DD213440A5

DD213440A5 - Verfahren zur herstellung eines antitumor-glykoproteins

Info

Publication number: DD213440A5
Application number: DD83253631A
Authority: DD
Inventors: Haruo Ohnishi; Kazuo Yamaguchi; Yasuo Suzuki; Ei Mochida; Nobuo Mochida
Original assignee: Mochida Pharm Co Ltd
Priority date: 1982-08-04
Filing date: 1983-08-02
Publication date: 1984-09-12
Also published as: KR840006127A; DE3328239A1; NL8302765A; PT77154B; GB2125048A; BR8304143A; PL243306A1; GR78638B; GB8320547D0; DK356483A; AU1759283A; FI832776A0; SE8304276L; SE8304276D0; ZA835680B; BE897470A; LU84946A1; DK356483D0; PT77154A; JPS5925332A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren z. Herstellg. v. Antitumor-Glykoprotein mit geringerem Molekulargewicht als dem Molekulargewicht des Ausgangs-Antitumor-Glykoproteins u. ist gekennzeichnet, dass als Ausgangsmaterial ein Antitumor-Glykoprotein eingesetzt wird, das aus einem Extrakt o. dem Ueberstehenden einer Kultur v. Reticuloendothelialzellen, Lymphoblasten, Leukaemiezellen o. Fibroblasten warmbluetiger Tiere gewonnen wird, eine Abbaubehandlung mit diesem Glykoprotein durch Reaktion mit einem Reduktionsmittel durchgefuehrt u. danach ein Antitumor-Glykoprotein mit reduziertem Molekulargew. aus dem Reaktionsgemisch zurueckgewonnen wird.

Description

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Verfahren zur Herstellung von Ant it unior-Glyko proteinen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Antitumor-Glykoproteinen mit geringerem Molekulargewicht als dem dem des Ausgangs-Antitumor-Glykoproteine, das darin besteht, daß das Molekulargewicht eines Antitumor-Glykoproteins mit einem großen Molekulargewicht reduziert wird durch Behandlung mit einem Reduktionsmittel und im Anschluß daran Antitumor-Glykoproteine mit verringerten Molekülargewichten aus dem Reaktionsgemisch zurückgewonnen werden.

Bekannte technische lösungen

Durch eine Vielzahl von Forschern sind v/eltweit schon eine Reihe von therapeutischen Mitteln gegen Tumore bereitgestellt worden, die Heilungsrate bei Tumoren durch derartige Antitumormittel ist jedoch noch sehr gering, so daß für die Entwicklung weiterer, verbesserter therapeutischer Mittel ein erhebliches Bedürfnis besteht·

Ziel der Erfindung

Es ist ein Ziel dieser Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Antitumor-Glykoproteinen bereitzustellen. Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Antitumor-Glykoproteinen mit geringerem Molekulargewicht aus Ant it uinor-Glykoprot einen mit größerem Molekulargwicht bereitzustellen«

Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Gewinnung von GB in höher Ausbeute,

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Ein weiteres Ziel dieser Erfindung .ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Gewinnung von CB^₂ in hoher Ausbeute.

Ein anderes Ziel dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Gewinnung von GB , in hoher Ausbeute.

Wesen der Erfindung

Dementsprechend sieht diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines oder mehrerer Antitumor-Glykoproteine vor, die geringere Molekulargewichte als das Au3gangs-Antitumor-Glykoprotein haben, und das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Antitumor-Glykoprotein mit einem größeren Molekulargewicht mit einem Reduktionsmittel umgesetzt wird und im Anschluß daran die Antitumor-Glykoproteine mit reduziertem Molekulargewichten aas dem Reaktionsgemisch gewonnen werden. Bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren erhält man ein Antitumor Glykpprotein GB mit gewünschtem Molekulargewicht in hoher Ausbeute.

Die Erfinder haben mit dem Wissen, daß reticuloendo-theliale Zellen, die eine wichtige Rolle im biophylaktischen Mechanismus spielen, eine Substanz bilden können, die möglicherweise Tumore heilen kann, kontinuierlich und intensiv diesen Gegenstand untersucht. Kürzlich entdeckten die Erfinder vier Arten von Antitumor-Glykoproteinen mit unterschiedlichen Molekulargewichten in einem Extrakt aus dem überstehenden . einer Kultur reticuloendothelialer Zellen, Lymphoblasten, Leukämiezellen oder Fibroblasten von warmblütigen Wesen und bez-eichneten diese als Carcino-Brecher X (Molekulargewicht 12003 bis 17000), X^ (Molekulargewicht '7OOOO-9OOOO),"" X₂ (Molekulargewicht 40000 bis 50000) und X^ (Molekulargewicht 7000 bis 9000) (JΑ-Pat entanmeldüngen 28992/1982, 28993/1982, 87674/1982, 87675/1982, 10846/1982 und US-Patentanmeldung 467840 vom 18.Pebruar 1983', wobei diese

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Glycoproteine im Anschluß als GB - OB ₁, CB _o und GB bezeichnet werden und für den Fall, wo sie insgesamt genannt werden, als CB).

Da ^GB _X"^GS _X3 ^ala Gemisch in einem Extrakt oder dem Überstehenden einer Kultur Reticuloedothelialzellen, Lynipho&laaten, Leukamiezellen oder Fibroblasten von warmblütigen Tieren vorliegen,' ist es sehr schwierig, effektiv und allein ein Carcino-Breeher mit gewünschtem Molekulargewicht, insbesondere einen mit einem geringeren Molekulargewicht wie beispielsweise CB oder CB ~, in großer Menge zu erhalten«

Die Erfinder haben intensiv an einem effektiven Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von CB_x, 0Β_χ2 und/οder CB ~ gearbeitet und als Ergebnis endeckt,' daß durch Abbaubehandlung eines Antitumor-Glykoproteins, z. B. eines Carcino-Brechers, den man aus einem Extrakt oder dem Überstehenden einer Kultur von Reticuloendothelialzellen, Lymphoblasten, Leukamiezellen oder Pibroblasten von warmblütigen Tieren erhält, mittels Behandlung mit einem Reduktionsmittel, aus dem genannten flüssigen Reaktionsgemisch ein Antituinor-Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 40000 bis 50000 (CB p)» öi*¹ Antitumor-Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 12000 bis 17000 (CB_) und/oder ein Antitumor-Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 7000 bis 9000 (CB -j) leicht und in hoher Ausbeute erhalten werden kann, wodurch diese Erfindung zustande kam.

Die Begriffe von CB^., CB^₁, CB ₂ und CB^, die in dieser Anmeldung verwendet werden, sind als Garcinobrecher-Antitumor-Glykoproteine im vorangegangenen Abschnitt diskutiert worden und weisen folgende Eigenschaften auf:

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1) Molekulargewicht: 12.000 bis 17 OOOj

2) Farbreaktionen: weist eine Färbung auf, die Proteine nach der Lowryreaktion anzeigt, weist eine Färbung auf, die Peptidbindungen und Aminosäuren in der Hinhydrinreaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure anzeigt und weist eine Färbung auf, die Zucker in der Phenol-Schwefelsäurereaktion in der Anthron-Schwefelsäurereaktion, in der Indol-Schwefelsäurereaktion und in der Tryptophan-Schwefelsäurereaktion anzeigt j

3) Erscheinungsbild und Löslichkeit: weißes Pulver, löslich in Wasser, wäßrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer sowie schwerer löslich in Benzol, Hexan und Chloroform,}

4) Zuckergehalt: 27 bis 33 % mit einer Zuckerzusatnmensetzung von 17 bis 20 % Hexosen, 5 bis 7 % Hexosaminen und 5 bis β % Sialsäurenj

5) Isoelektrischer Punkt: 4,3 bis 7,3»

6) Adsorptionsfähigkeit-: adsorptionsfähig an Ulex europeus agglutininkonjugierten Sepahadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2)j

7) Stabilität:stabil in wäßriger Lösung von pH 2,0,

"" pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4 ⁰G über 24 Stunden oder länger, sowie in wäßriger Lösung von pH 7,0 bei 60 ⁰G über 3 Stunden oder länger\ und

8) Cytotocizität selektive Schädigung von Tumorzellen ohne ' wesentliche Schädigung normaler Zellen,

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9) Differenzierung: induziert Differenzierung von 'luniorzellen, d, h· wandelt die Tumorzellen in normale Zellen um}

1) Molekulargewicht: 70 000 bis 90 000}

2) Parbreaktionen: weist eine Pärbung auf, die Proteine nach der Lowryreaktion anzeigt, weist eine Pärbung auf, die Peptidbindungen und Aminosäuren in der Hinhydrinreaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure anzeigt und weist eine Pärbung auf, die Zucker in der Phenol - Schwefelsäurereaktion der.Anthron—Schwefelsäurereaktion, der Indol-Schwefelsäurereaktion und in der Tryptophan-Schwefelsäurereaktion anzeigt}

3) Erscheinungsbild und Löslichkeit: weißes Pulver, löslich in Wasser.,* wäßrigem natriumchlorid und Phosphatpuffer sowie schwerer löslich in Benzol, Hexan und Chloroform}

4) Zuckergehalt: 35 bis 45 % niit einer Zuckerausammensetzung von 23 bis 28 % Hexosen, 8 bis 11 % Hexosaminen und 4 bis 6 % Sialsäurenj

5) Isoelektrischer Punkt: 4,3 bis 6,2

6) Adsorptionsfähigkeit: adsorptionsfähig an Ulex europeus agglutininkönjugierten Sephadex'in 0,01 M Phosphatρuffer (pH 7,2)}

7) Stabilität: stabil in wäßriger Lösung von pH 2,0,

-6- 62 765/12

pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4 ⁰G über 24 Stunden oder langer, sowie in wäßriger Lösung von pH 7,0 bei 60 ⁰G über 3 Stunden oder langer\ und

8) Cytotoxizität: selektive Schädigung von Tumorzellen ohne wesentliche Schädigung normaler Zellen}

1) Molekulargewichtί 40 000 bis 50 OOOj

2) Parbreaktionen: weist eine Färbung auf, die Proteine nach der Lowryreaktion anzeigt, weist eine Färbung auf, die Peptiäbindungen und Aminosäuren in der ilinhydrinreaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure anzeigt und weist eine färbung auf, die Zucker in der Phonol-Schwefelsäurereaktion der Anthron-Schwefelsäurereaktion, der Indol-Schwefeisäurereaktion und in der Irvptophan-Schwefelsäurereaktion anzeigt}

3) Erscheinungsbild und Löslichkeit: weißes Pulver, löslich in Wasser, wäßrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer sowie schwerer löslich in Benzol, Hexan und Ghloroformj

4) Zuckergehalt: 30 bis 37 % mit einer Zuckerzusammensetaung von 20 bis 23 % Hexosen, 6 bi3 8 % Hexosaminen und 4 bis 6 % Sialsäurenj

5) Isoelektrischer Punkt: 4,2 bis 7,3»

6) Adsorptionsfähigkeit: adsorptionsfähig an Ulex europeus agglutininkonjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2)j

-7- 62 765/12

7) Stabilität: stabil in wäßriger Lösung von pH 2,0,

pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4 ⁰C über 24 Standen oder länger, sowie in wäßriger Lösung von pH 7,0 bei 60 ⁰G über 3 Stunden oder längerj und

8) Cytotocizität: selektive Schädigung von Tumorzellen ohne wesentliche Schädigung normaler Zellen;

1) Molekulargewicht: 7 000 - 9000}

2) Farbreaktionen: weist eine Färbung auf, die Proteine nach der'Lowryreaktion anzeigt, weist eine Färbung auf, die Petidbindungen und Aminosäuren in der Ninhydrinreaktion nach Hydrolse mit Salzsäure anzeigt und weist eine Färbung auf, die Zucker in der Phenol-Schwefelsäurereaktion, in der Anthron-SchwefelSäurereaktion, in der Indol-SchwefelSäurereaktion und in der Tryptophan-Schwefelsäurereaktion anzeigt;

3) Erscheinungsbild und Löslichkeit: weißes Pulver, löslich in Wasser, wäßrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer sowie schwerer löslich in Benzol, Hexan und Chloroform^

4) Zuckergehalt: 8 bis 15 % aiit einer Zuckerzusammensetzung von 6 bis 10% Hexosen, 1 bis 2 % Hexosaminen und 1 bis 3 % Sialsäurenj

5) Adsorptionsfähigkeiten: adsorptionsfähig am Karboxymethylzellulose bei Ionenaustauschchromatografie unter Verwendung von Karboxymethylzellulose in 0,05 M Phosphatρuffer (pH 6,4)J

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β) Stabilität: stabil in wäßriger Lösung bei pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4 ⁰C für 24 Stunden oder länger und in wäßriger Lösung von pH 7,0 bei 60 ⁰G für 3 Stun-, den oder länger?

7) Cytotoxizität: selektive Schädigung von Tumorzellen ohne wesentliche Schädigung normaler Zellen;

8) die Aminosäuresequenz des N-Terminals des Proteinteiles ist Al an in- Alanin- „

Das erfindungsgemäße Verfahren wird wie folgt durchgeführt:

Ein Antitumor-Glj'koprotein GB mit einem größeren Molekulargewicht als dem gewünschten Molekulargewicht, das aus einem Zellextrakt oder dem überstehenden einer Kultur abgetrennt und gereinigt -worden ist, wird bei einer entsprechenden Konzentration von beispielsweise 10 bis 10 000 ug/ml gelöst und einer Abbaubehandlung durch Umsetzen mit einer entsprechenden Menge eines Reduktionsmittels unterworfen. Das Reaktionsgemisch wird dialysiert, das Dialysat ausgesalzen und die dabei angefallenen Niederschläge-werden abfiltriert· Danach werden diese Niederschläge in einer geringen Menge physiologischer Kochsalzlösung oder einer gepufferten Lösung gelöst und nach Bialyse die Lösung einer Gelfiltration unter Einsatz von Sephadex G-50 unterworfen, um ein Antitumor-Glykoprotein mit dem gewünschten .Molekulargewicht zu erhalten«

Unter dem hier- verwendeten Begriff "Abbaubehandlung¹¹ ist eine Behandlung zu verstehen, bei der ein. Glykoprotein mit größerem Molekulargewicht in ein Glykoprotein mit geringerem Molekulargewicht durch chemisches Brechen der intramolekularen Bindungen, wie der Disulfidbindungen, umgewandelt wird·

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Das geeignete Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren ist CB₂₁ oder CB^₂, obgleich CB^ auch eingesetzt werden kann, wenn CB ein gewünschtes Produkt ist. Während

X.2

da bevorzugte Ausgangsmaterial eine Lösung von gereinigtem CB_z1 und/oder CB^₂ in Pufferlösung, physiologischer Kochsalzlösung, destillierten Wasser usw. eingesetzt wird, ist es ebenfalls möglich, einen Zellextrakt oder das überstehende einer Kultur, die CB enthält, per se zu verwenden«,

CB kann aus einem Extrakt oder dem überstehenden einer Kultur von Reticuloendothelialzellen, Lymphoblasten, Leukämieζeilen .oder Fibroblasten von warmblütigen Lebewesen erhalten werden. Die Einzelheiten des Verfahrens zur Herstellung und des Antitumoreffektes von CB sind in der US-Aameldung 46? 840 vom 18.2.1983 enthalten. Auf die Beschreibung dieser Anmeldung wird hier Bezug genommen«

Beispiele für das Reduktionsmittel, das in dieser Erfindung verwendet werden kann, sind Thiolverbindungen wie 2-Merkaptoethanol, Dithiohreitol, Dithioerytkritol, Thioglykolsäure, Monothiophosphorsäure usw·} Metall-Wasserstoff-Komplexe wie Uatriumborhydridj tertiäre Phosphine wie Tri-n-butylphosphin, tris-Diethyläminöethylphosphin usw.j Sulfite wie Natriumsulfit; Cyansäuresalze wie Cyanbromid} Metallionen wie das Süberion usw. . Bs handelt sich dabei um solche Verbindungen, die allgemein für die Zersetzung und Entfernung von proteinartigen Verunreinigungen hohen Molekulargewichtes, für den Abbau einer höheren dimensionierten Struktur eines Proteins und zur Analyse der Grundstruktur dieses Proteins und so weiter verwendet werden« Die mit diesen Verbindungen behandelten Verbindungen verlieren oft ihre biologische Wirksamkeit, und es ist überraschend, daß die Abbaubehandlung möglich ist ohne Verlust der Antitumor-Wirk3amkeit bei der vorliegenden Erfindung.

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Die Bedingungen für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wie Konzentration des Reduktionsmittels, die Behandlungstemperatur, die Behandlungszeit, der Behandlungs-pH-· 'wert usvi/* können entsprechend gewählt werden in Abhängigkeit von der Aufgabe, beispielsweise, on GB oder CB - erhalten

v/erden sollen, allein oder beide gleichzeitig usw.» Das Reduktionsmittel kann bei einer Konzentration von 10 bis 10 Ii, vorzugsweise zum Beispiel bei 10 ^J bis 10 M 2-Merkaptoethanol, 10 bis 10""* M Dithiothreitol, 10~² bis 1.0" M Dithioerythritol, 10"* bis 10" Monothiophosphorsäure, 10~² bis 10"*⁵ M rJatriumborhydrid oder 10""¹ bis 10 M Thioglykolsäure eingesetzt werden« Die Betiandiungstemperatur ist nicht im einzelnen vorgeschrieben, solange das Glykoprokin nicht zersetzt wird, wobei sie bei 0 bis 37 °G, vorzugsweise um Zimmertemperatur von 15 bis 25 ⁰C liegt. Die Behandlungszeit kann entsprechend gewählt werden, so daß man GB erhält mit einem, erv^ünschten Molekulargewicht, und sie liegt im allgemeinen im Bereich von 10 Minuten bis 2 Stunden, Der pH-Wert wird gewählt, so' daß er im Bereich von leicht sauer bis neutral liegt, beispielsweise zwischen etwa pH 5,5 bis 7,5«

Weiterhin wird bei der Abbaubehandlung ein oberflächenaktives Mittel, beispielsweise ein ionisches oberflächenaktives Mittel wie Hatriumdodecylsulfat (SDS), ein nicht ionisches oberflächenaktives Mittel wie Triton J. usw, vorzugsweise im Reaktionsgemisch eingesetzt, um die Ausbeute zu erhöhen» Die Optimalkonzentration des oberflächenaktiven Mittels hängt vom Ausgangsmaterial bei der Abbaubehandlung ab, sie liegt geeignet erweise im Bereich von 0,001 bis 10 %» Zu den ionischen oberflächenaktiven Mitteln gehören anionsehe, kationische und amphothere· Beispiele für geeignete anionische oberflächenaktive Mittel sindSDS, Salze der Cholsäure usy/., Beispiele für kationische sind Dodecyltrimethvlammoniumbromid usw., und Beispiele für die amphoteren sind Desoxylysolecithin usw.,. Beispiele für nichtionische oberflächen-

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aktive Mittel sind Triton, die vom Tweentyp, die vom Spantyp usw. . Ss können Gemische oder einzelne Mittel verwendet werden»

Die Erfindung wird näher in den folgenden, nicht-beschränkenden Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

a) Herstellung des Ausgangsmaterials

Ss wurde CB mit größerem Molekulargewicht (z. B, CB ., CB ₀ und CB ) als Ausgangsmaterial in den Beispielen 1 bis 7 hergestellt.

Humanlymphozyten (2 χ 10 Zellen) wurden in 4 000 ml Saglemedium, das 10 % Kalbsserum enthält, suspendiert und nach der Zugabe von Phytohemagglutinin (Difco Co*) bei einer Sndkonsentration von 50 ^ig/ml bei"37 ⁰C über 48 Stunden in einer aus 5 % CO₂ und 95 % Luft bestehenden Atmosphäre kultiviert«, Danach wurde das Überstehende des Kulturmediums dialysiert gegen 0,01 M Phosphatρuffer (pH 7,2), und man erhielt eine mit 40 bis 80%igem Ammoniumsulfat ausgesalzene Fraktion aus dem Dialsat. Diese Fraktion wurde redialysiert gegen ein Phosphatpuffer und dann einer Gelfiltration iToer Sephadex G-100 (Pharmacia Co.) unterworfen.

Man erhielt rohes CB ,, ^CB _S2 ¹^ ^CB ^¹ ^^rairt i°^nen ^m^ entsprechenden Molekulargewichten von 70 000 bis 90 000, 40 000 bis 50 000 und 12 000 bis 17 000,

Rohes CB- wurde an Ulex europeus Agglutinin-konjugiertem Sephadex adsorbiert und mit 0,01 M Phosphatρuffer, der 0,5 M Fucose enthielt, eluiert. Ifech der Entfernung von Fucose durch Dialyse wurde CH - nochmals an Ulex europeus Agglutinin-konju-

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giert em. Sephadex adsorbiert und im Anschluß daran nach der Gradientenmethode unter Verwendung von Phosphorpuffer (pH 7,2) eluiert, wobei gereinigtes 0Β_χ1 eluiert wurde» Gereinigtes GB_x1 mit einer spezifischen Aktivität von 50 000 Einheiten pro mg erhielt man in einer Gesamtmenge von 5 000 Einheiten in einem Arbeitsgang*

Rohes GB^₂ wurde in gleicher Weise gereinigt und man erhielt gereinigtes OB λ niit einer spezifischen Aktivität von 20 800 Binheiten/mg in einer Gesamtmenge von 5 200 Einheiten in einem Arbeitsgang.

Rohes CB wurde in gleicher Weise gereinigt, und man erhielt gereinigtes GB„ mit einer spezifischen Aktivität von 10 000 Einheiten/mg in einer' Gesamtmenge von 10 000 Einheiten in einem Arbeitsgang. Man erhielt auch gereinigtes GB mit einer

.Λ.

spezifischen Aktivität von 7500 Einheiten/mg in einer Gesamtmenge von 150 Einheiten, ausgehend von der gleichen Anzahl Humanlymphozyten bei gleicher Arbeitsweise, allerdings mit der Ausnahme, daß kein Phytrohemagglutinin im Kulturmedium vorhanden war.

Die Aktivität ist über die ganze Beschreibung hinweg auf der Konzentration basierend angegeben, die 50 % der ZeilVermehrung von 10^ Zellen von KB-Zellen, die als eine Einheit genommen wurden, inhibiert.

b) Abbaubehandlung

200 000 Einheiten von CB^₁ (Molgew, 70 000 bis 90 000) wurden in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und eine Stunde bei Zimmertemperatur in Anwesenheit von 5 x 10 M 2-Merkaptoethanol umgesetzt« !lach der_; Reaktion wurde das - Reaktionsgemisch dialysiert mit 80 % Ammoniumsulfat ausgesalzen und die ausgefällte Fraktion abfiltriert. Diese Fraktion wurde gelöst

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in physiologischer Kochsalzlösung und der Gelfiltration unter Einsatz von Sephadex G-50 unterworfen. Die den Molekulargewichten 40 000 bis 50 000, 12 000 bis 17 000 und 7 000 bis 9 .000 entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und als Fraktion A, Fraktion B und Fraktion C entsprechend bezeichnet. Die oben genannten Verfahrensschritte wurden auch in Anwesenheit von 0,05 % SDS wiederholt, wobei die gleichen Fraktionen erhalten wurden»

Die physiochetnisehen Eigenschaften dieser Fraktionen A, B und G wurden untersucht, und sie wurden entsprechend als GB _o, GB und CB - identifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt·

Tabelle 1; Physiochemische Eigenschaften der Fraktionen A bis C

Fraktion A Fraktion B ; Fraktion G (MG 4QQOO-5OOOO (MG 12000-17000) (MG, 7OOO-9QOO

Identifizierung ^cb~q ^GBv ^CB^-^

Erscheinungsbild und weißes Pulver} löslich in V/asser, wäßr. MaCl und Phosphatpuffer Löslichkeit sowie schwerer löslich in Benzol, Hexan und Chloroform

Farbreakt ion	Blau	(Peptidbindungen)
L ο wry	Violettblau	(Aminsäuren)
Ninhydrin	Graubraun	(Zucker)
Phenol-Schwefel säure*^	Grünblau	(Zucker)
Anthron-Schwefel- säure2	Violett	(Zucker)
-Naphthol- ₂ Schwefelsäure	Graunbraun	(Zucker)
Indol-Schwefel- säure2	Grauviolett	(Zucker)
iCcyptophan-Schwe- felaäure²	Farblos	(keine Lipoide)
HoIff³

ro

-ο er*

Fortsetzung Tabelle

Fraktion A	Frakt	ion B	Frakt ion
30 -	27 -	33 %	8 -
20 -	17 -	20 %	6 -
6 -	5 -	7 %	1 -
4 -	5 -	6 %	1 -
• 37 %	- 15 %
- 23 %	- 10 %
- 8 %	- 2 %
- 6 %	- 3 %

Zuckergehalt Hexose Hexosarain Sialeäure

Adsorptionsfäiiigkeit

Adsorptionsfähig an Ulex europens Agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatρuffer (pH 7,2)

Adsorptionsfähig an iCarboxymethyl cellulose bei lonenaustauschchromatografie mit Karb· oxyoiethylzelluloae in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,4)

Isoelektrischer Punkt-

Stabilität

Oytotoxizität

4,2 - 7,3

6,3 - 7,8

Stgbin in wäßr. Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4 ⁰C für 24 Std. oder langer und in wäßr» Lösung von pH 7,0 bei 60 ⁰O fur 3 Std. oder langer

Selektive Schädigung von Tumorzellen ohne wesentliche Schädigung normaler Zellen

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Erläuterungen zur Tabelle

ITaeh. der Methode von Seikagakn Jikken Koza, Bd. 1 (Tanpakushitsu Teiryohou) 197.1

Spiro, H. Α., Methoden der Enzymologie, Bd, 8, S. 3-26, 1966

Isoelektrofokussieren unter Verwendung von Ampholin

10^ Zellen wurden in 1 ml 10 % Kalbaserum enthaltenden Bagle-Medium. kultiviert und jede Fraktion.bei 37 ⁰C über .48 Stunden in einer Atmosphäre, bestehend aus 5 % CO₂ und 95 % Luft, Anschließend wurde die Zahl der lebensfähigen Zellen, die 3ich nicht durch Trypanblau anfärben ließ, gezählt und die Konzentration der Fraktion, bei der 50 % der Zellen abgetötet wurden, ala.Maß für die "Gytotoxizität genommen.

Der Erhalt der Aktivität jeder Fraktion in Beispiel 1 ist aus Tabelle 2 zu entnehmen*

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Tabelle 2

Ab heilbehandlung

CB,

Aktivität (Einheiten)

^GB

X2

^GBX3

Vor Behandlung 200 000

2-Mercaptoethanolbehandlung 0

2-Mercaptoethanolbehandlung

10 000 160 000 15 000

SDS Behandlung

5 000 150 000 25 OQO

Beispiel 2

200 000 Einheiten GB ₂ wurden in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und eine Stunde bei Zimmertemperatur mit 5 χ 10 M 2-Merkaptoethanol uingesetzt, lach der Reaktion wurde das Gemisch dialsiert und mit Ammoniumsulfat ausgeaalzen_s um eine Fraktion zu erhalten, die anschließend einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-50 unterworfen wurde« Die Fraktionen mit einem Molekulargewicht von 12 000 bis 17 000 (Fraktion B) und 7 000 bis 9 000 (Fraktion C) wurden gesammelt.

Die dem genannten Verfahrensschritt wurden auch wiederholt in Anwesenheit von 0,05 % SDS. Die Fraktionen wurden als CB und CB ο nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise bestimmt. Der als Ergebnis erhaltene Aktivitätserhalt ist aus Tabelle zu entnehmen,»

	^GBx2	-18-	tat (	62	765/12	^GBx3
Tabelle 3	200 000		GB_x			—
	0	Aktivi	—	Einheiten)	000
Abbaubehandlung	0		000		000
Tor Behandlung			000
2-Mercaptoethanol- behandlung		170		20
2-Mercaptoethanol- behandlung	140		37
SDS Behandlung
Beispiel 3

200 000 Einheiten CB „ wurden mit 5 x 10~^ M 2-Merkaptοethanol

«aw

behandelt und man erhielt eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 7 000 bis 9 000 (Fraktion G) in ähnlicher weise wie im Beispiel 1. Die Fraktion wurde als GB ο wie im Beispiel 1 identifiziert· Der Aktivitätserhalt von gewonnenem

^Sx3 ^{isi; aus} '^^abelle 4 zu entnehmen.

Tabelle 4

Aktivität (Einheiten) Abbaubehandlung ~ GB ' "" C

Yor Behandlung 200 000

2-Mercaptoethanol-

behandluag 110 000 58 000

2-Mercaptoethanol-

behandlung

+ 90 000 73 000

SDS Behandlung - ;

Beispiel 4

Ein Gemisch von 100 000. Einheiten GB^₁ und 100 000 Einheiten GB ο wurde mit 5 χ 10"*^ M 2-Merkaptöethanol ähnlich wie im Beispiel 1 behandelt. Der Aktivitätserhalt der gewonnenen GB_x und 0Β_χο ist aus Tabelle 5 zu entnehmen»

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Tabelle 5	Aktivität	(Einheiten)
-	r"Q PT) ^G3x1 ^x2*	⁰V ^CB*3
Abbaubehandluag

Vor Behandlung 100 000 100 000

2-Mercaptoethanol-

behandlung 0 20 000 150 000 20 000

2-Mercaptoethanol behandlung

. + 0 3 000 HO 000 42 000

SDS-Behandlung ._ -

Beispiel 5

Ein Gemisch von 100 000 Einheiten C3 .j und 100 000 Einheiten

GB wurde mit 5x1O M 2-Merkaptoethanol ähnlich wie in Beix.

spiel 1 behandelt* Der Aktivitätaerhalt der gewonnenen GB 2» CB und CB ^ ist aus Tabelle 6 au entnehmen.

Tabelle 6

Aktivität (Einheiten)

Abbaubehandlung CB^₁ GB^₂ ' 0Β

Vor Behandlung 100 000 - 100 000

2-Mercaptoethanol-

behandlung 0 19 000 130 000 40 000

2-Mercaptoethanolbehandlung

+ 0 7 000 120 000 57 000

SDS-Be han dl ung , „

Beispiel 6

Ein Gemisch von 100 000 Einheiten CB_ und 100 000 Einheiten

GB ρ wurde, mit 5x10 M 2-Merkaptοethanol ähnlich wie in Beispiel 1 behandelt. Der Aktivitätserhalt der gewonnenen GB^ und GB ο ist aus Tabelle 7 au entnehmen.

-20- 62 765/12

Tabelle 7

Aktivität (Einheiten)

Abbaubehandlung	^GBx2	^GBx "	^CBx3
Vor Behandlung 2-Mercaptοethanol behandlung 2-Mercaptoethanol- behandlung SDS-Behandlung	100 000 0 0	100 000 120 000 90 000	0 65 000 _-- 77 000
Beispiel 7

Ein Gemisch von 100 000 Einheiten CB., 100 000 Einheiten CB 2 us-ä- 1°° ⁰⁰° Einheiten CB wurde mit 5x10 ' M 2-Eerkaptoethanol ähnlich wie im Beispiel 1 behandelt« Der Aktivitätserhalt der gewonnenen CS „ CB und CB-, ist aus Tabelle 8 zu entnehmen,

Tabelle 8

Aktivität (Einheiten)

100 000	1	00	100
0		23	240
0		8	240

Abbaubehandlung - 0Β_χ1 0Β_χ2 CB^

Vor Behandlung

2-Mercaptoethanol 0 23 000 240 000 22 000

behandlung

2-Mercaptoethanolbehandlung

_ — — ^ 3 ₀₀₀

SDS Behandlung -

Beispiel 8

Ein Gemisch von 100 000 Einheiten CB -j, 100 000 Einheiten CB ₂ und 100 000 Einheiten. CB wurde mit jedem Reduktionsmittel gemäß Tabelle 9 nach einem ähnlichen Verfahren wie dem des Beispiels 1 behandelt. Der Aktivitätserhalt der erhaltenen CB _o, CB und CB - ist aus Tabelle 9 zu entnehmen·

-21- 62 765/12

Tabelle 9

Thioglykolsäure	-6 10 M	0
Monothiο-phos phorsäure ·	10⁵M	0
Tri-n-butylphos- phin	-6 10 M	0
Tris-diethylamino- ethylphosphin	-6 10 M	0
Natriumsulfat	-7 10 M	0
Gyanbromid	-6 10 M	0
Silberion	-6 10 M	0

Reduktionsmittel Konzen- Aktivität (Einheit en) *^ratlOnCB_x1 CB^ CB_x Vor Behandlung - 100 000 100 000 100 000

26 000 240 000 25 000

27 000 260 000 11 000

23 000 230 000 32 000 21 000 230 000 27 000 25 000 220 000 29 000

24 000 240 000 28 23 000 240 000 25

Beispiel 9

1 χ 10¹¹ Zellen der Human-BALL-1-Zellen (Miyoshi, Nature, Bd. 267, S. 843-844, 1977); die subkutan bei der unbehaarten Maus vermehrt worden waren, wurden in 20 1 Eagle-Medium suspendiert, das 10 % Kalbsserum enthielt, und nach dem Zusatz von 1x10⁸ pfu Sendai-Virus bei 37 ⁰C 48 Stunden in einer Atmosphäre, bestehend aus 5 % GO₂ und 95 % Luft, kultivier-!;· Das daraus erhaltene Überstehende der Kultur wurde als Ausgangsmaterial eingesetzt und enthielt im Gemisch GB ₁, CB 2t ^{CB 1211}O- ^G3 3· Unter Zusatz von 10" M 2-Merkaptoethanol und 0,1 % SDS bei Zimmertemperatur wurde über 1 Stunde die Abbaubehändlung durchgeführt. Das Reaktionsgetnisch wurde dialysiert und mit Ammoniumsulfat ausgesalsen, wobei man eine Fraktion erhielt, die einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-50 unterwarf und als Ergebnis GB o, GB und CB ^ erhielt· Die Ergebnisse sind aus Tabelle

9 zu entnehmen.

-22- 62 765/12

Tabelle 10

Abbaubehandlung *

Vor Behandlung . 47 000 49 000 98 000 500 ITach Behandlung 0 1 000 150 OQQ 37 000

Beispiel 10.

Das Verfahren nach Beispiel 9 wurde v/iederholt mit der Aus-

—7 nähme, daß 5x10 M 2-Merkaptoethanol ala Reduktionsmittel

und jede der in Tabelle 1 aufgeführten Verbindungen bei einer gegebenen Konzentration als oberflächenaktives Mittel eingesetzt wurde« Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 11 enthalten«

Tabelle 11

Reduktionsmittel oberfl,aktives Aktivität (Einheit)

(Konzentration) Mittel _{ητι nri ητ}> _η-η j- (Konzentration) x1 x2 χ x3

Vor Behandlung "48.000 51 000 99 000 400

Cholsäure

(0,01 %) 0 2 000 154 000 3β 000

Dodecyltri-

mat hvlamnioni um

bromid (0,01 %) 0 1 000 149 000 39 000

2-Mercapto- Desoxyly-sole-

ethanol cithin (0,01 %) 0 3 000 160 000 31 000

(5 χ 10~⁷ M) Tween 20 0 2 000 159 000 29 000

(0,01 %)

Soan 60

(0,01 %) 0 1 000 158 000 31 000

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Beispiel 11

9 5x10-^ Zellen von Rinder-Peripherielymphozyten wurden in 1000 ml Eagle-Medium suspendiert das 10 % Kalbsserum enthielt, und dann bei 37 °C 48 Stunden in einer Atmosphäre von 5 /o CO₀, 95 % Luft kultiviert. Das Überstehende der

—Ϊ Kultur wurde durch Zugabe von 10 ^ M. Dithiothreitol bei Zimmertemperatur für 2 Stunden einer Abbaubehandlung unterworfen, woran sich ähnliche Verfahrenssehritte wie jene des Beispiels 9 anschlössen. Man erhielt CB ₂, CB und CB ~. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 aufgeführt.

Tabelle 12 Aktivität (Einheiten)

Abbaubehandlung _{CB QB CB}

Vor Behandlung 13 000 12 000 23 000 200 Bach Behandlung 0 1 000 32 000 11 000

Beispiel 12

3x10¹⁰ Zellen von Humanfibroblasten -J/ο Hf 7 000 Zellen wurden in 6 000 ml Bagle-Medium, das 10 % Kalbsserum enthielt, suspendiert und nach Zugabe vom Phytohemagglutinin, um eine Bndkonzentration von 50 /ug/ml zu erreichen, bei 37 ⁰C, 48 Stunden in einer Atmosphäre aus 5 % CO₂, 95 % Luft kultiviert. Das daraus erhaltene Kulturüberstehende wurde als Ausgangstnaterial benutzt. Dieses Überstehende der Kultur enthielt im Gemisch OB ^, CB ₂, CB₃. und CB ~· Die Abbaubehandlung dieses überstehenden der Kultur wurde in Anwesenheit von 0,1 M ITatriumborhydrid bei-Zimmertemperatur über 2 Stunden durchgeführt, danach gefolgt von ähnlichen Verfahrensschritt en wie denen des Beispiels 8, wobei man CB ρ» CB und CB - erhielt. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 13 zu entnehmen.

-24- 62 765/12

Tabelle 13

Aktivität (Einheiten)

Äbbaubehandlung _{rTi P1V}- _„ ₍

Vor Behandlung 16 OOO 18 000 35 000 600

lach. Behandlung 0 1 700 52 000 17 000

Beiapiel 13 "10

2x10 Zellen von Human-Peripherielymphozyten wurden in 4 000 ml Eagle-Medium suspendiert, das 10 % Kalbsserum enthielt, und nach der Zugabe von Phytohemagglutinin, um eine Sndkonzentration von 50 ug/ml- zu erhalten, bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5 % CO₂ und 95 % Luft 48 Stunden kultiviert. Das daraus erhaltene Überstehende der Kultur wurde als Ausgangsmaterial benutzt und enthielt im Gemisch CB₁, CB ρ» OB und CB ^» Die Äbbaubehandlung dieses überstehenden der Kultur wurde durch Zugabe von 5x10 M Dithioerythritol bei Zimmertemperatur über eine Stunde durchgeführt, gefolgt von ähnlichen Verfahrenssehritten wie im Beispiel 8, wobei man CB -» OB und CB « erhielt. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 14 zu entnehmen»

Tabelle 14

	Aktivität	25 2	(Einheiten)	CB	x3
Ab baübe handlung	^GBx1		^GBx2 ^GBx	13	800 000
Vor Behandlung Mach Behandlung	23 000 0		000 51 000 000 83 000
Beispiel 14

^° Zellen von Human-BALL-1-Zellen, die durch eine Hautkultur vermehrt worden" waren,- wurden in 2 000 ml Sagle-Medium suspendiert, das 10 % Kalbsserum enthielt, und bei. 37 ⁰C 48 Stunden in einer Atmosphäre aus 5 % CO₂ und 95 %

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Luft kultiviert.

Das daraus erhaltene Überstehende der Kultur wurde als Ausgangsprodukt eingesetzt und enthielt im Gemisch CB ., CB ₂, CB und CB ^, Die Abbaubehandlung dieses Überstehenden der Kultur erfolgte in Anwesenheit von 5^:10"" M 2-Merkaptoethanol bei Zimmertemperatur entweder für 2 Stunden oder für 5 Minuten, gefolgt von ähnlichen Verfahrensschritten wie im Beispiel 8, wobei man CB ₂, CB und CB -,.erhielt. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 15 zu entnehmen.

Tabelle 15

Aktivität (Einheiten)

Abbaubehandlung _r

x2

"Vor Behandlung 5 200 Nach Behandlung (2 Std,) 0 Hach Behandlung (5 min) 3 600

4	900	1	1	000	7	1	10
	300	1	3	000		1	00
5	400	1	2	000	1	20

Bei Durchführung der Abbaubehandlung über 5 Minuten konnte man CB _o und CB in hohen Ausbeuten erhalten, während man

, A.C. Ti

bei der 2 stündigen Abbaubehandlung CB^ und CB ~ in hohen Ausbeuten erhielt.

Beispiel 15

Reinigung von 0Β_χ2, CB₃₅. und

Rohea CB 2» ^_x ⁰^ ^GB 3» 3-^{as 0}^ nach den vorangegangenen Beispielen erhielt, kann gewünschtenfalls weiter gereinigt werden in einer Weise, wie dies für die Reinigung biologischer Substanzen üblich ist. ,

-26- 62 765/12

CB ο us-ä- GB wurden beispielsweise nach dem Verfahren von Beispiel 1a) gereinigt for*.-die ..Herstellung des Ausgangs— materials unter Verwendung von Ules europeus Agglutininjonjugiert em Sephadex. Dabei fielen gereinigte GB ₂- und GB -Präparationen mit spezifischen Aktivitäten von 2400 Einheiten/mg und 2500 Einheiten/mg -an»

CB λ wurde beispielsweise durch Adsorption an Goncanavalin Α-konjugierter Sephalose gereinigt, gefolgt von einer Eluierung- mit 0,01 M Phosphatρuffer (pH 7,2), der 0,5 M OC-Methyl-D-mannosid enthielt·

Nach Entfernung des ^ -Methyl-D-mannosids durch Dialyse wurde die Lösung auf Garboxymethylzellulose gegeben, die mit 0,05 M Phosphatρuffer (pH 6,0) ins Gleichgewicht gebracht worden τ/ar, und im Anschluß daran mit 0,05 M Phosphatρuffer (pH 7,8) eluiert· Man erhielt eine gereinigte GB ^-Präparation mit einer spezifischen Aktivität von 2100 Einheiten/mg_#

-27- 62 765/12

Effektivität, Toxizität, Verwendung und Dosierung von erfindungsgemäß hergesteilten GB

Versuch 1

Selektivität des cytotoxischen Effektes Proben von 1Cr Zellen jeder der besonderen Tumorseilinien einschließlich KB-Zellen (2?asopharynx-Krebs), MX-1-Zellen (Brustkrebs, von Dr. Shigem Tsukagushi, Krebsinstitut, übermittelt), ΗΞρ-2-Zellen (Kehlkopfkrebs) und HSL-ZeIlen (Hepatoma, Plow Go.) sowie von normalen Zellinien einschließlich von Da-m 407-Zellen, Girardi-Herzzellen, Chang-Leberzelien, Vero-Zellen (Affenniere) und MDGK-ZeIlen (Hundeniere) (Plow Co.), die alle jeweils für 24 Stunden vorkultiviert worden waren, sowie 1Cr Zellen von P388 und L1210 (Leukämie, von Dr. Shigeru Tsukayoshi, Krebsinstitut, übermittelt), die unmittelbar eingesetzt wurden, wurden jeweils in 1 ml Eagle-Medium, das 10 % Kalbsserum enthielt, bei 37 ⁰C 48 Stunden in einer Atmosphäre von 5 % GO₂, 95 % Luft kultiviert»

Danach wurde die Zahl der lebenden Zellen, die nicht durch Trypanblau. angefärbt wurden, unter einem Licht-Mikroskop gezählt und die Konzentration der Testsubstanz, bei der 50 % der Zellen abgetötet wurden, gegen eine Kontroilsübstanz, die als 100 gesetzt wurde, berechnet. Als Testsubstanzen wurden 0Β_χ2> ^Β_χ und GB , nach Beispiel erhalten, &-, ß- und/-Lymphotoxine, die nach einer bekannten Methode erhalten wurden [Granger G«A. et al.,, Cellular Immunology, Bl. 38 _t S. 388-402 (1978)] und Mitomycin G eingesetzt. Eine Einheit des Lymphotoxins wird durch einen konventionellen Index ausgedrückt, der auf der Cytotoxizität von Maus-L-Zellen basiert (Hrsg· Bloom & Grade, in vitro Methods" in Gell-tne diät ed "Immunity, Academic Press, 1979)· Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 aufgeführt»

Tabelle 16	Art	Maus	Hund	Einh. ml	Konzentrationen	1,0	für 50	% Wachstumainhibierunp;	j-Lympho- Mitomycin C toxin Einheit ml (/ig/ml)	36	ro
		Human		1,0	^CBx2 ^CBÜ Einheit Einh. ml ml	1,5	a-Lympho toxin Einheit ml	ß-Lympho- toxin Einheit ml	7	17	CO
	Human	Girardi Human Heart Chang Human Liver Vero Affe		1,5	1,0	1,4	18	20	7	24
	Human	MUCK	1,2	1,6	1,7	6	5	-	31	ro
	Human	1,7	1,3	3,0	-	-	-	42	-J σ\ VJI
	Human	3,1	1,6	_L.4	-	-	-	36
	L121Q Maus	3,0	3,3	1000	-	-	_	33
Zell	P388	1000	3,1	1000 1000 630		—	81	21 20 51
name	Intes tine 407	1000 1000 610	1000	530	77	91	9	43
KB	540	1000 1000 620		10	9
H£p~2		550		—
Tumor- HEL
zellen BiDC-I



Nor mal- zel len

-29- 62 765/12

Wie aas den obigen Ergebnissen hervorgeht, schädigt GB selektiv Tumorzellen ohne im wesentlichen irgendwelchen Schaden an normalen Zellen hervorzurufen. Im Gegensatz dazu zeigen aowohl<* -» ß- und^-Lymphotoxin als auch Mitomycin G eine nichtselektive Cytotoxizität bei normalen und Tumorzellen*

Versuch 2

Einfluß auf die Maus, transplantiert mit Sarcoma 180 oder Bhrli ch-T umor

Männliche Mäuse (ddY-Stamm) mit 25 bis 30 g Körpermasse wurden intraperitoneal mit 3x10 Zellen pro Tier Sarcoma 180 oder Ehrlich-Asciteatumor transplantiert und die Überlebenazeit in Tagen beobachtet.

Nach Beispiel 13 erhaltenes GB , CB ρ und GB- wurde intravenös Gruppen von 5 Mäusen täglich ab einen Tag nach der Transplantation bis zum Tod verabreichte Die Ergebnisse sind in Prozent als Durchschnittsüberlebenstage der Testgruppen denen der Kontrollgruppe gegenübergestellt und in Tabelle 17 aufgeführt«

	^CBx3	CB_x3	Tägl	-30-	62 765/12
Tabelle 17			1,2
			4	. Dosis
Tumor Test Substanz	Mitomycin G	Mitomycin G	12	Sinheiten/kg	Durchschnittliche Überlebenstage
	Gyclophos- phamid	Cyclophoa- phamid	1	Einheiten/kg	112
	y ρ π		3	Sinheiten/kg	132
			10	Sinheiten/kg	165
Sarcoma CB «		1	Einheiten/kg	114
180	Ehrlich ^GBx2 Ascites	3	Einheiten/kg	134
	Tumor	10	Einheiten/kg	160
0,5	Einheiten/kg	109
20	Sinheiten/kg	133
1,2	mg/kg.	154
4	mg/kg	141
12	Sinheiten/kg	170
1 3	Einheiten/kg	140
10	Einheiten/kg	160
1	Einheiten/kg Einheiten/kg	186
.3	Sinheiten/kg	136 164
10	Einheiten/kg	187
0,5	Einheiten/kg	140
20	Einheiten/kg	155
mg/kg	181
mg/k«	165
205

62 765/12

Versuch 3

Einfluß auf die Überlebenstage beim Lungenkrebs der Maus

Männliche Mäuse des BDI?.,-Stammes von 20 bis 25 g Kö'rpermasse wurden mit 2x10 ^Zellen von Lewis-Lungenkrebs am rechten Oberschenkel intramuskulär transplant iert und die tiberlebenstage beobachtet, ITach Beispiel 15 erhaltenes GB₂, CB^2 U-ftcl GB- wurden Gruppen von 6 Liäusen täglich ab einen Tag nach der Transplantation bis zum Tode verabreicht. Die Ergebnisse sind in Prozent der Durchschnittaiiberlebenstage der Testgruppen im Verhältnis sur Kontrollgruppe abgegeben und aus Tabelle zu entnehmen«

Tabelle 18

	Tägliche Dosis	I Einheiten/kg Einheiten/kg 3inheiten/kg	Durchschnittliche Überlebenstage (%)
Testsubstanz	4 12	Einheiten/kg Einheiten/kg Einheiten/kg	108 114 150
^CB*	1 3 10	Einheiten/kg Sinneiten/kg Einheiten/kg	107 123 145
^0Bx2	1 3 10	mg/kg	116 140 158
^CBx3	0,5	mg/ks;	120
Mitomycin C	20		162
Cvclophosphamid

62 765/12

Versuch 4

Einfluß auf Krebs-Lungenmetastasen

Männlichen Mäusen dea BDF..-Stammes mit einer Körpermasse von 20 bis 30 g, und zwar 6 Tiere je Gruppe, wurde subkutan in ihre Rücken ein 2 mm großes, quadratisches Segment von Lewis-Lungenkarainom. transplant iert.

!lach Beispiel 15 erhaltenes CB^, CB

CB ^ wurde einmal

am Tag über 12 Tage vom 9.Tag.nach der Transplantation an intravenös verabreicht. Am 21, Tag nach der Transplantation wurde die Hasse an Primärtumor isoliert und gewogen und die Ansah! der metastasierten Knoten in der tierischen Lunge nach der Methode von Y/exler, H, Cl♦ Uati«. Cancer Inst,, Bd, 36, 641, 1966) berechnet. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 19 zu entnehmen.

Tabelle 19

Testsubstanz

(Sinheiten/kg)

'i'umormasse	Anzahl der
	metastasierten
	Knoten in der
(g)	Lunge
8,8+ 0,8	30,1 + 5,6
4,4 ± 1,4^s	6,7 + 2,9^s
3,2 + 0,5**	0,5 + 0,3²^
4,5 ± 1,5^s	.6,9 i 2,1^s
2,3 ± 0,4²^	0,7 ± 0,4⁵^
4,1 ± 1,3^s	7,0 + 2,8^s
2,1 ± 0,3²^	0,6 + 0,3²^
J · W "T* ν* · ι	0,7 + 0,4²^

Kontrolle

x2

x3

Cyclophosphamid

3 30

3 30.

30 20

-33- 62 765/12

Bemerkungen zu 'Tabelle 17

Die Ergebnisse in der Tabelle sind ausgedrückt als (Durchschnitt) + (Standardfehler)

χ Statistisch verschieden von der Kontrollgruppe bei einem signifikanten Spiegel von /) £ 5 %

xx statistisch verschieden von der iiontroIlgruppe bei einem signifikanten Spiegel von Y\ £ 1 %

Wie aus den Ergebnissen oben deutlich erkennbar ist, hemmen GB , CB „ und CB-, sehr erfolgreich den primären Lungenkrebs und dessen Lungenmetastasen.

Versuch 5 Toxizitätstest (Einfachverabreichung)

3 Gruppen von mannlichen Mäusen des BDP₁-Stammes mit einer Körpermasse von 20 bis 25 g» und zwar 10 Tiere in jeder Gruppe, wurde intravenös 10 000 Einheiten GB- , 10 000 Einhexten GB ρ und 100 000 Einheiten GB λ veravreicht und die Tiere über 7 Tage beobachtet· Als Ergebnis überlebten alle 10 Tiere ohne irgend welche Änderungen der Körpermasse und des Allgemeinzustandes, obgleich so hohe Einheiten an Glykoproteinen verabreicht wurden»

-34- 62 765/12

Versuch 6

Toxizitätstest (30 Tage kontinuierliche Verabreichung)

Männlichen Mäusen des BDI?..-Stammes mit 20 bis 25 g Körpermasae, und zwar 10 Tieren in jeder Gruppe, wurde intravenös GB_x, CB^₂ oder GB_x- 30 Tage lang verabreicht, die Anzahl der toten Tiere registriert sowie Änderungen der Körpermasse und des Allgemeinzustandes· Die Körpermasse wurde zwischen 9 und 10 Uhr vormittags bestimmt und der Allgemeinzustand am 10·, 20. und 30, Tag nach der Methode von Arvien (Science, Bd. 36, S. 123, 1962). Als Ergebnis gab es kein totes Tier in diesen 30 Tagen, wobei 1 000 Einheiten/kg / Tag GB_x oder CB_x2 oder 10 000 Einheiten/kg/Tag CB_x-, verabreicht wurde, und die Massenerhaitungskürve entsprach annähernd der der Kontrollgruppe. Außerdem war der Allgemeinzustand normal'wie in der Kontrollgruppe·

Wie aus den oben beschriebenen Versuchen hervorgeht, hemmen GB , GB ₂ ^¹³·^· CB ~ selektiv das Wachstum von Tumorzellen und hemmen nicht nur in bemerkenswerter Weise die Krebsmetastasen sondern sind auch außerordentlich wirksam gegen unterschiedliche Tumore und darüber hinaus sehr sicher auch bei Dosismengen, die über der Dosis liegen, bei der der pharmazeutische Effekt eintreten würde· Daher sind GB GB _o und GB -, außerordentlich nützlich für die Therapie verschiedener Tumore wie Magenkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs, Dickdarmkrebs, Brustkrebs, Uteruskrebs, Leukämie. Weiterhin können Formen von GB (GH_x, 0Β_χ2, GB_x^) mit relativ geringem Molekulargewicht aus Formen von CB (CS , GB'p» CB O ^mi^ relativ hohem Molekulargewicht abgeleitet werden, indem diese mit einem Reduktionsmittel behandelt werden, ohne daß deren Tumorwirksamkeit beeinträchtigt wird·

Claims

3erlin, den 2. 4. 1984 62 765 12 Erfindungsanspruch

1) Molekulargewicht: 7 000 bis 9 000;

1) Molekulargewicht: 12 000 bis 17 000

1) Molekulargewicht: 40 000 bis 50 000

1) Molekulargewicht: 70 000 bis 90 000;

1. Verfahren zur Herstellung eines Antitumor-Glykoproteins mit geringerem Molekulargewicht als dein Molekulargewicht des Ausgangs-Antitumor-Glykoproteins, gekennzeichnet dadurch, daß man als Ausgangsmaterial ein Antitumorglykoprotein einsetzt, das aus einem Extrakt des Überstehenden einer Kultur von reticuloendothelialen Zellen, lymphoblasten, leukämiezeilen oder Fibroblasten von warmblütigen Tieren erhalten wird, Durchführung einer Abbaubehandlung des Glykoproteins durch Umsetzung mit einem Reduktionsmittel und anschließende Wiedergewinnung wenigstens eines Antitumor-Glycoproteins mit verringertem Molekulargewicht aus dem Reaktionsgemisch.

2. 4. 1984 62 765 12

erhalten wird durch Aussalzen des Überstehenden und der Niederschlag davon mittels Gelfiltration fraktioniert wird, wobei man eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 40 000 bis 50 000 erhält und diese Fraktion anschließend an Ulex europeus agglutininkonjugiertem Sephadex adsorbiert und eluiert.

2, 4* 1984

62 765 12

2) Farbreaktionen: weist eine Färbung auf, die Proteine nach der Lowryreaktion anzeigt, weist eine Färbung auf, die Peptidbindungen- und Aminosäuren in der NinhydrinreakMon nach Hydrolyse mit Salzsäure anzeigt und weist eine Färbung auf, die Zucker in der Phenol-Schwefelsäurereaktion, in der Anthron-Schwefelsäurereaktion, in der IndolvSchwefelsäurereaktion und in der Tryptophan-Schwefelsäurereaktion anzeigt;

2. 4. 1984 62 765 12

2) Farbreaktionen: weist eine Färbung auf, die Proteine nach der Lowryreaktion anzeigt, weist eine Färbung auf, die Peptidbindungen und Aminosäuren in der Hinhydrinreaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure anzeigt und weist eine Färbung auf, die Zucker in der Phenol-Schwefelsäurereaktion, der. Anthron-Schwefelsäurereaktion, der Indol-Schwefelsäurereaktion und in der Tryptophan-Schwefelsäurereaktion anzeigt;

2. 4· 1984 62 765 12

2) Farbreaktionen: weist eine Färbung auf» die Proteine nach der Lowryreäktion anzeigt, weist eine Färbung auf, die Peptidbindungen und Aminosäuren in der Uinhydrin« reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure anzeigt und weist eine Färbung auf, die Zucker in der Phono1-Schwefeisäurereaktion, der Anthron-Schwefelsäurereaktion, der Indol-Sehwefelsäurereaktion und in der Tryptophen-Schwefelsäurereaktion anzeigt;

2. 4. 1984 62 765 12

2) Farbreaktionen: weist eine Färbung auf, die Proteine nach der Lowryreaktion anzeigt, weist eine Färbung auf, die Peptidbindungen und Aminosäuren in der Mnhydrinreaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure anzeigt und weist eine Färbung auf, die Zucker in der Phenol-Schwefelsäurereaktion, der Anthron-Sehwefelsäurereaktion, der Indol-Schwefelsäurereaktion und in der Tryptophan-Schwefelsäurereaktion anzeigt;

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Ausgangs-Antitumor-Glyeoprotein ein Glycoprotein CBy.. mit folgenden Eigenschaften ist:

3· Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß das Ausgangs-Antitumor-Glykoprotein ΟΒγ. aus dem Überstehenden einer Kultur von Reticuloendothelialzellen, Lymphoblasten, leukämiezellen oder Fibroblasten warmblütiger lebewesen durch Aussalzen des Überstehenden erhalten wird und der enthaltene Niederschlag mittels Gelfiltration fraktioniert wird, wobei man eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 70 000 bis 90 000 erhält und diese anschließend an Ulex europeus agglutininkonjugiertem Sephadez adsorbiert und eluiert.

3) Erscheinungsbild und löslichkeit: weißes Pulver, löslich in Wasser, wäßrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer sowie schwerer löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

4· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Ausgangs-Antitumor-Glykoprotein CBj₂ ist und das durch Abbaubehandlung erhaltene Antitumor-Glykoprotein wenigstens eines ist, das aus der aus CB₃. und CB₃-, bestehenden Gruppe ausgewählt worden ist·

4) Zuckergehalt: 8 bis 15 % mit einer Zuekerzusammensetzung von 6 bis 10 % Hexosen, 1 bis 2 % Hexosaminen und 1 bis 3 % Sialsäuren;

' ί> ♦ ΐ -» «a 1

4) Zuckergehalt: 27 bis 33 % mit einer Zuckerzusammensetzung von 17 bis 20 % Hexosen, 5 bis 7 % Hexosaminen und 5 bis 6 % Sialsäuren;

4) Zuckergehalt: 30 bis 37 % mit einer Zuckerzusammensetzung von 20 bis 23 % Hexogen, 6 bis 8 % Hexosaminen und 4 bis β $ Sialsäuren;

4) Zuckergehalt: 35 bis 45 % mit einer Zuckerzusammensetzung von 23 bis 28 % Hexosen, 8 bis 11 % Hexosaminen und 4 bis 6 % Sialsäuren;

5· Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß das Ausgangs-Antitumor-Glykoprotein CB^₀ aus dem Überstehenden einer Kultur von Reticulo-endothelialzellen, lymphoblasten, leukämiezellen oder Pibroblasten von warmblütigen Tieren

5) Adsorptionsfähigkeit: adsorptionsfähig an Karboxymethylzellulosen bei Ionenaustauschchromatografie unter Verwendung von Karboxymethylzellulose in 0,05 M Phösphatpuffer (pH 6,4)?

5) Isoelektrischer Punkt: 4,3 bis 7»3;

5) Isoelektrischer Punkt: 4,2 bis 7,3;

5) Isoelektrischer Punkt: 4,3 bis 6,2

6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Ausgangs-Antitumor-Glykoprotein CB^ ist und das durch Abbaubehandlung erhaltene Antitumor-Glykoprotein CB-jro ist.

6) Stabilität: stabil in wäßriger Lösung bei pH 2,0,

pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4⁰C für 24 Stunden oder langer und in wäßriger lösung von pH 7_f0 bei 6O⁰C für 3 Stunden oder langer;

6) Adsorptionsfähigkeit: adsorptionsfähig an ülex europeus agglutininkonjugiertem Sepaha dex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2);

6) Adsorptionsfähigkeit: adsorptionsfähig an Ulex europeus agglutininkon.jugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (ph 7,2);

6) Adsorptionsfähigkeit: adsorptionsfähig an Ulex europeus agglutininkonjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2)?

7· Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß das Ausgangs-Antitumor-Glykoprotein aus dem Überstehenden einer Kultur von Reticulo-endothelialzellen, Lymphoblasten, Leukämiezeilen oder Fibroblasten von warmblütigen Tieren durch Aussalzen des Überstehenden erhalten wird und der niederschlag davon mittels Gelfiltration fraktioniert wird, wobei man eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 12 000 bis 17 000 erhält und diese Fraktion danach an Ulex europeus agglutininkonjugiertem Sephadex adsorbiert und eluiert.

7) Stabilität: stabil in wäßriger lösung von pH 2,0,

pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4⁰C über 24 Stunden oder langer, sowie in wäßriger Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C über 3 Stunden oder langer; und

7) Stabilität: stabil in wäßriger Lösung von pH 2,0,

pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4⁰O über 24 Stunden oder länger, sowie in wäßriger Lösung von pH 7,0 bei 6O⁰C über 3 Stunden oder länger; und

7) Stabilität: stabil in wäßriger Lösung von pH 2,0,

pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4⁰C über 24 Stunden oder langer, sowie in wäßriger lösung von pH 7,0 bei 6O⁰C über 3 Stunden oder langer; und

8. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß das Reduktionsmittel zumindest eines aus der Gruppe ist, die aus einer Thiolverbindung, einem Metallhydridkomplex, einem tertiären Phosphin, einem Sulfit, einem Zyansäuresalz und einem Metallion besteht«

8) die Aminosäresequenz des N-Terminals des Proteinteiles ist Alanin-Alanin-.

8) Cytotocizität: selektive Schädigung von Tumorzellen ohne wesentliche Schädigung normaler Zellen,

8) Cytotoxizität:,selektive Schädigung von Tumorzellen ohne wesentliche Schädigung normaler Zellen,

und daß das durch die Abbaubehandlung erhaltene Antitumor-Glycoprotein wenigstens eines der Bestandteile aus der aus den Antitumor-Glylsoproteinen 0Βγ₂, CBy und CBy^ bestehenden Gruppe ist, wobei diese folgende Eigenschaften aufweisen:

^CBX2^:

9· Verfahren nach Punkt 8,-gekennzeichnet dadurch, daß die Thiolverbindung 3-Merkaptoethanol, Dithiothreitol, Dithioerythritol, Thioglykolsäure oder Monothiophosphorsäure ist.

9) Differenzierung: induziert Differenzierung von Tumorzellen, d. h.· wandelt die Tumorzellen in normale Zellen um;

10· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Abbaubehandlung in Anwesenheit eines oberflächenaktiven Mittels durchgeführt wird.

11* Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß die Abbaubehandlung in Anwesenheit eines oberflächenaktiven Mittels durchgeführt wird.

12· Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet dadurch, daß das oberflächenaktive Mittel Hatriumdodecy!sulfat, Batriumcholat, Dodecyltrimethylammoniumbromid, Desoxylysolecithin, Triton Σ, Tweed 20 oder Span 60 ist.

13* Verfahren nach Punkt 11, gekennzeichnet dadurch, daß das oberflächenaktive Mittel latriumdodecylsulfat, Uatriumcholat, Bodecyltrimethylammoniumbromid, DesoxyIysolecithin, Triton "X, Tweed 20 oder Span 60 ist.

14* Verfahren nach Punkt 8 oder 11, gekennzeichnet dadurch, daß die Abbaubehandlung bei einer Temperatur zwischen 0 und 37⁰C, im pH-Bereich von leicht sauer bis neutral durchgeführt wird^.

15· Verfahren nach Punkt 14, gekennzeichnet dadurch, daß die Temperatur zwischen 15 und 25⁰C liegt.