JPS63290824A - ウイルス感染症治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野　゛ 本発明は、細胞の蛋白合成を特異的に阻害する毒素含有
リポソームを主成分とするウィルス感染症治療剤に関す
る。　更に詳しくは、本発明は、後天性免疫不全症候群
（ＡＩＤＳ）の治療に有用な細胞の蛋白合成を特異的に
阻害する毒素を含有するリポソームを主成分とするウィ
ルス感染症治療剤に関する。

従来技術及び問題点 レトロウィルス（ＲＮＡウィルス）による後天性免疫不
全症候群（ＡＩＤＳ）に対する治療剤は現在種々開発中
であるが、インターフェロンやインターロイキン、アジ
ドチミジン（ＡＺＴ）など数種類に限られており、その
効果の評価も定まっておらず実際上、有効なものはほと
んど無いのが現状である。　これらの病気は大きな社会
問題を引き起こしておりこれらの治療剤の開発が待たれ
ている。

本発明者らは、これらについて誠意研究の結果、細胞の
蛋白合成を特異的に阻害する毒素、特にジフテリア毒素
フラグメントＡを含有するリポソームが後天性免疫不全
症候群（、ＩＤ５）の原因ウィルス感染細胞を選択的に
破壊し、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療剤と
して極めて有効であることを発見し本発明を完成した。

ジフテリア毒素は、分子量約６０，０００の単一鎖蛋白
質であり、ヒトに対し強い毒性をもっている。

その致死量は成人に対し約１０〜２０μｇと言われてい
る。　この毒素蛋白質を還元剤の存在下、トリプシンで
温和に処理して限定分解すると、分子量約２０．０００
のフラグメントＡと分子ｌＩｂ４０，０００のフラグメ
ントＢに分解する（ＣＯＬＬＩｆ！Ｒ，Ｒ，Ｊ、　ａｎ
ｄＫＡＮＤＥＬ、Ｊ、（１９７１）　　１．　Ｔｈ１ｏ
ｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　　
ｏｆ　　ａ　　ｆｒａｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｔｏｘｉ
ｎ　　ｉｎｔ。

ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　
１ｎａｃｔｉｖｅ　ｆｒａｇｓ＋ｅｎｔｓ、。

Ｊ、ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２４６：１４９６−１５０
３；およびＧＴＬＬ、Ｄ、Ｍ。

ａｎｄ　ＤｒＸＩＵＳルル、（１９７１）　０ｂｓｅｒ
ｖａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏ
ｎ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ　ｔｏｘｉｎ、＋　Ｊ、ｂｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｗ。

２４６：１４８５−１４９１）。このように分離すると
、それぞれのフラグメント単独では毒性をもたなくなる
。

それは各フラグメントが毒性を持つための機能分担をし
ているからである。　即ち、フラグメントＡは細胞内で
蛋白質合成を阻害して細胞を殺し、フラグメントＢは細
胞表面へ結合してフラグメンｌ−Ａを細胞内へ送り込む
働きをしている（ＵＣＨＩＤ＾、Ｔ、、ＰＡＰＰＥＮＨ
ＥＩＭＥＲ，Ａ、Ｍ、Ｊｒ、　ａｎｄ　ＨＡＲＰＥＲ，
Ａ、＾。

（１９７２）＋　Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｏｆ
　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ　ｔｏｘｉｎｆｒｏｍ　ｔｗｏ
　ｎｏｎｔｏｘｉｃ　ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ　
ｍｕｔａｎｔｔｏｘｉｎｓ、、　　５ｃｉｅｎｃｅ　１
７５：９０１−９０３）。

従って、フラグメントＢを持たないフラグメントＡは細
胞外にあっては全く毒性を発揮せず、その毒性は、ジフ
テリア毒素の１０−４以下である。

しかし、細胞内では極めて強い毒性を示し、人為的にフ
ラグメン）Ａを細胞内に注入すれば、１分子でその細胞
を死に至らしめる（ＹＡＭＡＩＺＵＭｌｌＭ、。

ＭＡＫＡＥＤＡ、Ｅ、、ＵＣＩＩＩＤＡ、Ｔ、ａｎｄ　
　　０ＫＡＤＡ、Ｙ、（１９７８）。

Ｏｎｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｏｆ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉ
ａ　ｔｏｘｉｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ａｉｎｔｒｏｄｕ
ｃｅｄ　１ｎｔｏ　ａ　ｃｅｌｌ　ｃａｎ　ｋｉｌｌ　
ｔｈｅ　ｃｅｌｌ、。

Ｃｅ１ｌ　１５：２４５−２５０）。

フラグメントＡは、下記の反応（１）を触媒してＥＦ２
（伸長因子２）を失活させることにより蛋白質合成を阻
害する（ＩＩＯＮＪＯ，Ｔ、、、Ｎｌ５ＨＩＺＵＫＡ、
Ｙ、。

ＨＡＹＡＩＳＨｌ、０．　ａｎｄ　ＫＡＴＯ，１，（１
９６８）、　　Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ−ｔｏｘｊｎ−ｄ
ｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｄｉｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ａｍ
ｉｎｏａｃｙｌ　　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　　ＩＩａ
ｎｄ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　
５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、＋Ｊ、ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２４３：２５５３−３５５５）。

Ｅ　Ｆ　２　＋ＮＡＤ”″→ＡＤＰ−リボースーＥＦ２
＋ニコチンアミド　＋　Ｈ”　　　　　　　　（１）即
ち、ＥＦ２はリポソーム上で蛋白質合成が行われる際、
ペプチイディール　ｔＲＮＡがＡサイトからＰサイトへ
転移してペプチドを伸長させるのに必須な蛋白質因子で
あるが、（１）の反応によりＡＤＰ−リボースと共有結
合して失活し、このため蛋白質合成が阻害されるのであ
る。　尚、この反応は極めて特異性の高い反応であり、
ＥＦ２以外の基質は現在のところ全く見つけられていな
い。

ジフテリア毒素フラグメントＡをリポソームに封入して
動物の脳内に注入した場合、該フラグメントが有膜ウィ
ルス感染細胞に選択的に導入され細胞内の全ての蛋白質
合成が阻害され、結果的に感染細胞が破壊されるが、同
時にウィルス増殖が阻止され、感染の拡大が完全た防止
される。

従って、ウィルス性脳炎、特に亜急性硬化性脳炎、麻疹
脳炎およびヘルペス脳炎などの治療に優れた効果を発揮
することが知られている（特開昭６Ｏ−２５２４２５）
。

一方、ジフテリア毒素フラグメントＡと同様に細胞の蛋
白合成を阻害する毒素としては、例えば緑膿菌外毒素の
Ｃ一部側活性部分、ヒマ種子由来のＡフラグメント等が
知られている。

発明の構成 本発明は、細胞の蛋白合成を阻害する毒素を含有するリ
ポソームを主成分とする後天性免疫不全症候群（ＡＩＤ
Ｓ）に対する治療剤として有効なウィルス感染症治療剤
を提供する。

以下に本発明について、詳細に説明する。

本発明に用いる細胞の蛋白合成を阻害する毒素としては
、ジフテリア毒素フラグメントＡ、緑膿菌外毒素のＣ一
部側活性部分、ヒマ種子由来のＡフラグメント等の公知
のものが挙げられるが、特に好適な例としてはジフテリ
ア毒素フラグメントＡが挙げられる。

ジフテリア毒素フラグメントＡは、概述したように、公
知の方法によりジフテリア菌の産生ずるジフテリア毒素
を還元剤とトリプシンで処理し、常法に従って、フラグ
メントＢおよびその他の夾雑物を分離することにより得
ることができるが、フラグメントＡだけを産生ずるジフ
テリア菌変異株Ｃ７（β２２）からジフテリア毒素自体
を含まないフラグメントＡを得ることができる（口ＣＨ
ＩＤＡ、Ｔ、、ＫＩＭ、Ｊ、、ＹＡＭＡＩＺＵＭｌ、Ｍ
、。

ＭＩＹＡＫＥ、Ｙおよび０ＫＡＤＡ、Ｙ、（１９７９）
：Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｏｆ　１ｉｐｉｄ　ｖ
ｅｓｉｃｌｅｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｈ
ＶＪ（Ｓｅｎｄａｉｖｉｒｕｓ）　５ｐｉｋｅｓ。

Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｏｍｅ　ｐｒｏ
ｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｖｅｓｉｃｌｅｓｃｏｎｔａｉ
ｎｉｎｇ　ｎｏｎｔｏｘｉｃ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ａ　
ｏｆ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｔｏｘｉｎ＋　Ｊ、Ｃｅ１
ｌ　Ｂｉｏｌ、８０：１Ｏ−２０）。

このジフテリア菌変異株Ｃ７（β２２）は、大阪大学細
胞工学センター　細胞工学技術開発部門（大阪府吹田市
山田丘１番３号）に保存されており、同部門から人手で
きる。

本発明においては、ジフテリア毒素のフラグメントＡの
みを産生ずるジフテリア菌変異株Ｃ７（β２２）を使用
するのが好ましい。

次に、本発明に用いるリポソームの調製方法についてジ
フテリア毒素のフラグメントＡを用いる場合を代表とし
て説明するが、細胞の蛋白合成を阻害する他の毒素を用
いる場合も同様にして調製することができる。

本発明に用いるリポソームは、主として燐脂質とコレス
テロールから調製することができる。

燐脂質としては、レシチンを用いることが好ましいが、
これのみに限定されない。　また、これらにフォスファ
ティディール・セリンおよびフォスファティディール・
エタノールアミンを加えてもよい。　燐脂質とコレステ
ロールの混合割合には特に制限はなく、その混合物が低
温（約Ｏ〜１０”Ｃ）でリポソームの形を保つことがで
きる範囲内であればよい。　通常、燐脂質とコレステロ
ールの混合割合は、ｌ：　５〜１：８　（重量）の範囲
である。　　フォスファティディール・セリンおよびフ
ォスファティディール・エタノールアミンを加える場合
の添加量は、コレステロールの１／２〜１／３量、好ま
しくは、１／２量である。

フラグメントＡを含有するリポソームの調製は、燐脂質
、コレステロールおよびフラグメントＡの混合物を０．
５％に非イオン系界面活性剤（例えば、オクチルグルコ
シドあるいはノニデットＰ４０等）を含む少量の０．０
１Ｍリン酸緩衝液（蔗糖を０．２５〜０．３Ｍに含む）
中で良く混合し、次いで透析、ゲル濾過、吸着などによ
って界面活性剤を除去するという通常のリポソーム形成
手段によって行うことができる。

形成したリポソームに封入されなかったフラグメントＡ
は、ゲル濾過により分離することができる。この場合に
、ゲル濾過剤としては、例えば、Ｂｌｏ−Ｇｅ１　＠Ａ
５０ｍ（Ｂｉｏ　Ｒａｄ社）が挙げられる。

この場合、フラグメントＡは、燐脂質に対して通常、１
〜１１５量の割合で添加される。

このようにして得られた細胞の蛋白合成を阻害する毒素
を含有するリポソームは、後天性免疫不全症候群（ＡＩ
ＤＳ）に対する治療、発病予防剤として有効である。　
この目的に使用する場合、その使用方法および使用量は
、毎週１回静脈内投与、１回につき１〜５ｍｆであるが
、適宜増減できる。

ＡＺＴは本発明のリポソーム処理後に残存する細胞由来
または遊離ヒト免疫不全症ウィルス（ＨｕｍａｎＩｍｓ
ｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ：　ＨＩ　Ｖ
　）がウィルレス非惑染細胞へ感染することを阻止し、
本発明の毒素含有リポソームとＡＺＴとの併用療法が後
天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療に特に有効であ
る。

発明の効果 本発明のウィルス感染症治療剤を添加して細胞を培養す
ると、フラグメントＡがウィルス感染細胞内に導入され
、細胞内の全ての蛋白質合成が阻害され、結果的に感染
細胞が破壊される。　重要なことは、その結果、目的ウ
ィルスの増殖が阻止され、感染の拡大が防止されること
である。

本発明のフラグメントＡ含有リポソームはＨ１■非感染
細胞の原形質膜の脂質二重層へは到達しえないが、ＨＩ
Ｖ感染およびＨＩＶ産生細胞の場合にはＨｒＶ感染およ
び／あるいはＨＩＶ産生のために構造変化を生じる結果
、細胞表面の脂質二重層にフラグメントＡを含有するリ
ポソームが到達可能となる為めフラグメンｌ−Ａを含有
するリポソームがＨＩ　Ｖ感染およびＨＩＶ産生細胞に
対して選択的な細胞傷害作用を示すと考えられる。

ＨＩＶのｅｎｖ蛋白を認識する抗ＨＩＶ抗体はＨＩＶ感
染細胞に対するフラグメントＡ含有リポソームの細胞傷
害作用に影響を及ぼさず、このことはＨＴＶ抗体を有す
るＡＩＤＳ患者あるいはＨＩＶ惑染者のＨＩＶ感染細胞
またはＨＩＶ産生細胞をフラグメントＡ含有リポソーム
による治療で破壊することができることを意味する。

ＡＩＤＳ患者あるいはＨｒＶ惑染者のＨＩＶ感染細胞ま
たはＨＩＶ産生細胞は主として血中に存在するので、こ
れらの細胞にフラグメントＡ含有リポソームを作用させ
ることは容易であると考えられる。　このように、本発
明の毒素含有リポソームは、レトロウィルスによる後天
性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に対する治療において優
れた効果を発揮する。　　本発明のウィルス感染症治療
剤は、（１）後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に対す
る治療において優れた効果を発揮する。

（２）非感染正常細胞に悪影響を与えないので、副作用
の危険が少ないなどの特徴をもった優れたウィルス感染
症治療剤である。

次に具体例を挙げ、本発明の代表例としてジフテリア毒
素フラグメントＡ含有リポソームの調製方法について更
に詳細に説明する。　以下の例は、本発明のジフテリア
毒素フラグメントＡを含有するリポソームの調製方法を
例示的に示すものであり、本発明は以下に挙げる例のみ
に限定されるものではない。

ジフテリア毒素フラグメントＡの調整 ジフテリア菌変異株Ｃ７（β２２）を培養した後遠心し
、菌を除いた培養上清を得る。　この培養上清に硫酸ア
ンモニウムを加えてフラグメントＡを沈澱して集め、透
析して硫酸アンモニウムを除き、ＤＥＡＥセルロースに
吸着させてＮａＣ１の濃度勾配で抽出する。　これによ
り殆ど夾雑物を含まないフラグメントＡを得る。これを
さらにＧ１５０を用いてゲル濾過し、最終精製品を得る
。

５１の培養上清から約２０ｍｇの精製品を得る。

、ジフテリア毒素フラグメントＡ含有リポソームの調製 レシチンとコレステロールの５対１（重り混合物を最終
濃度が２ｍｇ／ｍｆとなるように０．０１Ｍトリス・バ
ッファー（ｐＨ７，５）に加える。　これにフラグメン
トＡを１ｍｇ　−５００ｐｇ／ｍ！！となるように添加
する。　以上の混合物をよく撹拌し、ＮＰ４０を最終濃
度が０．５％となるように加える。　ＮＰ４０の代わり
にアルキルフェノール・ポリオキシエチレンエーテル（
Ｔｒｉｔｏｎ＠Ｘ　１００：ロームアンドハース社製）
を加えてもよい。

これらの中性界面活性剤を加えると脂質が可溶化し透明
になる。　　ＮＰ４０を用いた場合は、透析チューブ５
ｐｅｃｔｒａｐｏｒｅ　＠＃　２　（スペクトラム　メ
ディカル　インダストリーズ、インク（Ｓｐｅｃｔｒｕ
ｍＭｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ）
）に入れて透析し、ＮＰ４０を除＜、　　Ｔｒｔｔｏｎ
　＠Ｘ　Ｉ　ＯＯの場合は、Ｂｉｏｂｅａｄｓ＠　Ｓ　
Ｍ　２　（バイオ　ラッド（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）社）を加
えて撹拌し、Ｂｉｏｂｅａｄｓ　＠　　にＴｒｉｔｏｎ
＠Ｘ１００を吸着させて除く。　こうして中性界面活性
剤を除くことによりリポソームが出来上がる。

このリポソームには、フラグメントＡが含まれている。

　　リポソームに含まれなかったフラグメントＡを除く
ためにＢｉｏ−Ｇｅ　１＠Ａ３０ｍ　（バイオラド（Ｂ
ｉｏ　Ｒａｄ）社）を用いてリポソームとフラグメント
Ａに分離する。　得られた精製リポソーム懸濁液はフラ
グメントＡを２−５μｇ　／　ｍ　Ｅの割合で含んでい
る。

以下に、実施例を挙げ本発明を更に詳細に説明する。　
本発明は、以下の実施例のみに限定されるものではない
。

実施例１ 後天性免疫不全症候群（Ａ■Ｄｓ）ウィルス感染細胞に
対する効果 ＨＩＶ産生ヒト細胞Ｍｏ　１　ｔ−４／ＨＴＬＶ−■を
５　ｘ　ｌ　Ｏｈ個試験管に調製し、遠心分離により培
養上清を除いた後、１ｍｌの培地（１０χ牛脂児血清含
有ＲＰＭＩ−１６４０）を加えて細胞浮透液を得た。　
これを０．５ｍｆｆ１ずつ二つに分けた後、一方には０
．３５ｍ　４２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のみ
を、もう一方には予め調製したジフテリア毒素フラグメ
ントＡを含有するリポソーム液０．３５ｍ　ｌ　（フラ
グメントＡの含有量１．４０μｇ）を加えた。　両方と
もＣＯ□インキュベーター（３７°Ｃ５χＣｏ、）にて
１．５時間、静置の後、５ｍｌの新鮮培地（１０χ牛脂
児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０）を加えた。　　１日ご
とに細胞数をカウントし細胞の増殖曲線を得た（第１図
）。

ウィルス非感染細胞Ｍｏ１ｔ−４についても同様の操作
を行った。

ジフテリア毒素フラグメントＡを含有するリポソームを
添加すると、ウィルス感染細胞では、細胞増殖の明らか
な抑制が見られた。

ウィルス非感染細胞では、ジフテリア毒素フラグメント
Ａを含有するリポソームの添加の有無にかかわらず同等
の増殖曲線を得た。　このことからジフテリア毒素フラ
グメントＡを含有するリポソームは、ウィルス感染細胞
に特異的に増殖阻害作用を示すことが明らかとなった。

参考実験 成人白血病ウィルス感染細胞に対する効果ＨＴＬＶ−１
（ヒト成人Ｔ細胞白血病ウィルス■）に感染したヒト細
胞ＭＴ−４に対して、前述の方法により調製したジフテ
リア毒素フラグメントＡを含有するリポソームを用いて
、実施例１と同様の実験を行い第２図に示した増殖曲線
を得た。

この場合も、ウィルス感染細胞では、ジフテリア毒素フ
ラグメントＡを含有するリポソームの添加により、増殖
が阻害された。

実施例２ レシチンとコレステロールのｆｉ合ＩＦＩ（５：１）及
びジフテリア毒素フラグメントＡ　（５ｍｇ）を混合し
た後、これを０．３Ｍ蔗糖含有０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐ　Ｈ７，２）　ｌ　ｍｌ！中、０．５％ノニデット
Ｐ４０で可溶化した。　ついで、０〜１℃で数日間同緩
衝液で透析した後、バイオ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）Ａ
５０ｍによりゲル濾過し形成したリポソームに封入され
なかったフラグメントＡを除きジフテリア毒素フラグメ
ントＡを含有するリポソームを得た。

急性リンパ球性白血病（Ａｃｕｔｅ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙ
ｔｉｃＬｅｕｋｅｍｉａ：　Ａ　Ｌ　Ｌ　）由来細胞Ｍ
ｏ　１　ｔ−４およびＴａ１ｌ−１のＨＩＶ非感染細胞
および産生細胞ならびにＭＴ−４細胞をｌＯ％牛脂児血
清含有ＲＰＭｌ−１６４０培地中で培養した。　この細
胞（最終細胞濃度２．５　ＸＩＯ’個／　ｍ　ｊ！　）
をジフテリア毒素フラグメントＡ（最終３．３３μｇ／
ｍ１．）を含有するリポソーム液（０，１９０ＤＳ、。

７．）および対照として同量のＰＢＳと混合した。　　
３７°Ｃで２時間、振盪しつつインキュベートした後、
ｌＯ％牛脂児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地中で最終
濃度５Ｘ１０’個／　ｍ　ｊ！まで希釈しＣＯ，インキ
ュベーターにより３７℃で培養し、２４時間毎に２日間
細胞数を測定した。　　ＨＩＶとしては、米国で分離さ
れたＨＴＬＶ−Ｉ［［、フランスで分離されたＬＡＶを
用いた（Ｍ、Ｐｏｐｏｖｉｃ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅ
ｎｃｅ。

２２４、　４９７（１９８７）、　　Ｊ、八、Ｌｅｖｙ
　　ｅｔ　　ａｌ、＋　　１ｂｉｄ、＋２２５＋８４０
（１９８４）；　　Ｆ、Ｂａｒｒｅ−３ｉｎｏｕｓｓｉ
　ｅｔ　ａｌ、＋　１ｂｉｄ、＋２２０．８６８（１９
８３）　）　。

結果を第３図に示した。

ＨＩＶ非惑染細胞Ｍｏ　１　ｔ−４およびＭＴ−４（第
３図ＡおよびＥ）に対してジフテリア毒素フラグメント
Ａを含有するリポソームは全く毒性を示さなかったが、
非感染細胞Ｔａ１ｌ−１（第３図Ｃ）に対して微かな増
殖抑制効果が見られた。

ＨＴＬＶ−ＩＩＩ産生細胞（Ｍｏ　１　ｔ−４／ＨＴＬ
Ｖ−１１［）の場合、ジフテリア毒素フラグメントＡを
含有するリポソーム処理２日後、細胞数は対照ＰＢＳ処
理の場合の６．２％までに減少した（第３図Ｂ）、　同
様に、ＨＩＶ産生細胞Ｔａ１ｌ−１／ＬＡＶで４０．０
％（第３図Ｄ）まで減少した。

この結果から、ＡＬＬ−由来細胞はＨＩＶ産生によって
その細胞表面構造がジフテリア毒素フラグメントＡを含
有するリポソームに感受性となることおよびジフテリア
毒素フラグメントＡを含有するリポソームはＨＩＶ産生
細胞に対し選択的な細胞傷害作用を及ぼすことが明らか
になった。

実施例３ ＭＴ−４細胞にＭｏ　ｌ　ｔ−４／ＨＴＬＶ−ｍ細胞培
養液から得たＨＩＶを感染させた。　この細胞を２日間
培養した後、実施例２と同様にジフテリア毒素フラグメ
ントＡを含有するリポソームで処理した。　対照はＰＢ
Ｓで処理した。

次に、細胞をそれぞれ５Ｘ１０’個／ｍｌの濃度に調整
し５μＭのＡＺＴ存在下および非存在下に１０％牛脂児
血清含有ＲＰＭＩ−１６４０中で、３７°Ｃで２４時間
培養した。　それぞれの細胞の活性を（３Ｈ）チミジン
の細胞への取込みにより測定した。　即ち、それぞれの
細胞浮遊液２００μ！の細胞を４０μｃｉ／ｍｆｆ１の
（３Ｈ）チミジン（アマジャム：　２３Ｃｉ／ｍ５ｏｌ
）の１０ａｎで２時間パルス標識した後、ＴＣＡ　（）
リクロロ酢酸）不溶性カウントを測定しく３Ｈ）チミジ
ンの細胞への取込みを測定した。　その結果を第４図に
示した。

即ち、１：リポソーム処理、ＡＺＴ非添加２：リポソー
ム処理、ＡＺＴ添加 ３：リポソーム非処理、ＡＺＴ非添加 ２：リポソーム非処理、ＡＺＴ添加 の各実験郡で、ＨＩＶ感染細胞への（３Ｈ）チミジンの
取込みはジフテリア毒素フラグメントＡを含有するリポ
ソーム処理を施した細胞の場合〔１，２〕、対照ＰＢＳ
処理細胞〔３〕に比し高いことが判明した。　しかし、
ジフテリア毒素フラグメントＡを含有するリポソーム処
理を施しＡＺＴを添加した細胞の場合に最も高い（３Ｈ
）チミジンの取込みがみられた（第４図２）。　この結
果から、ＭＴ−４細胞の細胞表面構造は、ＨＩＶ惑染に
よって本発明のリポソームとの融合に感受性となったこ
とおよび、ＡＺＴは本発明のリポソーム処理後に残存す
る細胞由来または遊離ＨＩＶが非感染ＭＴ−４細胞へ感
染することを阻止することが示唆された。

実施例４ ジフテリア毒素フラグメントＡを含有するリポソーム処
理に対する抗ＨＩＶ抗体の効果について試験を行った（
第５図）。

Ｍｏ　ｌ　ｔ−４／ＨＴＬＶ−ｍ細胞を最終濃度５００
倍希釈ＡＩＤＳ患者血清（ＩＦ力価１：４０９６　）と
３７°Ｃで２時間インキュベートした。

この抗体処理したＭｏ　１　ｔ−４／Ｉ（ＴＬＶ−ｍ細
胞オヨび非処理Ｍｏ　ｌ　ｔ−４／ＨＴＬＶ−ｍ細胞を
前述と同様にジフテリア毒素フラグメントＡ（最終３．
５７μｇ／ｍｊ２）を含有するリポソーム液（最終０．
３３０ＤＳ４゜１１．）で処理した（−・−）。

対照として、ジフテリア毒素フラグメントＡを含有しな
いリポソーム液（最終０．３３０Ｄ、、。、）（−嚢一
）、ジフテリア毒素フラグメントＡ（最終１８６７μｇ
／ｍｌり（−ｍ−）、ジフテリア毒素フラグメントＡを
含有しないリポソーム（最終０゜３３０Ｄｓａｏ−−）
とジフテリア毒素フラグメントＡ（最終１．６７μｇ　
／　ｍ　ｌ　）の混合物（−合一）なら、びにＰＢＳ（
−０−）の４種類の液で同様に処理した。　更に、抗体
非処理の非感染Ｍｏ　１　ｔ−４細胞について同様にジ
フテリア毒素フラグメントＡを含有するリポソーム液お
よびＰＢＳで処理した。　これらの細胞について処理後
４日間、２４時間毎に細胞数を測定した。　結果を第５
図に示した。

ＭＯＬＴ−４／ＨＴＬＶ−１［［細胞に対する細胞傷害
効果は、ジフテリア毒素フラグメントＡを含有するリポ
ソームで処理した場合にのみ観察され（第５図Ｂ）、抗
ＨＩＶ抗体はジフテリア毒素フラグメン）Ａを含有する
リポソームの細胞傷害効果に影響を及ぼさなかった（第
５図Ｃ） 非感染Ｍｏ１ｔ−４細胞に対しジフテリア毒素フラグメ
ントＡを含有するリポソームは毒性を示さなかった（第
５図Ａ）。

実施例５ 実施例４と同一のリポソーム液および４種類の対照液で
処理後３日目におけるＭｏ１ｔ−４／ＨＴＬＶ−１１１
細胞培養液中のウィルス感染価および細胞分画の感染価
をＭＴ−４細胞を用いて１０００倍希釈ＡＩＤＳ患者血
清（ＩＦ力価　１：４０９６）を用いた免疫蛍光法によ
り測定した。　細胞浮遊液を細胞と培養液とに分画した
後、細胞分画はもとの細胞浮遊液と同容の培養液に懸濁
した。　各試料のＴＣＩｎｓ。／ｍｌをＭＴ−４細胞を
用いて測定した。１００ａｆの１ｘｉｏ６個／ｍｅのＭ
Ｔ−４細胞をマイクロプレートのフラットウェルに乗せ
た後、これにそれぞれ段階的に１０倍希釈した同量の前
記試料の培養液および細胞懸濁液を接種した。　次に、
これらを３７°Ｃで５日間培養した後、細胞を塗布し、
冷アセトンで１０分間固定した後、抗ＨｒＶ血清で標識
した。　　５０％終点をＲｅｅｄ　　ａｎｄ　　Ｍｕｅ
ｎｃｈ　　法　（Ｌ、Ｊ、Ｒｅｅｄ、　　Ｈ，Ｍｕｅｎ
ｃｈ、　　Ａｎ＋、Ｊ、ｌＩｙｇ、、２７．４９３（１
９３Ｂ）　）で測定した。　結果を表１に示した。　ジ
フテリア毒素フラグメントＡを含有するリポソームで処
理したＭｏ１ｔ−４／ＨＴＬＶ−ＩＩＩ細胞培養液から
細胞を分離した後の培養液中のウィルス感染価は、フラ
グメントＡを含有しないリポソームとフラグメントＡの
混合物で処理した場合の４．６％に減少した。　細胞分
画に間しては、ジフテリア毒素フラグメントＡを含有す
るリポソームで処理した細胞のＨ）Ｖ感染性は、フラグ
メントＡを含有しないリポソームとフラグメントＡの混
合物で処理した細胞の１．０％に減少した。他の対照液
、フラグメントＡを含有しないリポソーム、フラグメン
トＡおよびＰＢＳで処理した細胞の培養液および細胞の
感染性は、はぼフラグメントＡを含有しないリポソーム
とフラグメントＡの混合物で処理した場合と同等であっ
た。

抗ＨＩＶ抗体処理したＭ　ｏ　ｌ　ｔ　−４／　ＨＴ　
Ｌ　Ｖ−ｍ細胞についても同様の結果を得た。　抗ＨＩ
Ｖ抗体処理したＭｏ　１　ｔ−４／ＨＴＬＶ−ｍ細胞の
培養液については若干低いウィルス感染価を得たが、こ
れは抗体の中和作用によると思われる。

表１ Ｌｉｐ（Ｆｒ、Ａ）　　ニジフチリア毒素フラグメント
Ａを含有するリポソーム Ｌｉｐ　　：フラグメントＡを含有しないリポソームＦ
ｒ、Ａ　ニジフチリア毒素フラグメントＡ

【図面の簡単な説明】

第１図は、ジフテリア毒素フラグメントＡを含有するリ
ポソーム添加がＨＩＶ惑染ヒト細胞Ｍ。 ｌ　ｔ−４／ＨＴＬＶ−ｍ及び非感染ヒト細胞Ｍ。 １ｔ−４の増殖に及ぼす影響を示す図である。 第２図は、Ｉ（ＴＬＶ−１でトランスフォムしたヒト細
胞ＭＴ−４のジフテリア毒素フラグメントＡを含有する
リポソーム添加における増殖曲線を示す図である。 第３図は、ＨＩＶ惑染および非感染Ｍｏ１ｔ−４および
Ｔａ１ｌ−１並びにＨＴＬＶ−１感染ＭＴ−４に対する
ジフテリア毒素フラグメントＡを含有するリポソームの
細胞傷害作用を示す図である。　図中、−合一はジフテ
リア毒素フラグメントＡを含有するリポソーム添加にお
ける細胞増殖曲線を示す。　−〇−は対象ＰＢＳ添加に
おける細胞増殖曲線を示す。　Ａは、ウィルス非感染細
胞Ｍｏ　１　ｔ−４、ＢはＨＴＬＶ−ＩＩＩ産生細胞Ｍ
。 Ｉ　ｔ−４／ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、Ｃはウィルス非感染細
胞Ｔａ　Ｉ　１−１、ＤはＬＡＶ産生細胞Ｔａ１ｌ−１
／ＬＡＶ、ＥはＨＴＬＶ−１感染細胞ＭＴ−４の細胞増
殖曲線を示す。 第４図はＡＺＴ存在下および非存在下でのジフテリア毒
素フラグメントＡを含有するリポソーム添加におけるＨ
ＩＶ感染細胞ＭＴ−４への（Ｈ）チミジンの取込み量を
示す図である。 図中、ｌはＡＺＴ非存在下でのジフテリア毒素フラグメ
ントＡを含有するリポソーム添加、２はＡＺＴ存在下で
のジフテリア毒素フラグメントＡを含有するリポソーム
添加、３はＡＺＴ非存在下での対照ＰＢＳ添加、４はＡ
ＺＴ存在下での対照ＰＢＳ添加における値を示す。 第５図は、抗ＨＩＶ抗体処理および非処理のＨＴＬＶ−
ＩＩＩ産生細胞Ｍｏ　１　ｔ−４／ＨＴＬＶ−ｍのジフ
テリア毒素フラグメントＡを含有するリポソームの細胞
傷害作用を示す図である。 図中、Ａは抗体非処理のＨＩＶ非悪染細胞Ｍｏ１ｔ−４
のジフテリア毒素フラグメントＡを含有するリポソーム
添加および対照ＰＢＳ添加における細胞増殖曲線を示す
、　Ｂは抗ＨＩＶ抗体非処理のＨＴＬＶ−Ｉ１１産生細
胞Ｍ　ｏ　ｌ　ｔ　−４／　ＨＴ　Ｌ　Ｖ−ｍのジフテ
リア毒素フラグメントＡを含有するリポソーム添加およ
び対照液添加における細胞増殖曲線を示す。　Ｃは抗Ｈ
ＩＶ抗体処理のＨＴＬＶ−■産生細胞Ｍｏ　１　ｔ−４
／ＨＴＬＶ−ＩＩのジフテリア毒素フラグメントＡを含
有するリポソーム添加および対照液添加における細胞増
殖曲線を示す。　　−ｍｍはジフテリア毒素フラグメン
トＡを含有するリポソーム添加、−〇−は対照ＰＢＳ添
加、−合一はジフテリア毒素フラグメントＡを含有しな
いリポソームとフラグメントＡの混合物添加、−１−は
ジフテリア毒素フラグメントＡを含有しないリポソーム
添加、−トはフラグメントＡ添加における細胞増殖曲線
を示す。 細胞数（個／ｍｌ） 第２図 培養日数（日） 第４図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）細胞の蛋白合成を特異的に阻害する毒素を含有す
   るリポソームを主成分とする後天性免疫不全症候群治療
   剤
2. （２）細胞の蛋白合成を特異的に阻害する毒素がジフテ
   リア毒素フラグメントＡであることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の後天性免疫不全症候群治療剤