LU84946A1 - Procede de preparation de glycoproteines anti-tumeurs - Google Patents

Description

»

Procédé de préparation de glycoprotéines anti-tumeurs.

La présente invention concerne un procédé de préparation d’une glycoprotéine anti-tumeur ayant un poids moléculaire inférieur à celui d’une glyco-5 protéine anti-tumeur de départ, ce procédé consistant à réduire le poids moléculaire d’une glycoprotéine anti-tumeur ayant un poids moléculaire important par ς traitement avec un agent réducteur, puis récupérer, du - ' mélange réactionnel, des glycoprotéines anti-tumeurs 10 ayant des poids moléculaires réduits.

^ i En dépit du fait que de nombreux agents thérapeutiques pour les tumeurs ont été présentés jusqu’à présent par un certain nombre de chercheurs dans le monde, le taux de guérison des tumeurs par ces 15 agents thérapeutiques est encore très faible et l’on cherche activement à élaborer d'autres agents thérapeutiques améliorés.

Un objet de la présente invention est de fournir un procédé de préparation de glycoprotéines 2 0 anti—tumeurs·

Un autre objet de la présente invention est de fournir un procédé de préparation de glycoprotéines anti-tumeurs ayant des poids moléculaires inférieurs à partir d’une glycoprotéine anti-tumeur ayant un poids 25 moléculaire supérieur.

Un autre objet de la présente invention est de fournir un procédé en vue d’obtenir la glycoprotéine ί ’ CBy avec un haut rendement.

Un autre objet encore de la présente inven-30 tion est de fournir un procédé en vue d’obtenir la Ä glycoprotéine CB.^ avec un haut rendement.

Un autre objet, de la présente invention est de fournir un procédé en vue d’obtenir la glycoprotéine CB_„ avec un haut rendement.

. ^ I' \ 2 « |- |s » ; La présente invention fournit un procédé de préparation d'une ou de plusieurs glycoprotéines anti-tumeurs ayant des poids moléculaires inférieurs i à celui d’une glycoprotéine anti-tumeur de départ, 5 ce procédé consistant à faire réagir une glycoprotéine anti-tumeur ayant un poids moléculaire supérieur avec j 1 un agent réducteur, pour obtenir ensuite, à partir du ; mélange réactionnel, les glycoprotéines anti—tumeurs ,ç - ayant un poids moléculaire réduit.

;J *· j 10 Grâce au procédé de la présente invention, | on peut obtenir, avec un haut rendement, une glyco- ! protéine anti-tumeur CB d’un poids moléculaire désiré.

i Concevant que les cellules réticulo-endo- | 1 théliales jouant un rôle important dans le mécanisme 15 biophylactique pouvaient probablement produire une substance permettant de guérir les tumeurs, la Deman— , deresse a entrepris de longues études continues et ! intensives sur ce sujet. Récemment, la Demanderesse a découvert quatre types de glycoprotéines anti-|j 20 tumeurs ayant des poids moléculaires différents et provenant d’un extrait ou d’un produit surnageant de ; culture de cellules réticulo-endothéliales, de lympho- j blastes, de cellules leucémiques ou de fibroblastes ! d’animaux à sang chaud et elle les a désignées par les !; 25 appellations 11 Carcino-Breaker X (poids moléculaire : 12.000-17.000), X^ (poids moléculaire : 70.000-90.000), X0 (poids moléculaire : 4-0.000-50.000) et X (poids !' moléculaire : 7*000-9.000)" (voir demande de brevet luxem— p^. bourgeois 84.662 du 25.2.83 et la demande de brevet des Ί ? p 30 Etats-Unis d’Amérique n° 467.840 déposée le 18 février 1983 l ces glycoprotéines sont désignées ci-après par ;i les appellations 0Βχ, 0Βχι, CBX2 CBX3 resPec‘tivenie:ri'fc' et, dans le cas où elles sont mentionnées inclusivement, elles sont désignées par l’appellation CB).

/ Λ i ‘ ; r v » 3

Etant donné que les glycoprotéines CB^^-CB^ • sont présentes en mélange dans un extrait ou un produit surnageant de culture de cellules réticulo-endothéliales, de lymphoblastes, de cellules leucémiques ou de 5 fibroblastes d1 animaux à sang chaud, il a été très „ difficile d1obtenir efficacement et exclusivement un carcino-rupteur (en anglais : Carcino-Breaker) ayant s un poids moléculaire désiré, en particulier, la glyco- - c. protéine ayant un poids moléculaire inférieur, c’est- 10 à-dire CB„ ou CB, , en une quantité importante, •Λ. Aj ; La Demanderesse a entrepris des études pous- ; sées dans le but de trouver un procédé efficace en vue d*obtenir et de purifier les glycoprotéines CB^, CB^ i et/ou CB et, suite à ces études, elle a découvert -a.3 15 que, moyennant un traitement de dégradation d’une glycoprotéine anti-tumeur (c’est-à-dire un carcino-rupteur) provenant d’un extrait ou d’un produit surnageant de culture de cellules réticulo-endothéliales, \ de lymphoblastes, de cellules leucémiques ou de fibro- j . 20 blastes d’animaux à sang chaud avec un agent réducteur, | on pouvait obtenir, à partir de ce mélange réactionnel : liquide, une glycoprotéine anti-tumeur ayant un poids ! moléculaire de 40.000-50.000, c’est-à-dire CB-^j 11116 ! glycoprotéine anti-tumeur ayant un poids moléculaire \ 25 de i2.OOO-i7.OOO, c’est-à-dire 0Βχ et/ou une glyco protéine anti-tumeur ayant un poids moléculaire de 7.000-9·000, c’est-à-dire CB^ et ce, aisément et avec j ' un haut rendement, aboutissant ainsi à la présente invention.

! 30 Les expressions 11CB^., CB^q , CB.^ et CB^’1 > j utilisées dans la présente spécification, sont les glyco- j protéines anti-tumeurs (carcino-rupteurs) décrites dans 3e ; paragraphe précédent et ayant les propriétés suivantes : i //\ i i v » » 4 α>χ : (1) Poids moléculaire : 12.000-17-000 ; (2) Réactions chromogènes : coloration indiquant la présence de protéines dans la réaction de 5 Lowry,' coloration indiquant la présence de liaisons peptide et d’acides aminés dans la réaction à la nin-hydrine après hydrolyse avec l’acide chlorhydrique et coloration indiquant la présence de sucres dans la - réaction au phénol/acide sulfurique, la réaction à 10 1 ’anthrone/acide sulfurique, la réaction à l’iiidole/ u; acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique ; (3) Aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et 15 un tampon de phosphate, et peu soluble dans le benzène l’hexane et le chloroforme 3 (4) Teneur en sucres : 27-33$ dont 17—20$ d’hexoses, 5-7% d’hexosamines et 5-6$ d’acides sialiques ;

20 (5) Point isoélectrique : 4>3—7*3 J

(6) Capacité d’adsorption : adsorbable sur Sephadex conjugué à l’agglutinine Ulex europeus dans un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7*2) ; (7) -Stabilité : stable dans une solution 25 aqueuse d’un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant 24 heures ou plus, ainsi que dans une solution aqueuse d’un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus 5 (8) Cytotoxicité : détruit sélectivement \ les cellules tumorales sans endommager sensiblement 30 les cellules normales 5 et ** (9) Différenciation : provoque une diffé renciation des cellules tumorales, c’est-à-dire qu’elle rétablit les cellules tumorales en cellules normales.

/λ * ' \ ν' ί 5 ; * I CBX1 = ί (l) Poids moléculaire : 70*000-90.000 ; | (2) Réactions chromogènes : coloration in- 1 diquant la présence de protéines dans la réaction de 5 Lowry, coloration indiquant la présence de liaisons peptide et d’acides aminés dans la réaction à la nin— j hydrine après hydrolyse avec l’acide chlorhydrique et ! coloration indiquant la présence de sucres dans la ~ réaction au phénol/acide sulfurique, la réaction à ; 10 l’anthrone/acide sulfurique, la réaction à l’indole/ [ V acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique $ (3) Aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans !’eau, le chlorure de sodium aqueux et 15 un tampon de phosphate, et peu soluble dans le benzène, l’hexane et le chloroforme j (4) Teneur en sucres : 35-45$ dont 23-28$ d’hexoses, 8-11$ d’hexosamines et 4-6$ d’acides siali- ! , ques 5 i 20 (5) Point isoélectrique : 4*3-6,2 ; (6) Capacité d’adsorption : adsorbable sur Sephadex conjugé à l’agglutinine Ulex europeus dans un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7*2) ; (7) Stabilité : stable dans une solution ; 25 aqueuse d’un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant 24 heures ou plus, ainsi que dans une solution aqueuse d’un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus j et (8) Cytotoxicité : détruit sélectivement ΐ ^ les cellules tumorales sans endommager sensiblement 30 les cellules normales.

' * PR * ; °ßX2 * ! (l) Poids moléculaire : 40.000 - 50.000 5 (2) Réactions chromogènes : coloration indiquant la présence de protéines dans la réaction de 35 Lowry, coloration indiquant la présence de liaisons t i i__.

* 6 h peptide et d’acides aminés dans la réaction à la nin-hydr.ine après hydrolyse avec l’acide chlorhydrique et coloration indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/acide sulfurique, la réaction à 5 l’anthrone/acide sulfurique, la réaction à l'indole/ acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique ; (3) Aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et 10 un tampon de phosphate, et peu soluble dans le benzène, V l’hexane et le chloroforme : •w * (4) Teneur en sucres : 30-37/» dont 20-23$ d’hexoses, 6-8$ d’hexosamines et 4-6$ d’acides sialiques ; 15 (5) Point isoélectrique : 4,2-7,3 ; (6) Capacité d’adsorption : adsorbable sur Sephadex conjugué à l’agglutinine Ulex europeus dans un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7,2) ; (7) Stabilité : stable dans une solution 20 aqueuse d’un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant 24 heures ou plus, ainsi que dans une solution aqueuse d’un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus ; et (8) Cytotoxicité : détruit sélectivement les cellules tumorales sans endommager sensiblement 25 les cellules normales.

CBX3 : (1) Poids moléculaire ï 7*000-9*000 5 (2) Réactions chromogènes : coloration in-diquant la présence de protéines dans la réaction de 30 Lowry, coloration indiquant la présence de liaisons % peptide et d’acides aminés dans la réaction à la nin- hydrine après hydrolyse avec l’acide chlorhydrique et coloration indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/acide sulfurique, la réaction à 35 l’anthrone/acide sulfurique, la réaction à l’indole/ » 7 acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique ; (3) Aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et un 5 tampon de phosphate, et peu soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme ; (4) Teneur en sucres : 8-15% dont 6-10% d'hexoses, 1-2%, d'hexosamines et 1-3/= d’acides siali- 7 ques } 10 (s) Capacité d’adsorption : adsorbable sur la carboxyméthyl-cellulose dans une chromatographie d’échange d'ions en utilisant la carboxyméthyl-cellulose dans un tampon de phosphate 0,05M (pH : 6,4) j (6) Stabilité : stable dans une solution 15 aqueuse d'un pH de 2, de 7 de 11 à 4°C pendant 24 heures ou plus, ainsi que dans une solution aqueuse d'un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus ; (7) Cytotoxicité : détruit sélectivement les cellules tumorales sans endommager sensiblement 20 les cellules normales et (8) la séquence d'acides aminés de la terminaison N de la fraction protéique est : Alanine-Alanine-,

La présente invention est généralement 25 mise en oeuvre de la manière suivante : on dissout une glycoprotéine anti-tumeur CB ayant un poids moléculaire supérieur au poids moléculaire désiré (que l'on a séparée et purifiée à partir d'un extrait de cellules ou ^ d'un produit surnageant de culture) à une concentra- 30 tion appropriée, par exemple, de 10-10,000 jîg/ml et L on la soumet a un traitement de dégradation en faisant réagir une quantité appropriée d'un agent réducteur.

On soumet le mélange réactionnel à une dialyse, on relargue le dialysat et, par filtration, on sépare 35 les précipités formés. Ensuite, on dissout ces préci- b » 8 pités dans une petite quantité d'une eau physiologique ou d'une solution tamponnée et, après dialyse, ,j on soumet la solution à une filtration en gel en uti— jj lisant "Sephadex G—50" pour obtenir une glycoprotéine li Π 5 anti-tumeur ayant le poids moléculaire désiré.

i : L'expression "traitement de dégradation", utilisée dans la présente spécification, désigne un traitement de transformation d'une glycoprotéine ayant ~ un poids moléculaire supérieur en une glycoprotéine 10 ayant un poids moléculaire inférieur par rupture chi-- mique des liaisons intramoléculaires telles que des i i liaisons disulfure.

,1 ; La matière de départ de la présente inven- ’ tion est avantageusement CB^ ou CB^ t encore que l'on 15 puisse également utiliser CB^. lorsque CB^ constitue le produit désiré. Bien que, comme matière de départ, il soit préférable d'utiliser une solution des glyco-:! protéines CB^ et/ou CB^ purifiées dans un tampon, ii ' de l'eau physiologique, de l'eau distillée, etc., on !j 20 peut également utiliser un extrait de cellules ou un • 1 ' produit surnageant de culture contenant une glycopro— ( ; h téine CB telle quelle.

La glycoprotéine CB peut être obtenue à partir d'un extrait ou d'un produit surnageant de cul— 25 ture de cellules réticulo-endothéliales, de lymphoblastes, de cellules leucémiques ou de fibroblastes d'animaux à sang chaud. Les détails relatifs au procédé de préparation et à l'effet anti—tumeur d'une gly- • coprotéine CB sont décrits dans la demande de brevet I 30 des Etats-Unis d'Amérique n° 467·84·0 déposée le 18 i février 1983· La description de cette demande de brevet est mentionnée ici à titre de référence.

Parmi les agents réducteurs pouvant être utilisés suivant la présente invention, il y a, par 35 exemple, les composés thiols tels que le 2-mercapto- i ( 9 t éthanol, le dithiothréitol, le dithioérythritol, l'acide thioglycolique, 1_'acide monothiophosphorique, etc», les complexes de métaux et d'hydrogène tels que le borohydrure de sodium, les phosphines tertiaires 5 telles que la tri—n—butyl—phosphine, la tris—diéthyl— amino—éthyl—phosphine, etc., les sulfites tels que le sulfite de sodium, les sels de l'acide cyanique tels = que le bromure de cyanogène, les ions de métaux tels que l'ion argent, etc.j ces composés sont ceux générait) lement utilisés pour la décomposition et l'élimination d'impuretés protéiques de poids moléculaire élevé, pour la dégradation d'une structure dimensionnelle supérieure d'une protéine et l'analyse de la structure de base de cette protéine, etc. Les protéines trai-15 tées avec ces composés perdent souvent leur activité biologique, mais il est surprenant de constater que, suivant la présente invention, le traitement de dégradation est possible sans qu'il y ait une perte de s l'activité anti-tumeur.

20 Les conditions pour la mise en oeuvre de la présente invention, par exemple, la concentration de l'agent réducteur, la température de traitement, le temps de traitement, le pH de traitement, etc., peuvent être choisies d-'une manière appropriée suivant le but 25 envisagé, par exemple, selon que l'on veut obtenir CBY ou CBY individuellement ou qu'on veut les obtenir toutes deux simultanément, etc. L'agent réducteur peut -1-9 être utilisé en une concentration de 10 — 10 M, ^ de préférence, par exemple, le 2-mercapto-éthanol 30 10 10“^ M, le dithiothréitol 10 ^-10 ^ M, le dithio- 2» 6 ^ érythritol 10“ -10~ M, l'acide monothiophosphorique —1 f\ —2 —ζ 10“ -10“ M, le borohydrure de sodium 10“ -10~° M ou l'acide thioglycolique 10~^-10~^ M. La température de traitement n'est pas particulièrement limitée pour 35 autant que la glycoprotéine ne subisse pas une dénatu- / / /-χ » · 10 j · ration j on peut avantageusement adopter une tempé-1 rature de 0-37°C, de préférence, une température ambiante d’environ 15-25°C. Le temps de traitement j peut être choisi d’une manière appropriée pour obte- j 5 nir une glycoprotéine CB ayant un poids moléculaire j , désiré, ce temps de traitement se situant générale- j j ment dans l’intervalle allant de 10 minutes à 2 heures.

! , ,

De preference, le pH se situe entre un pH faiblement acide et un pH neutre, c’est-à-dire entre environ 10 5,5 et 7,5.

De plus, lorsqu’on effectue le traitement de dégradation, afin d’améliorer le rendement, il est préférable que le mélange réactionnel contienne un j ! agent tensio-actif, par exemple, un agent tensio—actif 15 ionique tel que le dodécyl-sulfate de sodium, un agent I tensio-actif non ionique tel que nTriton X”, etc. La concentration optimale de l’agent tensio-actif varie suivant la matière de départ intervenant dans le traitement de dégradation et elle se situe judicieusement 20 dans l’intervalle allant de 0,001 à 10%. Parmi les agents tensio-actifs ioniques, il y a les agents tensio-j actifs anioniques, cationiques et amphoteres. Parmi ij les agents tensio-actifs anioniques appropriés, il y ; a, par exemple,· le dodécyl-sulfate de sodium, le sel ; 25 de l’acide cholique, etc. Parmi les agents tensio- actif s cationiques appropriés, il y a, par exemple, le bromure de dodécyl-triméthyl-ammonium, etc, et, • * parmi les agents tensio-actifs amphoteres appropriés, j il y a, Par exemple, la déoxylysolécithine, etc. Par— ; 30 mi les agents tensio-actifs non ioniques appropriés, ; ~ il y a, par exemple, les agents tensio-actifs “Triton", ] ceux de type "Tween", ceux de type ’'Span”, etc. On : peut utiliser les agents tensio-actifs individuelle ment ou sous forme de mélanges.

j 11 h t

La présente invention sera décrite plus · particulièrement par les exemples non limitatifs ci- i ' après.

Exemple 1 5a) Préparation des matières de départ

On a préparé des glycoprotéines CB de poids ; moléculaire supérieur (c’est-à-dire CB^, CB^ ^B^) j ' utilisées comme matières de départ dans les exemples 1-7.

; ‘ 10 On a mis des lymphocytes humains (2 x 10*^ j > cellules) en suspension dans 4.000 ml de milieu d1 Eagle contenant 10$ de sérum de veau et, après addition de ! phytohémagglutinine ("Difco Co.") à une concentration

! finale de 50 ^ig/ml, on a procédé à une culture à 37°C

| 15 pendant 48 heures dans une atmosphère à 5% de CO2 et ! a 95% d’air. Ensuite, le produit surnageant du milieu j de culture a été soumis à une dialyse contre un tampon

Ide phosphate 0,01M (pH : 7*2) et, à partir du dialysat, on a obtenu une fraction relarguée avec 40—80$ de sul— 20 fate d’ammonium. On a redialysé cette fraction contre ce tampon de phosphate, puis on l’a soumise à une filtration en gel en utilisant "Sephadex G—100" I ("Pharmacia Co.").

I On a- obtenu les glycoprotéines brutes CB^q * p 25 CB^ ^®X en ^30^0115 ayant des poids moléculaires de 70.OOO-9O.OOO, 4Ο.ΟΟΟ-5Ο.ΟΟΟ et i2.OOO-i7.OOO respectivement .

‘ On a adsorbé la glycoprotéine brute CB^ :sur Sephadex conjugué à l’agglutinine Ulex europeus j 30 ("Maruzen Oil Co.") et on l’a éluée avec un tampon de I = phosphate 0,01M contenant du fucose 0,5M. Après éli- j j mination du fucose par dialyse, on a à nouveau adsorbé la glycoprotéine CB^ sur Sephadex conjugué à l’agglutinine Ulex europeus, puis on a procédé à une élution 35 par un procédé à gradient en utilisant un tampon de / / ! 12 fr phosphate (pH ï 7j2), éluant ainsi la glycoprotéine CBxi purifiée. En une opération, on a obtenu la glycoprotéine CB purifiée ayant une activité spécifi— Λ1 que de 50.000 unités/mg en une quantité totale de 5 5.000 unités· . On a purifié la glycoprotéine brute 0Βχ2 de la même manière et, en une opération, on a obtenu la glycoprotéine purifiée 0Βχ2 ayant une activité i spécifique de 20.800 unités/mg en une quantité totale ; 10 de 5·200 unités.

- On a également purifié la glycoprotéine brute CB de la même manière et, en une opération, on ai.

a obtenu la glycoprotéine purifiée 0Βχ ayant une ac— i tivité spécifique de 10.000 unités/mg en une quantité 15 totale de 10.000 unités. On a également obtenu la glycoprotéine purifiée 0Βχ ayant une activité spécifique de 7*500 unités/mg en une quantité totale de ί I50 unités à partir du même nombre de lymphocytes I . humains, puis en effectuant le même procédé, avec 20 cette exception que le milieu de culture ne contenait pas de phytohémagglutinine.

j: Dans la présente spécification, l'activité |· est exprimée en se basant sur la concentration inhi— j: bant 50$ de la prolifération de 10^ cellules KB, 25 prises comme une unité.

b) Traitement de dégradation

On a dissous 200.000 unités de la glyco- j: j’ ' protéine 0Βχ^ (poids moléculaire : 70.000-90.000) dans [i \ de l’eau physiologique et on a fait réagir pendant une I 30 heure à la température ambiante en présence de 2-mer- \ - capto-éthanol 5 x 10~^ M. Après la réaction, on a ï ? dialysé le mélange réactionnel et on l’a relargué avec

V

80/o de sulfate d’ammonium^ puis par filtration, on a séparé la fraction précipitée. On a dissous cette 35 fraction dans de l’eau physiologique et on l’a soumise » v * » 13 s.

* à une filtration en gel en utilisant "Sephadex G-50".

On a recueilli les fractions correspondant aux poids moléculaires de 40.000-50.000 ; 12.000-17.000 et 7.000-9.000 et on les a désignées par les appella- 5 tiens "fraction A" 9 "fraction B" et "fraction C" respectivement. On a également répété les procédés ci-dessus en présence de 0,05% de dodécyl-sulfate de sodium et l’on a obtenu les mêmes fractions.

On a examiné les propriétés physicochimi- 10 ques de ces fractions A, B et C et on les' a identi— ; ; fiées comme CBV„, CBV et CBV_ respectivement. Les 1 * X A3 i, résultats sont repris dans le tableau 1.

i»· 14 k <d H *

•1 H

. Π5 v

1 r—I O

4 do HO

4 O O O d H

*1 '0) · -h

5 d H O *0 W

| O O CO O d î *H H ! M 03 d I -P co ·ΰ

3 O 05 O O O

1 ce *0 O *c O

;! U -H O H

m fr« o · ¢) ,q ;ïï ΛΝ d d 1 - —__d h

If do iïî ·· o te 1 3 r-1 M -, α> Λ d 4 d ü G) 1 d O ^

ΐ rH /—v H -P

ι* - do oo I co ο o ·» g 5 ό o d ·» d ^

J O ßrl · d Ο ο O

1 ο ΟΝ X O-peu T3 ^ 4 IHHiHCQ^dO "ri ^ m i -P I o H d 45 to o ’ < ü ffi O (d O Cd '0 i ¢-00 05 05 H O c .p ; 1 w d -h o c ο λ a -h - a d fri o · ccjoo h -h

Ο Λμ Oft 05 d H

H '-'tH O d s ✓—V V

’ : -P .____00H 003 05 05 05 05 050 î 2 H Ό 050 O O O Ö ü Ό |j t ? " rO -p-ri-Üddddd

IM d ddO dHüOOOOtP

*n P0 HO -riOdddddß d O & O Hdfl5 05 05 U3 05ft W H^ COEd ^ ^ w w d o d d H i—1 o o -p w do £ 0 05 <J o · O d ,d

ο ό o d d — -P

d d h 10 d h a> s< CTOOcNH-p rH i 1 1

£ H -H e 1 Jx; 43 O ·» O -H d *H O O

1 E-PC0 O -H d O ddd

I H ÎiJS2OQ)yc i>faDÎ> -p W) -P -p O

£ H d H O d p /0 O O O O O CÖ 1—i

1 2 ^ H 0 SdddddHddH05O

" £ d* g * d d d o 0) ÿ-p »-p od-po-wo y (do O D* O HH dtt Hei -H d <d ·Η d d

H '“Ή Ρ-ιΡ,Ο C0 PQ CO te CO Ό î> CO 05 î> bi) H

I b---:--- *—( ft ί . 05 -h ,5 t S § f| -P dH 10

i>W r H Ό H HH

i-5 d H fai d O d H

j d1 H O 05 Ο Ό 03 O

f ? -d h d I« « d d O ^ O o^-s O -'vr-s

η H OH d 1-1 Ό OtN ßc4 H OiM

Ji . HO JC o H d O \ O H d o ,£] 1 ·ρκ odo^dHdo-vdd # d h d o er o cr dis æ u1 :Ü o 43 ‘10 d \ d H -PH \0 ÛH^ ; S -n 0 d 1-1 H H o d JC d O p O d co H h o î>> dd eudHed-Pdfr'

S H -p H d x CM ,d H d l·! OH ftCu H

2 B 2 -P £ d'OO -pH dH H d >>H H

o d g ooHÆdddidddddo

B d & GOlZIfcD'Cai SKHOEhoîC

<1 H 05 Ό H _H <_ci_ / 15 t

·· I

Q) 0 i g

P cfl C i—i ß I

H H d M 0 -P Ö Λ-ν ü β

« C* ®C«ü ÎTf *d B

r. h o t< i œ-ri oh i c « > d s

u 3 O iHßÄ-rl h3îo do O

_ P o to^cca-.pi^a ο -h *d s , JT ^ x fl c ΐ c æ i6 K - oo -pœ o

OH θ' ^ K (D p d (5 4) β o - O- d d O

•HO 100¾¾.¾¾. H'O O büß ffi'OCdd i—j J—i •psi T-iT-t<sco 5 £ œ o bD-H s *o o. d. ο ο o. m ^ . c >> o -p ch î>5 '-'i'oœ d CCtOO II II .QXHßß-HXCO d ß u o t< o d sd-P o Eflg co •'üo ω

Ci.-H O 00 vO ή t-i OJOH O O dd Ο Ό ·» Md Ο* 03 d H d Ό d H d O vD plO 03 d<i>- oued- dcdo ^ ο 0 ο

w <ΟΟΟΌΟΟΗα.Ο Ό 03 d H

----d d es

·· ïd ο ο P

m &Ό- o P · s te "C* c -P co do

H g ^ dû -p H

O g - P> ß WHO ✓tfld·' fl Iß ß ® g P· tv. co d es öd

d O ^ 'È '03 œ *» O H fl HO

oo η co o ^ ^ d β ·· i» n. d d d

•HH co M t Ό 5 β d ûH

oSI.i..d'0!5 i û d a h w P £ i I I I ό o. do co «o d W ^ M O O oh

d 03 O N N Lf) CO od ^ (5 J) O H

WOOMtH O O H" û O KH

*" · ^ Çp *d dpvoûH

ON x P O O d H û W’-* û d ·Η û *ß ü w Ό d o 43 ,£ß 43 “--. dû - d N fi in

·· Λ . û H H- O O

fl) g ^ H ON ® £H

û û û CC iß »C Q) fß'-' tOHÄ 43 [> 43

Hg Od. ûdtd-Hd <ho d û ο ΡΌοε _p·^ od d Λ ,ddoo

d û O ¾¾. ’Çj^. H d. CO K O d H i I

O'IIO) N N ^ ^ D β ^ d d.- M» J2 •HH co M 00 vO H H û N ij d Kl ·Η ηοι ^43ό -ο o œ üS lIllßd I o G) 43 β 030 ,QHd û'chOS-HÛ PCOOOOVOH-Pÿo MH ddw ü.'dOcOM 0 bD d. η ,ο ,ß 0 £ ’oh - ® ce d -p d

OO *0~ß 4) h ü1 '0 (D

<. Η -p t/} τ-ι β n bD

c ^ 0 vo •H Û ^ -p d “· 7" a c·

P » K d H

-P Û 0) o C

H d d 03 43 ^

t ? 2 P* *Ö ü vO

® d -H cs 0 Ό

' ' W K H — r-J IJ

Û ß *0 '0 Ή 5 C H O '0 ü

ö 0 „ H m '0 03 -p -H

W K £ 43 -Η Η X

< d Ο ß 03 -H Ϊ g dttKÛ Ο 43 Η ^ Ή 000*0 β β ο Η S c χ χ -η α -Η b -p ^ ,Ρ ,Ρ ,2 ® Ο 4> ï>> H Ht-idß<5 O PiCGÜ / / — 16 j · i ! i 1) Suivant le procédé de Seikagaku Jikken Koza, | volume 1 (Tanpakush.itsu Teiryohou) , 1971» j: 2) Suivant le procédé de Seikagaku Jikken Koza, j volume 4 (Toshitsu Teiryohou), 1971· i | 5 3) Suivant le procédé de Seikagaku Jikken Koza, volume 3 (Shishitsu Teiryohou), 1971· 4) Spiro, H.A., Methods in Enzymology, volume 8, j ' pages 3-26, I966.

5) Xso-électrofocalisation en utilisant "Ampholine11 .! ‘ 10 (marque commerciale déposée de 11LKB—Produkt er ABn, j Suède).

i 6) On a cultivé 10^ cellules dans un ml de milieu I d1Eagle contenant 10$ de sérum de veau et chaque fraction à 37°C pendant 48 heures 15 dans une atmosphère à 5^ de CO2 et à 95$ d*air, après quoi on a compté le nombre de cellules viables non colorées par le bleu "Trypan" et, comme mesure de la cytotoxicité, on a pris la concentration de la fraction à laquelle 50$ des cellules i 20 sont tuées.

; Le rétablissement de 1» activité de chaque fraction de 1*exemple 1 est indiqué dans le tableau 2.

ί /λ \ w J 17 ' ί! 1¾ I] TABLEAU 2 !| . g a Traitement de Activité (unités) I dégradation 0Βχι 0Βχ2 CB^ CB^ ;] 5__ 1 Avant le trai- ' 1 ! tement 200.000 - - - Ü | ' Traitement au | 2-mercapto- 0 10.000 160.000 15.000 ! 10 éthanol

J

I Traitement au !2-mercapto- éthanol j + ' 15 traitement au 0 5*000 150.000 25.000 dodécyl-sulfate ] de sodium ‘__ i! - ί 20 Exemple 2 I On a dissous 200*000 unités de la glyco- ! 1 i j protéine 0Βχ2 dans de l’eau physiologique et on a j fait réagir pendant une heure à la température ambian- i , _-7 ] te en présence -de 2-mercapto-éthanol 5x10 'M. Après ^ 25 la réaction, on a dialysé et relargué avec du sulfate i d’ammonium pour obtenir une fraction que l’on a sou- ] mise à une filtration en gel en utilisant "Sephadex ,i G—50". On a recueilli les fractions ayant des poids '3 " moléculaires de 12.000-17.000 (fraction B) et de 1*3 s jf 30 7*000-9.000 (fraction C). On a également répété les !« j procédés ci-dessus en présence de 0,05^ de dodécyl- .1 sulfate de sodium. De la manière décrite à l’exemple ) 1, il a été déterminé que les fractions étaient 0Βχ et CB . Le rétablissement d’activité des glycopro- , A3 j 35 téines CBV et CBvo obtenues est indiqué dans le ta- ΐ A A3 j I / , 18 k ? bleau 3.

j TABLEAU 3

K

| ___ ï! Traitement de Activité (unités) si ________ ;! 5 dégradation CB^ CB^. CB^ rj . _ I j | Avant le trai- 1 - tement 200.000 — — i : ; Traitement au j 10 2—mercapto- j ·. éthanol 0 170.000 20.000 ! Traitement au 2—mercapto-éthanol ! 15 + traitement au 0 140,000 37*000 dodécyl-sulfate i de sodium I --—-- I 20 Exemple 3

On a traité 200.000 unités de la glyco— I _η

*1 protéine CBY avec du 2-mercapto-éthanol 5 x 10 'M

I et, de la même manière qu’à l’exemple 1, on a obtenu ^ une fraction d’un poids moléculaire de 7*000—9*000 h 25 (fraction C). Comme décrit à l’exemple 1, la frac- :i tion a été identifiée comme glycoprotéine CBY„. Le

rétablissement d’activité de la glycoprotéine CBY<J

1 1 $ * obtenue est indiqué dans le tableau 4* r ' il ' if ' if] h

II

Ί

Si • *1 ! "* 1 TABLEAU 4 1.

19

Traitement de Activité (unités) ri dégradation CB^ Î! 5 ______

Avant le traitement 200.000 —

Traitement au 2- mercapto—éthanol 110.000 5^.000 S 10 Traitement au 2— I * mercapto-éthanol ;ï traitement au dodé- y | cyl-sulfate de sodium 90.000 73*000 ' 15 ____ : Exemple 4

De la même manière qu’à l’exemple 1^ on || a traité un mélange de 100.000 unités de la glyco— ij protéine CBV1 et de 100.000 unités de la glycopro- b XI ^»7 | 20 téine CB^ avec du 2-mer capto -éthanol 5 x 10 'M* ; Le rétablissement d’activité des glycoprotéines 0Βχ2, ICB et CBY obtenues est indiqué dans le tableau 5« TABLEAU 5 25 Traitement de Activité (unités) dégradation 0Βχ^ 0Βχ9 CB^, CB^ ; Avant le irai— 100.000 100.000 — - r tement ii 30 Traitement au 2— 0 20.000 150.000 20.000 F, ' mer capto-éthanol •ri '1 Traitement au 2- mercaptoéthanol + 0 3*000 140.000 42.000 traitement au do- 35 décyl—sulfate de sodium -"Λ

-V

20 5 >. .

i - _

Exemple 5 i j De la même manière qu'à l'exemple 1a on a 1 traité un mélange de 100.000 unités de la glycoprotéi— "1

! ne CB . et de 100.000 unités de la glycoprotéine CBY

•j - ·Λ.Ί ^ A

1 5 avec du 2-mercapto-éthanol 5 x 10 'M, Le rétablisse-

j ‘ ment d'activité des glycoprotéines CBY„} CBY et CBY

obtenues est indiqué dans le tableau 6.

! * TABLEAU 6 1 \ f “ —— 1 |î 10 Traitement de Activité (unités) N dégradation 0Βχ^ 0Βχ2 0Βχ 0Βχ.

:1 il -----——-- il Avant le trai- i j tement 100.000 — 100.000 - v 15 Traitement au 2- . mercapto- ;| . éthanol 0 19.000 130.000 40.000 i Traitement au 2- j: mer capto-éthanol j 20 + 0 7.000 120.000 57-000 traitement au

Idodécyl-sulfate de sodium 25 Exemple 6

De la même manière qu'à l'exemple 1t on a jj traité un mélange de 100.000 unités de la glycopro— IJ téine CB„ et de 100.000 unités de la glycoprotéine 1 Jfv? x , „7 •s . ®χ2 avec Ou 2-mercapto-ethanol 5 x 10 M. Le réta- 130 blissement d'activité des glycoprotéines 0Βχ et CB^ obtenues est indiqué dans le tableau 7· & 21 TABLEAU 7 : Traitement de Activité (unités) | dégradation CB^ CB^ \ 5__ . Avant le trai- ; tement 100.000 100.000 0 : Traitement au 2- mercapto-éthanol 0 120.000 65.000 ; 10 Traitement au 2- ! v mercapto—éthanol + 0 90.000 77.000 traitement au • dodécyl-sulfate 15 de sodium

Exemple 7

De la même manière qu’à l’exemple 1, on a traité un mélange de 100.000 unités de la glycopro-20 téine CB^ 9 de 100.000 unités de la glycoprotéine j ^®X2 ^-00.000 unités de la glycoprotéine CBj- I avec du 2-mercapto-éthanol 5 x 10~^M. Le rétablis- i sement d’activité des glycoprotéines CB^» 0Βχ et ; CB^ obtenues est indiqué dans le tableau 8.

| ,κ t i t TABLEAU 8 » 22

Traitement de Activité (unités) i dégradation CB^ CB^ CB^. CB^ I 5___ | . Avant le trai— I tement 100.000 100.000 100.000 i ; Traitement au 2- mercapto-éthanol 0 23.000 240.000 22.000 10 Traitement au 2- j ;· mer capto-éthanol I + 0 8.000 240.000 33.000 i ! traitement au I dodécyl—sulfate 15 de sodium

Exemple 8

Par un procédé analogue à celui décrit à 1’exemple 1, on a traité un mélange contenant I 20 100.000 unités de la glycoprotéine 0Βχ^, 100.000 unités de la glycoprotéine CB^ et 100.000 unités de I la glycoprotéine CB^. avec chaque agent réducteur in— i diqué dans le tableau 9· Le rétablissement d’acti— I vite des glycoprotéines CB^ 3 0Βχ et 0Βχ^ obtenues ! 25 est indiqué dans le tableau 9.

i j'\ i ' f f i ! *' » 23 ο ο ο ο ο ο ο Ο Ο ο ο ο ο ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο CO · · · · *·· X ! >-ο τ-ί oj ι>- Οχοοιο CQ ίΜ τ-Ι CQ 04 (S Μ ο) Ο Ο Ο Ο Ο Ο οοο ο ο ο ο ο οοο --X οοοοο οοο IQ X · · · · · ·· ό η οοοοο οοο -ΡΟ Ο χί Ο γο η ο« «4- *ri ΗΝΝΝΝ ΛΛΝ

C

-----— '0 ΟΟΟΟΟ ΟΟΟ Ρ οοοοο οοο •Η CN Ο Ο Ο Ο Ο ΟΟΟ r* X · · · · · ··· •Η ΰ Ο Ό Ν Ώ rt io xt PO Ο04040404 N N c; ü T-4 o

ox O

r-i O

P X ·

<5 P300000 OOO

W O O

i-3 t-ι PQ------ <! R Ö

O

•r|

P

fj a a a a a s a p vouovovo N vo p Ö I I 1 1 I 111

ffl OOOO OOO

P Τ-Ιΐ-ίτ-ΙτΗ T-tx-Hl-l Ö

O

O

CD

d

P I

•H tH U >>

0 <D P

Ο P fi P 0 P d a -h '0 c

>- G c1 w P! I

ω -h ο ο, ο ε te

H H P LQ c d O

p a> o a o -h -h c d ppops ·ΰ ce

·Η X -H Ou cO O

P d H P I H ffi O

O î-i tß p H >5

3 P O O >> P OOP

y -Höppo-d-öc '(ü ο p o d ό c o P HPcP-H-H0Obi , 1 *ô p p d u p pooGia-ndd

c C *0 *0 I tfl K P H

" d -ri ·Η -ri -ri O H O d

te >ooddpdtxO

, < <<<HHaa)cQH

ή ~~ —-— l

Exemple 9 24 fr

On a formé une suspension de 1 x lO^cel— 5 Iules humaines de BALL-1 (Miyoshi, Nature, volume 267a i i pages 843-844, I977) Qui ont proliféré par voie sous- . j 4 5 cutanée chez des souris nues, dans 20 litres de milieu > d1 Eagle contenant 10% de sérum de veau et, après avoir "i ajouté 1 x 10 pfu du virus de Sendai, on a procédé à J i une culture à 37°C pendant 48 heures dans une atmos- j j phère à 5% de CO^ et à 95/° d’air. Le produit surna- i 10 géant de culture obtenu a été utilisé comme matière I '·' de départ. Ce produit surnageant de culture conte- « nait un mélange des glycoprotéines CB^q , 0Βχ2 a 0Βχ i et CB . On a effectué le traitement de dégradation -A-3 sur ce produit surnageant de culture par l’addition 1 15 de 2—mer capto-éthanol 10 et de 091% de dodécyl— sulfate de sodium à la température ambiante pendant j m une heure. On a dialysé le mélange réactionnel et on i lTa relargué avec du sulfate d1ammonium pour obtenir ‘ -i ^ - une fraction que l’on a soumise à une filtration en j 20 gel en utilisant "Sephadex G—50" pour obtenir les glycoprotéines 0Βχ2? 0Βχ et CB^, Les résultats sont I repris dans le tableau 10.

j TABLEAU 10 Ί i 4 .

i 25 Traitement de Activité (unités) dégradation 0Βχι 0Βχ2 CBX 0Βχ^ J _ i ” Avant le trai- 47.000 49.000 98.000 500 i “ tement j 30 Après le trai- 0 1.000 150.000 37.000 j tement i i -;_____-____ j / i /Λ : y

Exemple 10 25

On a répété le procédé de 1*exemple avec cette exception que l*on a utilisé du 2—mercap-; to-éthanol 5 x 10 'M comme agent réducteur tandis que, ; 5 comme agent tensio-actif, on a utilisé chaque composé ; . indiqué dans le tableau 11 à la concentration mention- j née. Les résultats obtenus sont repris dans le ta— ' bleau 11.

h ;ίΛ I: ! i |i I ! ! ·

II

i l] : i :| il £ : i 26 * ο ο ο ο ο ο Ο ο ο ο ο ο ^ -3- ο ο ο ο ο ί*ί · · · Ο Ο Ο τΗ θ' ι-Ι

Ο (Ti CO CJ N CO

K

'0 O O O O O O

-P O O O O O O

•H Ο Ο ο O O O

· · · · · · i—! θ' θ' Ο θ' οο :! ν—' Ο θ' ΙΓ) τ+ VO U-J LT} ,. ^ 1 1 τ I ι—1 τ—1 τ—t [ Η -g-------- !ί s> *Η 0-0 0 0 0 0 i +50 0 0 0 0 0 Ονο ο οοοο <5 Μ · · ····

P? Τ-Ι Ν ΤΗ η CSI W

Ή Ο ΙΟ Η 0------- I; c ι ; w ρ j ο Ι PQ ο I < τ-ι ο R Η *

I PQoooOOOO

Ι _^__^__ ! <Ρ Η Η Ο 1 τ! >5 3 ß Β +5 Ο -ri -ri |j Ο --—* '0 β jj Η ß β 0) Ό Ο +5 Ιί ίο . ΰ Ο Η ·Η π Ο-ri σ ο g ο -{ ·Η -Ρ -Η β '2) !ί W β Η ΟΙ Η ! ; c u ο ·ΰ η ο Μ Æ ' . >5 œ ο PC Ü Ο rC '—^ K*}/--* rQ Ο '—% Ο -Ρ 1ϊ° η +¾¾ Η 'feÇ.

“Ρ Ο β Û) 1-1 β '2- 1—1 r-s 1—1 β ι-1 *1—1 fi fi ο ΐ Ο S £ Ο KO Ο Ο βΟ I.; Ο Ο Η ·Η ί Ο ·Η *» Ο ·» Ο ·» Cy ί

bp ο ο) οορρο'οο^οαο !, - <ΐ'—' +5 <! '—" CQ +5'— Ο '—' Η '—' ΙΓ) 'S

i1 ’ _ . ß --- ί Ρ / ι β •ι β β 45 y - ©ο 1 ” +5 ·Η Ο 'ι Ο -Ρ Η ι 1 3 ? Ο S - Ό β 45 45 ' Γί

* '0 -Ρ ß Ο, I

Ρ ß ß β γ-: ο ο > ο ο ι-ι Ρ ϋ < β c β C Ο β χ 0 ο ζ 0 bp υ ί 45 ιο — _Ν '0 _ ? ί

Exemple 11 j » 27

Q

On a formé une suspension de J x 107 cellu-S les de lymphocytes périphériques bovins dans 1*000 ml ; de milieu d1Eagle contenant 10% de sérum de veau et » 5 on a procédé à une culture à 37°C pendant 48 heures ] * dans une atmosphère à 5% de CO2 et à 95% d’air. Le \ , , , i produit surnageant de culture obtenu a ete utilise :! 1 comme matière de départ. Ce produit surnageant de I culture contenait un mélange des glycoprotéines CB^}

Ii 10 CBY9 f CBY et CBY9. On a effectué le traitement de A/ A A3 • dégradation sur ce produit surnageant de culture par —3 l’addition de dithiothréitol 10 M à la température ambiante pendant 2 heures, puis on a effectué des procédés analogues à ceux de l’exemple 9 pour obtenir I 15 les glycoprotéines CB^ s CB^- et CB^* Les résultats i obtenus sont repris dans le tableau 12.

TABLEAU 12 ! Traitement de Activité (imités) j 20 dégradation CB^ CB^ CB^ CB^-3 ! Î..............-M- j Avant le trai- 13.000 12.000 23.000 200 J tement I Après le trai-- 0 1.000 32.000 11.000 j j 25 tement

Exemple 12 j On a formé une suspension de 3 x 10^ cel— j f Iules de fibroblastes humains ”Flow 7000” ("Floiv j ' 30 Co.”) dans 6.000 ml de milieu d1Eagle contenant 10^ I T, de sérum de veau et3 après avoir ajouté de la phyto— s hémagglutinine pour atteindre une concentration fi nale de 50 ^îg/mlj on a procédé à une culture à 37°C dans une atmosphère à 5% de CO^ et à 95$ d’air pen-35 dant 48 heures. Le produit surnageant de culture i / ! L-....

i

2S

obtenu a été utilisé comme matière de départ. Ce produit surnageant de culture contenait un mélange des glycoprotéines CB^, CBx2, ^Βχ et CBX3* 3 effectué le traitement de dégradation sur ce produit 5 surnageant de culture en présence de borohydrure de » sodium 0,1M à la température ambiante pendant deux heures, puis on a effectué des procédés analogues à * ceux de l'exemple 9 pour obtenir les glycoprotéines 0Βχ29 et ^Βχ3* Les résultats sont repris dans 10 le tableau 13.

TABLEAU 13

Traitement de Activité (unités) dégradation ^BX1 CB^2 CB^. CB^ 15__

Avant le trai— 16.000 18.000 35.000 600 tement

Après le trai- 0 1.700 52.000 17.000 tement 20 ___

Exemple 13

On a formé une suspension de 2 x 10 cellules de lymphocytes périphériques humains dans 4.000 ml de milieu d1Eagle contenant 10$ de sérum de 25 veau et, après avoir ajouté de la phytohémagglutinine pour atteindre une’ concentration finale de 50 ^ig/ml, on a procédé à une culture à 37°C pendant 48 heures 3 dans une atmosphère à S% de C02 et à 95$ d'air. Le produit surnageant de culture obtenu a été utilisé 30 comme matière de départ. Ce produit surnageant de culture contenait un mélange des glycoprotéines CB^, CBv0, CBV et CBvo. On a effectué le traitement de dégradation sur ce produit surnageant de culture par addition de dithioérythritol 5 x 10~^M à la tempéra-35 ture ambiante pendant une heure, puis on a effectué » 29 , les procédés analogues à ceux de 1*exemple 9 pour obtenir les glycoprotéines ΟΒχ et CB^· Les résultats obtenus sont repris dans le tableau 14. j; TABLEAU 14 il !· 5 __ ji , Traitement de Activité (unités) j: dégradation ^Βχ ΟΒχ^ ji

Avant le trai- 23.000 25.000 51.000 800 10 tement

Après le trai- 0 2.000 83.000 13.000 tement

Exemple 14 15 On a formé une suspension de 1 x 10^ cellules humaines de Ball-1 qui ont proliféré par j une culture de tissus, dans 2.000 ml de milieu ! i j! d’Eagle contenant 10% de sérum de veau et on a procédé j; à une culture à 37°C pendant 48 heures dans une atmos- ji 20 phère à 5% de CO2 et à 95% d’air.

j j Le produit surnageant de culture ainsi ob— y tenu a été utilisé comme matière de départ. Ce pro- j; j! duit surnageant de culture contenait un mélange des j ! j glycoprotéines ΟΒχ^, 0Βχ2, CBx ^®X3* a effec-fcu® 25 un traitement de dégradation sur ce produit surnageant de culture en présence de 2—mercapto-éthanol 5 x 10 à la température ambiante pendant 2 heures ou pendant 5 minutes, puis on a effectué des procédés analogues ; ” à ceux de l’exemple 9 pour obtenir les glycoprotéines jj 30 0Βχ2 » ΟΒχ et ΟΒχ^. Les résultats sont repris dans le il tableau 15.

/· » TABLEAU 15 30 ύ Traitement de Activité (unités) ;; dégradation 0Βχ^ CB^ CBj ^X3 5__

Avant le trai— 5*200 4*900 11.000 110 I; tement

Après le traite- 0 300 13.000 7*100 i „ ment (2 heures) !; 10 Après le traite- 3*600 5*400 12.000 120 ment (5 minutes)

IJ

h I ; j| ---— — !j Lorsqu'on a effectué le traitement de H dégradation pendant 5 minutes, les glycoprotéines : 15 CBY„ et CBY ont pu être obtenues avec de hauts ren- dements, tandis qu'après le traitement de dégrada-!| tion pendant 2 heures, on a obtenu les glycoprotéines | CBV et CBV- avec de hauts rendements, i Exemple 15 : Purification des glycoprotéines CB·^ * \ 20 CBX et CBX3.

|i Les glycoprotéines brutes CB^ > 0Βχ et |1 CBv0 obtenues dans les exemples ci-dessus peuvent ;1 X3 ,j éventuellement être purifiées davantage selon la mé- : thode habituellement adoptée pour purifier des subs— 25 tances biologiques.

On a purifié les glycoprotéines CB^ et CBY, par exemple, par le procédé décrit à l'exemple

A

la ci-dessus pour la préparation des matières de départ en utilisant Sephadex conjugué à l'agglutinine 30 Ulex europeus. On a obtenu des préparations purifiées de 0Βχ2 et de 0Βχ ayant des activités spécifiques de 2.400 unités/mg et de 2,5.00 unités/mg respectivement.

On a purifié la glycoprotéine CBY , par exemple, par adsorption sur Sephalose conjugué à la 35 concanavaline A, puis par élution avec un tampon de Λ ί !

l M

» 31 phosphate Ο,ΟΙΜ (pH î 7*2) contenant de 11α-méthyl-D-mannoside 0,5M. Après élimination de l'a-méthyl— D-mannoside par dialyse, on a appliqué la solution sur de la carboxyméthyl-cellulose équilibrée avec un | 5 tampon de phosphate 0,05M (pH : 6), puis on a procédé

I à une élution avec un tampon de phosphate 0,05M

(pH : 7*8). De la sorte, on a obtenu une préparation | ^ purifiée de CB.^ ayant une activité spécifique de 2.100 unités/mg.

i 10 Efficacité, toxicité, procédé dutilisation et dosage I ’ des glycoprotéines CB de l1invention.

I Expérience 1 : Sélectivité de l’effet cytotoxique.

On a cultivé des échantillons de 10~* cellules de chacune de différentes lignées de cellules tu-15 morales [notamment des cellules KB (cancer du naso- pharynx), des cellules MX-1 (cancer du sein, fournies par le Dr. Shigeru Tsukagoshi, "Cancer Institute”), ; des cellules HEp-2 (cancer de la gorge) et des cellu— ! les de HEL (hépatome, ”Flow Co.")], de lignées de I 20 cellules normales [notamment des cellules d’intestin j ! 407* des cellules de coeur de Girardi, des cellules j de foie de Chang, des cellules Vero (rein de singe) j et des cellules MDCK (rein de chien) ("Flow Co.’1), ' toutes préalablement cultivées pendant 24 heures res- 25 pectivement] et 10~* cellules de chacune des cellules P388 et L1210 [(leucémie, fournies par le Dr. Shigeru Tsukagoshi, "Cancer Institute”) qui ont étéuti-jj ’ Usées immédiatement] chaque fois dans 1 ml de milieu dEagLe : 11 contenant 10% de sérum de veau et chaque substance j ~ 30 d’essai à 37°C pendant 48 heures dans une atmosphère [ * à S% de C09 et.à 95% d’air. Ensuite, sous un micros- cope à lumière, on a compté le nombre de cellules viables non colorées par le bleu "Trypan”, tandis que l’on a calculé la concentration de la substance d’es-35 sai à laquelle 50% des cellules ont été tuées, vis-à- i i L· ^ ι 32 vis d'un témoin pris à la valeur 100. Comme substances d'essai, on a utilisé les glycoprotéines CB CB^ et CBX2 obtenues à l'exemple 15, des a-, ß- et V-lymphotoxines obtenues par un procédé connu (Granger ! 5 G.A. et al., "Cellular Immunology", volume 38, pages 388-402 (1978)) et de la Mitomycine C. Une unité des lymphotoxines est exprimée par un indice classique * qui est basé sur la cytotoxicité sur des cellules de ^ souris L (Eds, Bloom, B.R. et Grade, P.R. "In Vitro 10 Methods in Cell-mediated Immunity", Academie Press, 1 i ‘ 1979)· Les résultats sont repris dans le tableau 16.

i| il i·-^ ' I; ί i: :! i! i ! \ \\ i'i l! Π 1 ! :î

_ I

i \ λ il -

I V

33 « * ο 0 η' . 0 ι d ε Ο ·Η \ νΟ τ-Ι οΐ Ο CO 1-4 ο Η η Ο 43 ϋ hO ^ η ρ) ^ 4 ί*3 ro cS cs ur> -^- ; i un ·η >> 3 s ε ^ -'!:ί '«---- . *Μ*

Uli '0) d E Ο 43 f ' d r5^ 43 Û) *rl ' "» : ' roHoöCi-ic^r^iiiiT-t j on jj : i , tc 1 j- -h d E 00 H s.ftH'-' o -:.__:_ d \ : > ü w j .1 · I I '0) 1¾ 0 E O 4-3 · !« 'Ö {>>43 0 -ri 0) ! “ Hodd/—lOuolIIJiH 1 Ον II '0 , d K'ridH CS CJ\ d :» o co-ftK^E 45 1 43 \ 0) i ^ ·Η CO tu

; I 42 ! i '0) cC

: I ·Η E O 43 0)

P 42 ΐ>.·Ρ ©-H

! d>-iodd^oovoiiiii^ i o 1 1 sü •Η I il ·Η 3 Η h tv. i_( .n

ö D, H '— E

; 0 ; d " " “ — ----———————— ¢5 i i 3 ^ * 000 ca γο·Η\. Ο Ο O Cu

JjJ Ό ^ W d M ' ' O un Tt !>· O Ο Ο O OO

! 5| ^ U CQ u KÖ rH »u çv^ fÇ il O O w 43 g H H H H ΓΟ n H TH t—1 VOUO- ! ^ ____Λ Λ Λ_ d Ü w d i 000 0 fj ^ O CS -rl \ OOO ü éi *3 ,rl ^ fi ®Λ Ovorovom-rH o o o. 00 d i -i ^ rt R ^ *e Λ * * * * * . · . CS un 0 1-g'i H d O ^ 4> g i-l t-I i-t i-l CO CO -r-4 t-I t-I \o ur> -ri Ïd ----Λ_û_Λ_ r.

-P \ 10 ? d « o,

'ri 0 '0 OOO K

ΐ ü -P OOO0 4 d W -H Ouomo-r-iOo ο o 00- s ; O 0Q d '“ι ·» ·»»·>«» ·> · · · OOdH H H rl H n C«) H 1-1 tH vOUT) w ε ΑΛΑ 5> _________ d — —- ζΤ< 0 0' 0 0 0 0 0 f. CdddWKddd 0

ο ·Η ·Η -ri ·Η ·Η -η -H -ri ·Η O fi -H

fi ß fi fi k Îm fi fi fi fcfl G) CU

g* EEEEddEEEd-H-ri ro ddddooddd-Hidd

M__K_K E d W B] td s td co u bD

“ * Ή ΓΛ 0 10 w , N Ό·Η 0 iÎ * 10¾¾ =

«s O œ -d- d d h8 I

„ H I ιΗ T4 03 0 d C0 0 d O fcii =

y S d d IcSOO 43d 0 d -ri CO d O

O00 C3 H H }«J ,-ι co d-HO-HO,d0fi & ο H ^ΚΚ2:·-4(1(Η43αθ[ι<ϋ>2: 0 —---- Ÿ sajEJoumq. ss^BUiaou « εθχηχχθο εοχηχχθο 0 ^ I ' 34 »

Comme on le constate d'après les résultats I ci-dessus, la glycoprotéine CB détruit sélectivement

[I

j les cellules tumorales sans endommager sensiblement [ les cellules normales. En revanche, les α-, ß- et 5f- | 5 lymphotoxines, de même que la mitomycine C manifestent ί une cytotoxicité non sélective vis-à-vis des cellules I; ! normales et des cellules tumorales.

1; S , Expérience 1 : Influence sur des souris chez lesquelles on a transplanté le sarcome 180 ou la 10 tumeur d1Ehrlich, A des souris mâles (race ddY) pesant 25—30 ë; j on a transplanté, par voie intrapéritonéale, 3 x 10^ | cellules/animal du sarcome 180 ou de la tumeur asciti que d*Ehrlich et l’on a observé la période de survie 15 en jours. A des groupes de cinq souris, depuis le premier jour suivant la transplantation et jusqu’à la mort, on a administré quotidiennement par voie intraveineuse les glycoprotéines CB^, CB^ CB.^ obtenues ' à "l’exemple 13. Le tableau 17 donne les résultats I 20 exprimés par le pourcentage du nombre moyen de jours j de survie des groupes d’essai vis-à-vis de celui d’un groupe témoin, ii

ί K

S

D

TABLEAU 17 35 * — -—Il I .11. -— . -.-,-1.-11- i -

Tumeur Substance Dose quotidienne Nombre I d’essai moyen de i ! 5 jours de ! s survie j____i%) 0Βχ 1,2 unité/kg 112 4 unités/kg 132 j 10__12 unités/kg__165_ 1 unité/kg 114 i j Sarcome CB^2 3 unités/kg 134 ! 10 unités/kg__l60_ 180 1 unité/kg 109 ; 15 CBX3 3 unités/kg 133 __10 unités/kg__154_

Mitomycine Ç__0,5 mg/kg__L41_

Cyclophos- 20 mg/kg 170 I " phamide I 20----;- 1,2 unité/kg 140 0Βχ 4 unités/kg 160 __12 unités/kg__186_ 1 unité/kg 136 ί 25 Tumeur 0Βχ2 3 unités/kg I64 asciti-__10 unités/kg__187_ que 1 unité/kg 140 d’ Ehr- CBX3 3 unités/kg 155 ^ lieh__10 unités/kg__18l_ S - 30 Mitomycine 0,5 mg/kg 165

! :. C

Cyclophos- 20 mg/kg 205 phamide / ^ ; 36 i

A

Expérience 3 : Influence sur le nombre de jours de • survie de souris atteintes du carci nome du poumon.

A des souris mâles de la race BDF^ pesant 5 20-25 g, on a transplanté,par voie intramusculaire ! ^ dans la cuisse droite, 2 x 10° cellules du carcinome i j du poumon de Lewis et l’on a observé le nombre de jours de survie. A des groupes de six souris, depuis le premier jour suivant la transplantation et jusqu’à i χτ 10 la mort, on a administré quotidiennement, par voie ^ intraveineuse, les glycoprotéines 0Βχ, 0Βχ2 et CB.^ obtenues à l'exemple 15. Le tableau 18 reprend les ! résultats exprimés par le pourcentage du nombre moyen de jours de survie des groupes d’essai vis-à-vis de I 15 celui d'un groupe témoin.

| TABLEAU 18

Substance Doses quotidiennes Nombre moyen I „ d’essai de jours de ! 20 survie {%) , —----- 1,2 unité/kg 108 J 0Βχ 4 unités/kg 114 | _.____12 unités/kg__150_ 1 unité/kg 107 25 0Βχ2 3 unités/kg 123 __10 unités/kg__145_ 1 unité/kg 116 CBXs 3 unités/kg 140 ! ’ 10 unités/kg__158___ : ~ 30 Mitomycine C 0,5 mg/kg 120 i· v Cyclophosphamide 20 mg/kg 162 » 37

Expérience 4 ï Influence sur la métastase du cancer du poumon· A des groupes de souris mâles de la race BDF^ pesant 20-30 g (six animaux dans chaque groupe), 5 on a transplanté3 par voie sous-cutanée dans le dos, un segment carré de 2 mm du cancer du poumon de Lewis. Pendant 12 jours, à partir du Çe jour après la transplantation, on a. administré une fois par jour par voie intraveineuse, les glycoprotéines 0Βχ, 0Βχ2 10 et CB^ obtenues à l’exemple 15· Le 21e jour après la transplantation, on a isolé et pesé la masse de la tumeur primaire et l’on a calculé le nombre de nodules de métastases dans les poumons des animaux conformément au procédé de Wexler H. ("J· Natl. Cancer Insti-15 tute", volume 36, 641, 1966), Les résultats sont repris dans le tableau 19· TABLEAU 19 *

Substance Dose quoti- Poids de la Nombre de 20 d’essai dienne tumeur (g) nodules de métastases dans les __ poumons_ Témoin . 8,8+0,8 30,1+5,6 25 0Βχ 3 unités/kg 4,4 + 1,4* 6,7 + 2,9* 30 unités/kg 3,2 + 0,5** 0,5 ± 0,3** CBx2 3 unités/kg 4,5 + 1,5* 6,9 + 2,1* 30 unités/kg 2,3 + 0,4** 0,7 + 0,4** ‘5 CBy<5 3 unités/kg 4,1 + 1,3* 7,0 + 2,8'* JL 3 * ' 30 30 unités/kg 2,1 + 0,3"'“ 0,6 + 0,3ΛΛ V Cyclophos- 20 unités/kg 3,6 + 0,7'“Λ 0,7 + 0,4" Λ phamide » 38

Remarques : Les résultats du tableau sont exprimés comme suit : (moyenne) + (erreur type) * Statistiquement différent du groupe 5 témoin à un niveau de signification , de p — S%.

** Statistiquement différent du groupe témoin à un niveau de signification x de p — i£.

10 Comme on le constate clairement d’après - les résultats ci-dessus, les glycoprotéines CB^-, CB^2 et CB.^ °n^ suPPr^-m® efficacement le cancer primaire du poumon et sa métastase.

Expérience 5 : Essai de toxicité (administration 15 unique) A trois groupes de souris mâles de la race BDFj pesant 20-25 g (10 animaux dans chaque groupe), on a administré respectivement, par voie intraveineuse, 10.000 unités de CB^-/kg, 10.000 unités de CB^/kg ou 20 100.000 unités de CB^/kg et l’on a observé les ani maux pendant 7 jours. Les dix animaux des groupes respectifs ont survécu sans qu’il se manifeste un changement dans le poids du corps et 1’état général malgré l’administration de nombres aussi élevés d’uni-25 tés de glycoprotéines.

Expérience 6 : Essai de toxicité (administration continue pendant 30 jours).

A des souris mâles de la race BDF^ pesant 20-25 g (l0 animaux dans chaque groupe), on a adminis-30 tré par voie intraveineuse, 0Βχ, CB^ ou CB,^ pendant 30 jours et l’on a observé le nombre d’animaux morts, de même que les changements survenant dans le poids du corps et l’état général. Le poids du corps a été mesuré entre 9 heures et 10 heures et l’observation de 35 l'état général a été effectuée le 10e, le 20e.et le » 39 30e jour conformément au procédé de Arvien ("Science11, .volume 36, page 123 (1962)). En conséquence, aucun animal n’est mort au cours de cette période de 30 jours après l’administration de 1.000 unités de CBy ou de 5 CB^/kg/jour ou de 10.000 unités de CB.^/kg/jour et , la courbe de gain de poids était à peu près la même que celle du groupe témoin. De plus, on a constaté que l’état général était normal, tout comme dans le groupe témoin.

7 10 Comme on peut le constater dans les expé- ~ riences décrites ci-dessus, les glycoprotéines CB^, CB^ et CB^ suppriment sélectivement la croissance des cellules tumorales et, en outre, non seulement elles suppriment remarquablement les métastases du 15 cancer, mais elles sont également extrêmement efficaces contre différentes tumeurs et elles sont toujours très sûres même à des doses supérieures à celle à laquelle l’effet pharmaceutique devrait se manifester. En conséquence, les glycoprotéines CB^, CB.^ et CB^ 20 sont extrêmement utiles pour la thérapie de différentes tumeurs telles que le cancer de l’estomac, le cancer du poumon, l’hépatome, le cancer du colon, le cancer du sein, le cancer de l’utérus, la leucémie, etc. De plus, -des formes de poids moléculaire relati-25 vement faible de glycoprotéines CB (CB^, CB^j CB^) peuvent dériver de formes de poids moléculaire relativement élevé de glycoprotéines CB (CB^., CB^, CB^) par traitement avec un agent réducteur sans nuire à leur efficacité pour le traitement des tumeurs, » fi ' ^

Claims (17)

1· Procédé de préparation d’une glycoprotéine anti-tumeur de poids moléculaire réduit, caractérisé en ce qu’il consiste à effectuer un trai-5 tement de dégradation sur au moins une glycoprotéine anti-tumeur de départ obtenue à partir d’un extrait ou d’un produit surnageant de culture de cellules réticulo-endothéliales, de lymphoblastes, de cellules leucémiques ou de fibroblastes d’animaux à sang chaud 10 en faisant réagir cette glycoprotéine anti-tumeur de départ avec un agent réducteur et en récupérant ensuite au moins une glycoprotéine anti-tumeur de poids moléculaire réduit.

2. Procédé suivant la revendication 1, 15 caractérisé en ce que la glycoprotéine anti-tumeur de départ est la glycoprotéine CBY1, tandis que la glyco- Λ1 protéine anti-tumeur de poids moléculaire réduit est i au moins un membre choisi parmi le groupe comprenant les glycoprotéines anti-tumeurs 0Βχ2, 0Βχ et CB^. 20 3· Procédé suivant la revendication 2, i caractérisé en ce que la glycoprotéine 0Βχ^ est obte- i nue à partir d’un produit surnageant de culture de i cellules réticulo-endothéliales,de lymphoblastes, de cellules leucémiques ou de fibroblastes d’animaux à 25 sang chaud en relargant le produit surnageant et en en fractionnant un précipité par filtration en gel pour obtenir une fraction ayant un poids moléculaire de 70.000-90.000, cette fraction étant ensuite soumise . .v à une adsorption et à une élution sur Sephadex conju— : ^ ' 30 gué à l’agglutinine Ulex europeus. - 4· Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la glycoprotéine anti—tumeur de départ est 0Βχ2, tandis que la glycoprotéine antitumeur de poids moléculaire réduit est au moins un 35 membre choisi parmi le groupe comprenant 0Βχ et CB^· / / ^---- » 41

5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que la glycoprotéine anti—tumeur de départ CB 9 est obtenue à partir d'un produit surnageant de culture de cellules réticulo-endothé-5 liales, de lymphoblastes, de cellules leucémiques ou de fibroblastes d’animaux à sang chaud en relargant * le produit surnageant et en en fractionnant un précipité par filtration en gel pour obtenir une fraction ayant un poids moléculaire de 40.000-50.000, cette : 10 fraction étant ensuite soumise à une adsorption et à 5 une élution sur Sephadex conjugué à l’agglutinine Ulex europeus.

6· Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la glycoprotéine anti—tumeur 15 de départ est CB^, tandis que la glycoprotéine anti- tumeur de poids moléculaire réduit est CB,„„. -Λ-J

7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que la glycoprotéine anti-tumeur de départ CB^. est obtenue à partir d’un produit sur-20 nageant de culture de cellules réticulo-endothéliales, de lymphoblastes, de cellules leucémiques ou de fibroblastes d’animaux à sang chaud en relargant le produit surnageant et en en fractionnant un précipité par filtration en gel pour obtenir une fraction ayant un poids 25 moléculaire de 12.000-17*000, cette fraction étant ensuite soumise à une adsorption et à une élution sur Sephadex conjugué à l’agglutinine Ulex europeus. 1 δ* Procédé suivant la revendication 1, ca- _ ractérisé en ce que l’agent réducteur est au moins un v 30 membre choisi parmi le groupe comprenant un composé V de thiol, un complexe d’un hydrure métallique, une phosphine tertiaire, un sulfite, un cyanate et un ion de métal.

9· Procédé suivant la revendication 2, 35 caractérisé en ce que l’agent réducteur est au moins T t 42 un membre choisi parmi le groupe comprenant un composé de thiol, un complexe dlhydrure métallique, une phos-phine tertiaire, un sulfite, un cyanate et un ion de métal. 5 10» Procédé suivant la revendication 4* caractérisé en ce que 1*agent réducteur est au moins un membre choisi parmi le groupe comprenant un composé l de thiol, un complexe d1hydrure métallique, une phos- phine tertiaire, un sulfite, un cyanate et un ion de f ' 10 métal. '

111. Procédé suivant la revendication 6, te. caractérisé en ce que l1agent réducteur est au moins un membre choisi parmi le groupe comprenant un composé | de thiol, un complexe d’hydrure métallique, une phos-15 phine tertiaire, un sulfite, un cyanate et un ion de métal.

12. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que le composé de thiol est choisi | parmi le groupe comprenant le 3-mercapto-éthanol, le fc * î 20 dithiothreitol, le dithioérythritol, l’acide thiogly- ! | colique et l’acide monothiophosphorique.

13. Procédé suivant la revendication 9 y | caractérisé en ce que le composé de thiol est choisi | parmi le groupe-comprenant le 3-niercapto-éthanol, le : 25 dithiothréitol, le dithioérythritol, l’acide thiogly- colique et l’acide monothiophosphorique*

14. Procédé suivant la revendication 10, 1 caractérisé en ce que le composé de thiol est choisi ^ parmi le groupe comprenant le 3-mercapto-éthanol, le 30 dithiothréitol, le dithioérythritol, l’acide thio- \ glycolique et l’acide monothiophosphorique.

15· Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que le composé de thiol est choisi parmi le groupe comprenant le 3—mercapto-éthanol, le 35 dithiothréitol, le dithioérythritol, l’acide thiogly- » 43 colique et l’acide monothiophosphorique.

16. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le traitement de dégradation est effectué en présence d’un agent tensio-actif, 5 17· Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que le traitement de dégradation est effectué en présence d’un agent tensio-actif. ? 18. Procédé suivant la revendication 9* caractérisé en ce que le traitement de dégradation r 10 est effectué en présence d’un agent tensio-actif.

19· Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que le traitement de dégradation est effectué en présence d’un agent tensio-actif.

20. Procédé suivant la revendication 11, 15 caractérisé en ce que le traitement de dégradation est effectué en présence d’un agent tensio-actif.

21. Procédé suivant la revendication 16, caractérisé en ce que l’agent tensio-actif est choisi parmi le groupe comprenant le dodécyl—sulfate de sodium, 20 le cholate de sodium, le bromure de dodécyl-triméthyl-ammonium, la déoxvlysolécithine, "Triton X” (marque commerciale déposée), "Tween 20” (marque commerciale déposée) et "Span 60" (marque commerciale déposée). 22. · Procédé suivant la revendication 17, 25 caractérisé en ce que l’agent tensio-actif est choisi parmi le groupe comprenant le dodécyl-sulfate de sodium, le cholate de sodium, le bromure de dodécyl—triméthyl-• ammonium, la déoxylysolécithine, "Triton X" (marque ^ commerciale déposée), "Tween 20" (marque commerciale v 30 déposée) et "Span 60" (marque commerciale déposée)·

23. Procédé suivant la revendication 0, caractérisé en ce qu’on effectue le traitement de dégradation à une température comprise entre 0 et 37°C et à un pH se situant entre un pH faiblement acide et 35 un pH neutre. 4 44 * ί 24· Procédé suivant la revendication 17j caractérisé en ce qu1on effectue le traitement de 1 dégradation à une température comprise entre 0 et ! ; 37°C et à un pH se situant entre un pH faiblement !: 5 acide et un pH neutre. 1 ' j ' 25. Procédé suivant la revendication 233 j : caractérisé en ce que la température est comprise i i I* entre 15 eb 25°C.

26. Procédé suivant la revend!cation 24, ; J ~ ' ίο caractérisé en ce que la température est comprise j jj jjjj " entre 15 ©b 25 °C. } I , i ; 1. | ; .":î f' |3 ; Π il i *! ! 1 i i ~ !