DE19600301A1 - Bioregulatorischer Wirkstoff, Verfahren zu seiner Herstellung sowie dessen Verwendung - Google Patents

Description

Bereich der Erfindung

Die Erfindung betrifft bioregulatorische Wirkstoffe mit einem anorganischen Strukturgerüst und Verfahren für ihre synthetische Herstellung sowie für ihre Isolierung aus verschiedenen Ausgangs­ materialien. Die Anwendung dieser Wirkstoffe als solche oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen für die Enzym- und Bioregula­ tion sowie ihre Verwendung zur Diagnose einiger Krankheiten ist ebenfalls beschrieben.

Hintergrund der Erfindung

Der richtige Ablauf biochemischer Prozesse und die optimale Funk­ tion der biologischen Abwehrmechanismen wird durch zahlreiche bio­ regulatorische Wirkstoffe gewährleistet. Die bisher bekannten bio­ regulatorischen Wirkstoffe sind aus chemischer Sicht Peptide, Kohlenhydrate, Steroide oder Lipide, wobei diese Strukturelemente auch gemeinsam (z. B. Glykopeptide, Lipoproteine) vorkommen können. Die Anwendung bioregulatorischer Wirkstoffe für die Therapie von Krankheiten, die durch Fehlfunktionen in einen oder mehreren die­ ser Regulationsmechanismen verursacht sind, ist weiterhin bekannt. Der therapeutische Einsatz von Steroid-Hormonen, Corticosteroiden und herzwirksamen Glykosiden sowie von Wachstumshormonen oder Blutgerinnungsfaktoren sind einige der vielen Beispiele in diesem Sinne. Allerdings ist die Pharmakotherapie mit derartigen Stoffen sehr oft von schädlichen Nebenwirkungen begleitet und somit auch wesentlich begrenzt. Die ausführliche Betrachtung dieser Aspekte ist in Goodman & Gilman′s "The Pharmacological Basis of Therapeu­ tics" 8. Auflage, New-York 1991, zu finden.

Bei herzwirksamen Glykosiden ist z. B. die positiv-inotrope, thera­ peutisch nützliche Wirkung durch eine kardiotoxische Nebenwirkung gefährdet, und somit müssen die therapeutische Dosen sehr streng begrenzt werden. Als weiteres Beispiel sei noch die Anwendung der Corticosteroide erwähnt, wo durch eine Reihe von ganz schweren Nebenwirkungen, wie Myopathie, Osteoporose, psychische Störungen, erhöhte Infektionsanfälligkeit etc., der therapeutische Einsatz nur in sehr schweren Fällen und nur für begrenzte Zeit empfohlen wird. Trotz erheblicher Bestrebungen, immunologisch bedingte Krankheits­ syndrome mit immunregulatorischen Wirkstoffen zu behandeln, sind die bisherigen klinischen Testversuche nicht überzeugend.

Zweck solcher immuntherapeutischen Anwendungen wäre, die bis heute nicht gefundene Basis-Therapie für Autoimmunkrankheiten, wie: rheumatoide Arthritis, multiple Sclerosis u. a., zu gewährleisten. Nach E. Sercarz und S.K. Datta "Autoimmunity" in Current Biology 6, 875-881 (1995), wurden diese Autoimmunkrankheiten meist durch eine fehlerhafte Steuerung der Immunregulation verursacht. Für die Bekämpfung von schweren Krankheitssyndromen, die durch ein erheb­ lich geschwächtes Immunsystem gekennzeichnet sind, wie Krebser­ krankungen oder AIDS, haben die bisherigen therapeutischen Ein­ sätze von immunregulatorischen Substanzen nur wenig gebracht.

Es wurden mehrere bioregulatorische Peptide und Proteine isoliert und charakterisiert, wie es in der Monographie von M.J. Clemens "Cytokines", Oxford 1991, berichtet wird. Daß Cytokine eine wich­ tige Rolle bei verschiedenen Krebserkrankungen, in Autoimmunkrank­ heiten und in viralen Infektionen (einschließlich HIV) spielen, wurde ebenfalls schon mehrfach berichtet.

Trotzdem sind breitere therapeutische Anwendungen von diesen und anderen bioregulatorischen Proteinen und Peptiden noch weitgehend ausgeblieben. Eine der Ursachen dafür liegt sicherlich in den meist sehr mühsamen Herstellungstechnologien: Die Extraktionen und darauffolgenden Reinigungen bioregulatorischer Substanzen aus menschlichen oder tierischen Gewebe-Flüssigkeiten, wo sie ja nur in sehr geringen Mengen vorkommen, ist für die Bereitstellung der therapeutisch benötigten Mengen vollkommen ungeeignet. Bei den gentechnologisch hergestellten bioregulatorischen Polypeptiden oder Glykoproteinen besteht immer noch die Gefahr von allergischen Neben- bzw. anaphylaktischen Schock-Reaktionen, die für die Human­ therapie trotz ihrer Seltenheit eine schwerwiegende Nebenwirkung und einen erheblichen Risikofaktor bedeuten.

Das Grundproblem der therapeutischen Anwendungen von einigen "in vitro" hochwirksamen polypeptidischen Faktoren liegt darin, daß sie "in vivo" ganz andere, meist viel schwächere Aktivität zeigen. Einerseits hindern zahlreiche physikalische und enzymatische Hür­ den die von außen verabreichten peptidischen und proteinischen Wirkstoffe daran, den Ort des pathologischen Geschehens (Entzün­ dungsherd, Krebsgeschwulst etc.) zu erreichen. Anderseits werden sie von den dort vorhandenen körpereigenen Enzymen und anderen Faktoren rasch neutralisiert und metabolisiert. Bei der peroralen Verabreichung werden peptidische, glykopeptidische und zum Teil auch glykosidische Wirkstoffe durch mehrfache Abbauprozesse schon im Magen-Darm System praktisch unwirksam gemacht.

Mit einem relativ schnellen Abbau bioregulatorischer Substanzen peptidischer oder glykopeptidischer Natur muß man aber auch bei einer Zuführung "per os" rechnen.

Um die therapeutisch wirksame Konzentration ganz gezielt am Ort der pathologischen Erscheinungen, wie am Entzündungsherd oder an einer Krebsgeschwulst, zu erreichen, wurde z. B. eine getarnte Zu­ führung der Wirkstoffe vorgenommen. Ähnliches wurde von R. Collier und D. Kaplan in "Immuntoxine", Heidelberg 1988, beschrieben im Zusammenhang mit der Verwendung von Toxinen, die an monoklonale Antikörper gebunden zielgerichtet (drug targeting) eingesetzt werden können. Diese Behandlungstechnik ist aber noch sehr kompli­ ziert und bleibt nur für spezifische Fälle beschränkt anwendbar. Für regulatorische Wirkstoffe ist die Bioverfügbarkeit nicht nur von der Stabilität, sondern auch von rein physikalischen Vorgän­ gen, wie Löslichkeit und Membrandurchlässigkeit, abhängig. Es geht darum, die Wasserlöslichkeit der lipophilen Substanzen im Plasma oder die Membrandurchlässigkeit der hydrophilen Wirkstoffe, wie der Na⁺- oder K⁺-Ionen, zu ermöglichen. Normalerweise ist z. B. die Mitochondrien-Membran für die Kalium Ionen nicht durchlässig. Cyc­ lische Antibiotika wie Nonactin oder Valinomycin ermöglichen diese Durchlässigkeit durch eine organische Umhüllung des entsprechenden Ions. Seit 1967 wurden zahlreiche neue Verbindungen hergestellt, die eine Makroring-Struktur haben und eine kryptatartige Umhüllung von anorganischen Ionen oder kleineren Molekülen ermöglichen. Wichtige Voraussetzungen für eine direkte therapeutische Anwendung solcher kryptatbildender Substanzen ist aber eine geringe Toxizi­ tät und gute Bioassimilation, was bei synthetisch hergestellten Kryptand-Reagenzien nur selten erfüllt ist.

Viele grundlegenden bioregulatorischen Mechanismen werden durch die sogenannte Natrium-Pumpe kontrolliert. Dieses Enzym ist fähig, die Natriumionen vom Zellinneren nach außen pumpen und gleichzeit­ ig Kaliumionen in die entgegengesetzte Richtung zu treiben. Der Energieverbrauch wird durch eine damit gekoppelte Hydrolyse des Adenosintriphosphats (ATP) gedeckt. Diese Pumpe ist mit dem als Na⁺,K⁺-ATPase bezeichneten Enzym identisch und ist ubiquitär ver­ breitet. Mehrere wichtige zelluläre Funktionen wie Zellvolumen, Wärmeproduktion, intrazelluläre freie Ca²⁺-Ionen-Konzentration, neuronale Transmission, Muskelkontraktion oder Membranpotential, werden durch diese Na⁺,K⁺-ATPase gesteuert.

Bei zahlreichen immunregulatorischen Prozessen werden wichtige Phasen ebenfalls durch Na⁺,K⁺-ATPase gesteuert, und so bekommt die Natrium-Pumpe auch in der Immunregulation eine grundlegende Rolle. Trotz dieser allgemeinen Verbreitung und Bedeutung konnte der Re­ gulationsmechanismus dieses Enzyms noch nicht aufgeklärt werden. Als Wirkungsort für die Bioregulation der Natrium-Pumpe wird der sogenannte "Herzglykosid-Rezeptor" des Enzyms vermutet. Die in einigen Pflanzenarten vorkommenden Herzglykoside werden mit hoher Affinität an dieser Stelle gebunden und üben ihre kardiotonische aber auch toxische Wirkung aus. Ihre Toxizität beweist jedoch, daß sie mit dem endogenen Liganden dieses Enzyms nicht identisch sind. In der Arbeit "Endogenous digitalis-like factors" von W. Schoner in Progress in Drug Research, 41, 249-291 (1993) wird berichtet, daß trotz eines großen Forschungsaufwands die chemische Natur und die Struktur dieser endogenen bioregulatorischen Substanzen noch nicht aufgeklärt werden konnte. Aus großen Mengen von tierischem Gewebe und Flüssigkeiten konnte man bis jetzt keine ausreichende Menge dieser endogenen Faktoren isolieren, um eine genaue Charak­ terisierung und Strukturbestimmung zu ermöglichen.

Mit diesen endogenen Liganden identischen oder strukturähnlichen Faktoren könnte man die Aktivität des Na⁺,K⁺-ATPases und somit mehrere bioregulatorische Mechanismen wirksam steuern.

Neuerdings wurden auch einige einfache anorganische Substanzen ge­ funden, die in den bioregulatorischen Prozessen teilnehmen. Es ist aber wichtig zu bemerken, daß alle diese anorganischen Substanzen nur als einfache Botenstoffe oder Effektoren zum Einsatz kommen. Es fehlt ihnen grundsätzlich die für die Ausübung einer bioregula­ torischen Tätigkeit erforderliche dreidimensionale Struktur und die damit verbundene Fähigkeit für strukturspezifische Wirkung. In der Arbeit "Biological Roles of Nitric Oxide" von S. Snyder und D. Bredt in Scientific American, 1992 (5) 22-29, wird berichtet, daß diese Gasverbindung in der Steuerung der nicht spezifischen Immunantwort ein wirksamer Effektor ist. Im Organismus hat das Stickoxid eine sehr kurze Lebenszeit, um seine lokale, meist toxi­ sche Wirkung auszuüben und wird immer "in situ" hergestellt. Wenn die Freßzellen des Immunsystems, die sogenannte Makrophagen, mit bakteriellen Toxinen oder Cytokinen aktiviert werden, können sie innerhalb von Stunden relativ große Mengen von Stickoxid produ­ zieren und dieses als immunologische Waffe einsetzen.

Es wird angenommen, daß auch weitere einfache gasförmige Verbin­ dungen an bioregulatorischen Prozessen teilnehmen. Ethylen z. B. ist in der Pflanzenbiologie als ein wichtiger Faktor bekannt. Kohlenmonoxid nimmt an der physiologischen Regulation der Cycli­ sierung des Guanosin-Monophosphats (GMP) teil, wie dieses von A. Verma in Science, 259, 381 (1993), berichtet wurde.

Über die biologische Wirkung eines anderen Kohlenoxids, des viel seltener vorkommenden Kohlensuboxids C₃O₂, wurde bisher nur sehr wenig berichtet. Es ist nur bekannt, daß es sich um eine bei Raumtemperatur gasförmige (Sp. 7°C), schleimhautreizende, nach Senfölen und Acrolein riechende Verbindung handelt. Kohlensuboxid stellt ein relativ starkes Blutgift dar, das das Hämoglobin irre­ versibel bindet; die Erträglichkeitsgrenze bei Mäusen liegt bei 0,2-0,4% C₃O₂ in trockener Luft. Mit Wasser reagiert C₃O₂ und bildet Malonsäure. Ohne Spuren von Mineralsäuren verläuft aber diese Reaktion nicht so schnell, wie das früher behauptet wurde. Es wird vermutet, daß die ursprünglich reduzierende Erdatmosphäre neben Kohlenmonoxid auch erhebliche Mengen C₃O₂ enthalten hat, und neuerdings wurden auch Hinweise für seine mögliche Anwesenheit im interstellaren Raum gefunden, wie dieses von W. Huntress & al. in Nature, 352, 316-18 (1991), berichtet wird. Bis jetzt gibt es aber keinen konkreten Hinweis für ein mögliches Vorkommen von C₃O₂ in biologischen Flüssigkeiten. Angesichts der Wasserempfindlichkeit des monomeren Gases wie auch des amorphen Polymerisats wurde eine mögliche biologische Rolle meist a priori ausgeschlossen. Prinzi­ piell vertretbar wurde die Hypothese von H. Yanagawa u. F. Egami, Precambrian-Research 14, 75 (1981), gefunden, wonach das wasserre­ aktive amorphe Polymerisat ein mögliches Ausgangsmaterial für die Ursynthese einfacher organischer Verbindungen gewesen sein könnte.

Das gasförmige C₃O₂ bildet mehr oder weniger schnell amorphe Poly­ mere, die gelb bis intensiv rot-braun gefärbt sind. Über die Struktur dieser Polymere liegt nur sehr wenig gesichertes Wissen vor. Im allgemeinen werden sie als eine inhomogene amorphe Masse beschrieben, die früher auch als "rote Kohle" bezeichnet wurde. Die chemischen Eigenschaften des Kohlensuboxids und seiner Polyme­ ren sind in der Arbeit von T. Kappe und E. Ziegler, Angew. Chem., 86, 529 (1974), zusammengefaßt. Die Polymerisationsprodukte sind zum Teil in Wasser oder in verdünnten Alkalien löslich, wobei sich intensiv gelb bis dunkelbraun gefärbte Lösungen bilden. Für die Struktur dieser amorphen, uneinheitlichen Polymeren wurden mehrere hypothetische Formeln vorgeschlagen, aber keine davon konnte auch experimentell bestätigt werden. Als wahrscheinlichste wurde eine graphitartige hexagonale Gitter-Struktur vermutet, die am Rande ungesättigt ist und dementsprechend instabil sein muß. Diese Hypothese wurde in der Arbeit von N.S. Smith und D.A. Young in Inorganic Chemistry 2, 829 (1963), ausführlich dargestellt.

Es ist weiterhin bekannt, daß einige biologisch hochwirksame Sub­ stanzen im Plasma nicht als solche, sondern als Konjugate vorkom­ men. Steroidhormone z. B. sind im Blutplasma als ihre Sulfat- oder Glukuronat-Konjugate vorhanden und ihre Abbauprodukte werden eben­ falls als solche Konjugate eliminiert. Nicht selten zeigen diese konjugierten Steroide sogar bessere therapeutische Eigenschaften im Vergleich mit dem reinen Wirkstoff, wie dieses für konjugierte Östrogensteroide gemäß US-2565115 und US-2720483 oder für Dehydro­ epiandrosteron-sulfat (DHEAS) beschrieben wurde. Die oben erwähnte Konjugation regelt die biologische Verfügbarkeit und den Abbau dieser Steroid-Wirkstoffe und kann damit die verbesserten thera­ peutischen Eigenschaften erklären. Es ist verhältnismäßig wenig über die Regelung der Bioverfügbarkeit von polypeptidischen Wirk­ stoffen durch die Bildung von entsprechenden Konjugaten bekannt. Die enzymatische Konjugation von Proteinen mit Ubiquitin hat auch regulatorische Funktionen, wie dieses in Trends Biochemical Scien­ ces 15, 195 (1990), berichtet wurde.

Die zweckmäßige Konjugation polypeptidischer Substanzen könnte einen Durchbruch bei den therapeutischen Anwendungen dieser Wirk­ stoffe erzielen. Als bekannteste Beispiel ist die Suche nach lang­ zeitwirkendem Insulin zu erwähnen. Es ist bekannt, daß die thera­ peutische Wirkungszeit des Insulins durch Zugabe von Zinksalzen oder von Protaminsulfat wesentlich verlängert werden kann. Diese Zusatzstoffe können aber verschiedene Nebenwirkungen verursachen. Eine zweckmäßige Konjugation, die eine retardierte Freilassung des Insulins gewährleisten soll, wurde von zahlreichen Autoren versucht, aber bis jetzt noch nicht verwirklicht.

Beschreibung der Erfindung Bereich der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, neue bioregulatorische Wirkstoffe bereitzustellen, bei denen die vorstehend erwähnten Nachteile nicht auftreten und welche die Wiederherstellung der, bei Krankheiten gestörten bioregulatorischen Mechanismen bewirken. Außerdem sollen die Wirkstoffe die therapeutische Wirkung und die Bioverfügbarkeit von bekannten Arzneistoffen deutlich verbessern. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Merkmale der Ansprüche 1 bis 30 gelöst.

Strukturbeschreibung

Die erfindungsgemäßen bioregulatorischen Wirkstoffe sind chemische Verbindungen, deren Strukturgerüst aus dem einfachen anorganischen Kohlensuboxid C₃O₂ durch Cyclooligomerisierung aufgebaut ist. Obwohl Kohlensuboxid O=C=C=C=O selbst und die von ihm gebildeten amorphen Polymeren als reaktionsfähige wasserempfindliche Substan­ zen bekannt sind, konnte der Autor erstaunlicherweise bestimmte cyclooligomere Kohlensuboxid-Strukturen wasserstabil erhalten. Die Grundvoraussetzung für die Stabilität ist, daß diese Struktu­ ren die reaktionsfähigen kumulierten C=C und C=O Doppelbindungen des Kohlensuboxids nicht mehr enthalten. Dieses wird erfindungsge­ mäß so gelöst, daß mehrere, bevorzugt sechs, Kohlensuboxidmoleküle mehrere, bevorzugt sechs, miteinander kondensierte 4-Pyron- oder 2-Pyron-Ringe bilden und diese zusätzlich sich in einer Makroring­ struktur schließen.

Im Grunde genommen sind diese aus cyclooligomerem Kohlensuboxid aufgebauten Gerüste keine organischen Verbindungen und gehören wie auch das Kohlensuboxid selbst zur anorganischen Chemie.

Die chemische Formel der hier beschriebenen cyclooligomeren und zu Makroringen geschlossenen Kohlensuboxid-Gerüste ist wie folgt:

co-(C₃O₂)_n

worin n den Cyclooligomerisationsgrad des C₂O₃ bezeichnet und co die vorgenannte Art der Verknüpfung dieser Einheiten symbolisiert.

Der Autor hat weiterhin gefunden, daß von der unendlich großen Zahl der prinzipiell möglichen Strukturen mit cyclooligomeren und durch Makroring geschlossenen Kohlensuboxide nur einige, mit be­ stimmten n-Werten besonders stabil sind. Bevorzugt sind diejenigen cyclooligomeren Makroring-Gerüste, bei denen in der Formel

co-(C₃O₂)_n

die Zahl n gleich 6 oder ein Vielfaches von 6 und/oder 10 ist. Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe mit diesen bevorzugten n-Werten können auch als Derivate des cyclohexameren Kohlensuboxids mit der Formel co-(C₃O₂)₆ betrachtet werden. Dieses erstes Glied der hier definierten Serie der cyclooligomeren Kohlensuboxide hat so eine besondere Bedeutung und wird im weiteren ausführlich beschrieben.

Cyclohexameres Kohlensuboxid co-(C₃O₂)₆

Die experimentell durch Massenspektrometrie bestimmte molare Masse M = 408,19 entspricht der Formel C₁₈O₁₂ und zugleich der sechsfachen molaren Masse des Kohlensuboxids M = 68,032. Für die Struktur sind mehrere Isomerie­ möglichkeiten vorstellbar, z. B. mit Kopf-an-Kopf-Verknüpfung oder die nachfolgend dargestellte Struktur mit alternierend Kopf-an- Schwanz-kondensierten sechs 4-Pyronringen, die anhand der spektra­ len und anderen Eigenschaften als wahrscheinlich angenommen wird.

Die tatsächliche Elektronenverteilung liegt vermutlich der als Pyrylium bezeichneten, zwitterionischen Struktur näher, weil diese im Vergleich mit der Pyronstruktur zusätzlich stabilisiert ist.

Hydroxy-Pyrylium- und Pyryliumsalz-Derivate

Die Existenz von Derivaten der Formel (C₃O₂)₆ · H_1-6 des cyclohexa­ meren Kohlensuboxids ist auch im Massenspektrum (Fig. 1) sichtbar. In wässerigen Lösung und/oder durch Behandlung mit Perchlorsäure, Salzsäure, Schwefelsäure und anderen Säuren, liegen die erfin­ dungsgemäßen Wirkstoffe meist als Hydroxy-Pyrylium-Derivate vor. Die allgemeine Formel der durch mehrfache Protonierung gebildeten Hydroxy-Pyrylium-Derivate lautet:

co-(C₃O₂)_n · H_m

worin die Zahl m der gebundenen Wasserstoffatome durch die Zahl n der exacyclischen Sauerstoffatome begrenzt und somit m n ist. Das Hydroxy-Pyrylium Derivat des Cyclohexamers mit der Formel

co-(C₃O₂H)₆

und der molaren Masse M = 414,24 hat für die Bildung von anorgani­ schen und organischen Derivaten eine besondere Bedeutung und ist zusammen mit co-(C₃O₂)₆ die Grundeinheit für die Bildung von Selbstassoziaten und verschiedenen Derivaten. Die vermutliche 4-Hydroxy-Pyrylium-Struktur des cyclohexameren Kohlensuboxids co-(C₃O₂H)₆ wird folgendermaßen dargestellt:

Im allgemeinen werden die durch Protonierung der exacyklischen Sauerstoffatome entstandenen positiven Ladungen durch die entspre­ chenden OH⁻-Ionen oder Säureanionen An neutralisiert.

Für die Bildung von Pyryliumsalz-Verbindungen kommen sowohl Säuren oder Basen wie auch einige leicht dissoziierende, aus Anionen An und Kationen Ka gebildete Salzverbindungen in Betracht. Die che­ mische Formel der Pyryliumsalz-Derivaten, die von den erfindungs­ gemäßen Wirkstoffen mit einer Säure, einer Base oder einer Salz­ verbindung der allgemeinen Formel Ka · A_n gebildet werden, ist

co-(C₃O₂)_n · Ka_n · An_n

worin Ka die kationischen und An die anionischen Gegenionen bedeu­ ten, die die insgesamt 2n zwitterionischen Ladungen des Pyrylium­ gerüstes neutralisieren. Die Struktur der Pyrylium-Salz-Verbindun­ gen kann folgendermaßen dargestellt werden, wobei in der wässeri­ gen Lösung die Gegenionen nicht mehr genau lokalisierbar sind.

Die anionischen An und kationischen Ka Gegenionen können vorliegen

• - als einzelne und einheitliche anorganische oder organische Kationen und Anionen, z. B. alle Ka = Na⁺ und alle An = Cl⁻,
• - als Gemisch von anorganischen oder von organischen Kationen und Anionen, z. B. in einem, den physiologischen Konzentrationen dieser Ionen entsprechenden Verhältnis oder
• - selbst als zwitterionische, beide Gegenionen enthaltenden Verbindungen wie Aminosäure, Betaine, ionische Seifen.

Im Wasser sind die Pyrylium-Salz-Derivate der erfindungsgemäßen Wirkstoffe meist sehr gut löslich. Die etwas geringere Löslichkeit in Aceton oder Ethanol von Pyrylium-Salzen mit Anionen wie Chlorid oder Sulfat wird bei der erfindungsgemäßen Isolierung der hier beschriebenen Wirkstoffen benützt.

In physiologischen Flüssigkeiten sind die zwitterionischen Ladun­ gen des Wirkstoffes durch den dort anwesenden Anionen und Kationen neutralisiert. Es ist dementsprechend angebrachter, von einer sta­ tistischen Verteilung der Gegenionen als von chemisch einheitli­ chen Salzverbindungen einer bestimmten Ions zu sprechen.

Mit gewissen Metallionen, bevorzugt Übergangsmetallionen wie Fe(III), Sb(III), Cd(II), Pt(II), Au(III), Pb(IV), gebildete Komplexen können für die Isolierung und zum Nachweis der erfin­ dungsgemäßen Wirkstoffe verwendet werden.

Die mit komplexen anorganischen oder organische Anionen wie SCN⁻, BF4⁻, Cr₂O₇^2-, MnO₄⁻, Pikrat, Reineckate, gebildeten Verbindungen können ebenfalls zur Isolierung und zum Nachweis angewandt werden.

Addukte, Konjugate

Durch die starke Assoziationsfähigkeit der erfindungsgemäßen cyclooligomeren und Makroring-geschlossenen Kohlensuboxide wird die Bildung von molekularen Addukten mit anorganischen Elementen oder mit anorganischen oder organischen Verbindungen gefördert. Die stöchiometrische oder nicht-stöchiometrische Addukte mit organischen Verbindungen werden als Konjugate bezeichnet. Cyclohexameres Kohlensuboxid kann mit mehreren, bevorzugt 2 bis 6 Molekülen Ammoniak, organischen Aminen, Aminosäuren, Peptiden oder anderen Substanzen mit Aminfunktion stabile Addukte bilden. Die allgemeine Formel dieser Amin-Addukte lautet:

co-(C₃O₂)₆ · (R¹R²R³N)_m

worin R¹, R² und R³ jeweils ein Wasserstoffatom oder ein orga­ nischer Rest und m eine Zahl von 1 bis 6 ist.

Experimentell wurde die molare Masse des Diaminadduktes mit der Formel co-(C₃O₂)₆ · (NH₃)₂ als M = 442,2 und des Hexaminadduktes co-(C₃O₂)₆ · (NH₃)₆ als M = 510,4 durch ES-Massenspektrometrie ermittelt (Fig. 2).

Bei den Hexaminaddukten sind die beiden Ammoniak- oder Amin-Mole­ küle wahrscheinlich an die Carbonyl-Gruppen der Pyronringe durch Wasserstoffbrücken gebunden. Da in diesem Falle aber Diaminkom­ plexe vermutlich schon der innere Hohlraum der Makroringstruktur verwendet wird, sind diese eher als Wirt-Gast-Komplexe zu be­ trachten.

Wirt-Gast-Komplexe

Die zweite besonders wichtige Struktureigenschaft der erfindungs­ gemäßen Wirkstoffe kommt so zustande, daß die sechs zusammenkon­ densierten Pyron- oder Pyryliumringe zusätzlich den erfindungsge­ mäßen, vorzugsweise zylinderförmigen Makroring gestalten. Die mo­ lekularen Dimensionen dieser Makroringstruktur sind für die er­ findungsgemäße Bildung von erfindungsgemäßen Wirt-Gast-Komplexen geeignet. Als "Gäste" kommen Elemente, kleinere Moleküle oder Molekülanteile in Frage, die in den zylinderförmigen Hohlraum mit dem Durchmesser von 2,9-3,2 Å sterisch gut passen und /oder an deren Rand durch spezifische Bindungskräfte gebunden sind. Die Form und Dimensionen der zylinderförmigen Makroringstruktur des cyclohexameren Kohlensuboxids sind der nachfolgender Abbildung zu entnehmen.

Kationen, wie Kalium, Ammonium, Silber oder Rubidium oder Anionen, wie Fluorid, Chlorid, Formiat oder Rhodanat passen gut in den in­ neren, zylindrischen Hohlraum des Makrorings mit einem Innendurch­ messer von 2,9 bis 3,2 Å und einer Höhe von 4,9 bis 5,2 Å.

Bei den erfindungsgemäßen Anwendungen befindet sich ein Ion oder ein neutrales Element oder Molekül in dem Hohlraum der zylinder­ förmigen Makroring-Struktur einer co-(C₃O₂)₆-Einheit und ist von dieser umhüllt. Die durch Massenspektrometrie gemessene molare Masse entspricht der Summe der einzelnen Komponenten und beweist, daß dieser Wirt-Gast-Komplex eine selbständige Verbindung ist.

Der Autor hat die Existenz von Wirt-Gast-Komplexen des cyclohexa­ meren Kohlensuboxids mit kleineren anorganischen oder organischen, im allgemeinen mit Y bezeichneten Verbindungen, wie Ammoniak, Hyd­ roxylamin, Methanol, Ethanol, Propanol, Aceton, Dichlormethan, Chloroform, Acethylcholin, Ameisensäure, Essigsäure sowie mit einigen Aminosäuren und Kohlenhydraten experimentell festgestellt. Erfindungsgemäß kommt die Substanz Y oder ein Teil ihrer Struktur als "Gast" in dem Innenhohlraum des erfindungsgemäßen Wirkstoffs wie es der nachfolgenden Abbildung zu entnehmen ist.

Durch diese "Umhüllung" werden gewisse Eigenschaften der Substanz Y "getarnt" und die neue, erfindungsgemäß erzielten Eigenschaften, wie verbesserte Membrantransport und Bioverfügbarkeit ermöglicht.

Wirkstoffe unterschiedlicher Molmasse M 2.000 Dalton

In diese Kategorie gehört das oben beschriebene cyclohexamere Kohlensuboxid als solche co-(C₃O₂)₆ oder in Hydroxy-Pyrylium-Form co-(C₃O₂H)₆ und alle ihren Derivate, Addukte, Wirt-Gast-Komplexe, deren Molmasse unter dieser Grenze liegt.

Die von 2 bis 4 cyclohexameren Einheiten gebildeten Selbstasso­ ziate werden ebenfalls als kleinmolekulare Wirkstoffe betrachtet. Solche Selbstassoziationen sind durch die Neutralisierung von mehreren zwitterionischen Ladungen stabilisiert. Somit wird die Existenz des vom Autor identifizierten Dimers mit der molaren Masse M = 816 D und des Trimers mit M = 1.224 D erklärt.

M < 2.000 Dalton

Zunächst erscheinen die hier eingestuften Wirkstoffe als ein Ge­ misch von Verbindungen mit heterogener molarer Masse. Die nähere Analyse hat jedoch bewiesen, daß trotz der prinzipiell unendlich großen Zahl der möglichen Verbindungen nur sehr wenige, und zwar die mit einer ganz bestimmten molekularen Größe, erhältlich und identifizierbar sind. Die molaren Massen einiger der identifizier­ ten Verbindungen sind der nachfolgenden Tabelle zu entnehmen:

Die Untersuchungen wurden mit Hilfe der MALDI-Massenspektrometrie (MS), Gel-Chromatographie (GE) oder der Polyacrylamid-Gel-Elektro­ phorese (PAGE) durchgeführt. Wie aus dem MALDI-Massenspektrum er­ sichtlich (Fig. 3), kommen die für n = 60 und insbesondere für n = 72 entsprechenden Verbindungen in deutlich größeren Konzentratio­ nen als alle anderen vor. Die durch diese Methode bestimmten mola­ ren Massen entsprechen mit sehr guter Genauigkeit für n = 60 und n = 72 in der Formel co-(C₃O₂H)_n der Hydroxy-Pyrylium-Oligomeren. Diese Verbindungen können entweder als Cyclooligomere mit n = 60 oder n = 72 oder als s = 10- oder s = 12fache Selbstassoziate der cyclohexameren Grundeinheit {co-(C₃O₂H)₆}_s betrachtet werden. Die physikalisch-chemischen und spektroskopischen Eigenschaften dieser Verbindungen co-(C₃O₂H)₆₀ und co-(C₃O₂H)₇₂ deuten auf eine hohe Struktur-Symmetrie hin, die z. B. mit einer sphärischen Anord­ nung der 10, 12 oder mehr co-(C₃O₂H)₆-Einheiten erklärbar wäre. Eine sandwichartige Anordnung mit pentagonaler oder hexagonaler Symmetrie könnte ebenfalls die Neutralisierung einer großen Anzahl an zwitterionischen Ladungen erklären.

Die Untersuchungen mit Hilfe der Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) haben eine starke Bande im Bereich von M ≈ kD und gegebe­ nenfalls weitere Linien bei den Molmassenwerten von ca. 10 kD, 12,5 kD, 15 kD, 30 kD, 60 kD und 120 kD gezeigt. Diese entsprechen mit annehmbarer Genauigkeit den Oligomerisationsgraden n = 72, 144, 180, 216, 432, 864 und 1728. Merkwürdigerweise stellen diese Zahlen bestimmte Vielfache der Zahlen 6 und 12 dar. Mit einer 16,5%-igen Polyacrylamid-Konzentration des Gels kommt die weitaus stärkste Bande im M ≈ 5.0 kD Bereich vor. Wird aber dieselbe Pro­ be auf einem anderen Gel, z. B. mit geringerem Polyacrylamid-Gehalt aufgetragen kann die selbe Bande bei einem zweifach größerem Be­ reich (≈ 10 kD) erscheinen. Diese Anomalie wird durch spezifische Assoziations-Dissoziations-Gleichgewichte der Wirkstoffe erklärt.

Assoziations-Gleichgewichte und Membrantransport

Auch bei der Dialyse und Ultrafiltration der Verbindungen mit hö­ herem Molgewicht hat der Autor bestimmte Anomalien festgestellt. Nach gewisser Dialysezeit sind die größeren, normalerweise nicht membrandurchlässigen Wirkstoffe auf beiden Seiten der Membran nachweisbar geworden. Die Erklärung dafür ist, daß die höheren Assoziate gemäß nachfolgender Gleichung 1 in kleinere, membran­ durchlässige Formen dissozieren und diese im äußeren Dialysat durch Selbstassoziation die größeren Assoziate zurückbilden. Nach längerer Dialysezeit entsteht ein Gleichgewicht auf den beiden Seiten der Membran.

worin s = 2, 3, 4, 5, 6, 10 oder 12 sowie ein Vielfaches dieser Zahlen und p < s ist.

Das Gleichgewicht zwischen dem einfachen Cyclohexamer und seinen mehrfach assoziierten Derivaten mit einer höheren Molmasse ist von zahlreichen Faktoren abhängig oder beeinflußbar wie z. B. durch die Natur des Lösungsmittels, den pH-Wert, die Konzentration der Alka­ limetall- und anderer Ionen, die Temperatur und die Konjugation mit anderen, in der Lösung vorhandenen Substanzen. Das Gleichge­ wicht (1) ermöglicht einen Zugang von erfindungsgemäßen Wirkstof­ fen mit größeren molaren Masse in den intrazellulären Raum deren normalerweise dieser Zugang versperrt ist. Im membranäußeren Raum können die erfindungsgemäßen Wirkstoffe als größere co-(C₃O₂H)_n-Ver­ bindungen vorhanden sein. Durch Dissoziation nach Gleichung (1) können diese Wirkstoffe durch die Membran und so in den membran­ inneren Raum gelangen, wo sie durch Assoziation die größere Verbindungen zurückbilden.

Die größeren Selbstassoziate können durch ihre Stabilität auch für die physiologische Aufbewahrung und den Transport der Wirkstoffe dienen und so den Ort der pathologischen Erscheinung erreichen. Dort entfalten sie ihre bioregulatorische, therapeutische Wirkung entweder als solche, oder konjugiert mit anderen Wirkstoffen. Ein "getarnter" Membrantransport von einen membranundurchlässigen Substanz Y kann erfindungsgemäß so durchgeführt werden, daß diese Substanz in dem zylinderförmigen Innenhohlraum des Wirkstoffes "versteckt" ist.

Spektroskopische Charakterisierung

Im allgemeinen sind die molekularen Spektren der erfindungsgemäßen Wirkstoffe verhältnismäßig bandenarm, was mit der hohen Symmetrie der entsprechenden Strukturen im Einklang steht. Das in KBr-Pille aufgenommene Infrarot-Spektrum (Fig. 4) zeigt mehrere charakteris­ tische Absorptionsbanden bei 3500-3000 cm^-1; 1680-1620 cm^-1; 1400-1385 cm^-1; 1210 cm^-1; 1100 cm^-1 und zwischen 830-600 cm^-1, wobei die starke Bande bei 1660 cm^-1 als "Ringatmungs-Frequenz" des 4-Pyron­ ringes interpretiert wird. Die Abwesenheit einer IR-Absorptions­ bande bei 1720 cm^-1 macht eine 2-Pyron-Struktur unwahrscheinlich.

Das stärkste Absorptionsmaximum der UV-VIS Spektren liegt bei ca. 190 nm mit Schultern bei ca. 220 nm und 265 nm (Fig. 5).

Wie ersichtlich liegt anstatt der erwarteten starken Absorption der konjugierten Doppelbindungen bei ca. 320 nm nur eine schwache, unspezifisch abfallende Absorption von 240 bis 400 nm vor. Daß hier jedoch ein starker, aber symmetrieverbotener Übergang vor­ handen ist, konnte der Autor durch eine deutliche Fluoreszenz- Emission im Bereich von 400-450 nm beweisen, die durch eine Anre­ gungsbestrahlung der erfindungsgemäßen Wirkstoffen bei 310-340 nm erzeugt wird (Fig. 6).

Diese erfindungsgemäße Eigenschaft wird für den Nachweis und für die analytische Bestimmung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe durch direkte Fluoreszenz-Messungen oder, gekoppelt an bekannte chroma­ tographische Trennungsverfahren, für eine Detektion verwendet.

Analytische Reaktionen

Die Wirkstoffe, in Form ihrer Amin-Addukte, zeigen eine positive gelbe Ninhydrin-Reaktion, die für ihren analytischen Nachweis oder spektrophotometrischen Bestimmung verwendet werden kann. Da diese Reaktion aber von den meisten Aminosäuren und Peptiden ebenfalls gezeigt wird, ist die analytische Verwendung nur nach einer chro­ matographischen Trennung sinnvoll. Für eine dünnschichtchromato­ graphische Trennung werden Kieselgel-60 Fertigplatten (Merck) und ein Gemisch aus 1-Propanol: Ethylacetat und 30%-ige Essigsäure im Verhältnis 60 : 10 : 30 (V/V) als Eluens verwendet.

Als Sprühreagenz wird 0,1%-ige Ninhydrinlösng in Ethanol, die zusätzlich noch 2% (V/V) Eisessig und 0,5% (V/V) sym-Collidin enthält, verwendet. Gelbe Flecken im Rf-Bereich 0,32 bis 0,45 deuten auf die Anwesenheit der erfindungsgemäßen Wirkstoffe hin.

Die Hydroxy-Pyrylium-Gruppe der erfindungsgemäßen Wirkstoffe zeigt eine leicht positive Phenol-Reaktion mit dem Folin-Ciocalteu-Rea­ genz und dieses kann für eine Identifizierung verwendet werden. Da die bekannte Lowry-Methode für die Proteinbestimmung ebenfalls auf dieser Reaktion aufbaut, muß zuerst eine chromatographische Trennung von Proteinen oder phenolischen Substanzen erfolgen.

Bei der HPLC-Trennung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe wird eine Ionenaustauscher-Säule, bevorzugt Nucleosil-10 SA (Macherey-Nagel) mit einer 0,01 bis 0,05 molaren Na₂HPO₄ Pufferlösung als Eluens verwendet. Die Detektion erfolgt durch Messung der Fluoreszenz- Emmision bei 420 nm mit Anregungsbestrahlung bei 340 nm.

Charakteristisch für die erfindungsgemäßen Pyrylium-Salz-Derivate ist, daß sie alle die bekannten analytischen Reaktionen der Gegen­ ionen, z. B. die Präzipitation der Halogenide mit Silberionen oder des Sulfations mit Barium, zeigen.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe größerer molarer Masse M < 2,0 kD zeigen bemerkenswerte spezifische Reaktionen mit Immunoglobulinen. Diese immunspezifischen Präzipitations-Reaktionen mit humanen oder tierischen Immunoglobulinen werden spektrophotometrisch und durch die Ouchterlouny Methode in Agarosegel oder durch Immunelektropho­ rese nach Laurell untersucht. Die bemerkenswerten Unterschieden zwischen Reaktionen mit Immunoglobulinen aus normalen oder aus pathologischen Seren ermöglicht die Anwendung dieser Reaktion in der Diagnostik verschiedener Immunpathologien.

O-Alkyl und O-Acyl Derivate

Durch die Bindung von anorganischen oder organischen Molekülen oder Resten R an die Sauerstoffatome des Grundgerüstes entstehen anorganische und/oder organische Derivate oder Konjugate der all­ gemeinen chemischen Formel:

co-(C₃O₂)_n · R_m

worin R = ein anorganisches oder organisches Molekül und/oder ein organischer Rest bevorzugt Methyl-, Ethyl-, Acetyl, Benzyl, und m 2n ist.

Herstellung

Für die synthetische Herstellung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe kann erfindungsgemäß Kohlensuboxid als Ausgangsmaterial verwendet werden, welches seinerseits durch bekannte Verfahren erzeugt wird. Das durch fraktionierte Destillation gereinigte C₃O₂ wird erfin­ dungsgemäß photochemisch und/oder durch Verwendung von geeigneten Hilfsstoffen in die cyclooligomeren Derivate umgewandelt. Die Syn­ these von Kohlensuboxid wird bekannterweise durch doppelte Wasser­ abspaltung aus kleineren Dicarbonsäuren, wie Malonsäure oder ihren Derivaten, unter Einwirkung von Phosphorpentoxid und/oder durch Erwärmung durchgeführt. Beim diesen Verfahren wird aber auch die Bildung des ungewünschten amorph-polymeren Kohlensuboxids geför­ dert. Der Autor hat dagegen festgestellt, daß eine im inerten aprotischen Lösungsmittel durchgeführte thermische Dehydratierung der Säure oder ihren Estern für die Bildung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe viel besser geeignet ist. Erfindungsgemäß wird die Säure oder das entsprechende Derivat in einem aprotischen Lösungs­ mittel, bevorzugt Dimethylformamid oder Essigsäureanhydrid, durch Erwärmen und Rühren aufgelöst. Das Gemisch wird auf 120-150°C erhitzt, wobei die Bildung von C₃O₂ schon nach einigen Minuten eintritt. Für die Umwandlung des somit erzeugten Kohlensuboxids in die erfindungsgemäßen cyclooligomeren Wirkstoffe wird erfindungs­ gemäß eine photochemische Aktivierung angewandt und/oder es werden noch geeignete Hilfsstoffe zugefügt. Als wirksame Hilfsstoffe wur­ den diejenigen Substanzen gefunden, die für die Bildung der Makro­ ringstrukturen eine Art Schablone bilden. Bevorzugt sind stabile Salzverbindungen derjenigen Ionen, deren Radius zu dem inneren Hohlraum des co-(C₃O₂)₆ Makroringes, Innendurchmesser 2.9-3,1 Å, entspricht. Bevorzugte Ionen sind Rubidium (2,94 Å), Kalium (2,66 Å), Ammonium (2,86 Å), Fluorid (2,72 Å).

Die erfindungsgemäßen bioregulatorischen Wirkstoffe können erfin­ dungsgemäß auch aus den Nebenprodukten von einigen großtechnolo­ gisch aus Kohlenmonoxid hergestellten Produkten isoliert werden. Der Autor hat überraschenderweise gefunden, daß einige bekannte organische Syntheseprodukte, deren industrielle Herstellung aus Kohlenmonoxid oder aus Synthese-Gas erfolgt, geringe, aber nach­ weisbare Mengen der erfindungsgemäßen Wirkstoffe enthalten können. Dies kann mit einem geringen Kohlensuboxid-Gehalt des Synthese­ gases erklärt werden. Um die äußerst geringen Gehalte an erfin­ dungsgemäßen Wirkstoffen in diesen großtechnologischen Produkten zu erhöhen werden fraktionierte Destillationsverfahren angewandt. Zu 100 Teilen ("Teile" bedeutet "Gewichtsteile", soweit nichts an­ deres angegeben ist) des Ausgangsprodukts, bevorzugt aus Synthese- Gas hergestelltes technischen Methanol, werden 2 bis 60 Teile be­ vorzugt 20 Teile Wasser oder wäßrige Pufferlösung hinzugefügt und aus diesem Gemisch wird zuerst das Methanol durch Anwendung einer Destillationskolonne abdestilliert. Die zurückgebliebene Wasser- Phase zeigt einen erhöhten Gehalt an den erfindungsgemäßen Wirk­ stoffen. Durch mehrmalige Wiederholung der Destillation mit Hin­ zufügung von immer neuen methanolischen Phasen wird eine beacht­ liche Konzentration der erfindungsgemäßen Wirkstoffe erreicht. Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe werden aus dieser Lösung durch Anwendung von fraktionierter Destillation oder durch Adsorption an festen Phasen, bevorzugt Aktivkohle, und Desorption mit Hilfe von Lösungsmittelgemischen, bevorzugt Wasser-Ethanol, isoliert.

Erfindungsgemäß werden die erfindungsgemäßen Wirkstoffe auch aus Pflanzenextrakten, pflanzlichen Zellkulturen oder aus Bakterien­ kulturen gewonnen. Zahlreiche Pflanzenarten wurden untersucht, wobei die erfindungsgemäßen Wirkstoffe nicht als solche, sondern als undefinierte Konjugate anderer, bevorzugt toxischer, Pflanzen­ inhaltstoffe vorkommen. Bevorzugte Rohstoffquellen sind diejenigen Pflanzenarten, die auch toxische Inhaltsstoffe, wie Alkaloide oder kardiotoxische Glykoside, enthalten. Weiterhin bieten Pflanzen­ arten mit einem relativ hohen Gehalt an Saponinen oder Gerbstoffen auch ein geeignetes Ausgangsmaterial für die Gewinnung der erfin­ dungsgemäßen Wirkstoffe. Als Pflanzenteile sind Wurzel, Wurzel­ stock, Stengel, Blätter, Rinde oder Kerne, oder die entsprechende Pflanzenzellkulturen die in bekannter Weise durch Kallusbildung initiiert werden, geeignet.

Wenn die Herstellung von kleinmolekularen Kohlensuboxid-Derivaten, bevorzugt co-(C₃O₂H)₆, erwünscht ist wird erfindungsgemäß das fol­ gende Verfahren angewandt: Zu 1 Teil getrocknetem und mit Hexan entfettetem Pflanzenmaterial werden 10 Teile Extraktionsmittel, bevorzugt 30% eines Alkohol-Wasser Gemisches, hinzugefügt und es wird 24 Stunden unter leichtem Erwärmen mazeriert. Das Verfahren wird mehrmals, bevorzugt 2-3 Mal, wiederholt und die vereinigten alkoholischen Extrakte werden eingeengt. Die konzentrierte Tinktur wird nach Zugabe einer Mineralsäure, bevorzugt Schwefelsäure oder Salzsäure, in einer Menge von 0,01 bis 5%, bevorzugt 1%, bezogen auf die Tinktur, aufgekocht und kurze Zeit, bevorzugt 10-30 Min., bei 80-100°C gehalten. Die gekühlte Lösung wird mit einer Base, bevorzugt NH₄OH, neutralisiert und mit 1 bis 20 Teilen, bevorzugt 5-10 Teilen Aktivkohle pro 100 Teile Flüssigkeit, behandelt. Die abfiltrierte Aktivkohle wird nochmals mit Wasser gewaschen und filtriert. Die im Vakuum getrocknete Aktivkohle wird mit kochendem Extraktionsmittel, bevorzugt 1 : 1 Ethanol-Wasser, behandelt, und das Verfahren 2mal wiederholt. Die so erhaltene Lösung der erfin­ dungsgemäßen Wirkstoffe ist stabil und für langzeitige Aufbewah­ rung geeignet. Die vereinigten Lösungen können auch eingeengt und gefriergetrocknet werden. Die Reinigung des festen Rückstands er­ folgt durch wiederholte Umkristallisierung, bevorzugt aus Alkohol- Äther-Gemischen. Die so gewonnenen Addukte sind stabil für lang­ zeitige Aufbewahrung.

Wenn die Herstellung von hochmolekularen cyclooligomeren Kohlen­ suboxid-Verbindungen erwünscht ist, wird erfindungsgemäß das fol­ gende Verfahren angewendet: Zu 1 G.-teil getrocknetem und mit Pet­ rolether entfettetem Pflanzenmaterial werden 5-20, bevorzugt 8, Teile Methanol zugefügt und 1 bis 36, bevorzugt 16, Stunden, mit leichtem Erwärmen mazeriert. Das Verfahren wird mehrmals, bevor­ zugt zweimal, wiederholt und die vereinigten Extrakte werden ein­ geengt. Die konzentrierte Lösung wird in ein, mit Wasser mischba­ res organisches Lösungsmittel, bevorzugt Aceton oder Ethanol, in einem Verhältnis 1 : 20 bis 1 : 2, bevorzugt 1 : 8, eingemischt. Das ge­ bildete Präzipitat wird durch Filtrieren oder Zentrifugieren abge­ trennt und in minimalen Mengen Wasser oder einer Pufferlösung nochmals aufgelöst. Das ganze Verfahren wird 1- bis 5-mal, bevor­ zugt 2mal wiederholt. Das somit erhaltene Rohprodukt wird in mi­ nimalen Menge Wasser aufgelöst und einer Dialyse gegen destillier­ tes Wasser unter Verwendung von Membranen, bevorzugt mit der Aus­ schlußgrenze 3 kD, unterworfen. Nach einer längeren Dialysezeit, bevorzugt nach 3-4 Tagen, mit mehrmaliger Erneuerung der membran­ äußeren Wassermenge wird die membraninnere Lösung filtriert, scho­ nend eingeengt und gefriertrocknet.

Für die erfindungsgemäße Gewinnung der erfindungsgemäßen Wirk­ stoffe unterschiedlicher molarer Masse werden neutrale Absorbanten oder ionische Festphasen, wie Harze, Gele oder modifizierte Poly­ saccharide, mit Ionenaustauscher-Funktion eingesetzt. Wegen des zwitterionischen Charakters der erfindungsgemäßen Wirkstoffe kön­ nen sowohl Anionit- wie auch Kationit- oder Mischbettaustauscher- Phasen angewandt werden. Zuerst werden die Extrakte pflanzlicher oder andersartiger Herkunft mit der Ionenaustauscherphase behan­ delt. Nachdem die Komponenten auf der Festphase gebunden sind, wird die Säule mit einem Überschuß von neutralem oder schwach saurem Eluens, bevorzugt Wasser oder einer Pufferlösung, reichlich gewaschen, bis keine herkömmlichen Inhaltstoffe (Kohlenhydrate, Aminosäuren) in dem Eluat nachweisbar sind. Die Desorption von Kationit-Phasen erfolgt durch Verwendung von verdünnten Mineral­ säuren, bevorzugt Salzsäure, oder von organischen Säuren, bevor­ zugt Ameisen- oder Essigsäure. Die Freisetzung der an anionische Phasen oder Mischbettphasen gebundenen erfindungsgemäßen Wirkstof­ fe erfolgt durch verdünnte Alkalien, bevorzugt 0,1-0,3 molare Ammonium- oder Kaliumhydroxydlösung.

Die erfindungsgemäße Desorption von neutralen Festphasen, wie Silikagel, Polyamiden oder verschiedenen Polysacchariden, erfolgt durch Verwendung von 0,2-5%-iger, bevorzugt 1,2%-iger, Natrium­ dodecylsulfat-(SDS)-Lösungen oder von 1- bis 12-molaren, bevorzugt 8-molaren, Harnstofflösungen.

Die erfindungsgemäße Trennung und Reinigung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe unterschiedlicher Molmasse erfolgt mit Hilfe der Gel­ filtration oder durch Membrandialyse und Ultrafiltration. Für die Trennung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe nach ihren Molekular­ größen wird Gelchromatographie mit Hilfe synthetischer Festphasen, bevorzugt mit Sephacryl 200, Sephadex LH-20 oder TSK HW-60, ver­ wendet. Als Eluens werden schwach basische Pufferlösungen, bevor­ zugt Ammoniumacetat oder -bicarbonat oder eine 0,01- bis 0,3-mo­ lare, bevorzugt 0,15-molare NaCl- oder KCl-Lösung verwendet. Bei diesen Trennungsverfahren werden zuerst die Verbindungen mit hö­ herem Molekulargewicht eluiert und die kleineren Verbindungen, wie co-(C₃O₂H)₆, fließen später aus der Säule heraus.

Erfindungsgemäß können einige Konjugate, die von den erfindungsge­ mäßen Wirkstoffen mit pflanzlichen Inhaltstoffen gebildet werden, auch direkt isoliert werden. Diese meist klebrigen, gelblichbraun gefärbten Konjugate können aus den konzentrierten methanolischen Pflanzenextrakten durch Anwendung von organischen Lösungsmitteln, bevorzugt Aceton oder Diethylether, präzipitiert werden. Durch mehrfache,bevorzugt 3- bis 5fache Wiederholung der Präzipitation sind die somit erhaltenen Konjugate verhältnismäßig einheitlich. Für die erfindungsgemäße Spaltung der Konjugate kann erfindungs­ gemäß das folgende Aussalzungsverfahren verwendet werden. Das Kon­ jugat wird in Wasser gelöst, in dem noch zusätzlich ein anorgani­ sches Salz, bevorzugt Ammoniumsulfat, in einer Menge von 5 bis 50% (G/G), bevorzugt 15%, bezogen auf die Endlösung aufgelöst wird. In dieser Lösung wird ein organisches Lösungsmittel, bevorzugt n-Butanol oder 2-Propanol, eingemischt und es wird heftig geschüt­ telt. Die Phasen werden getrennt und das Verfahren wird 2- bis 5-mal, bevorzugt 3-mal wiederholt, wobei der pH-Wert der wässerigen Phase mit einer Säure auf 1 eingestellt wird.

Nach einem weiteren erfindungsgemäßen Spaltungsverfahren wird das Konjugat in Wasser gelöst, der pH Wert mit Ammoniak auf 10 eingestellt und die Lösung in ein chloriertes Lösungsmittel, bevorzugt Dichlormethan oder Chloroform, im Verhältnis von 1 : 0,5 bis 1 : 6, bevorzugt 1 : 2, eingerührt. Die durch kräftiges Schütteln gebildete sehr stabile, schlammige Emulsion wird abge­ trennt und davon wird das organische Lösungsmittel unter redu­ ziertem Druck entfernt.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können auch aus bakteriellen Aus­ gangsmaterialien gewonnen werden. Dafür werden erfindungsgemäß Bakterienkulturen verschiedener Arten, bevorzugt BCG (Bacillus Cualmette-Guerin), Corynebacterium parvum oder Escherichia coli, verwendet. Zuerst werden eine physikalische Behandlung, bevorzugt Ultraschallbehandlung, und eine Hydrolyse durch Anwendung von ver­ dünnten Mineralsäuren, bevorzugt Salzsäure, durchgeführt. Das filtrierte Hydrolysat wird gegebenenfalls neutralisiert und auf eine Festphase, bevorzugt Silikagel, aufgetragen. Die Festphase wird mit verschiedenen neutralen Elutionsmitteln behandelt, bis in dem Eluat keine Aminosäuren, Kohlenhydrate und andere einfache Hydrolyseprodukte nachweisbar sind. Die Desorption der erfindungs­ gemäßen Wirkstoffe erfolgt mit Hilfe von verdünnten Alkalien, be­ vorzugt mit 0,1- bis 0,2-molarem Ammoniumhydroxid.

Tierische Gewebe und Gewebeflüssigkeiten können geringe Mengen der erfindungsgemäßen Wirkstoffe als undefinierte Konjugate enthalten. Erfindungsgemäß wird zuerst eine organische Extraktion der Gewebe oder der schonend gefriergetrockneten organischen Flüssigkeiten, bevorzugt Urin, durchgeführt. Aus dem eingeengten organischen Ex­ trakt werden die erfindungsmäßen Wirkstoffe durch Verwendung von selektiven, affinitätschromatographischen Methoden isoliert und gereinigt. Zu diesem Zwecke wird ein bekanntes Herzglykosid, be­ vorzugt Ouabain oder Hellebrin, an einer festen Phase, bevorzugt Sepharose, kovalent gebunden. Diese Affinitäts-Phase hält die er­ findungsgemäßen Wirkstoffe aus der konzentrierten Rohstofflösung fest. Nach mehrmaligem Auswaschen der Säule mit schwach sauren oder neutralen Pufferlösungen werden die erfindungsgemäßen Verbin­ dungen mit Hilfe von alkalischen Pufferlösungen freigesetzt.

Bioregulatorische Anwendungen

Der Autor hat gefunden, daß die erfindungsgemäße Wirkstoffe die Aktivität des Na⁺,K⁺-ATPase-Enzyms, das auch als Natrium-Pumpe bekannt ist, wirksam steuern. Dieses weit verbreitete Enzym regelt durch den sogenannten aktiven Membrantransport die extra- und in­ trazelluläre Konzentration der wichtigsten Alkalimetailionen. Die dafür nötige Energie liefert die Hydrolyse des ATP, die mit der Aktivität dieses Enzyms direkt gekoppelt ist. Die erfindungs­ gemäßen Wirkstoffe sind fähig die komplexe Aktivität dieses Enzyms zu steuern. Die Richtung und Intensität dieser Steuerung ist von der Konzentration und von der molaren Masse der erfindungsgemäßen Wirkstoffe abhängig. Die Natur und Konzentration der anwesenden Alkalimetallionen und der anderen anorganischen Ionen können diese Steuerungseffekte maßgebend beeinflussen. Bei der Zugabe der er­ findungsgemäßen Wirkstoffe zu einer Erythrozyten-Suspension wurde nach kurzer Zeit eine Steigerung der extrazellulären Na-Konzentra­ tion d. h. eine Aktivierung der Natrium-Pumpe beobachtet.

In vitro und bei bestimmten Konzentrationen der erfindungsgemäßen Wirkstoffen kleinerer molaren Masse wurde dagegen eine Inhibition des Na⁺,K⁺-ATPase-Enzyms festgestellt.

Eine Reduzierung der toxischen Nebenwirkungen von Ouabain oder von anderen herzwirksamen Glykosiden wurde ebenfalls beobachtet wenn die erfindungsgemäßen Wirkstoffe zusammen mit diesen Glykosiden angewandt wurden. Der LD₅₀ Wert von Hellebrin wird bei der Zu­ mischung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe in einem Molverhältnis zwischen 0,02 bis 2/1 Mol Glykosid, bevorzugt 1 : 1, wesentlich erhöht, was eine Verringerung der akuten Toxizität bedeutet. Aller Anzeichen nach sind die erfindungsgemäßen Wirkstoffe als endogene Liganden des Na⁺,K⁺-ATPase Enzyms verwendbar. Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe sind weiterhin fähig, die Akti­ vität von mehreren anderen lebenswichtigen Enzymen zu steuern, z. B. von Kollagenase, Hyaluronidase, Phosphokinasen und anderen Enzymen, wie experimentell festgestellt wurde.

Immunregulation

Der Autor hat mehrere immunregulatorische Wirkungen für die er­ findungsgemäßen Substanzen gefunden. Diese Mechanismen können zum Teil mit der oben beschriebenen Steuerung des Na⁺,K⁺-ATP-ases auch erklärt werden, weil dieses Enzym an sehr vielen immunologischen Vorgängen maßgebend beteiligt ist.

Eine neuartige immunoregulatorische Wirkung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe kommt aber dadurch zustande, daß diese eine spezifische Affinität für die Fc-Rezeptoren haben. Diese Rezeptoren sind an verschiedenen Immunozyten verankert und deren Besetzung oder Unbe­ setzung spielt bei der Aktivitätssteuerung dieser Zellen eine grundlegende Rolle.

In klinischen Untersuchungen hatten die erfindungsgemäßen Wirk­ stoffe die Aktivität der K-Zellen bei der antikörperabhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC) gehemmt. Dagegen wurde die Aktivi­ tät der NK-Zellen bei der spontanen zellulären Zytotoxizität (SCMC) von den erfindungsgemäßen Wirkstoffen unterschiedlich be­ einflußt: Bei rheumakranken-Patienten wird die pathologisch über­ höhte spontane Zytotoxizität deutlich herabgesetzt. Bei gesunden Versuchspersonen wurde die spontane Zytotoxizität nur geringfügig beeinträchtigt. Die klinischen Daten bewiesen damit, daß die er­ findungsgemäßen Wirkstoffe für eine kausale Rheumatherapie durch eine Dämpfung der pathologischen autoaggressiven Vorgänge geeignet sind. Es ist wichtig zu bemerken, daß all diese Effekte mit unge­ wöhnlich kleinen Wirkstoffmengen im Bereich von µg/kg erzielt wurden. Anderseits ist die Toxizität der erfindungsgemäßen Verbin­ dungen äußerst gering. Somit sind die wichtigsten pharmakotoxiko­ logischen Voraussetzungen für die erfindungsgemäßen humanthera­ peutischen Anwendungen weitgehend gesichert.

Die rheumatherapeutische Verwendung der erfindungsgemäßen Wirk­ stoffe bietet einen zusätzlichen deutlichen Vorteil. Das einfache Cyclohexamer co-(C₃O₂)₆ und seine Addukte zeigen eine ungewöhnlich starke schmerzstillende und spasmolytische Wirkung. Die bei einer lokalen Verabreichung sofort eintretende schmerzstillende und spasmolytische Wirkung bietet für die praktischen Rheumatherapie- Anwendungen wichtige Vorteile. Die schnell eintretende Schmerzbe­ freiung und Spasmolyse wird durch die Wiederherstellung der nor­ malen Immunregulation langzeitig beibehalten.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe mit größerer molaren Masse sind fähig, eine bemerkenswerte nichtspezifische Immunstimulation aus­ zuüben. Dies wurde in Tierexperimenten mit bakteriellen Infektio­ nen eindeutig bestätigt. Die mit Wirkstoff behandelten Tiere hatten bei lethalen-Pseudomonas-aeruginosa-Dosen erheblich größere Überlebensraten als die Tiere in der Kontrollgruppe.

Die erfindungsgemäßen bioregulatorischen Wirkstoffe können ent­ weder getrennt als Reinsubstanz oder als Substanzgemisch oder in Form von pharmazeutischen Zubereitungen verabreicht werden, wobei die letztgenannten außer den erfindungsgemäßen Substanzen noch einen und/oder mehrere pharmazeutisch unbedenkliche Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthalten können. Als diese Stoffe seien hier 0,9%-ige Kochsalzlösung, 1 bis 5%-ige Glucose- oder Fructose­ lösung, Carboxymethylcellulose, Kartoffelstärke, Lactose, Lanolin, Mannit, Magnesiumstearat, Glycerin, Cetylstearylalkohol, Nipagin, Natriumlaurylsulfat und Talcum genannt. Gegebenenfalls können den so hergestellten pharmazeutischen Zubereitungen auch noch weitere therapeutische Wirkstoffe oder Adjuvanzien zugesetzt werden. Diese galenischen Formulierungen schließen alle diejenigen Formu­ lierungen ein, die für parenterale, intramuskuläre, intravenöse, subkutane, peri- oder intraartikulare Injektionen, eine perorale wie mittels Tabletten, Kapseln oder Tropfen, oder eine äußere Anwendung, wie mittels Salben, Cremes, Gelen oder Suppositorien, geeignet sind.

Beispiel 1 Synthetische Herstellung aus Kohlensuboxid

In einem Glasreaktor, der mit einem mit Wasser gekühlten Rück­ flußkühler ausgerüstet ist werden 15 Teile Malonsäure in 80 Teilen Essigsäureanhydrid durch Erwärmen mit einem Ölbad (80°C) und unter Rühren aufgelöst. In Verlängerung des Rückflußkühlers werden noch weitere zwei Kühlfallen angeschlossen, um die entstandenen flüch­ tigen Verbindungen aufzufangen. Nachdem die ganze Säuremenge auf­ gelöst ist, gibt man 0,2 Teile Rubidiumfluorid zu, und es wird eine photochemische Bestrahlung mit einer 250 W-starken Sonnenlicht Lampe durchgeführt. Es folgt eine Erhöhung der Ölbadtemperatur bis auf 130-150°C, und das Reaktionsgemisch wird immer stärker braun gefärbt. Das im starken Vakuum flüchtige Kohlensuboxyd und seine Derivate werden in den mit Trockeneis und Aceton gekühlten Fallen kondensiert. Das Kondensat wird durch fraktionierte Vakuum-Destil­ lation gereinigt. Die somit erhaltenen Wirkstoffe werden durch Verwendung von bekannten chromatographischen Methoden gereinigt und analysiert.

Beispiel 2 Gewinnung aus technischen Methanol

Zu 1000 Teilen aus Synthesegas hergestelltem Methanol werden 250 Teile 0,1-molare Ammoniumacetat-Pufferlösung von pH 9 hinzugefügt, und aus diesem Gemisch wird zuerst das Methanol durch Anwendung einer Destillationskolonne abdestilliert. Der zurückgebliebenen Wasserphase werden wiederum 1000 Teile Methanol zugeführt, und die Abdestillation des Methanols wird noch 3-4 mal wiederholt. Die zu­ letzt zurückgebliebene Wasserphase wird schonend eingeengt und mit Aktivkohle behandelt. 50 Teile der durch Filtration abgetrennten und an der Luft getrockneten Aktivkohle werden mit 400 Teilen 45% (V/V) Ethanol enthaltendem Wasser bei 80-90°C behandelt und nach 30 min Mazeration warm filtriert. Die Extraktion wird noch 2-mal wiederholt. Die vereinigten ethanolischen Auszüge werden schonend eingeengt und gefriertrocknet.

Beispiel 3 Gewinnung aus Helleborus spezies

15 Teile getrocknete und grob pulverisierte Wurzel und Wurzelstock von Helleborus purpurascens (Familie Ranunculaceae) werden mit 120 Teilen Hexan entfettet und anschließend mit 80 Teilen Methylen­ chlorid vorextrahiert. Nach Entfernung des Extraktionsmittels wird der getrocknete Rückstand mit 200 Teilen 30% (V/V) Ethanol enthal­ tendem Wasser während 24 Stunden bei Raumtemperatur mazeriert. Die Extraktion wird zweimal wiederholt und anschließend werden die vereinigten Extrakte filtriert und im Vakuum eingeengt. 250 Teile des somit erhaltenen Extrakts werden mit 3 Teilen konzentrierter Salzsäure versetzt und 20 Minuten auf 95°C erwärmt. Nach dem Neutralisieren wird die Lösung mit wenig Aktivkohle behandelt und filtriert. Das im Vakuum eingeengte Filtrat wird in das 8-fache Volumen Aceton eingegossen, das zentrifugierte Präzipitat in minimaler Wassermenge aufgelöst und mit Aceton 2-3mal wiederholt präzipitiert. Der Niederschlag wird in minimaler 0,1 molaren Koch­ salzlösung gelöst und die Lösung auf eine mit TSK-HW-60 gefüllte Gelsäule geleitet. Die Elution erfolgt mit 0,125-molarer Ammoniak­ lösung in Wasser die noch 10% (V/V) 2-Propanol enthält, mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 5 cm/h. Die Detektion erfolgt durch Messung der Fluoreszenzemission im Bereich von 430 nm, die durch eine Anregungsbestrahlung 330 nm erzeugt wird.

Beispiel 4 Gewinnung der Wirkstoffe aus Kernen von Vitis vinifera

25 Teile getrocknete und gemahlene Kerne von Vitis vinifera werden mit 150 Teilen 0,05-molarem Boratpuffer mit pH = 9,6 versetzt und 30 Minuten auf 90°C erwärmt und mazeriert. Die filtrierte Lösung wird eingeengt und in das 8fache Volumen gekühltes Ethanol unter Rühren eingegossen. Der somit entstandene Niederschlag wird ab­ zentrifugiert und in minimaler Menge Wasser aufgelöst und mit je 6facher Menge gekühltem Ethanol noch zweimal präzipitiert. Das in minimaler Ammoniumacetatpufferlösung aufgelöste Präzipitat wird einer Trennung durch Ultrafiltration unterworfen, wo Membranen mit molaren Ausschlußgrenzen von 30, 10, 3, und 1 kD verwendet werden. Der pH der so getrennten Fraktionen wird auf einen schwach sauren pH-Wert eingestellt und lyophilisiert.

Beispiel 5 Wirkstoffgewinnung aus Phytolacca americana

100 Teile getrocknete Wurzel aus Phytolacca americana, wird auf eine Partikelgröße von 0,5-1,2 mm zerkleinert und mit 600 Teilen Hexan durch einen 24 Stunden dauernde Behandlung entfettet. Zu­ nächst wird das Hexan abgepreßt und das Pflanzenmaterial luftge­ trocknet, bis der Hexangeruch nicht mehr wahrnehmbar ist. Die ge­ trocknete Droge wird mit 800 Teilen 5% (V/V) Essigsäure enthalten­ den Wasser 4 Stunden bei Raumtemperatur mazeriert und der Prozeß wird zweimal wiederholt. Die vereinigten Extrakte werden filtriert und im Vakuum eingeengt. Zu 100 Teilen der wäßrigen Lösung werden stufenweise 15 bis 50 Teile Ammoniumsulfat zugemischt und aufge­ löst. Die durch Aussalzen präzipitierten Proteine werden durch Zentrifugieren und Filtration entfernt. Zu 50 Teilen Supernatant werden 50 Teile 1-Butanol gegeben und es wird kräftig geschüttelt. Nach einige Zeit wird die organische Phase abgetrennt, und die Extraktion mit Butanol wird noch zweimal wiederholt. Die vereinig­ ten butanolischen Lösungen werden mit 0,1% Ammoniak enthaltendem Wasser zurückextrahiert. Die wäßrige Phase wird im Vakuum einge­ engt und durch Gelfiltration gereinigt.

Beispiel 6 Herstellung aus Escherichia-coli-Kulturen

2000 Volumenteile autoklaviertes Kulturmedium, das 20 Teile Trypton, 10 Teile Hefe, 20 Teile NaCl und 30 Teile Agar enthält und mit den entsprechenden Nährstoffzusätzen ergänzt ist, wird mit Escherichia coli Stamm K-12 in Verdünnung 1 : 100 inokuliert. Die Kultur wird auf 37°C gehalten, bis eine Sättigungsdensität von 2 × 10⁹ Zellen/ml erreicht ist. Das Reaktionsgemisch wird an einer Ultraschallbehandlung ausgesetzt und mit 0.1 n Salzsäure 60 min auf 90°C erwärmt, nach dem Abkühlen filtriert und im Vakuum einge­ engt. 150 Teile der konzentrierten Lösung werden auf Kieselgel 60 für Säulechromatographie (Merck) absorbiert und die Festphase wird zuerst mit 2% (V/V) Essigsäure enthaltendem Wasser gewaschen, da­ nach mit 1000 Teile Puffergemisch bestehend aus n-Propanol: Ethyl­ acetat: Borax/Borat von 600 : 100 : 300% (V/V) und am Ende mit Wasser gewaschen. Die Festphase wird mit diesen neutralen Elu­ tionsmitteln so lange ausgewaschen, bis in dem Eluat keine Aminosäuren, Kohlenhydrate und andere einfache Hydrolyseprodukte nachweisbar sind. Die Desorption der erfindungsgemäßen Wirkstoffe erfolgt mit 0,2-molarem Ammoniumhydroxid, dessen Überschuß durch Konzentrieren im Vakuum entfernt wird, bis der pH-Wert der Lösung auf 7 bis 8 sinkt. Die somit erhaltene Lösung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe wird eingeengt.

Beispiel 7 Gewinnung aus tierischen Flüssigkeiten

10 000 Teile Schweineurin werden gefriertrocknet und das feste Rückstand wird mit 600 Teilen Methanol dreimal extrahiert. Die me­ thanolischen Auszüge werden bis auf 20 Teile eingeengt. 100 Teile Bromcyan-aktivierte Sepharose 4B wird 90 Minuten mit einer Lösung von entsprechend aktivierten Hellebrin behandelt, bis 80% der verwendeten Glykosids an die Festphase kovalent gebunden sind. 10 Teile eingeengte methanolische Lösung werden auf die so präpa­ rierte Affinitätschromatographie-Säule aufgebracht und mit Tris- Puffer-lösung so lange eluiert, bis in dem Eluat keine chemischen Verbindungen mehr nachweisbar sind. Von der Säule wird der erfin­ dungsgemäße Wirkstoff durch Gradient-Elution mit 0,05- bis 0,2-molaren Ameisensäure eluiert und gefriertrocknet.

Die Reinigung der Wirkstoffe erfolgt auf eine mit Sephadex LH-20 (Pharmacia) gefüllte Säule. Die Wirkstoffe werden zuerst an der Säule absorbiert und mit einem Gradient von 20 bis 60 (V/V) % Aceton in Wasser eluiert. Die Detektion erfolgt durch die Fluo­ reszenzmessung bei 420 nm mit einer Anregungsbestrahlung bei 335 nm.

Beispiel 8 Immunmodulatorische Anwendung

Die spontane zellvermittelte Zytotoxizität (SCMC) der NK-Zellen wurde durch die Dosierung der von den K₅₆₂-Targetzellen freige­ setzten ⁵¹Cr-Isotope in einem 100/1 bis 10/1 Effektor/Target- Verhältnis gemessen. Der erfindungsgemäße Wirkstoff hat bei 8 von den 10 gesunden Subjekten die lytische Aktivität erhöht mit einem Durchschnittswert von 15%. Die pathologisch auf 141% erhöhte SCMC-Akti­ vität der 16 rheumakranken Patienten wurde durch die Verabrei­ chung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe deutlich normalisiert. Die Effektorzellen bei der antikörperabhängigen zellulären Zytoto­ xizität (ADCC) werden von den erfindungsgemäßen Wirkstoffen viel einheitlicher beeinflußt. Wie aus dem nachfolgenden Diagramm 1 ersichtlich ist, wird die ADCC-Aktivität sowohl der gesunden wie auch der rheumakranken Patienten herabgesetzt.

Diagramm 1

Zytotoxizität von gesunden und rheumakranken Patienten mit und ohne Wirkstoffbehandlung

Diese Normalisierung der Aktivität kann durch die spezifische Affinität der Wirkstoffe an die Fc-Rezeptoren erklärt werden.

Beispiel 9 Stimulierung der Makrophagen

Die Milzlymphozyten von 10 normalen Mäusen wurden im mit Hepes ge­ pufferten und mit 10% fetalem Kalbserum ergänzten RPMI₁₆₄₀-Medium suspendiert. Die Suspension wurde 1 Stunde auf 37°C gehalten, um die Adhärenz der Makrophagen zu ermöglichen.

In der Versuchsgruppe wurden die Mäuse intraperitoneal mit 5 µg/kg Wirkstoff behandelt und 24 Stunden danach getötet. Die Tiere der Vergleichsgruppe hatten keinen Wirkstoff bekommen. Die Lymphozyten aus den beiden Gruppen wurden in 5 × 10⁵ adhärente Makrophagen ent­ haltenden Tuben kultiviert.

Wie ersichtlich, sind die durch LPS (Lypopolysaccharid) und PHA (Phytohaemagglutinin) erzielten Stimulationsindizes (SI) bei den mit Wirkstoff behandelten Tieren signifikant größer.

Beispiel 10 Anwendung für Immunstimulation

Eine nicht spezifische Immunstimulation wurde durch die Bestimmung der Überlebensraten von Tieren, die mit einer lethalen Dosis von Pseudonomas aeruginosa infiziert wurden, untersucht.

In drei Versuchsgruppen von je 30-100 Mäusen erhielt jedes Tier die lethale Dosis von Pseudomonas aeruginosa.

• I. In der ersten Gruppe wurden am 7-ten, 14-ten und am 28-ten Tag vor der lethalen Pseudomonas Infektion je 2 µg Wirkstoff, am 21-ten Tag 0,25 ml physiologisches NaCl-Lösung verabreichert,
• II. In der zweiten Gruppe wurden dieselben Wirkstoffdosen wie bei der Gruppe I., jedoch am 21-ten Tag 0,06 mg Cyclophosphamid
• III. Der Vergleichsgruppe wurden keine Wirkstoffe zugeteilt.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe hatten eine deutliche Steigerung der Überlebungsraten hervorgerufen. Durch die bekannte immunsup­ pressiven Wirkung des Cyclophosphamids sind zwar die Überlebungs­ raten gesunken aber sie blieben jedoch deutlich über den Werten von der Kontrollgruppe. Die Interaktion deutet auf eine nichtspe­ zifische Immunstimulation der erfindungsgemäßen Wirkstoffen wobei ein neuartiges bisher nicht beschriebenen Immunmechanismus auch vorstellbar wäre.

Claims (32)

1. Bioregulatorischer Wirkstoff mit anorganischem Strukturgerüst, dadurch gekennzeichnet, daß das Strukturgerüst aus dem einfachen Kohlensuboxyd C₃O₂ durch Cyclooligomerisierung so aufgebaut ist, daß mehrere, miteinander kondensierte 4-Pyron oder 2-Pyron-Ringe zusätzlich in einer Makroringstruktur derart zusammengeschlossen sind, daß die kumulierten C=O und C=C Doppelbindungen der Grund­ verbindung O=C=C=C=O nicht mehr vorhanden sind und diesem Grundge­ rüst der allgemeinen chemischen Formel: co-(C₃O₂)_nentspricht, worin co die vorgenannte Art der Verknüpfung der C₃O₂-Einheiten symbolisiert und n den Cyclooligomerisationsgrad des Kohlensuboxids bezeichnet.

2. Wirkstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in den Formeln der cyclooligomeren Kohlensuboxyd-Gerüste die Zahl n gleich 6 oder ein Vielfaches der Zahl 6 und/oder 10 ist.

3. Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß dieser mediumabhängig als Pyron oder Pyryliumsalz oder als andersartige Strukturform vorliegt, wobei in Lösung diese miteinander im Gleichgewicht stehen können.

4. Wirkstoff nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein in Lösung vorliegendes Pyron-Pyrylium Gleichgewicht für das cyclohe­ xamere Kohlensuboxid co-(C₃O₂)₆ mit alternierend Kopf-Schwanz-kon­ densierten und zusätzlich in einem Makroring zusammengeschlossenen sechs 4-Pyron-Ringen folgender Darstellung entspricht:

5. Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß dieser durch die Protonierung der exacyklischen Sauerstoffatome des Grundgerüstes, als Hydroxy-Pyrylium-Derivat mit der allgemeinen chemischen Formel co-(C₃O₂)_n · H_mvorliegt, worin in die Zahl der gebundenen Wasserstoffatome bedeu­ tet und einem Wert von m n entspricht.

6. Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das cyclohexamere Kohlensuboxid der Formel co-(C₃O₂)₆ mit der molaren Masse M = 408,19 oder sein Hydroxy-Py­ rylium-Derivat der Formel co-(C₃O₂H)₆ mit der molaren Masse M = 414,24, die Grundeinheiten für die Bildung von Addukten, Pyrylium­ salzen, Wirt-Gast-Komplexen, Selbstassoziaten und anorganischen oder organischen Derivaten sind.

7. Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die cyclohexamere Grundeinheit eine zylinderförmige Makroring-Struktur mit einem Innenhohlraum hat.

8. Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß er als Pyrylium-Salz der Formel co-(C₃O₂)_n · Ka_n · An_nvorliegt, worin Ka die kationische und An die anionische Gegen­ ionen bedeuten, die insgesamt die zwitterionischen Ladungen des Pyryliumgerüstes neutralisieren.

9. Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß er in Form eines Adduktes der Formel co-(C₃O₂)₆ · (R¹R²R³N)_mworin R¹, R² und R³ jeweils ein Wasserstoffatom oder
einen organischen Rest und in eine Zahl von 1 bis 6 ist, bestehend aus einem cyclohexameren Kohlensuboxid-Gerüst und 1 bis 6 Molekülen Ammoniak, organisches Amin, Aminosäure, Peptid oder einer anderen Substanz mit Aminfunktion vorliegt.

10. Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß anorganische oder organische Molekülen oder organi­ sche Reste R an die Sauerstoffatome des Grundgerüstes gebunden sind und somit anorganische und/oder organische Derivate oder Konjugate der allgemeinen chemischen Formel co-(C₃O₂)_n · R_mentstehen, worin R = ein anorganisches oder organisches Molekül und/oder einen organischen Rest bedeutet und m 2n ist.

11. Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Grundeinheit co-(C₃O₂)₆ oder co-(C₃O₂H)₆ in Form von stabilen Selbstassoziaten der Formel {co-(C₃O₂)₆}_s oder {co-(C₃O₂H)₆}_svorliegt, worin s = 2, 3, 4, 5, 6, 10 oder 12 sowie ein Viel­ faches dieser Zahlen ist.

12. Wirkstoff nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung entsprechend dem Wert s = 12 und den molaren Massen 4.898 und 4.970 des Gerüstes eine hohe Struktursymmetrie aufweist.

13. Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekenn­ zeichnet, daß er in Lösung in Form eines dynamischen Gleichge­ wichts zwischen kleineren und größeren Verbindungen gemäß der Gleichung: vorliegt, worin s die in Anspruch 11 angegebene Bedeutung hat und die Zahl p < s ist.

14. Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekenn­ zeichnet, daß dieser bei einer Anregung im Bereich von 310-340 nm eine charakteristische Fluoreszenzemission im Bereich von 400-450 nm zeigt.

15. Verfahren zur Herstellung von bioregulatorischen Wirkstoffen nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man Kohlensuboxid photochemisch aktiviert und/oder durch Verwendung von Hilfstoffen in Form von Salzen, deren Radius von 2,4 bis 3,2 Å liegt unter Bildung von Makroringstrukturen cyclooligomerisiert.

16. Verfahren zur Herstellung von bioregulatorischen Wirkstoffen nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man

• - großtechnologisch aus Synthesegas oder durch Oxosynthese er­ zeugte organische Produkte einsetzt,
• - die darin enthaltenden bioregulatorischen Wirkstoffe durch fraktionierte Destillation anreichert,
• - diese Wirkstoffe durch Vakuumdestillation und Kondensation bei niedrigen Temperaturen isoliert und
• - durch Absorption an festen Phasen und Desorption mit verschie­ denen Lösungsmitteln reinigt.

17. Verfahren zur Gewinnung von bioregulatorischen Wirkstoffen nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man

• - Pflanzen oder pflanzliche Zellkulturen, die toxische Glykoside, Alkaloide oder Gerbstoffe enthalten, als Rohstoff benutzt
• - die in diesem Rohstoff enthaltenen, chemisch undefinierten Konjugate mit wässerigen Lösungen extrahiert,
• - die Konjugate durch Hydrolyse spaltet und/oder mit Aceton, Alkohol oder andere Lösungsmittel präzipitiert,
• - das erhaltene Gemisch an einen Ionenaustauscher oder ein neut­ rales Absorbens bindet und die anderen Inhaltsstoffe auswäscht,
• - den Wirkstoff durch basische Pufferlösungen oder selektiv wirkende Lösungsmittelgemische desorbiert und
• - durch Dialyse, Membranfiltration, Gelchromatographie oder andere Verfahren reinigt und gegebenenfalls nach Molekülgrößen auftrennt.

18. Verfahren zur Gewinnung von bioregulatorischen Wirkstoffen nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff aus Bakterienkulturen erhalten wird, wobei man

• - die Kulturbrühe mit Ultraschall behandelt und/oder bei saurem pH-Wert hydrolisiert,
• - durch Flüssig-Flüssig-Extraktion den Wirkstoff grob isoliert,
• - den Wirkstoff an Aktivkohle oder ein anderes Absorbens bindet,
• - mit einer warmen Alkohol-Wasser-Lösung oder einem anderen Lösungsmittelgemisch selektiv in Lösung bringt und
• - durch chromatographische oder andere Trennungsverfahren reinigt.

19. Verfahren zur Gewinnung von bioregulatorischen Wirkstoffen nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff aus Gewebe, Gewebeflüssigkeiten oder Gewebekulturen tierischen Ursprungs extrahiert wird, wobei man

• - die wässerigen Extrakte einengt und/oder gefriertrocknet,
• - durch Flüssig-Flüssig und Flüssig-Fest Extraktionen vorreinigt,
• - an eine Affinitäts-Festphase mit kovalent gebundenem spezifi­ schem Glykosid oder Protein bindet und
• - durch ionische Lösungsmittelgemische selektiv freisetzt.

20. Verwendung des Wirkstoffs nach den Ansprüchen 1 bis 14, als therapeutische Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß das Cyclooligo­ mere co-(C₃O₂)₆ mit der molaren Masse M = 408,2 oder als Hydroxy- Pyrylium Derivat co-(C₃O₂H)₆ mit M = 414,2 sowie deren Addukte, Selbstassoziate und Komplexe mit der molaren Masse M 2.000 D zur

• - Bioregulation des Na⁺,K⁺-ATPase-s und anderer Enzyme,
• - Reduzierung von schädlichen autoaggressiven Vorgängen bei Autoimmunkrankheiten,
• - Immunregulation durch Bindung an Fc Rezeptoren und
• - Schmerztherapie durch Anbindung an Neurorezeptoren eingesetzt werden.

21. Verwendung des Wirkstoffs nach den Ansprüchen 1 bis 14, als therapeutische Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß die größeren Cyclooligomeren der allgemeinen Formel co-(C₃O₂)_n oder co-(C₃O₂H)_n und mit einer molaren Masse M < 2.000 D zur

• - Steuerung des Na⁺,K⁺-ATPase-s und anderer Enzyme,
• - Stimulation der Immunabwehrmechanismen und
• - Steuerung der Phagozytose

eingesetzt werden.

22. Verwendung nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß Addukte, Pyrylium-Salze, Derivate oder Gast-Wirt-Komplexe der Cyclooligomeren eingesetzt werden.

23. Verwendung des Wirkstoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß er in Form eines Konjugats oder Addukts mit bekannten pharmakologisch aktiven Substanzen zur

• - Herabsetzung der akuten und/oder chronischen Toxizität von Herzglykosiden, Alkaloiden oder anderen Arzneistoffen oder,
• - Erhöhung der Bioverfügbarkeit von steroidischen, peptidischen oder andersartiger Wirksubstanzen

eingesetzt wird.

24. Verwendung des Wirkstoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß er mit membranundurchlässigen Ionen oder kleinere Substanzen Gast-Wirt Komplexe bildet und dadurch den Transport durch die Zellmembran ermöglicht.

25. Verwendung des Wirkstoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Behandlung von Phlogosis, Rheumatismus und Autoimmunkrankhei­ ten.

26. Verwendung des Wirkstoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Behandlung von Krankheiten, die durch akute oder chronisch ge­ schwächte Immunabwehrkräfte verursacht worden sind.

27. Verwendung des Wirkstoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Pathologien, welche durch eine fehlerhafte Bioregulation des Na⁺,K⁺-ATPase-Systems verursacht worden sind.

28. Verfahren zur Diagnostik von Krankheiten mit Autoimmunpatholo­ gien, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 14 als solcher oder in markierter Form zur Unter­ suchung einer Blut- oder Gewebeprobe eingesetzt wird.

29. Verfahren zur Diagnostik von immunologisch bedingten Krank­ heiten, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische Präzipita­ tionsreaktion des Wirkstoffs nach Anspruch 21 oder 22 mit Immun­ globulinen oder deren Fragmenten benutzt wird.

30. Verfahren zur Diagnostik von Krankheiten mit Herz- und Kreis­ lauf-Pathologien, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 14 als solcher oder in markierter Form eingesetzt und/oder durch Gelchromatographie, Fluoreszenz oder Radioimmundosierungen analysiert wird.