparater inneholdende disse for antivirusbehandling. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører bakteriociner og preparater inneholdende disse for anti-virusbehandling.

Hvite blodceller innbefatter, bl.a. komponenter, T- og D-celler (lymfocytter).

Av virusene som er kjent for å infisere T-celler er det viruset som har den absolutt største medisinske betydningen ETLV-III, et retrovirus, som nylig er identifisert som det viruset som er ansvarlig for ervervet immunsviktsyndrom eller AIDS. Det er vist at HTLV-III viruset (i dag kjent som HIV), som er involvert ved AIDS, kan infisere T-cellene i blodet og eventuelt ødelegge disse. T^, suppressorcellene er ikke utsatt for slike infeksjoner.

En annen medisinsk viktig virusinfeksjon er infektivs mononukleose forårsaket at Epstein-Barr viruset (EBV). Et stort antall andre viruser som infiserer pattedyrceller er kjente, og innbefatter bl.a. influensavirusene.

AIDS-viruset er i dag et spesielt aktutt medisinsk problem, idet ingen helbredende effektiv antidot foreløpig er generelt tilgjengelig. AIDS-viruset kan infisere T-cellene i pasi-entens blod og ligge hvilende der i lange tidsrom. Når imidlertid visse faktorer utløser dets formering trans-formerer det raskt vertens T-celler, inntil de er ute av stand til å utføre deres immunfunksjon mot kroppsinvaderende stoffer.

Forskere har tidligere identifisert og isolert bakterle-avledede proteiner som nå betegnes som bakteriociner. Disse proteinene produseres av en lang rekke bakterier, både Gram-positive og Gram-negtive, og betegnes etter produsentstammen. Bakteriociner vekselvirker med spesifikke bateriestammer som normalt er nært beslektet med produsentstammen og forhindrer deres formering ved å avlive dem. Spesifisiteten ligger i den antigeniske hetrogeniteten for bakteriocinene og deres vekselvirkning med spesifikke reseptorer på overflaten av de de sensitive stammene avbakteriet. Bateriociner kan variere når det gjelder angrepsmåte på deres målbakterium. De kan virke ved å inhibere all makromolekylær syntese, eller ved å inhibere selekttive elektrontransport-avhengige prosesser, Idet de påvirker K+-transport og ATP-produksjon. Visse bakteriociner kan vekselvirke med ribosomer, slik at de spesifikt påvirker proteinsyntesen; andre vil inhibere cellevekst ved å forårsake nedbrytning av DNA. Bakteriociner som har felles virkningsmåter er ikke nødvendigvis struk-turelt eller antigenisk beslektede.

Anvendeligheten av bakteriociner som selektive Inhibitorer for veksten av neoplastiske og tumorigeniske celler er i den senere tid fastslått og rapportert. I ICRS Journal of Medical Scinence, bind 4, side 291-295, juli 1976, beskriver Farkas-Himsley evnen av bakteriocinet pyocin 1-4 til å inhibere veksten av tumorer indusert av KET fibrosarkoma-celler i mus samtidig som de er ikke-toksiske overfor ikke-tumorcellene. I Eur. J. Clin., Oncol. , 19, 163-171 (1983) beskriver forskere evnen av colicln HSC-10, et bakteriocin, til å inhibere veksten av leukemiske perifere blodlymfocytter på en selektiv måte fremfor de normale lymfocyttene og de ikke-kreftinfiserte nabo-benmargscellene.

Evnen av bakteriociner til å skille ondartede celler fra friske celler har ført til spekulasjoner vedrørende den spesifikke virkningsmåten for bakteriocinet på de ondartede målcellene. En hypotese er foreslått som antyder at den onkogene fenotypen av den ondartede cellen gjenkjennes av bateriocinet og eventuelt fører til inkorporering og interaksjon av bakteriocinet og dets endelige mål, det metaboliske eller genetiske maskineriet Inne i målcellen^ Denne hypo-tesen understøttes av den observasjonen at normale, friske celler som mangler den onkogeniske fenotypen og evnen til metastase, ikke skades av bakteriocinet.

Det er et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for deteksjon av virusinfiserte pattedyrceller. Det er et ytterligere formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe stoffer og preparater som kan benyttes ved behandlingen av forskjellige virusinduserte infeksjoner og sykdommer.

Foreliggende oppfinnelse er basert på den observasjonen at bakteriociner er istand til å skille mellom virusinfiserte pattedyrceller og friske, normale pattedyrceller. Denne observasjonen må sees i kontrast til tidligere observasjoner av bakteriocinangrep på kreftceller, på bakgrunn av tidligere spekulasjoner om at at bakteriociner gjenkjenner elementer av cellemorfologien som manifisteres ved den onkogene tilstanden av den ondartede cellen. Ondartede celler antas generelt å ha cellemembran-bestanddeler som gir cellen dens ikke-selvbegrensende, ikk-regulerte vekstegenskaper som i sin tur tillater metastase. På den annen side er virusinfiserte pattedyrceller som ikke er ondartede selvbegrensende med hensyn til deres vekstmønstre. Slike celler antas i dag ikke å være mottakelige for virkningsmåten av bakteriocinet.

Slik betegnelsen her benyttes betyr "ondartet" "som har evnen til lokalt invaderende og destruktiv vekst og metastase", dvs. som definert i Stedman<*>s "Medical Dictionary", 24. utgave, Williams & Wilkins, Baltimore, London, 1982.

Følgelig bør det klart fremgå at de virusinfiserte pattedyrcellene som her beskrives ikke er tumorogene eller ordartede celler ved at det virusinfiserte pattedyrcellene har selvbegrensende vekst og har et vekstmønster som umiddelbart synes ukarakteristisk for ondartede celler.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes derfor bakteriociner og preparater derav for anvendelse ved behandling av virusinfiserte pattedyrceller.

Det tilveiebringes videre, innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse, en fremgangsmåte for deteksjon av veksten av virusinfiserte ikke-ordartede pattedyrceller som innbefatter behandling av disse cellene med bakteriociner og preparater derav.

Bakteriocinene som er nyttige ved foreliggende oppfinnelse synes å ha et gjenkjenningssete i deres kjemiske struktur som spesifikt og selektivt vekselvirker med den virusinfiserte cellen. Videre synes egnede doser av bakteriocinene å avlive selektivt de virusinfiserte cellene, mens de etterlater de normale, friske cellene i det vesentlige upåvirket.

Slike bakteriociner er, I mange tilfeller, de samme som de som selektivt avliver eller inhiberer veksten av forskjellige kreftceller, såsom fibrosakoma, akutt lymfoblastisk leukemi (ALL), servikal karsinoma, adenokarsinoma, skjellcelle-karsinoma, kronisk myelogen leukemi, prolymfocyttisk leukemi, mastocytoma og mange andre. Spesifikke eksempler på bakteriociner som er nyttige ved foreliggende oppfinnelse innbefatter pyociner, vrlbrlociner, mykokateriociner og coliciner. Spesielt foretrukket for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse er pyocin 1-4 og colicin HSC10.

Virusinfiserte, ikke-ondartede, pattedyrceller kan innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse detekteres ved behandling av disse cellene med bakteriocin. Nærmere bestemt kan celler infisert av viruser detekteres ved cellevekt eller celledød av de bakteriocin-behandlede cellene.

Det finnes et antall fremgangsmåter som vil være kjente for fagmannen, innbefattende, men ikke begrenset til, bindingsanalyser (enzym-forbundne, fluorescens- og radiobindende), og metaboliske opptaksanalyser innbefattende opptaket av tritiert thymidin, strømnings-cytometri, som effektivt kan benyttes for deteksjon av virusinfiserte, ikke-ondartede celler behandlet med bakteriocin.

Bakteriocinene kan fremstilles ved å anvende de kjente standardteknikkene for bakteriell fermentering ved anvnedelse av en stamme av et bakterium som har evnen til bakteriocin-produksjon. Bakteriet dyrkes i en fermenteringsinnretning til den eksponentielle fasen. Induksjon foregår, ved anvendelse av et egnet kjemisk eller fysikalsk middel, som vil forårsake at de fleste av cellene (90.99$ av disse) syntetiserer bakteriocin. Et eksempel på et egnet induserende stoff er mitomycin C, ved et nivå på ca. 0,5 pg pr. ml. Deretter inkuberes cellene videre. Ved noen kulturer utskilles bakteriocinet i fermenteringsmediet. I andre tilfeller vil kulturene Ikke frigi bakteriocinet, slik at celleveggen må oppbrytes. Dette kan utføres udner trykk (f.eks. 137,9 kPa) ved anvendelse av en fransk-trykkscelle. Det rå bakteriocinet kan separeres fra celleavfallet ved sentrifugering, og inneholdes deretter i supernatantvæsken.

Når supernatanten er utvunnet kan standardbiokjemiske separasjonsprosesser anvendes for å rense bakteriocinet. F.eks. anvendes ammoniumsulfat fortrinnsvis innledningsvis ved forskjellige konsentrasjoner. Gjenværende ammoniumsulfat fjernes deretter ved dialyse mot vann. Deretter kan bunn-fallet som inneholder det ønskede bakteriocinet krommatogra-feres på en kolonne, såsom en "Sephadex DEAE-50" en svak kationveksler, og de forskjellige proteinene separeres ved å overvåke aborbansen ved 280 nm. Aktive fraksjoner kan bestemmes blandt de derved separerte proteinene, og utvelges på basis av den effektiviteten hvorved porsjoner av fraksjonene avliver bakteriestammer som er kjent for å være følsomme overfor bakteriocinet, dvs. indikatostammen. Aktive proteinfraksjoner samles deretter. Ytterligere rensing kan utføres ved høy presisjons væskekrommatografi' (HPLC) basert på ladningen av proteinene. De forskjellige toppene som oppnås ved å overvåke absorbansen ved 280 nm kan separeres og igjen undersøkes med henblikk på aktivitet mot indikatorstammen. Endelig renhet av proteinbakteriocinet kan be stemmes ved natriumdodecylsulf atpolyakrylamidgelelektroforese (SDSPAGE). Nærværet av et hovedbånd etter farging med "Coomassie blue", indikerer at renhet av bakteriocinet er oppnådd. Et eksempel på vibriocin- og colicin-rensing finnes i hhv. Microbios, 1969, IB 87-89 og Cytobios, 1985, 42: 193-207.

Følgelig ligger seleksjon, isolering og rensing av de egnede bakteriocinene for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse godt innenfor fagmannens kunnskaper. Rutinemessig bakterio-cinproduksjon og undersøkelsesfremgangsmåter som beskrevet ovenfor vil lett gi den trendede fagmannen spesifikke bakteriociner som er aktive mot virusinfiserte pattedyrceller. Selv om den følgende beskrivelsen av spesifikke foretrukne utførelser av oppfinnelsen beskriver individuelle, spesifikke bakteriociner som er funnet å være akive og effektive mot spesifikke virusinfiserte B- og T-celler er oppfinnelsen på ingen måte begrenset til anvendelsen av de spesifikke eksemplifiserte bakteriocinene.

Bakteriocinene som er nyttige ved foreliggende oppfinnelse bør benyttes i relativt små mengder, for å ha sikkerhet mot toksisitetsproblemer. Ved toksisitetsundersøkelse gjennom-ført på mus var den effektive gjentatte dosen på 10 jjg pr. dyr 100$ effektiv uten noen toksiske virkninger på musene. Med økende konsentrasjoner av bakteriociner opptrådte imidlertid toksisitet. Med mus av stamme C3H/J, var 80 til 100 pg pr. mus fatalt. Med andre musespecies, såsom hybrid C3DX2F1/J, ble det registrert en ti ganger større resistens enn for C3H/J mus, og toksisitet ble nådd ved 1000 jjg pr. mus.

På bakgrunn asv at en enhetsdose av bakteriocinet fortrinnsvis skal påvirke én million virusinfiserte celler er det foretrukket å administrere fra 0,01 jjg til 10 pg bakteriocin pr. behnadling, fortrinnsvis fra 0,1 pg til 1 pg pr. behandling. Gjentatte doser av denne størrelsen kan adimistreres. Det er foretrukket at bakteriocin tilsettes til en gitt lymfocyttpopulasjon slik at det oppnås et forhold på 10~<5>ng til IO-<2>ng bakteriocin pr. målcelle, mest foretrukket IO"<4>ng til 10-<3>ng pr. målcelle. Denne dosestørrelsen er betyd-leig lavere enn dosen som kreves for å behandle kreftceller.

Tilfellene hvor preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse vil bestemme doseringesformen for preparatet. Fordi bakteriocinene er proteiner og nedbrytes av mageenzymer, og også fordi preparatene fortrinnsvis benyttes i angrep på lymfocytter, fremstilles preparatene fortrinnsvis som oppløsninger for administrering ved injeksjon. Følgelig er foretrukne bærere buffrede og salte vannmedier. Slike oppløsninger fremstilles ifølge standardpraksis innen teknikken.

Oppfinnelsen illustreres videre ved hjelp av de følgende spesifikke eksemplene:

Eksempel 1 - Fremstilling av bakteriocin HSC10

To hundre liter av "Brain Heart Infusion" medium (BHI)

(Difco Labs, Detroit, Mich.) ble tilsatt et Inokulat av den bakterielle produsentstammen E.coli HSC-10 som var dyrket over natten. Kulturen ble dyrket ved 37°C, Inntil bakterie-veksten nådde den eksponensielle fasen. Et induserende species, nemlig Mitomycin C, i en mengde på 0,5 >jg pr. ml ble deretter tilsatt til kulturen og veksten fikk fortsette i ytterligere 4-5 timer.

Den resulterende buljongen ble behandlket på en "Sharples" sentrifuge, i 90 minutter, slik at det ble dannet en super-natantbuljong som ble kastet, og en pellet av fast og halvfast materiale. Pelleten hadde en våt masse på 505 g. Det cellulære materialet i pelleten ble deretter nedbrutt ved anvendelse av en fransk-trykkcelle og det resulterende materialet ble resuspendert i 1% av det opprinnelige volumet av "Tris" (0,05M, pH 7,8). Den resulterende suspensjonen ble sentrifugert, og pelleten av cellerester ble kastet. Super- natantmaterialet som derved ble oppnådd, inneholdende lysatet som inneholdt det rå bakteriocinet, ble opparbeidet og renset som beskrevet nedenfor I eksempel 2.

Eksempel 2 - Rensing av bakteriocin

Supernatanten inneholdende det rå bakteriocinet oppnådd i eksempel 1 ble frigjort fra andre proteiner enn det aktive bakteriocinet ved ammoniumsulfatutfelling ved forskjellige konsentrasjoner. Proteinet som saltet ut ved en konsentra-sjon på 35-50$ ammoniumsulfat i supernatantvæsken ble bevart, og supernatanten ble kastet. Det tilbakeholdte materialet ble dialysert mot vann, sentrifugert ved 46.000xg, og den resulterende supernatanten ble lagret ved -20°C før etter-følgende rensing.

Etter opptining ble den frosne supernatanten underkastet kromatografi ved anvendelse av "Sephadex - DEAE A-50" og samlet i separate fraksjoner ved anvendelse av 0,0-1,OM NaCl i 0,01M "Tris", pH 8,2 som elueringsmiddel og absorbansen ble overvåket ved 280 nm.

Fraksjoner av interesse ble deretter samlet og undersøkt vedrørende aktivitet mot indikatorstammen E.coli Y10 ved anvendelse av turbiditetstesten. Nærmere bestemt ble Indikatostammen dyrket over natten i "Brain Heart Infusion" medium ved 37° C benyttet som inokulat for å oppnå eksponen-siell vekst til et spesifikt celleantall. Disse bakteriene ble blandet med to gangers fortynninger av det delvis rensede bakteriocinet som beskrevet ovenfor, og vekstinhibering av Indikatorstammen ble registrert spektrofotometrisk. Vekst-responskurver ble generert ved disse turbiditetsmålingene hvorfra letale enheter/ml av colicin HSC10 ble beregnet på bakgrunn av den kjente konsentrasjonen av bakteriocin tilsatt til det kjente antallet celler av indikatorstammen i mediet. LU50, dvs. letale enheter pr. ml påkrevet for å avlive 50$ av indikatorstammepopulasjonen, er angitt i, og omtalt under henvisning til, den etterfølgende tabell I.

Ytterligere rensing av de oppsamlede fraksjonene ble utført ved anvendelse av høy presisjonsvæskekromatografi (HPLC), og de fraksjonene som ble samlet ved toppabsorbans på 280 nm ble slått sammen og porsjoner derav ble underkstet den samme turbiditetstesten som beskrevet ovenfor.

Renheten av den endelige fraksjonen ble bestemt ved SDS-PAGE analyse hvorved renheten av bakteriocinet, etter farging med Coomassie blue, ble bekreftet ved nærværet av et hovedbånd.

Mengdene av bakteriocin utvunnet ved hvert trinn i fremgangsmåten beskrevet ovenfor og den bakteriocidiske aktiviteten av disse mengdene er gjengitt i tabell I nedenfor:

Det skal bemerkes at mengden av colicin HSC10 avledet fra kulturlysatet bare er ca. 0,10$ av den opprinnelige vekten av lysatet, dette antyder at fortrinnsvis kultiveres store volumer av bakterier for å generere nødvendige mengder av bakteriocin. Fremgangsmåten for rensing som her er foretrukket var tilstrekkelig til å etablere en rensefaktor, basert på den bakteriocide aktiviteten av proteinet, på 930 hvorved bare 0,63 pg av bakteriocin er påkrevet for å inhibere vekst av 50$ av indikatorstammepopulasjonen. Fraksjonen som isoleres for yttelrigere undersøkelse i eksemplene 3, 4 og 5, og som nedenfor betegnes som HSC-10, er avledet fra utfellingen etter "Sephadex DEAE - A50" behandlingen.

Eksempel 3 - Selektivitet av colicin HSC10 ved identifikasjon

av virusinfiserte leukocytter in vitro Lymfocytter oppnådd fra 14 forskjellige AIDS-pasienter ble anriket på "Ficoll-Paque" (Pharmacia Fine Chemicals, Dorval, Quebec), telt og inndelt i forsøks- og kontrollgrupper. Colicin ESC10, ekstrahert og renset som beksrevet ovenfor, ble fortynnet i tris-buffer ved pH 7,4 og tilsatt til forsøkslymfocyttpopulasjonen, slik at det ble oppnådd et forhold på IO-<5>til IO-<2>ng bakteriocin pr. målcelle. Kontrollpopulasjonen fikkbare tris-buffer fortynningsmidlet.

De to cellepopulasjonene ble fordelt i mikrobrønner og dyrket over natten i nærvær av ^H-tymidin ved 37°C i nærvær av 5$ CC^-fuktiggjort luft. Deretter ble cellene høstet, vasket frie for overskudd av<3>H-tymidin og ført gjennom en scintil-lasjonsteller for å vurdere opptaket av radioaktivitet som er en følge av cellemetabolisme og vekst. Virkningen av bakteriocin ble bedømt som prosent reduksjon av disintegra-sjoner pr. minutt (dpm) i den bakteriocin-behandlede gruppen, sammenlignet med kontrollgruppene.

I et parallelt forsøk ble bakteriocin tilsatt til lymfocytter oppnådd fra 9 friske individer og, ved hjelp av Sjj-tymidin-opptaksforsøket, sammenlignet med kontrollfriske lymfocytter som bare var utsatt for tris-buffer bakteriocin-fortynningsmidlet.

En tredje gruppe innbefattende 3 pasienter i en høyrisiko-gruppe for AIDS (dvs. blødere) ble undersøkt, selv om nærværet av AIDS i disse pasientene ikke ble bekreftet.

^H-tymidinopptak i hver av de tre gruppene ble målt som en prosent av kontrollgruppen, som i hvert tilfelle var pasienter i de respektive gruppene uten bakteriocinbehandling.

I de anvendte konsentrasjonene viste bakteriocinet virkninger på antallet av HTLV-III infisert (AIDS) lymfocytter fra AIDS-pasientene, og på lymfocyttene fra de AIDS-mistenkte pasientene og de friske, normale individene som det fremgår av tabell II nedenfor:

Som beskrevet ovenfor var fire forsøk fra prøver fra Individer i den "normale" gruppen, som man visste ikke hadde AIDS-viruset, følsomme for bakteriociner i<3>H-tymidin-inhiberingsforsøket, hvilket er en Idikasjon på en virusinfeksjon. Alle disse "falske positive" individene ble senere funnet å ha ndre virusinfeksjoner ved<3>H-tymidinopptak og to individer ved 2-5-syntetasetesten. Den sistnevnte testen, beskrevet i Journal of Infections Diseases, Read, S.E., et al, september 1985, er velkjent og akseptert innen teknikken for tidlig diagnose av virusinfeksjoner. I en senere undersøkelse viste en av de "falskt positive" pasientene, ifølge en transient virusinfeksjon, stimulering, i motsetning til inhibering av<3>H-tymidin.

De femten forsøkene utført på AIDS-pasientene viste 53$ e4n inhibering av tymidinopptak, 13$ viste grenseområdein-hibering. Omvendt, av de fjorten forsøkene utført på de normale Individene, viste 57$ en effektiv stimulering av tymidinopptak, mens 14$ viste grensområdeinhibering, og bare 29$ (4 av 14) viste inhibering.

Ingen av de tre mistenkte AIDS-pasientene viste følsomhet for bakteriocin. Ved tidspunktet for denne undersøkelsen bekreftet forsøk og observasjoner at ingen av disse pasientene var bærere av AIDS-viruset.

Som en sammenfatning kan en bemerkelsesverdig effekt observeres fra resultatene gjengitt I tabell II. For det første reduseres antallet AIDS-lymfocytter som viser opptak av radioaktiviteten i betydelig grad når bakteriocin innføres. For det andre, og meget viktig, synes veksten av normale lymfocytter som underkastes de samme konsentrasjonene av bakteriocin ikke å ødelegges (71$). Enda mer interessant er det at 57$ av disse normale lymfocyttene som ble underkastet bakteriocin viste en økning i radioaktivitetstellingen sammenlignet med de ubehandlede. Dette betyr stimulering av veksten av normale lymfocytter, en respons som sannsynligvis vil gi et betydelig antall pasienter behandlet med bakteriocin, større immunitet mot andre infeksjoner som plager AIDS-pasienter.

For å identifisere målet for bakeriocinangrep på AIDS-infiserte lymfocytter mer spesielt, ble monoklonale antistoffer anvendt. Det er kjent at forholdet mellom underserie hjelper-induser (T4) celler og underserie supressor (Tg) celler som interfererer med Immunrsponsen hos AIDS-pasienten, dvs. T^Tg-forholdet, er redusert hos AIDS-pasienter - se Evatt et al, New England Journal of Medicin, bind 313, side 483. Underserie hjelper-indusercellene (T4) som aktiverer immunresponsene og derfor er vitale komponenter av kroppens forsvarssystem, infiseres med HTLV-III viruser og funksjonen ødelegges eller blir ikke-eksisterende. Forsøk ble derfor utført hvori spesifikke monoklonale antistoffer til T4-celler (New England Nuclear, katalog nr. NEN-038) og Tg-celler (New England Nuclear, katalog nr. NEI-039) ble benyttet for å vurdere nærværet og antallet av T4- og Tg-lymfocytter etter bakteriocinbehandling av lymfocytter avledet fra en AIDS-pasient.

Det ble funnet at antallet av underserie Tg supressor-lyrafocytter forble uendret etter bakteriocinbehandling, mens antallet av de infiserte T-cellene ble betydelig redusert.

Nærmere bestemt ble forsøket utført ved anvendelse avb spesifikke monoklonale antistoffer til T4- og Tg-celler, beskrevet ovenfor, fremstilt ved en fremgangsmåte kalt hybridomateknikken. Denne teknikken er meget anvendt av fagmenn innen området.

De monoklonale antistoffene til T4eller Tg, som derved var fremstilt, ble merket med enfluorescerende forbindelse (f.eks. fluoresceinisotiocyanat) som kan detekteres på grunnlag av fluorescensen for fargestoffet under ultrafiolett lys.

T4- og Tg-cellene assosieres deretter med deres respektive fluorescensantistoffer og telles under ultrafiolett lys.

Hver av AIDS-pasientene som ble undersøkt viste, i nærvær av bakteriocin, en reduksjon på mellom 14 og 21% i deres T4-lymfocytter. Deres Tg-lymfocytter ble enten ikke påvirket i det hele tatt, eller nominelt stimulert eller inhibert.

Ifølge den spesifikke utførelsen som her er beskrevet er det følgelig vist at bakteriociner er effektive for reduksjon av antallet virusinfiserte T-lymfocytter. Nærmere bestemt er anvendeligheten av bakteriociner, f.eks. colicin HSC-10, etablert ved reduksjon av antallet T4~celler uten tilsvarende ødeleggelse, men derimot stimulering av normale T-celler.

Eksempel 4

Virkningen av bakteriocin på AIDS-pasientlymfocytter, såvels om lymfocytter infirsert med andre viruser, såsom influensa med sår hals og infektivt mononukleose, kan bestemmes ved strømnings-cytometri ved anvendelse av teknikker svarende til de som er beskrevet i IRCS Medical Science, 11, 236-237 (1983 ).

Generelt innberf atter fremgangsmåten analyse av DNA-innholdet av hver celle i en gitt prøve for å fastslå prosentandelen av celler som, ved et gitt øyeblikk, eksisterer i en spesifikk fase av cellesyklusen. Idet bakteriociner kan påvirke følsomme celler ved nedbrytning av DNA, hvilket resulterer i nukleotid-lekkasje, kan et økende antall behandlede celler med lite DNA detekteres ved strømnings-cytometri. Celler som er følsomme for bakteriocin og behandlet med dette vil vanligvis observeres og akkumulere inne i "pre-G^"-kanalene når resultatene avsettes grafisk på et histogram, hvilket viser avtagende DNA-innhold, siden DNA for disse cellene er nedbrutt.

Nærmere bestemt ble lymfocytter oppnådd fra pasienter som tidligere var diagnostisert som bærende infektivt mononukleose (ved infeksjon med Epstein-Barr-viruset) isolert ved "Ficoll-Paque" (Pharmacia Fine Chemicals, Montreal) og farget med propidiumiodid. Colicin HSC-10, ekstrahert og renset som i eksempel 1, ble tilsatt til en prøve av de isolerte lymfocyttene. Cellefluorescens ble deretter målt under vekstsyklusen i et strømningscytometer (FCM). Lymfocytter som skulle undersøkes, hvortil Intet bakteriocin var tilsatt, ble benyttet for å kalibrere Gg/Gi-fasecellene til verdien for standard. Det samlede celleantallet som ble undersøkt ble oppnådd fra numerisk data print out. Prosentandelen av det samlede antallet ble beregent for cellene tilstede i "pre-Gi" og Gg/G^-fasene ved integrering av cellene under toppen. De endelige resultatene ble uttrykt etter subtrak-sjon eller addisjon av den prosentvise enderingen som fant sted i celleantallene av kontrollprøvene, dvs. de virusinfiserte cellene som ikke var eksponert mot bakteriociner.

Resultatene er gjengitt i tabell III.

Det ble utført ni forsøk på syv individer. Seks av de syv pasientene som ble undersøkt viste på sitt histogram en reduksjon i celler fra Go/G^-fasen (se kolonne 5) og fem av syv pasienter viste en akkumulering av celler i "pre-G^"-fasen (se kolonne 3). Som en oppsummering viste, i 78$ av forsøkene, pasientprøver følsomhet for colicin HSC-10.

Eksempel 5

Fire pasienter kategorisert som normale i den delen av eksempel 3 og som viste seg å ha influensa ved kliniske symptomer, ble funnet å ha en transientpositiv reaksjon med bakteriociner. Disse pasientene ble senere funnet å være positive for nærværet av 2-5Å syntetase, hvis nærvær enen indikajson på en virusinfeksjon (J. Infectious Diseases, Read, S.E., et al, september/85). Etter et tidsromsom var tilstrekkelig for å komme seg fra influensasymptomene ble disse pasientene undersøkt igjen for bakteriocinfølsomhet og funnet å være negative. En mulig konklusjon som kan trekkes fra disse resultatene er at i det minste visse virusinfeksjoner påvirkes av bakteriocin HSC-10.

Claims (11)

1. Fremgangsmåte for inhibering av veksten av virusinfiserte, ikke-ondartede pattedyrceller,karakterisertved at den innbefatter behandling av nevnte celler med en vekstinhiberende og cidal mengde av et bakteriocin.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at de virusinfiserte cellene er hvite blodceller, spesielt T-celler, f.eks. T-celler, infisert med et virus valgt fra HTL-III-viruset og infektivt mononukleosevirus.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 2,karakterisert vedat bakteriocinet er valgt fra pyociner, fortrinnsvis pyocin 1-4, vibriociner, mykobakteriociner og coliciner, fortrinnsvis colicin HSC-10.

4 . Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat cellene, som fortrinnsvis innbefatter lymfocytter, er tilstede i en biologisk prøve oppnådd fra et pattedyrlegeme, og behandles med en mengde av bateriocin, fortrinnsvis colicin HSC-10, i området fra IO"<5>ng til IO-<2>ng pr. målcelle, fortrinnsvisIO"<4>ng - IO"<3>ng pr. målcelle.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisertved at et levende pattedyr administreres en dose av bakteriocin i området fra 0,01 jjg til 10 jjg, fortrinnsvis 0,1 jjg til 1 jjg.

6. Farmasøytisk preparat som er nyttig for inhibering av veksten av og avlivelsen av virusinfiserte pattedyrceller,karakterisert vedat det innbefatter et bakteriocin som aktiv bestanddel i blanding med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel.

7. Preparat ifølge krav 6,karakterisert vedat bakteriocinet er valgt fra pyociner, fortrinnsvis pyocin 1-4, vibriociner, mykobakteriociner og coliciner, fortrinnsvis colicin HSC-10.

8. Fremgangsmåte for deteksjon av virusinfiserte, ikke-ondartede pattedyrceller, som fortrinnsvis omfatter lymfocytter,karakterisert vedat den innbefatter interaksjon mellom nevnte celler og bakteriocin, fortrinnsvis valgt fra pyociner, vibriociner, mykobakteriociner og coliciner, og etterfølgende vurdering av cellevekstinhibering og celledød etter behandling med nevnte bakteriocin.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisertved at cellevekstinhibering vurderes ved bindingsanalyser eller måling av optaket av et radioaktivt element ved hjelp av nevnte celler, og celledød bestemmes ved strømnings-cytometri.

10. Bakteriocin,karakterisert vedat det anvendes som reagens for deteksjonen av virusinfiserte, ikke-ondartede pattedyrceller.

11. Flytende preparat for anvendelse ved in vitro diagnose av virusinfiserte, ikke-ondartede pattedyrceller, karakt erisert ved at det innbefatter et bakteriocin, fortrinnsvis colicin HSC-10, sammen med en farmasøytisk akseptabel flytende bærer, som fortrinnsvis er en vandig suspensjon eller oppløsning, fortrinnsvis en buffer, f.eks. tris-buffer eller fosfatbufret saltvann.