SK88598A3 - Macrocyclic compounds made from suboxide units - Google Patents

Description

Makrocyklické zlúčeniny vyrobené zo suboxidových jednotiek

Oblasť techniky

Vynález sa týka makrocyklických zlúčenín, ktoré sú bioregulačne aktívne a spôsobov na ich syntetickú produkciu, rovnako ako ich izolácie z rôznych východiskových materiálov. Tiež je popísaná aplikácia týchto aktívnych zlúčenín ako takých alebo v kombinácii s inými aktívnymi zlúčeninami na reguláciu enzýmov a bioreguláciu.

Doterajší stav techniky

Správny priebeh biochemických procesov a optimálna funkcia biologických imunitných mechanizmov je zabezpečovaná mnohými bioregulačne aktívnymi zlúčeninami (Rompp Lexikón strana 3826 Regulation). Z chemického hľadiska sú doteraz známe bioregulačné aktívne substancie peptidy, uhľohydráty, steroidy alebo lipidy, kde sa tieto štrukturálne elementy tiež môžu vyskytovať spoločne (napríklad, glykopeptidy, lipoproteíny). Ďalej, je tiež známa aplikácia bioregulačne aktívnych substancií na terapiu ochorení, ktoré sú spôsobené narušenými funkciami jedného alebo viacerých z týchto regulačných mechanizmov. Terapeutické použitie steroidných hormónov, kortikosteroidov a srdcových glykozidov, rovnako ako rastových hormónov alebo faktorov koagulačnej kaskády sú v tomto zmysle jedny z mnohých príkladov. Napriek tomu, farmakoterapia zlúčeninami tohto typuje veľmi často sprevádzaná škodlivými nežiaducimi účinkami a je nimi významne obmedzená. Podrobné zváženie týchto aspektov je možné nájsť v Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8. vydanie, New York, 1991. Napríklad, u srdcových glykozidov, pozitívne inotropný, terapeuticky užitočný účinok je sprevádzaný kardiotoxickými vedľajšími účinkami a v dôsledku toho musí byť terapeutická dávka veľmi prísne obmedzená. Ako ďalší príklad môže byť uvedená aplikácia kortikosteroidov, kde je terapeutické použitie doporučované vo veľmi vážnych prípadoch a len počas obmedzenej doby, vzhľadom na množstvo veľmi vážnych nežiaducich účinkov, ako je myopatia, osteoporóza, psychické poruchy, zvýšená citlivosť na infekcie, atď.

Aj napriek značnej snahe o liečbu imunologický spôsobených syndrómov imunoregulačne aktívnymi látkami neboli skoršie klinické testy presvedčivé. Cieľom takých imunoterapeutic2 kých aplikácii bude základná liečba autoimunitných ochorení ako je reumatoidná artritída a roztrúsená skleróza, okrem iného, ktorá doteraz nebola objavená. Podľa E. Sercarz a S K. Datta (Autoimmunity v Current Biology 6: 875 - 881 (1995) sú tieto autoimunitné ochorenia najčastejšie spôsobené poruchou imunoregulácie. V boji proti vážnym ochoreniam, ktoré sú charakterizované značným oslabením imunitného systému, ako je karcinóza alebo AIDS, malo predchádzajúce terapeutické použitie imunoregulačných látok malý význam.

Bolo charakterizovaných niekoľko bioregulačných peptidov a proteínov, ako je popísané v monografii od M.J. Cíemens Cytokines, Oxford, 1991. Tieto cytokiny majú významnú úlohu u rôznych karcinózach, u autoimunitných ochoreniach a tiež už boli niekoľkokrát popísané pri vírusových infekciách (vrátane AIDS). Aj napriek tomu stále chýba väčší rozsah širšej terapeutickej aplikácie týchto a iných bioregulačných proteínov a peptidov. Jedna z príčin tohto stavu iste spočíva v často veľmi prácnej technológii produkcie: extrakcie a následne prečistenia bioregulačne aktívnych látok z tkanivových kvapalín ľudí alebo zvierat, kde sú prítomné vo veľmi malých množstvách, je úplne nevhodná na získanie terapeuticky potrebných množstiev. Nebezpečie alergických vedľajších účinkov a/alebo anafylaktickej reakcie, aj napriek tomu, že sa vyskytujú veľmi vzácne, znamená významný rizikový faktor na terapiu u ľudí, ktorý stále existuje v spojitosti s génovou technológiou produkovanými bioregulačnými polypeptidmi alebo glykoproteínmi. Základný problém terapeutických aplikácií niekoľko in vitro vysoko aktívnych polypeptidových faktorov spočíva v skutočnosti, že in vivo vykazujú úplne odlišnú, väčšinou omnoho slabšiu aktivitu. Na jednej strane, mnoho fyzikálnych a enzymatických bariér bráni zvonka podaným peptidom a proteínom dosiahnuť miesto patologických dejov (ložiská zápalu, nádorového defektu atď.). Na druhej strane, tieto látky sú rýchle neutralizované a metabolizované endogénnymi enzýmami a inými faktormi, ktoré sú tu prítomné. Pri perorálnom podaní aktívnych látok peptidového, glykopeptidového a glykozidického charakteru sú tieto látky prakticky neúčinné už v gastrointestinálnom trakte vďaka pôsobenia mnohých degradačných procesov.

Napriek tomu, relatívne rýchla degradácia bioregulačne aktívnych substancií peptidového alebo glykopeptidového charakteru musí byť vzatá do úvahy pri podaní per os. Na úplne dosiahnutie terapeuticky účinnej koncentrácie v mieste patologického deja alebo prejavu, ako je ložisko zápalu alebo nádorový vred, musí byť napríklad uskutočnené maskované podanie. Niečo podobného je popísané v R. Collier a D. Kaplan v Immunotoxine, Heidelberg 1988, v súvislosti s použitím toxínov, ktoré môžu účelne využívať väzby na monoklonálne protilátky (zacielenie liečiva). Napriek tomu, liečebná technika je stále veľmi komplikovaná a stále zostáva obmedzene aplikovateľnou na špecifické prípady. Pre regulačné aktívne substancie nie je biodostupnosť závislá len na stabilite, ale tiež na čisto fyzikálnych procesoch, ako je rozpustnosť a permeabilita membrán. Táto úvaha sa týka vytvorenia možnej rozpustnosti lipofilných substancií vo vode alebo vytvorenia možnej membránovej permeability hydrofilne aktívnych substancií ako sú ióny Na⁺ a K⁺ Napríklad, mitochondriálna membrána nie je normálne priepustná pre draselné ióny. Makrocyklické antibiotiká ako je nonaktín alebo valinomycín umožňujú túto priepustnosť vďaka organickému obaleniu odpovedajúcich iónov.

Od roku 1967, roku objavu korunkových éterov, bolo produkovaných mnoho zlúčenín, ktoré majú makrokruhovú štruktúru a umožňujú korunkové alebo kryptátu-podobné krytie anorganických iónov alebo menších molekúl. Napriek tomu, dôležitými podmienkami na priame terapeutické použitie takých kryptáty-tvoriacich makrocyklických látok sú nízka toxicita a dobrá bioasimilácia, čo je len zriedka splnené synteticky produkovanými činidlami tvoriacimi kryptáty.

Mnoho základných bioregulačných mechanizmov je kontrolovaných takzvanou sodíkovou pumpou. Tento enzým má schopnosť pumpovať sodíkové ióny z vnútra buniek do vonkajšieho prostredia a súčasne transportovať draselné ióny opačným smerom. Spotreba energie je hradená nadväznou hydrolýzou adenozín trifosfátu (ATP). Táto pumpa je identická s enzýmom označovaným ako Na⁺, K⁺- ATPasa a je všeobecne rozšírená. Niekoľko významným bunkových funkcií je kontrolovaných touto Na⁺, K⁺- ATPasou, ako napríklad objem bunky, produkcia tepla, intracelulárna koncentrácia voľných Ca2⁺ iónov, neuronálny prenos, svalové kontrakcie alebo membránový potenciál.

V mnohých imunoregulačných procesoch sú významné fázy tiež kontrolované Na⁺, K⁺ATPasou a preto má sodíková pumpa tiež základnú úlohu v imunoregulácii. Aj napriek tomu všeobecné rozšírenie a význam nebol regulačný mechanizmus tohto enzýmu objasnený. Takzvané receptorové miesto pre srdcové glykozidy tohto enzýmu je predpokladané ako funkčné umiestnenie bioregulácie sodíkovej pumpy. Srdcové glykozidy prítomné v niekoľkých rastlinných druhoch sa viažu na toto miesto s vysokou afinitou a tu vykazujú svoje kardiotonické, ale tiež svoje kardiotoxické účinky. Napriek tomu, ich toxicita dokazuje, že nie sú identické s endogénnymi ligandami tohto enzýmu. V správe (Endogenous digitalis-like factors od W. Schoner v Progress in Drug Research, 41: 249 - 291 (1993) sa popisuje, že chemický charakter a štruktúra týchto endogénnych bioregulačných substancií nebola doteraz určená, aj napriek značnej výskumnej snahe. Doteraz nemohlo byť dostatočné množstvo týchto endogénnych faktorov izolované zo zvieracích tkanív a tekutín, aby mohla byť uskutočnená presná charakterizácia a určenie štruktúry. Aktivita Na⁺, K⁺- ATPasy, a preto niekoľko bioregulačných mechanizmov, môže byť účinne kontrolovaných faktormi, ktoré sú identické alebo štrukturálne podobné s týmito endogénnymi ligandami.

Novo bolo objavených niekoľko jednoduchých anorganických zlúčenín, ktoré sa zúčastňujú bioregulačných procesov. Napriek tomu, je významné uviesť, že všetky z týchto anorganických zlúčenín sú používané len ako jednoduchí pošli alebo efektory. Chýba im trojrozmerná štruktúra nevyhnutná pre biologický účinok a pre schopnosť štrukturálne špecifického účinku s týmto spojeného. V správe Biological Roles of Nitric Oxide podľa S. Snyder a D. Bredt vo Scientific Američan, 1992 (5) 22 - 29 je popísané, že táto plynná zlúčenina je funkčným efektorom v kontrole nešpecifickej imunitnej odpovede. V organizme má oxid dusnatý veľmi krátku dobu života na dosiahnutie jeho lokálnych, väčšinou toxických účinkov a je obvykle produkovaný in situ. Keď sú fagocyty imunitného systému, takzvané makrofágy, aktivované bakteriálnymi toxínmi alebo cytokinmi, potom môžu produkovať relatívne veľké množstvá oxidu dusnatého počas hodín a tento je využitý ako imunologická zbraň. Predpokladá sa, že ďalšie jednoduché plynné zlúčeniny sa tiež zúčastňujú na bioregulačných procesoch. Etylén, napríklad, je známy ako dôležitý faktor v rastlinnej biológii. Oxid uhoľnatý sa účastní fyziologickej regulácie cyklizácie guanozínmonofosfátu (GMP), ako popísal A. Verma v Science 259, 381 (1993).

Len veľmi málo toho bolo doteraz napísané o biologickom účinku iného oxidu uhlíka, omnoho menej sa vyskytujúcom C3O2· Je len známe to, že je to zlúčenina, ktorá je plynná pri izbovej teplote (bp 7 °C), že je iritujúca pre slizničné membrány a že zapácha ako horčičná silica a akroleín. Suboxid uhlíka predstavuje relatívne silný krvný toxín, ktorý sa ireverzibilné viaže na hemoglobín; tolerančný limit u myší je medzi 0,2 -0,4 % C3O2 v suchom vzduchu. C3O2 reaguje s vodou a tvorí kyselinu malónovú. Napriek tomu, bez stôp minerálnych kyselín neprebieha táto reakcia tak rýchle, ako bolo skôr uvedené. Predpokladá sa, že okrem oxidu uhoľnatého obsahovala primitívna redukujúca atmosféra zeme tiež významné množstvo C3O2, a teraz boli objavené dôkazy jeho možnej prítomnosti v medzihviezdnom priestore, ako popisuje W. Huntress et al., v Náture 352: 316 - 318 (1991). Napriek tomu, doteraz tu nie je konkrétny dôkaz pre možnú prítomnosť C3O2 v biologických tekutinách. Pri zvážení citlivosti monomérneho plynu na vodu, rovnako ako amorfného polyméru, bola možná biologická úloha a priori vylúčená. Hypotéza H. Yanagawa a F. Egami v Precambrian Researchh 14: 75 (1981), kde sa uvádza, že vo vode reaktívne amorfné polyméry by mohli byť možným východiskovým materiálom pre pôvodnú syntézu jednoduchých organických zlúčenín, je považovaná za v zásade možnú.

Plynný C3O2 viac či menej rýchle tvorí amorfné polyméry, ktoré sú žlté až intenzívne červeno zafarbené. Je len veľmi málo konkrétneho známe o štruktúre týchto polymérov. Všeobecne, sú popisované ako homogénna amorfná hmota, ktorá bola skôr tiež označovaná ako červený uhlík. Chemické vlastnosti suboxidu uhlíka a jeho polymérov sú popísané v správe T. Kappe a E. Ziegler, Agnew. Chem., 86: 529 (1974). Produkty polymerizácie sú čiastočne rozpustné vo vode alebo v riedených alkáliách, kde tvoria intenzívne žlté až tmavo hnedo zafarbené roztoky. Pre štruktúru týchto amorfných, nepravidelných polymérov bolo navrhnuté niekoľko hypotetických vzorcov, ale žiadny z nich nemohol byť experimentálne potvrdený. Za najpravdepodobnejšiu sa považuje grafitu podobná, hexagonálna mriežková štruktúra, ktorá je nenasýtená na periférii a musí byť odpovedajúcim spôsobom nestabilná. Táto hypotéza bola podrobne popísaná v správe N.S. Smith a D. A. Young v Inorganic Chemistry 2, 829 (1963).

Ďalej je známe, že niekoľko biologicky vysoko účinných látok sa v plazme nenachádza ako také, ale skôr ako konjugáty. Napríklad, steroidné hormóny sú prítomné v plazme ako sulfátové alebo glukuronátové konjugáty a ich degradačné produkty sú tiež eliminované ako konjugáty. Nie je vzácnosťou, že tieto konjugované steroidy vykazujú i lepšie terapeutické vlastnosti v porovnaní s čistými aktívnymi zlúčeninami, ako je to popísané pre konjugovaný steroid estrogén podľa US 2565115 a US 2720483 alebo pre dehydroepiandrosterónsulfát (DHEAS). Vyššie uvedené konjugácie regulujú biologickú dostupnosť a asimiláciu týchto steroidných aktívnych zlúčenín a môžu tak vysvetliť zlepšené terapeutické vlastnosti. Relatívne málo je známe o regulácii biodostupnosti polypeptidových aktívnych zlúčenín tvorbou odpovedajúcich konjugátov. Enzymatická konjugácia proteínov s ubiquitínom má tiež regulačné funkcie, ako je popísané v Trends Biochemicals Sciences 15, 195 (1990). Vhodná konjugácia polypeptidových látok môže dosiahnuť pokrok v terapeutických aplikáciách týchto aktívnych zlúčenín. Ako príklad môže byť uvedené hľadanie inzulínu s retardovaným účinkom. Je známe, že terapeutický funkčný čas inzulínu je významne predĺžený pridaním solí zinku alebo protamínsulfátu. Napriek tomu, tieto prísady môžu spôsobovať rôzne vedľajšie účinky. Vhodný konjugát, ktorý by zaistil spomalené uvoľňovanie inzulínu, bol hľadaný mnohými vynálezcami, ale doteraz nebol realizovaný.

Podstata vynálezu

Predmetom predkladaného vynálezu je poskytnutie nových makrocyklických zlúčenín s bioregulačnou aktivitou, v ktorých sa neprejavujú vyššie uvedené nevýhody a ktoré spôsobujú obnovenie narušených bioregulačných mechanizmov pri ochorení. Okrem toho, aktívne zlúčeniny by mali jasne zlepšovať terapeutický účinok a biodostupnosť známych liečiv.

Tento predmet je vyriešený predkladaným vynálezom v bodoch 1 až 39 patentových nárokov.

Popis obrázkov na pripojených výkresoch

Obrázok 1: ElektroionizaČné hmotnostné spektrum com-(C₃O2)6 vo vode.

Obrázok 2: Elektrospray hmotnostné spektrum amínových komplexov com(C₃O₂)6.(NH3)2 a com-(C₃O₂)6(NH₃)₆.

Obrázok 3: LC-párované elektrospray hmotnostné spektrum viacnabitých jednotiek com-(C₃O₂)n s n=558.

Obrázok 4: MALDI- hmotnostné spektrum com-(C₃O₂H)6Q a com-(C₃O2H)72·

Obrázok 5: Infračervené spektrum v KBr peletách com-(C₃02)io

Obrázok 6: UV-VIS absorpčné spektrum com-(C₃O2)ô vo vode.

Obrázok 7: HP-gélový vylučovací chromatogram zmesi aktívnej látky a štandardná krivka kolóny charakterizujúcej molekulovú hmotnosť.

Látky podľa predkladaného vynálezu sú chemické zlúčeniny, ktorých štrukturálny skelet je založený na cyklooligomerizáci jednoduchého anorganického suboxidu uhlíka Ο₃Ο₂. I keď suboxid uhlíka O=C=C=C=O sám o sebe a amorfné polyméry z neho vytvorené sú známe ako reaktívne, na vodu senzitívne zlúčeniny, mohli vynálezci prekvapivo získať jednotlivé vo vode stabilné cyklooligoméme Štruktúry suboxidu uhlíka. Základným predpokladom pre stabilitu týchto zlúčenín vo vode je to, že tieto štruktúry ďalej neobsahujú reaktívne kumulované C=C a C=O dvojité väzby suboxidu uhlíka. Toto je podľa predkladaného vynálezu vyriešené tak, že niektoré, výhodne 4, 6, 8 alebo 10 molekúl suboxidu uhlíka sú cyklomerizované na kondenzovaný 4-pyrónový alebo 2-pyrónový kruh a tieto štruktúry sú ďalej uzavreté v dvojreťazcových makrokruhoch.

V podstate, tieto skelety, ktoré sú vyrobené z cyklooligomérneho suboxidu uhlíka, nie sú organické zlúčeniny a môžu byť radené k anorganickej chémii, rovnako ako suboxid uhlíka samotný.

Chemický vzorec cyklooligomérnych skeletov suboxidu uhlíka uzavretých do makrokruhov je nasledujúci:

com-(C₃O2)_n kde n označuje stupeň cyklooligomerizácie C3O2 a com značí vyššie uvedený cyklooligomérny a makrokruhový typ väzby týchto jednotiek.

Ďalej, vynálezci zistili, že medzi nekonečným množstvom v zásade možných štruktúr cyklooligomérnych suboxidov uhlíka uzavretých v makrokruhoch je len málo s určitými hodnotami n stabilných. Sú preferované tie cyklooligoméme makrocyklické skelety, v ktorých je n rovné 4, 6 alebo 10 alebo násobkom 4, 6 alebo 10 vo vzorci com-(C3O₂)_n

Aktívne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu s väčšími preferovanými hodnotami n môžu tiež byť považované za násobky menších cyklooligomémych jednotiek suboxidu uhlíka so vzorcom com-(C3O2)_n Prvý člen takej série cyklooligomémych a makrokruhových uzavretých suboxidov uhlíka má najmä význam, ako je podrobne popísané pre :

Cyklohexamémy suboxid uhlíka com-(C3O2)ô

Moláma hmotnosť M = 408,19 určená experimentálne hmotnostnou spektrometriou odpovedá vzorcu C]gOi2 a pri rovnakom čase šesťnásobku molárnej hmotnosti suboxidu uhlíka

M = 68,032. Pre štruktúru je možných niekoľko izomérnych možností, napríklad s kondenzovanými 2-pyrónovými kruhmi alebo s hlava-hlava kondenzovanými 4-pyrónovými kruhmi, alebo s ďalej ukázanou štruktúrou so šiestimi alternujúcimi hlava-päta kondenzovanými 4-pyrónovými kruhmi, ktorá je považovaná za najpravdepodobnejšiu na základe spektrálnych a iných vlastností.

PYRON

PYRYLIUM

Aktuálna elektrónová distribúcia leží predpokladane medzi tu nakreslenými krajnými štruktúrami označenými ako PYRON a PYRILIUM, ale môže mať iné, viac alebo menej polarizované tautomérne elektrónové štruktúry, v závislosti na rozpúšťadle alebo médiu.

Hydroxy-pyránové a pyryliové soľné deriváty

Existenciu niektorých redukovaných derivátov cyklohexamémeho suboxidu uhlíka s všeobecným vzorcom (0302)6^.5 je tiež možné pozorovať v hmotnostnom spektre (obrázok 1). Vo vodnom roztoku môže byť aktívna zlúčenina podľa predkladaného vynálezu tiež prítomná ako hydroxy-pyránové deriváty. Všeobecný vzorec redukovaných hydroxy-pyránových derivátov vytvorených niekoľkonásobnou adíciou vodíka je:

com-(C3O₂)_n H_m kde počet m naviazaných atómov vodíka je obmedzený počtom n exocyklických atómov kyslíka a tak je m < n.

Plne redukovaný hydroxy-pyránový derivát má v prípade cyklohexaméru vzorec com-(C₃O₂H)₆ a molárnu hmotnosť M = 414,24 a má značný význam pre tvorbu anorganických a organických derivátov a je, spolu s com-(C30₂)g, základnou jednotkou v cyklohexamérovej sérii na tvorbu vlastných asociátov a iných derivátov. Predpokladaná 4-hydroxy-pyránová štruktúra cyklohexamémeho suboxidu uhlíka com-(C3O₂H)6 je zobrazená nasledujúcim spôsobom:

HYDROXY-PYRAN

Všeobecne, v prítomnosti silných iónových činidiel ako sú kyseliny alebo zásady, rovnako ako v prítomnosti niekoľko ľahko disociujúcich solí, sa predpokladá tvorba pyryliových solí zlúčenín s aniónmi An a katiónmi Ka. Chemický vzorec derivátov pyryliových soli, ktoré sú tvorené z aktívnych zlúčenín podľa predkladaného vynálezu s kyselinami, zásadami alebo sólami všeobecného vzorca Ka.Anje:

com-(C3O₂)_n.Ka_nAn_n kde Ka a An sú katiónové a aniónové ióny, ktoré neutralizujú úplne 2n obojaké náboje pyryliového skeletu. Štruktúra zlúčenín pyriliových solí môže byť zobrazená nasledujúcim spôsobom, kde opačné ióny nie sú presne lokalizované vo vodnom roztoku.

+ Ka o“

Anióny An a katióny Ka môžu byť prítomné - ako jednotlivé a uniformné anorganické a organické katióny a anióny, napríklad všetky Ka = Na⁺ a všetky An = Cľ - ako zmes anorganických alebo organických katiónov a aniónov, napríklad vo vzťahu odpovedajúcom fyziologickým koncentráciám týchto iónov alebo - ako obojaké zlúčeniny, ktoré sami o sebe obsahujú oba tieto opačné ióny, ako sú napríklad aminokyseliny, betaín, iónové mydlá.

Vo vode sú pyryliové soli odvodené od aktívnych zlúčenín podľa predkladaného vynálezu väčšinou veľmi rozpustné. O niečo nižšia rozpustnosť pyryliových soli s aniónmi ako je chlór alebo síran v acetóne alebo v etanole je použitá na izoláciu aktívnych zlúčenín tu popísaných podľa predkladaného vynálezu. Vo fyziologických tekutinách sú obojaké náboje aktívnych zlúčenín neutralizované aniónmi a katiónmi tu prítomnými. V súlade s tým je vhodnejšie hovoriť o štatistickej distribúcii opačných iónov než o chemicky jednotných soliach určitého iónu.

Určité komplexy tvorené iónmi kovov, výhodne iónmi prechodných kovov ako je Fe (III), Sb (lll), C'd (II), Pt (11), AU (111), Pb (IV) môžu byť použité na izoláciu a na detekciu aktívnych zlúčenín podľa predkladaného vynálezu. Zlúčeniny tvorené komplexami anorganických o alebo organických aniónov ako je SCN', BF4·. (Τ^Ογ-^-, MnOz/, pikrat, raineckat, môžu byť tiež použité na izoláciu a detekciu.

Adukty, Konjugáty

Tvorba molekulových aduktov s anorganickými prvkami alebo s organickými zlúčeninami je umožnená silnou kapacitou cyklooligomérnych a makrokruhových uzavretých suboxidov uhlíka podľa predkladaného vynálezu na asociáciu. Stechiometrické alebo nestechiometrické adukty s organickými zlúčeninami sú označené ako konjugáty. Cyklooligomérne a makrokruhové uzavreté suboxidv uhlíka môžu tvoriť stabilné mostíky s niekoľko - v prípade cyklohexamérov s výhodne 2 až 6 - molekulami amoniaka, organických aminov, aminokyselín, peptidov alebo iných zlúčenín s aminovou funkciou. Prirodzené aminokyseliny, biologické amíny a ich deriváty s aminovou funkciou sú jednotlivo zahrnuté v rozsahu tohto vynálezu. Všeobecný vzorec týchto aminových aduktov je:

com-(C3O2)_n (R¹ R^2R-^JN)m kde R’, R² _a r3 _sý každý atóm vodíka alebo organický zvyšok a m je číslo od 1 do n, kde n má rovnaký význam, ako bolo definované vyššie.

Experimentálne, molárna hmotnosť diaminového aduktu cyklohexamérov vzorca com(C3O?)6.(NH3)2 bola stanovená ES hmotnostnou spektrometriou ako M = 442,2 a hexamínového aduktu vzorca 00111-(6302)5.ako M = 510,4 (obrázok 2). U diaminových aduktov sú dve molekuly amoniaka alebo aminu pravdepodobne naviazané na karbonylové skupiny pyrónových kruhov vodíkovými mostíkmi. Pretože v prípade hexaminových komplexov je vnútorná dutina štruktúry makrokruhu už obsadená, sú tieto tiež považované za komplexy prijemca-darca

Komplexy darca-príjemca

Druhá predovšetkým dôležitá štrukturálna vlastnosť aktívnych zlúčenín podľa predkladaného vynálezu je splnená tým, že kondenzované pyrónové alebo hydroxypyránové kruhy ďalej tvoria makrokruhy podľa vynálezu, výhodne v cylindrickej forme. Molekulárne dimenzie tejto kruhovej štruktúry sú vhodné na novú tvorbu komplexov darca-prijemca podľa vynálezu. Ako darca sú uvažované elementy s menšími molekulami alebo fragmentmi molekúl, ktoré stéricky pasujú do cylindrickej dutiny a/alebo sú naviazané na ich periférii špecifickými väzobnými silami. Tvorba a rozmery cylindrickej makrokruhovej štruktúry cyklohexamérneho suboxidu uhlíka sú uvedené na nasledujúcom obrázku.

: 2.9-3,1 a ;

4.9-5.2A

5.9

6.2 A

Katióny ako je draslík, amoniak, striebro alebo rubídium, alebo anióny ako je fluór, chlór, fbrmiat alebo rodanid dobre pasuju do vnútornej cylindrickej dutiny makrokruhu cyklohexamérov s vnútorným priemerom 2,9 až 3,2 A a výškou 4,6 až 5,2 A. V aplikáciách podľa vynálezu je ión alebo neutrálny prvok alebo molekula prítomná v dutine cylindrickej makrokruhovej štruktúr)' com-fC-jO-?)^ jednotky a je ňou obalený. Molárna hmotnosť meraná hmotnostnou spektrometriou odpovedá súčtu jednotlivých zložiek a overuje, že tieto komplexy darca-prijemca sú nezávislé zlúčeniny. Vynálezca pokusne stanovil existenciu komplexov darca-prijemca cyklohexamérneho suboxidu uhlíka s menšími anorganickými alebo organickými zlúčeninami, všeobecne označenými Y, ako je amoniak, hydroxylamin, metanol, etanol, propanol, acetón, dichlórmetán, chloroform, acetylcholin, kyselina mravčia, kyselina octová, rovnako ako s niekoľkými aminokyselinami a uhľohydrátmi. Podľa vynálezu je substancia Y alebo časť jej štruktúry prítomná ako darca vo vnútornej dutine aktívnej látky podľa predkladaného vynálezu a mala by byť zrejmá z nasledujúceho obrázka.

Vďaka tomuto obalu sú určité vlastnosti substancie Y maskované a novo sú získané vlastnosti podľa predkladaného vynálezu, ako je zlepšený membránový transport alebo biodostupnosť.

Aktívne substancie rôznej molárnej hmotnosti

M < 2000 Daltonov

Vyššie popísané cyklooligomérne suboxidy uhlíka podľa vzorca com-(C3O2)_n> kde n je 4, 6, 10, 12 alebo 18, ako také alebo vo forme hydroxy-pyránu vzorca com-(C3O2H)_n, a všetky ich deriváty, adukty, komplexy darca-prijemca, ktorých molárna hmotnosť je pod týmto limitom, patria do tejto kategórie s nízkou molárnou hmotnosťou. Vlastné asociaty tvorené z 2 až 4 cyklohexamérnych jednotiek sú tiež považované za substancie s nízkou molárnou hmotnostou. Existencia ¢0111-(6302)12 ^s molárnou hmotnosťou M = 816 D a ¢0111-(6309) | g s molárnou hmotnosťou M = 1224 D identifikovaných vynálezcom môže byť týmto tiež vysvetlená.

M > 2000

Za prvé, aktívne substancie tu klasifikované sa zdajú byť zmesou zlúčenín s heterogénnou molárnou hmotnosťou. Napriek tomu, bližšia analýza ukázala, že aj napriek v podstate nekonečného množstva možných zlúčenín je len malé množstvo, t.j. tie, ktoré majú určitú hmotnosť molekuly, možné získať a identifikovať.

LC-MS, elektrospray hmotnostné spektrum (obrázok 3) aktívnej substancie v roztoku voda-acetonitril ukazuje, že je prítomná séria viacnásobne nabitých iónov (m/z). Meranie m/z = 1,225.7 Dal najintenzívnejšej zložky A3 I presne odpovedá protónovanej molekule vzorca com(63()2)18 Experimentálna molárna hmotnosť odpovedajúceho polyméru je určená pomocou vzorca M - n (m/z - I) (strana 202, Practical Mass Spektrometry od J. R. 6hapmann, J. Wiley, New York, 1993) ako M = 3 I x 1,226.6 = 37,962.6 Dal

Molárne hmotnosti niektorých identifikovaných zlúčenín sú uvedené v nasledujúcej ta buľke

Zistená molárna hmotnosť	Vypočítaná molárna hmotnosť (D)
HP-GP, PAGE* MS**	n	com-(C3O2)n	com-(C3O2H)n
	408,2	6	408,2
	414,2	6		414,2
	680,6	10	680,3
	816,4	12	816,4
	1224,6	18	1224,6
«=2500		36	2449,2
«=4100	4084,2	60	4082,0
<=4100	4134,0	60		4142,5
«=5000	4900,8	72	4898,4
-=5000	4976,6	72		4970,9
<=10000	10065,2	144		9941,9
<=12500	12656,8	186	12654,2
«15000		216	14912,0
«30000		432		29825,7
«38000	37963,3	558	37962,6
«60000		864		59651,4
«120000		1728		119302,7

* v porovnaní so známymi štandardami ** priemerné hodnoty z troch pokusných meraní v MAL Dl

Merania boli uskutočnené pomocou MALD1 hmotnostnej spektrometrie (MS), gélovej vylučovacej chromatografie (GP) alebo polyakrylamidovej gélovej elektroforézy (PAGE). Ako je zrejme z MALD1 hmotnostného spektra (obrázok 4), odpovedajúce zlúčeniny pre n - 60 a predovšetkým pre n = 72, sú prítomné v jasne vyšších koncentráciách než všetky ostatné. Molárne hmotnosti určené touto metódou odpovedajú s veľmi dobrou presnosťou n = 60 a n = 72 vo vzorci com-(0,02H)_n hydroxy-pyránových oligomérov. Tieto zlúčeniny môžu byť považované buď za cyklooligoméry s n = 60 alebo n = 72 alebo za s = 10- alebo s = 12-násobné vlastné asociaty cyklohexamerickej základnej jednotky (com-(C3O2H)6)_s. Fyzikálno - chemické a spektroskopické vlastnosti týchto zlúčenín com-(C3O2H)gQ a com-íC^CHH^ naznačujú vysokú štrukturálnu symetriu, ktorá môže byť vysvetlená napríklad sférickým usporiadaním 10, 12 alebo viac com-(C3O2H)6 jednotiek. Sandwichové usporiadanie s pentagonálnou alebo s hexagonálnou symetriou môže tiež vysvetľovať neutralizáciu veľkého množstva obojakých nábojov.

Pokusy využívajúce polyakrylamidovú gélovú elektroforézu (PAGE) ukázali silný prúžok v regióne M '< 5 kDa a voliteľne ďalšie línie v hodnotách molárnej hmotnosti asi 10 kDa, 12,5 kDa, 15 kDa, 30 kDa, 60 kDa a 120 kDa. Tieto odpovedajú s prijateľnou presnosťou stupňom oligomerizácie n = 72, 144, 180, 216, 432, 864 a 1728. Dosť zvláštne je, že tieto čísla odpovedajú jednotlivým násobkom čísel 6 a 12. Pri použití 16,5% koncentrácie polyakrylamidu je najsilnejší prúžok prítomný v rozmedzí M * 5 kDa. Napriek tomu, pokiaľ je rovnaká vzorka aplikovaná na iný gél, napríklad s nižším obsahom polyakrylamidu, potom sa hlavný prúžok objaví vo dvakrát väčšom regióne (- 10 kDa). Táto anomália je vysvetlená špecifickou rovnováhou asociácie - disociácie aktívnej látky.

Asociačná rovnováha a membránový transport

Vvnálezci tiež určili jednotlixé anomálie v dialýze a ultrafiltrácii zlúčenín s vyššou molekulovou hmotnosťou. Po určitej dialyzačnej dobe boli väčšie, normálne membránou neprechádzajúce aktívne zlúčeniny detekovane na oboch stranách membrány. Vysvetlenie pre toto je také, že vyššie asociaty podľa rovnice I disociujú na menšie formy prechádzajúce membránou a tieto znovu vytvárajú väčšie vlastné asociaty v dialyzáte. Po dlhšej dobe dialýzy vznikne na oboch stranách membrány rovnováha.

(com-(C3O2)_n)s (com-(C3O2)n)_s-p ⁺ (com-fCjChjnJp (I) kde s = 2. 3, 4, 5, 6, 10 alebo 12, rovnako ako násobky týchto čísel a p < s Rovnováha medzi jednoduchým cyklooligomérom a jeho mnohonásobne asociovanými derivátmi s vyššou molárnou hmotnosťou je závislá na mnohých faktoroch alebo môže byť ovplyvnená napríklad charakterom rozpúšťadla, hodnotou pH, koncentráciou alkalických kovov a iných iónov, teplotou a konjugáciou s inými zlúčeninami prítomnými v roztoku Rovnováha (I) umožňuje penetráciu aktívnych látok podľa predkladaného vynálezu s vyššou molárnou hmotnosťou, ktorým je normálne tento prístup blokovaný, do intracelulárneho priestoru. V priestore zvonka od membrány môžu byť aktívne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu prítomné ako väčšie com(C3O-?)_n zlúčeniny. Vďaka disociácii podľa rovnice (I) môžu tieto aktívne zlúčeniny prechádzať cez membránu a tak dosiahnuť priestor za membránou, kde môžu znovu tvoriť väčšie zlúčeniny asociáciou.

(com-(CO)) 3 2 n s	1 M I	(com-(CO ) ) 3 2 n
Ť	1 e | 1 M 1	Ť
1	1 B 1	1
	1 R 1

com-(C O ) -------Á---.....> com-(C O )

2 n 3 2 n

I N I

I A I priestor zvonka od membrány priestor za membránou

Vďaka svojej stabilite môžu väčšie vlastné asociaty tiež slúžiť ako fyziologické zásobníky a transportéry aktívnej látky a tak môžu slúžiť na dosiahnutie miesta patologickej manifestácie. Tu vykazujú svoj bioregulačný, terapeutický účinok buď ako také, alebo v konjugácii s inými aktívnymi látkami Maskovaný membránový transport látky Y cez nepriepustnú membránu môže byť uskutočnený podľa predkladaného vynálezu tak, že táto látka je ukrytá v cylindrickej vnútornej dutine aktívnej látky.

Spektroskopická charakterizácia

Všeobecne, molekulárne spektrá aktívnych látok podľa predkladaného vynálezu sú relatívne chudobné na prúžky, čo sa zhoduje s vysokou symetriou odpovedajúcich štruktúr Infračervené spektrum uskutočnené v Kb peletách (obrázok 5) ukazuje niekoľko charakteristických absorpčnych prúžkov pri 3500 - 3000 cm’', 1680 - 1620 cm1400 - 1385 cm^-', 1210 cm', I 100 cm' a medzi 830 - 600 cm^-', pomocou čoho je silný prúžok pri 1660 cm^-' interpretovaný ako pulzačná frekvencia 4-pyrónového kruhu. Absencia ÍR. absorpčného prúžka pri 1720 cm^-1 činí 2-pyrónovú štruktúru nepravdepodobnou.

Najsilnejšie absorpčné maximum UV-V1S spektra leží pri asi 190 nm s ramenami pri asi 220 nm a 265 nm (obrázok 6). Ako je zjavné, miesto očakávanej silnej absorpcie konjugovaných dvojitých väzieb pri asi 320 nm je prítomná len slabá absorpcia s nešpecifickým sklonom pri 240 až 400 nm. Napriek tomu, vynálezci zistili pre niektoré adukty fluorescenčnú emisiu v rozsahu

400 - 450 nm produkovanú excitačným žiarením pri 310 - 340 nm. Toto môže naznačovať, že je prítomný silnejší, ale symetrický zakázaný prechod.

Analytické reakcie

Aktívne zlúčeniny podľa vzorca com-íCjChjn môžu byť identifikované pozitívnou reakciou s chloridom antimoničným alebo s Liebermann-Burchardovým činidlom pomocou chromatografie na tenkej vrstve. Na separáciu boli použité Silikagél-60 platne na okamžité použitie (Merck) a elučná zmes l-propanol:etylacetát. 20% kyselina octová v pomere 60:10:30. Ako postrekové činidlo bol použitý nasýtený roztok chloridu antimoničného v chloride uhličitom alebo zmes 2 ml anhydridu kyseliny octovej a 2 ml koncentrovanej kyseliny sírovej v 20 ml absolútneho etanolu. Po postreku boli platne zahrievané počas asi 10 minút pri 120 °C a boli prehliadnuté pri UV svetle pri lambda = 365 nm. Fluoreskujúce body ukazujú na prítomnosť aktívnych látok podľa predkladaného vynálezu.

Aktívne látky vo forme ich aminových aduktov vykazujú pozitívnu ninhydrínovú reakciu. ktorá môže byť použitá na ich analytickú detekciu alebo na spektroskopický test. Pretože túto reakciu tiež vykazuje väčšina aminokyselín a peptidov, je analytické použitie vhodné len po chromatografickej separácii. Na separáciu chromatografii na tenkej vrstve sú použité silikagél 60 platne na okamžité použitie a elučná zmes l-butanol: etanol: voda v pomere 50:30:20 (objem/objem). Ako postrekové činidlo je použitý 0,1% roztok ninhydrinu v etanole, ktorý ďalej obsahuje 2% (objem/objem) ľadovú kyselinu octovú a 0,5% (objem/objem) sym-kolidin. Žlté body v Rf regióne 0,32 až 0,45 ukazujú na prítomnosť niektorej z aktívnych látok podľa predkladaného vynálezu

Hydroxy-pyránová skupina aktívnych látok podľa predkladaného vynálezu vykazuje mierne pozitívnu fenolovú reakciu s Folin-Ciocalteuovým činidlom a táto môže byť použitá na identifikáciu. Pretože známa Lowryho metóda na určenie proteinu je tiež založená na tejto reakcii, musí byť najskôr uskutočnená chromatografická separácia proteinov alebo fenolických látok.

Na analytickú separáciu podľa veľkosti molekúl látok podľa predkladaného vynálezu je použitá HP-GP (gélová vylučovacia chromatografia s vysokou rozlišovacou schopnosťou). Separácia je uskutočnená výhodne na TSK G-2000 SW (Toso-Haas) kolóne 600 x 7,5 mm s 50 mM roztoku boritanového pufru (pH = 8,1) ako eluens. Molárne hmotnosti zložiek aktívnych látok v zmesi sa stanovia pomocou meraní retenčných objemov (obrázok 7) pomocou kalibračΙΚ ného diagramu (obrázok 7 A). Polyetylenglykolové štandardy so známou molekulovou hmotnosťou sa použijú na kalibračnú krivku.

Na chromatografickú separáciu podľa polarity zložiek je použitá HPLC metóda s reverznou fázou, výhodne na Nucleosil 5 C ] g kolóne (Mecherey Nagel) ako pevnou fázou a s, výhodne, 10 až 90% acetonitrilovým gradientom vo vode ako eluens.

Pre pyryliové soli podľa predkladaného vynálezu je charakteristické, že vykazujú známe analytické reakcie opačných iónov, napríklad zrážanie halogenidov s iónmi striebra, alebo síranových iónov s báriom.

Aktívne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu vykazujú vysoko senzitívne skrížené reakcie s protilátkami proti kardiotonickým steroidným glykozidom ako je ouabain, digoxín a iné. Pretože tieto organické molekuly nie su imunogénne sami o sebe, su najskôr chemicky naviazané na väčšie proteínové molekuly ako je BSA alebo avidin. Pri opakovanom podaní týchto konjugátov králikom sú získané špecifické anti-ouabainové a anti-digoxinové protilátky. Skrížená reakcia týchto protilátok s aktívnymi zlúčeninami podľa predkladaného vynálezu je vyšetrovaná metódami enzýmovo viazaného imunotestu EL1SA alebo radioimunotestu (RIA). Tieto techniky umožňujú vysoko senzitívne testovanie veľmi malých množstiev aktívnych látok (v ráde pg). Testy v ľudských telesných tekutinách môžu byť narušené prítomnosťou srdcových glykozidov, ktoré sú prítomné len pri špecifickej medikamentóznej liečbe ochorení srdca

Aktívne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu s väčšou molárnou hmotnosťou, M > 2,0 kDa, vykazujú zaznamenaniahodné špecifické reakcie s imunoglobulinmi. Tieto imunošpecifické precipitačné reakcie s ľudskými alebo so zvieracími imunoglobulinmi sú vyšetrované spektrofotometricky alebo Ouchterlouny metódou v agarózovom géli alebo imunoelektroforézou podľa Laurella. Významný rozdiel medzi reakciami s imunoglobulinmi z normálneho alebo z patologického séra umožňuje použitie týchto reakcii pri diagnostike rôznych imunopatológií.

O-alkylové a O-acylové deriváty

Vďaka väzbe zvyškov anorganických alebo organických molekúl, označených R, na atómy kyslíka základného rámčeka sú tvorené anorganické a/alebo organické deriváty alebo konjugáty všeobecného vzorca:

com-(C3O2)_nRm kde R = anorganická alebo organická molekula a/alebo organický zvyšok, výhodne metyl, etyl, acetyl, benzyl a M < 2n

Produkcia

Podľa predkladaného vynálezu môže byť suboxid uhlíka, ktorý ako taký môže byť produkovaný známymi metódami, použitý ako východiskový materiál na syntetickú produkciu makrocyklických zlúčenín podľa predkladaného vynálezu

Podľa predkladaného vynálezu je C3O2 prečistený frakčnou destiláciou fotochemický alebo za použitia vhodných pomocných činidiel konvertovaný na cykloligomerické deriváty. Syntéza suboxidu uhlíka je uskutočnená známym spôsobom dvojitou elimináciou vo vode z menších dikarboxylových kyselín ako je kyselina malónová alebo jej deriváty pod vplyvom oxidu fosforečného a/alebo tepla. Napriek tomu, v tejto metóde sa vyvíja tvorba nežiaduceho amorfného polymerického suboxidu uhlíka. Oproti tomu, vynálezci zistili, že termálna dehydratácia kyseliny alebo jej esterov uskutočnená v aprotickom rozpúšťadle je omnoho vhodnejšia na tvorbu aktívnych zlúčenín podľa predkladaného vynálezu. Podľa vynálezu je kyselina alebo odpovedajúci derivát rozpustená v aprotickom rozpúšťadle, výhodne v dimetylformamide alebo v anhydride kyseliny octovej, zahriatím a miešaním Zmes je zahriata na 120 - 150 °C, keď sa tvorba C3O2 objavuje už po niekoľkých minútach. Na konverziu suboxidu uhlíka produkovaného týmto spôsobom na cyklooligomérne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu je použitá fotochemická aktivácia a/alebo sú pridané vhodné pomocné činidlá podľa predkladaného vynálezu. Tie zlúčeniny, ktoré pôsobia ako typ templátu na tvorbu makrokruhovej štruktúry, sú považované za účinné pomocné činidlá. Preferované sú stabilné zlúčeniny soli tých iónov, ktorých priemer odpovedá vnútornej dutine ¢0111-(6302)0 makrokruhu s vnútorným priemerom 2,9 - 3,1 A. Preferovanými iónmi sú rubidium (2,94 A), draslík (2,66 A), amoniak (2,86 A) a fluór (2,72 A).

Vynálezci zistili, že niektoré enzýmy, výhodne tie, ktoré patria do triedy polyketid syntas (PHS), môžu byť použité na syntézu objavených cyklooligomerizovaných a makrokruhovych uzavretých derivátov suboxidu uhlíka. Bolo použitých niekoľko derivátov karboxylových kyselín, výhodne kyseliny malónovej, výhodne ako malonyl-koenzým A. Tento malonyl-koenzým A môže byť ľahko pripravený z acetyl-koenzýmu A a CO2 za prítomnosti biotinu.

Podľa predkladaného vynálezu môžu byť objavené bioregulačne aktívne zlúčeniny tiež izolované z vedľajších produktov niektorých priemyselných produktov vychádzajúcich z oxidu uhoľnatého. Vynálezca prekvapivo zistil, že niektoré známe organické syntetické produkty, ktorých priemyselná výroba vychádza z oxidu uhoľnatého alebo zo syntézy plynov môžu obsahovať nízke, ale detekovateľné množstvá aktívnych látok podľa predkladaného vynálezu. Toto môže byť vysvetlené nízkym obsahom suboxidu uhlíka v CO a syntetických plynoch. Na zvýšenie extrémne nízkeho obsahu aktívnych látok podľa predkladaného vynálezu v týchto priemyselných produktoch sú použité metódy frakčnej destilácie. 2 až 60 dielov (diel znamená diel podľa hmotnosti, pokiaľ nie je uvedené inak), výhodne 20 dielov, vody alebo vodného roztoku pufru sa pridá k 100 dielom východiskového materiálu, výhodne k priemyselnému metanolu vyrobeného zo syntézneho plynu a metanol je najskôr oddestilovaný z tejto zmesi aplikácií na destilačnú kolónu. Zostávajúca vodná fáza vykazuje zvýšený obsah aktívnych látok podľa predkladaného vynálezu. Mnohonásobným opakovaním destilácie s pridaním čerstvej metanolovej fázy je získaná významná koncentrácia aktívnych látok podľa predkladaného vynálezu. Aktívne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sú izolované z tohto roztoku za použitia frakčnej destilácie alebo absorpcie na pevných fázach, výhodne živočíšneho uhlia alebo oxidu kremičitého s reverznou fázou. a desorpciou za pomoci zmesi rozpúšťadiel, výhodne voda-etanol.

Podľa predkladaného vynálezu sú tiež vynájdené aktívne zlúčeniny izolované z rastlinných extraktov, kultúr rastlinných buniek alebo z bakteriálnych kultúr. Bolo vyšetrovaných mnoho rastlinných druhov, v ktorých nie sú aktívne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu prítomné ako také, ale miesto toho ako nedefinované konjugáty iných, výhodne toxických, rastlinných zložiek. Preferovanými surovými materiálovými zdrojmi sú tie rastlinné druhy, ktoré obsahujú toxické zložky ako sú alkaloidy alebo kardiotoxické glykozidy. Ďalej, rastlinné druhy s relatívne vysokým obsahom saponinov alebo tanínov tiež ponúkajú vhodný východiskový materiál na izoláciu aktívnych látok podľa predkladaného vynálezu Korene, pakorene, stonky, listy, kôra alebo semená alebo odpovedajúce kultúry rastlinných buniek, ktoré sú iniciované tvorbou kalu známym spôsobom, sú vhodné ako rastlinné zdroje.

Pokiaľ je žiaduca produkcia menších derivátov molekúl suboxidu uhlíka, výhodne com^CHjn, potom je použitá nasledujúca metóda podľa predkladaného vynálezu. 10 dielov extrakčného činidla, výhodne 30 % zmesi alkohol-voda, sa pridá k 1 dielu sušeného rastlinného materiálu zbaveného tuku hexánom a macerovaného počas 24 hodín pri miernom zahriati. Proces sa niekoľkokrát opakuje, výhodne 2 - 3 krát, a kombinované alkoholické extrakty sa koncentrujú. Koncentrovaná tinktúra sa uvedie do varu po podaní kyseliny, výhodne kyseliny octovej alebo kyseliny chlorovodíkovej v množstve od 0,01 do 5 %, výhodne I %, vzhľadom k tinktúre, a nechá sa počas krátkej doby, výhodne 10-30 minút, pri 80 - 100 °C. Ochladený roztok sa neutralizuje zásadou, výhodne ΝΉ4ΟΗ a ošetrí sa 1 až 20 dielmi, výhodne 5 r 10 dielmi, živočíšneho uhlia na 100 dielov kvapaliny. Filtrované živočíšne uhlie sa znovu premyje vodou a filtruje. Živočíšne uhlie sušené vo vákuu sa ošetri vrúcim extrakčným činidlom, výhodne 1:1 etanofvoda, a proces sa opakuje 2x. Roztok aktívnych zlúčenín podľa predkladaného vynálezu získaný týmto spôsobom je stabilný a je vhodný na dlhodobé skladovanie Kombinované roztoky môžu byť tiež koncentrované a sušené sublimáciou zo zmrazeného stavu. Prečistenie pevného zvyšku prebehne opakovanou rekryštalizáciou, výhodne zo zmesí alkohol - éter. Adukty získané týmto spôsobom sú stabilné a vhodné na dlhodobé skladovanie.

Pokiaľ je žiaduca produkcia vysokomolekulárnych cyklooligomérnych zlúčenín suboxidu uhlíka, potom je použitá nasledujúca metóda podľa predkladaného vynálezu: 5 - 20, výhodne 8, dielov metanolu sa pridá k I dielu (podľa hmotnosti) sušeného rastlinného materiálu zbaveného tuku za pomoci petroléteru a macerovaného počas I až 36, výhodne 16, hodín pri miernom zahriati. Proces sa opakuje niekoľkokrát, výhodne dvakrát, a kombinované extrakty sa koncentrujú. Koncentrovaný roztok sa vpraví do s vodou miesiteľného, organického rozpúšťadla, výhodne acetónu alebo etanolu, v pomere 1:20 alebo 1:2, výhodne 1:8, Vytvorená zrazenina sa separuje filtráciou alebo centrifugáciou a rozpusti sa v minimálnom množstve vody alebo pufrovacieho roztoku. Celý proces sa opakuje I - 5, výhodne 2-krát. Surový produkt získaný týmto spôsobom sa rozpustí v minimálnom množstve vody alkalizovanej pufrom s pH 9 - 10,5 a podrobí sa dialýze proti destilovanej vode alkalizovanej pufrom s pH 9 - 10,5 za použitia membrán, výhodne s limitom vylučovania 3 kDa. Po dlhej dobe dialýzy, výhodne po 3 - 4 dňoch, s niekoľkonásobnou výmenou objemu externej vody, sa vnútorný membránový roztok filtruje, starostlivo koncentruje a suší sa sublimáciou zo zmrazeného stavu.

Podľa predkladaného vynálezu sú neutrálne adsorbenty alebo iónové pevné fázy, ako sú živice, gély alebo modifikované polysacharidy s iónovou výmenou funkcií použité na izoláciu vynájdených aktívnych látok rôznej molárnej hmotnosti. Vďaka obojakému charakteru aktívnych látok podľa predkladaného vynálezu môžu byť použité aniónové- rovnako ako katiónové - alebo zmesné fázy. Najskôr sú extrakty rastlinného alebo iného pôvodu ošetrené iónovou výmennou fázou Po naviazaní zložiek na pevnú fázu je kolóna dôkladne premytá nadbytkom neutrálneho alebo slabo kyslého eluens, výhodne vodou alebo roztokom pufru, dokiad nie je žiadny obvyklý obsah (uhľohydráty, aminokyseliny) detekovateľný v eluate. Desorpcia z katiónových fáz prebieha za použitia riedených minerálnych kyselín, výhodne kyseliny chlorovodíkovej alebo organických kyselín, výhodne kyseliny mravčej alebo octovej. Uvoľnenie aktívnych látok podľa predkladaného vynálezu naviazaných na aniónovej fáze alebo zmesnej fáze prebieha pri použití riedených alkálii, výhodne 0.1 - 0,3 molárnych roztokov amoniaka alebo hydroxidu draselného. Desorpcia z oxidu kremičitého s reverznou fázou prebieha pri použití rozpúšťadiel, výhodne metanolu alebo acetonitrilu.

Podľa predkladaného vynálezu môže byť desorpcia z neutrálnych fáz, ako je silikagél, polyamidy alebo rôzne polysacharidy, uskutočnená za použitia 0,2 - 5 %, výhodne 1,2 % roztoku dodecylsulfátu sodného (SDS) alebo z I až 12 molárnych, výhodne 8 molárnych roztokov močoviny

Podľa predkladaného vynálezu môže byť separácia a prečistenie aktívnych zlúčenín rôznych molárnych hmotností podľa predkladaného vynálezu uskutočnené pomocou gélovej filtrácie alebo dialýzy na membráne a ultrafiltrácie. Na separáciu aktívnych zlúčenín podľa predkladaného vynálezu podľa veľkosti ich molekúl je použitá gélová chromatografia za pomoci syntetických pevných fáz, výhodne za použitia Sephacryl 200, Sephadex ĽH-20 alebo TSK HTW-60. Ako eluens sú použité slabo zásadité pufrovacie roztoky, výhodne octan amónny alebo kyslý uhličitan amónny alebo 0,01 až 0,3 molárny, výhodne 0,15 molárny roztok NaCI alebo KCI. Pri týchto metódach separácie eluuje zlúčenina s vyššou molekulovou hmotnosťou ako prvá a menšie zlúčeniny ako com-fC^O?^ alebo ¢0111-(6302)10 eluujú z kolóny neskôr.

Podľa predkladaného vynálezu môže byť tiež priamo izolovaných niekoľko konjugátov, ktoré sú tvorené z aktívnych zlúčenín podľa predkladaného vynálezu s rastlinnými zložkami. Tieto väčšinou lepkavé, žlto-hnedo sfarbené konjugáty môžu byť vyzrážané z koncentrovaných metanolových rastlinných extraktov aplikáciou organických rozpúšťadiel, výhodne acetónu dietyléteru. Pri niekoľko, výhodne 3 až 5, opakovaných zrážaniach sú konjugáty získané týmto spôsobom relatívne uniformné. Podľa predkladaného vynálezu môže byť nasledujúca vysolovacia metóda použitá na štiepenie konjugátov. Konjugát je rozpustený vo vode, v ktorej je ďalej rozpustená anorganická soľ, výhodne siran amónny, v množstve 5 až 50 % (hmotnosť/hmotnosť), výhodne 15 %, vzhľadom ku konečnému roztoku. Do tohto roztoku sa pridá organické rozpúš ťadlo, výhodne n-butanol alebo 2-propanol a roztok sa intenzívne mieša. Fázy sa separujú a proces sa opakuje 2 až 5-krát, výhodne 3, pričom je hodnota pH vodnej fázy upravená kyselinou na I. Po ďalšom procese štiepenia podľa predkladaného vynálezu je hodnota pH upravená na pH 10 amoniakom a roztok sa vmieša do chlórovaného rozpúšťadla, výhodne dichlórmetánu alebo chloroformu, v pomere 1:0,5 až 1:6, výhodne 1:2. Veľmi stabilná, penivá emulzia tvorená silným trepaním sa separuje a organické rozpúšťadlo sa z nej odstráni za redukovaného tlaku.

Aktívne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť tiež izolované z bakteriálnych východiskových materiálov. Na túto izoláciu môžu byť použité podľa predkladaného vynálezu bakteriálne kultúry rôznych typov, výhodne BCG (Bacillus Cualmette-Guérin), Corynebacterium parvum álebo Escherichia coli. Najskôr sa uskutočni fyzikálne ošetrenie, výhodne ošetrenie ultrazvukom, a hydrolýza aplikáciou riedených minerálnych kyselín, výhodne kyseliny chlorovodíkovej. Filtrovaný hydrolyzát sa voliteľne neutralizuje a aplikuje sa na pevnú fázu, výhodne na normálny silikagél alebo na silikagél s reverznou fázou. Pevná fáza sa ošetri rôznymi neutrálnymi elučnými činidlami tak, že v eiuate nie sú detekovateľné aminokyseliny, uhľohydráty alebo iné jednoduché produkty hydrolýzy. Desorpcia aktívnych látok podľa predkladaného vynálezu sa uskutočni pomocou riedených alkálii, výhodne 0,1 až 0,2 molárneho hydroxidu amónneho alebo metanolu alebo vodného etanolu alebo acetonitrilu pre reverznú fázu.

Tkanivá a telesné tekutiny zvierat môžu obsahovať malé množstvá aktívnych zlúčenín podľa predkladaného vynálezu v podobe nedefinovaných konjugátov. Podľa predkladaného vynálezu sa najskôr uskutočni organická extrakcia tkanív alebo starostlivo sublimáciou zo zmrazeného stavu sušených organických tekutín, výhodne moču. Aktívne látky podľa predkladaného vynálezu sú izolované a prečistené z koncentrovaných organických extraktov pri použití metód selektívnej afinitnej chromatografie. Na tento účel je známy srdcový glykozid, výhodne ouabain alebo hellebrin, kovalentne viazaný na pevnú fázu, výhodne Sepharosu Táto afinitná fáza zadržuje aktívne látky podľa predkladaného vynálezu z koncentrovaného roztoku surového materiálu. Po mnohonásobnom premyli kolony slabo kyslým alebo neutrálnym pufrovacim roztokom sú zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu uvoľnené pomocou alkalických pufrovacich roztokov

Bioregulačná aplikácia

Vynálezca zistil, že aktívne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu účinne kontrolujú aktivitu enzýmu Na⁺,K⁺-ATPasa, ktorý je známy ako sodíková pumpa. Tento široko rozšírený enzým reguluje extra- a intracelulárnu koncentráciu väčšiny dôležitých iónov alkalických kovov takzvaným aktívnym membránovým transportom. Energia potrebná na tento proces je dodaná hydrolýzou ATP, ktorá je priamo spojená s aktivitou tohto enzýmu Aktívne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sú schopné kontrolovať komplexnú aktivitu tohto enzýmu. Smer a intenzita tejto kontroly sú závislé na koncentrácii a molárnej hmotnosti aktívnych zlúčenín podľa predkladaného vynálezu. Charakter a koncentrácia prítomných iónov alkalických kovov a iných anorganických iónov môže významne ovplyvňovať tento kontrolný účinok. Pri pridaní aktívnych zlúčenín podľa predkladaného vynálezu k suspenzii erytrocytov bolo pozorované zvýšenie extracelulárnych koncentrácii Na, t.j. bola pozorovaná aktivácia sodíkovej pumpy. Naopak, inhibicia enzýmu Na⁺, K⁺-ATPasa bola stanovená in vitro a pri určitých koncentráciách aktívnych zlúčenín podľa predkladaného vynálezu s menšou molekulovou hmotnosťou.

Redukcia toxických vedľajších účinkov ouabainu alebo iných srdcových glykozidov môže byť tiež pozorovaná, pokiaľ sú aktívne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu aplikované spolu so srdcovými glykozidmi. Pri pridaní aktívnych zlúčenín podľa predkladaného vynálezu v molárnom pomere medzi 0,02 až 2/1 mólu glykozidu, výhodne 1:1 je hodnota LD5Q helleb.rinu významne vyššia, čo ukazuje na zníženie akútnej toxicity. Okrem toho, ako bolo pokusne určené. aktívne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sú schopné kontrolovať aktivitu niekoľko iných základných enzýmov, napríklad kolagenas, hyaluronidas, fosfokinas a iných enzýmov. Podľa všetkých týchto dôkazov sú aktívne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu použiteľné ako endogénne ligandy enzýmu Na⁺, K⁺ ATPasy.

Imunoregulácia

Vynálezca zistil niekoľko imunoregulačných účinkov zlúčenín podľa predkladaného vynálezu. Tieto mechanizmy môžu byť tiež čiastočne vysvetlené vyššie popísanou kontrolou Na⁺, K⁺ ATPasy, pretože tento enzým sa významne zúčastňuje veľkého počtu imunologických procesov.

Okrem toho, nový imunoregulačný účinok aktívnych zlúčenín podľa predkladaného vynálezu je dosiahnutý v tom, že tieto zlúčeniny majú špecifickú afinitu pre Fc receptory. Tieto receptory sú zakotvené na rôznych imunocytoch a ich obsadenie alebo neobsadenie hrá zásadnú úlohu pre kontrolu aktivity týchto buniek. V klinických testoch viedli aktívne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu k významnému potlačeniu patologicky aktivovaných killer buniek (K buniek) a iných lymfocytov v bunkovej cytotoxicite závislej na protilátkach (ADCC). Oproti tomu, aktivita prirodzených zabíjačov (NK. buniek) v spontánnej bunkovej cytotoxicite (SCMC) bola odlišne ovplyvnená aktívnymi zlúčeninami podľa predkladaného vynálezu: u reumatických pacientov bola patologicky nadmerne stimulovaná spontánna cytotoxicita jasne potlačená. U zdravých testovaných osôb bola spontánna cytotoxicita ovplyvnená len nesignifikantne. Preto, klinické dáta dokazujú že, prostredníctvom potlačenia autoagresivnych patologických procesov, sú aktívne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu vhodné na kauzálnu terapiu reumatizmu alebo na prevenciu odmietnutia tkanivového alebo orgánového štepu. Je dôležité si všimnúť, že všetky tieto účinky boli získané použitím neobyčajne malých množstiev aktívnych zlúčenín v rádoch pg/kg. Na druhej strane, toxicita zlúčenín podľa predkladaného vynálezu je mimoriadne nízka Preto sú splnené najdôležitejšie farmakotoxikologické podmienky na terapeutické aplikácie u ľudí podľa predkladaného vynálezu. Použitie aktívnych zlúčenín podľa predkladaného vynálezu na terapiu reumatizmu má ďalšiu jasnú výhodu. Malý cvklooligomér com-(C3O2)_n výhodne s n = 6 a jeho adukty vykazujú neobyčajne silné analgetické a spasmolytické účinky. Analgetický a spasmolytický účinok objavujúci sa ihneď po lokálnom podaní ponúka dôležitú výhodu na aplikáciu terapie u reumatizmu. Rýchle nastupujúca úľava od bolesti a spasmolýza sú udržované dlhodobo opätovným nastolením normálnej imunoregulácie Aktívne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu s väčšou molekulovou hmotnosťou sú schopné vykazovať významný nešpecifický účinok, ktorý napodobňuje imunostimuláciu. Toto bolo jednoznačne potvrdené v pokusoch na zvieratách s bakteriálnou infekciou. Zvieratá ošetrené aktívnymi látkami mali významne dlhšiu dobu prežitia pri letálnych dávkach Pseudomonas aeruginosa, než zvieratá v kontrolnej skupine

Bioregulačne aktívne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť podané buď separátne ako čisté zlúčeniny, alebo ako zmesi zlúčenín alebo vo forme farmaceutických prípravkov, kde posledne menované môžu obsahovať jednu a/alebo niekoľko farmaceutický bezpečných prísad a/alebo nosičov mimo zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu Ako tieto prísady môžu byť menované 0,9 % roztok chloridu sodného, I až 5 % roztoky glukózy alebo fruktózy, karboxymetylcelulóza, zemiakový škrob, laktóza, lanolín, manitol, stearan horečnatý, 1,2 propylénglykol, glycerín, cetylstearyl alkohol, nipagin, laurylsíran sodný a mastenec. Voliteľne môžu byť ešte ďalšie terapeuticky aktívne látky alebo prísady pridané k farmaceutickým prípravkom produkovaným týmto spôsobom. Tieto galenické formulácie zahrnujú všetky také formulácie, ktoré sú vhodné na parenterálne, intramuskulárne, intravenózne, subkutánne, peri- alebo intraauriku láme injekcie, na perorálne aplikácie ako napríklad vo forme tabliet, kapsli alebo kvapiek, alebo na vonkajšie aplikácie ako napríklad vo forme masti, krémov, gélov alebo čipkov.

Predkladaný vynález je teraz ďalej ilustrovaný v nasledujúcich príkladoch

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Syntetická produkcia zo suboxidu uhlíka hr/RbF

CH₂(COOH)₂......-> C₃O₂------> com-(C₃O2)_n

Vo sklenenom reaktore, ktorý je vybavený refluxným vodným chladičom je rozpustených 15 časti kyseliny malónovej v 80 častiach anhydridu kyseliny octovej zahriatím v olejovom kúpeli (80 °C) a miešaním V predĺžení refluxného chladiča su pripojené dva ďalšie chladiace nadstavce chladené suchým ľadom na oddelenie vznikajúcich prchavých zlúčenín. Po rozpustení úplného množstva kyseliny sa pridá 0,2 dielu fluoridu rubidného a uskutoční sa fotochemické 0žiarenie 250 W slnečnou lampou Uskutočni sa zvýšenie teploty olejového kúpeľa na 130 - 150 °C a reakčná zmes sa stane tmavšie hnedou Suboxid uhlíka, ktorý je prchavý pri silnom vákuu a jeho deriváty sú kondenzované v kondenzačnych hrncoch ochladzovaných suchým ľadom a acetónom. Kondenzát sa prečisti trakcionovanou vákuovou destiláciou Aktívne zlúčeniny získané týmto spôsobom sú prečistené a analyzované známymi chromatografickými metódami.

Príklad 2

Izolácia z priemyselného metanolu

250 dielov 0.1 molárneho pufrovacieho roztoku octanu amónneho s pH 9 sa pridá k 1000 dielom metanolu vyrobeného zo syntézneho plynu a metanol sa najskôr oddestiluje z tejto zmesi aplikáciou na destilačné kolóny. K zvyšnej vodnej fáze sa znovu pridá 1000 dielov metanolu a destilácia metanolu sa opakuje 3-4 krát. Zostávajúca vodná fáza sa nakoniec starostlivo koncentruje a ošetri sa živočíšnym uhlím. 50 dielov živočíšneho uhlia separovaného filtráciou a sušeného na vzduchu sa ošetri 400 dielmi vody obsahujúcej 80% (objem/objem) etanol pri 80 °C a za tepla sa filtruje po 30 minútovej macerácii. Extrakcia sa opakuje 2-krát. Kombinované etanolové extrakty sa starostlivo koncentrujú a sušia sa sublimáciou zo zmrazeného stavu.

Príklad 3

Izolácia z druhu Helleborus

Časti sušených a hrubo nasekaných koreňov a pakoreňov Helleborus purpurascens (čeľaď Ranunculaceae) sa zbaví tuku pomocou 120 dielov hexánu a potom sa pre-extrahujú 80 dielmi dichlórmetánu. Po odstránení extrakčného činidla sa sušený zvyšok maceruje s 200 dielmi vody obsahujúcej 30% (objem/objem) etanol počas 24 hodín pri izbovej teplote. Extrakcia sa opakuje dvakrát a potom sú kombinované extrakty filtrované a koncentrované vo vákuu. 250 dielov extraktu získaného týmto spôsobom sa pridá k 3 dielom koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej a zahrieva sa počas 20 minút pri 95 °C. Po neutralizácii sa roztok ošetrí trochou živočíšneho uhlia a filtruje sa. Filtrát koncentrovaný vo vákuu sa naleje na 8-násobný objem acetónu, centrifugovaná zrazenina sa rozpusti v minimálnom množstve vody a opakovane sa zráža 2 - 3 krát acetónom. Zrazenina sa rozpusti v minimálnom 0,1 molárnom roztoku chloridu sodného a roztok sa zavedie na gélovú kolónu naplnenú TSK HW-60. Elúcia prebieha pri prietoku 5 cm/h s 0.125 molárnym roztokom amoniaku vo vode, ktorý- tiež obsahuje 10% (objem/objem) 2propanol Detekcia sa uskutočni meraním optickej denzity pri 230 nm

Príklad 4

Izolácia aktívnych látok zo semien Vitis vinifera dielov sušených a rozomletých semien Vitis vinifera sa pridá k 150 dielom 0,5 molárneho boritanového pufru s pH = 9,6 a zahreje sa a maceruje sa počas 30 minút pri 90 °C. Filtrovaný roztok sa koncentruje a naleje sa na 8-násobný objem chladného etanolu za miešania. Takto vzniknutá zrazenina sa centrifúguje a rozpustí sa v minimálnom množstve vody a zráža sa dvakrát 6-násobným množstvom chladného etanolu. Zrazenina rozpustená v minimálnom množstve pufrovacieho roztoku octanu amónneho s mierne alkalickým pH sa podrobí separácii ultrafiltráciou, pri ktorej sú použité membrány s limitmi priepustnosti molekúl 30, 10, 3 a 1 kDa. pH frakcii separovaných týmto spôsobom sa upraví na slabo kyslé hodnoty pH a frakcie sa lyofilizujú.

Príklad 5

Izolácia aktívnych látok z Phytolacca americana

100 dielov sušených koreňov od Phytolacca americana sa naseká na kúsky veľkosti 0,5 1,2 mm a odmasti sa 600 dielmi hexánu ošetrením, ktoré trvá 24 hodín Najskôr sa hexán vytlačí a rastlinný materiál sa suší na vzduchu, dokiaľ nie je znateľný žiadny zápach hexánu. Sušený rastlinný materiál sa maceruje s 800 dielmi vody obsahujúcej 5% (objem/objem) kyselinu octovú počas 4 hodín pri izbovej teplote a proces sa opakuje dvakrát. Kombinované extrakty sa filtrujú a koncentrujú sa vo vákuu. 15 až 50 dielov síranu amónneho sa po častiach pridá k 100 dielom vodného roztoku a rozpusti sa. Proteiny zrážané vysolovanim sa odstránia centrifúgáciou a filtráciou. 50 dielov l-butanolu sa pridá k 50 dielom supernatantu a táto zmes sa silno trepe. Po určité dobe je organická fáza separovaná a extrakcia butanolom sa opakuje dvakrát. Kombinované butanolové roztoky sa znovu extrahujú vodou obsahujúcou 0,1 % amoniak. Vodná fáze sa koncentruje vo vákuu a prečisti sa gélovou filtráciou.

Príklad 6

Produkcia z Escherichia coli

2000 objemových dielov autoklávovaného kultivačného média, ktoré obsahuje 20 dielov tryptónu, 10 dielov kvasinkového extraktu. 20 dielov NaCI a 30 dielov agaru je doplnené vhodnými nutričnvmi prísadami a inokuluje sa kmeňom K-12 Escherichia coli v riedení 1:100. Kultúra sa udržuje pri 37 °C, dokiaľ nie je dosiahnutá nasýtená hustota 2x10^ buniek/ml. Reakčná zmes je vystavená pôsobeniu ultrazvuku a zahriata na dobu 20 minút pri 90 °C s kyselinou octovou, po ochladení sa filtruje a koncentruje sa vo vákuu. 150 dielov koncentrovaného roztoku sa absorbuje na oxid kremičitý s reverznou fázou (RPI8) pre chromatografiu na kolóne (Merck) a pevná fáza sa najskôr premyje vodou obsahujúcou 2% (objem/objem) kyselinu octovú, potom 1000 dielmi pufrovacej zmesi obsahujúcej n-propanol: etylacetát:20 mM borax/boritanový pufor v pomere 600:100:300 % (objem/objem) a nakoniec sa premyje vodou. Pevná fáza je premývaná týmito neutrálnymi elučnými činidlami tak dlho, dokiaľ nie sú v eluáte detekovateľné žiadne aminokyseliny. uhľohydráty alebo iné jednoduché produkty hydrolýzy. Desorpcia aktívnych látok podľa predkladaného vynálezu sa uskutočni za použitia acetonitrilu, ktorého nadbytok sa odstráni koncentráciou vo vákuu. Roztok aktívnych látok podľa predkladaného vynálezu získaný týmto spôsobom sa koncentruje.

Príklad 7

Izolácia z tekutín od zvierat

10000 dielov moču od prasiat sa suší sublimáciou zo zmrazeného stavu a pevný zvyšok sa extrahuje trikrát 600 dielmi metanolu. Metanolové extrakty sa koncentrujú na 20 dielov. 100 dielov brómkyánom aktivované Sepharose 4B sa ošetrí počas 90 minút roztokom vhodne aktivovaného hellebrínu, dokiaľ nie je 80 % použitého glykozidu kovalentne naviazané na pevnú fázu. 10 dielov koncentrovaného metanolového roztoku sa aplikuje na kolónu pre afinitnú chromatografiu pripravenú týmto spôsobom a eluuje sa počas takej doby, dokiaľ nie je viac chemických zlúčenín detekovateľných v roztoku. Aktívna zlúčenina podľa predkladaného vynálezu je eluovaná z kolóny gradientovou elúciou 0,5 až 0,2 molárnou kyselinou mravčou a je sušená subhmáciou zo zmrazeného stavu. Prečistenie aktívnych zlúčenín prebieha na kolóne naplnenej Sephadex LH-20 (Pharmacia). AJctivne zlúčeniny sú najskôr absorbované na kolónu a sú eluované gradientom 20 až 60 (objem/objem) % acetónu vo vode.

Príklad 8

Imunomodulačná aplikácia

Spontánna bunkami sprostredkovaná cytotoxicita (SCMC) NK buniek bola meraná v teste ^Cr izotopu uvoľňovaného z K552 cieľových buniek za pomeru efektor/cieľ 100/1 a 10/1. U 8 z 10 zdravých subjektov zvýšila aktívna látka podľa predkladaného vynálezu lytickú aktivitu priemerne o 15 %. Patologická SCMC aktivita u 16 pacientov s reumatizmom, patologicky zvýšená na priemerne 141 %, bola zreteľne normalizovaná po podaní aktívnych látok podľa predkladaného vynálezu. Efektorové bunky v bunkovej cytótoxicite závislé na protilátkach (ADCC) sú aktívnymi látkami podľa predkladaného vynálezu ovplyvnené viac-menej jednotným spôsobom. Ako je jasné z nasledujúceho diagramu I, ADCC aktivita je znížená u zdravých jedincov, rovnako ako u pacientov s reumatizmom.

Diagram 1: Cytotoxicita u zdravých jedincov a u pacientov s reumatizmom s a bez liečby aktívnymi látkami

	i o o % 1	zdravých jedincov		100
	1 1	1
	1 78% 1
	I	látka	|z::::::::::::::::::::::: I	115
	1		1 1
	112% | I	Pacient s reumatizmom	(SSÍSíSŽOgíj;® I	141!
v«VAvr»*Xv»*»s	1 1	Pacient s reumatizmom +	1
V.S'.V.V.V.’.SS·.	69% |	aktívna látka	IWM 104%

ADCC - bunková SCMS - spontánna cytotoxicita závislá na protilátkach bunkami sprostr.

cytotoxicita

Táto normalizácia aktivity môže byť vysvetlená špecifickou afinitou aktívnych zlúčenín k Fc receptoru

Príklad 9

Imunosupresivna aplikácia pre orgánové transplantácie lmunosupresivny účinok zlúčenín podľa predkladaného vynálezu vedie k zreteľnej redukcii reakcii odmietnutia štepu u orgánových transplantácií. Toto bolo pokusne overené pomocou série pokusných transplantácii srdca u myši.

Metóda alogénnej srdcovej transplantácie podľa Corry, R, Winn, H. a Ressel, P., Transplantation 16, 343 (1973) bola použitá na patogénov zbavených, 5 - 6 týždňov starých myšiach línie Sprague Dawley DBA/2 ako darcov a C57BL/6 ako príjemcov

Po intravenóznej heparinizácii zvierat použitých ako darci sa ich srdcia odoberú a uchovávajú sa v ľadovo chladnom roztoku Ringer-laktáte do prípravy C.57BL/6 príjemcov. Anasto mózy medzi aortou a pľúcnymi artériami darca s brušnou aortou a dolnou dutou žilou príjemcu sa uskutočnia mikrochirurgickými technikami.

Po obnovení toku krvi sa pozoruje frekvencia a intenzita srdcového tepu a hodnotí sa od 0 do +4. Odhojenie sa urči podľa spomalenia pulzu a vizualizuje sa laparotómiou. Myši v teste dostali nasledujúce množstvá aktívnych zlúčenín podkožným podaním:

- 2 mg/kg tri dni pred transplantáciou

- 3 mg/kg v deň operácie

- 2,5 mg/kg tretí pooperačný deň

- 1,5 mg/kg každý ďalší tretí deň

Zvieratá v kontrolnej skupine boli liečené len citrátovým pufrom ako placebom.

V týchto transplantačných pokusoch boli získané nasledujúce výsledky:

Zviera č.	Liečba	Doba prežitia (dni)
1	aktívna zlúčenina	24
2	aktívna zlúčenina	31
J	aktívna zlúčenina	18
4	aktívna zlúčenina	21
5	aktívna zlúčenina	42
6	aktívna zlúčenina	18
7	aktívna zlúčenina	6
8	aktívna zlúčenina	» J D
9	aktívna zlúčenina	12
10	aktívna zlúčenina	22
1 1	placebo	8
12	placebo	6
13	placebo	10
14	placebo	9

Priemerná doba prežitia pre zvieratá liečené placebom bola 8,2 dni. Pri priemernej hodnote 22,7 dní vykazovali zvieratá liečené aktívnou zlúčeninou zreteľné, takmer trojnásobné, zvýšenie doby prežitia oproti zvieratám liečeným placebom. Tento výsledok je vysvetlený špecifickou supresiou T-iymfocytov spôsobujúcich reakciu odmietnutia štepu.

Príklad 10

Stimulácia makrofágov

Lymfocyty zo sleziny od 10 normálnych myši sa suspendujú v RPMI154Q médiu pufrovanom HEPES a doplnenom 10 % fetálnym teľacím sérom. Suspenzia sa uchováva pri 37 °C po dobu jednej hodiny na umožnenie adherencie makrofágov. V testovanej skupine boli myši ošetrené intraperitoneálne 5 mg/kg aktívnej zlúčeniny a boli usmrtené za 24 hodín. Zvieratá v kontrolnej skupine nedostali žiadnu aktívnu zlúčeninu. Lymfocyty od oboch skupín boli kultivované v tubách obsahujúcich 5x10$ adherujúcich makrofágov.

Stimulačný index makrofágov

	LPS	PHA
Kontrolná skupina	288 %	165 %
Skupina s aktívnou zlúčeninou	402 %	1346 %

Ako je zrejmé, stimulačné indexy (SI) dosiahnuté pri použití LPS (lipopolysacharid) a PHA (fytohemaglutinín) u zvierat ošetrených aktívnou zlúčeninou sú signifikantne vyššie.

Príklad 11

Aplikácia pre zreteľnú imunostimuláciu

Nešpecifická zreteľná imunostimulácia bola vyšetrovaná určením doby prežitia zvierat, ktoré boli infikované letálnou dávkou Pseudomonas aeruginosa.

V troch testovaných skupinách s 30 - 100 myši, v príslušnom poradí, dostalo každé zviera letálnu dávku Pseudomonas aeruginosa.

I. V deň 7, 14 a 28 pred letálnou pseudomonádovou infekciou boli v prvej skupine podané 2 pg aktívnej zlúčeniny; v deň 21 bolo podané 0,25 ml fyziologického roztoku NaCl,

II. V druhej skupinke boli podané rovnaké dávky aktívnej zlúčeniny ako v skupine I, ale v deň 21 bolo podané 0,06 mg cyklofosfamidu,

III. V kontrolnej skupine nebola podaná riadna aktívna zlúčenina.

% prežitia pri letálnej infekcii Pseudomonas aeruginosa

I. —* s-----x---

#--#— aktívna látka aktívna látka + cyklofosfamid kontrolná skupina

Aktívne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu spôsobovali jasné zvýšenie doby prežitia. Aj keď bola doba prežitia znížená známym imunosupresivnym účinkom cyklofosfamidu, zreteľne zostávala nad hodnotami kontrolnej skupiny. Interakcie naznačujú nešpecifickú zreteľnú imunostimuláciu spôsobenú aktívnymi zlúčeninami podľa predkladaného vynálezu, kde je predstaviteľný nový, doteraz nepopísaný imunitný mechanizmus. Nedávno bolo zistené, že ihneď po podaní letálnej dávky Pseudomonas dôjde k explózii-podobnému uvoľneniu cytokinov. Tento stav cytokinového šoku takto spustený je považovaný za bezprostrednú príčinu náhlej smrti. Imunosupresivny účinok podľa predkladaného vynálezu môže zabrániť tomuto cytokinovému šoku a vedie k prekvapivo vyššej dobe prežívania bez uplatnenia správnej imunostimulácie.

Príklad 12

Testy aktívnych zlúčenín za pomoci kompetitivnych ELISA metód

Na testy je použitá skrížená reakcia aktívnych zlúčenín podľa predkladaného vynálezu s anti-ouabainovým (a-OU) antisérom. Konjugát ouabain-avidín (OU-con) bol syntetizovaný z analytického ouabainu (Sigma) a avidínu (Fluka) podľa metódy podľa Harris et al., Hypertension 17, 930 (1991). Pri produkcii odpovedajúceho anti-ouabaínového séra boli použité vylepšenia podľa V. Di Bartolo et al., Life Sciences, 57, 1417, (1995).

ELISA mikrotitračné platne boli najskôr inkubované s 0,1 pg/50 μΐ OU-con roztokom konjugátu cez noc pri 4 °C. Nenaviazané konjugáty boli vypláchnuté fosfátovým pufrom (PBS, pH = 7,4) a neobsadená väzobné miesta boli blokované I % roztokom želatíny.

μΙ roztoku vzorky s neznámym obsahom aktívnej látky bolo zmiešané s konštantným množstvom anti-ouabaínového séra (0,5 μβ/50 μΙ) v polypropylénových tubách a nechalo sa pri izbovej teplote počas 2 hodín. Potom sa 50 μΙ z každej vzorky antiséra aktívnej látky aplikovalo na platne a inkubovalo počas 3 hodín. Po vypláchnutí nenaviazaného antiséra PBS sa platne ošetrili 1:500 roztokom protein A alkalickej fosfatázy (Sigma) počas 2 hodín pri izbovej teplote. Po odstránení nenaviazaného enzýmu sa každá platňa ošetrí 50 μΙ roztoku p-nitrofenyl fosfátu (1 mg/ml) a po inkubačnej dobe 30 minút sa automaticky odčítajú absorpčné hodnoty (A) pri 405 nm.

.35

Na konštrukciu kalibračnej krivky sa známe množstvá aktívnej látky v rozmedzí 5 ng/ml až OJ mg/ml zmiešajú s konštantným množstvom antiséra, ošetria sa vyššie uvedenými metódami a merané hodnoty absorpcie sa znázornia ako funkcie odpovedajúcich koncentrácii.

Claims (39)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Makrocyklická zlúčenina, ktorej štrukturálny skelet je tvorený anorganickým suboxidom uhlíka C3C2 cyklooligomerizáciou za tvorby kondenzovaných 4-pyrónových alebo 2-pyrónových kruhov ďalej spojených v makrokruhovej štruktúre takým spôsobom, že kumulované C=O a C=C dvojité väzby základnej zlúčeniny nie sú naďalej prítomné, kde tento štrukturálny skelet odpovedá všeobecnému vzorcu:

   com-(C3C₂)_n kde com znamená vyššie uvedené cyklooligomérne a makrocyklické spojenie C3C2 jednotiek a n znamená stupeň cyklooligomerizácie suboxidu uhlíka
2. 2. Makrocyklická zlúčenina podľa nároku I, kde vo vzorci štrukturálneho skeletu cyklooligomérneho suboxidu uhlíka je n rovné 4, 6 alebo 10 alebo násobkom 4, 6 alebo 10.
3. 3. Makrocyklická zlúčenina podľa nárokov 1 alebo 2, kde uvedená látka prijíma elektrónovú distribúciu závislú na médiu predstavovanom pyrónom, pyryliom alebo inými tautomérnymi limitnými štruktúrami, kde tieto môžu byť vo vzájomnej rovnováhe v roztoku.
4. 4 Makrocyklická zlúčenina podľa nároku 3, kde je rovnováha pyrón-pyrylium prítomná v roztoku pre cyklohexamérny suboxid uhlíka com-fCjCq)^ tvorený šiestimi alternujúcimi hlavapäta kondenzovanými 4-pyrónovými kruhmi znázornená nasledujúcim spôsobom:

   ο

   Ω
5. 5. Makrocyklická zlúčenina podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde uvedená látka je prítomná ako hydroxy-pyránový derivát podľa všeobecného vzorca com-(C₃C2)_n H_m vytvorený adíciou vodíka k exocyklickým atómom kyslíka, kde m je počet naviazaných atómov vodíka a m š n, H je vodík a com a n sú rovnaké ako bolo popísané vyššie.
6. 6. Makrocyklická zlúčenina podľa akéhokoľvek z nárokov I až 5, kde cyklooligomérny suboxid uhlíka podľa vzorca com-(C3C₂)_n alebo jeho hydroxy-pyránový derivát podľa vzorca com(C3C2H)_n sú základné jednotky na tvorbu aduktov, pyryliových solí, komplexov darcapríjemca, vlastných asociátov a anorganických a organických derivátov a kde com a n sú rovnaké, ako bolo popísané vyššie.
7. 7. Makrocyklická zlúčenina podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 6, kde cyklooligomérne základné jednotky poskytujú cylindrickú makrokruhovú štruktúru s vnútornou dutinou.
8. 8. Makrocyklická zlúčenina podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 7, kde uvedená látka je prítomná ako pyryliová soľ vzorca com-(C3C2)_n. K_n.An_n kde Kaje anión a An je aniónový protiión, ktoré spoločne neutralizujú obojaký náboj pyryliového skeletu.
9. 9. Makrocyklická zlúčenina podľa akéhokoľvek z nárokov I až 8, kde uvedená látka je prítomná vo forme aminového aduktu vzorca com.(C₃C₂)_n (R’R²R³N)_m kde R¹, R² a R³ sú každý atóm vodíka alebo metylová, etylová, acetylová alebo benzylová skupina a m je číslo od 1 do n, kde uvedená látka sa skladá zo skeletu cyklooligomémeho suboxidu uhlíka a i až n molekúl amoniaka, organického amínu, aminokyselín, peptidov alebo iných látok s amínovou funkciou. .
10. 10. Makrocyklická zlúčenina podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 9, kde anorganické alebo organické zvyšky R sú naviazané na atómy kyslíka základného skeletu a následkom toho vzniknú anorganické a/alebo organické deriváty alebo konjugáty všeobecného chemického vzorca com-(C₃C2)n R_m kde R je anorganická alebo organická molekula a/alebo metylová, etylová, acetylová alebo benzylová skupina a m < 2n.
11. 11. Makrocyklická zlúčenina podľa akéhokoľvek z nárokov I až 10, kde základná jednotka com-(C₃C2)_n alebo com-(C₃C2H)_n je prítomná vo forme vlastných asociátov vzorca (com-(C₃C2)_n)s alebo (com-(C₃C2H)_n)_s kde s = 2, 3, 4, 5, 6, 10 alebo 12, rovnako ako násobkom týchto čísiel.
12. 12. Makrocyklická zlúčenina podľa nároku 1 I, kde zlúčenina odpovedajúca hodnote s = 12 a n = 6 a molárnou hmotnosťou 4,898 alebo 4,970 má skelet s vysokou štrukturálnou symetriou.
13. 13. Makrocyklická zlúčenina podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 12, kde uvedená zlúčenina je prítomná v roztoku vo forme dynamickej rovnováhy medzi menšími a väčšími zlúčeninami podľa rovnice:

    (com-(C3C2)_n)s < (com-(C3C₂)n)s-p ⁺ (com-(C₃C₂)_n)_p kde s má hodnotu danú v nároku II p < s.
14. 14. Bioregulačné liečivo, ktoré obsahuje ako aktívnu prísadu makrocyklickú zlúčeninu podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 13.
15. 15. Spôsob na produkciu makrocyklických zlúčenín s bioregulačnou aktivitou podľa akéhokoľvek z nárokov I až 14 vyznačujúci sa tým, že suboxid uhlíka je fotochemický aktivovaný a/alebo cyklooligomerizovaný za tvorby makrokruhových štruktúr použitím pomocných činidiel vo forme soli alebo iónov, ktorých polomer pasuje do dutiny makrokruhu.
16. 16. Spôsob na produkciu makrocyklických zlúčenín s bioregulačnou aktivitou podľa akéhokoľvek z nárokov I až 14 vyznačujúci sa tým, že deriváty malých karboxylových kyselín ako je kyselina malónová sú ošetrené enzýmom patriacim do triedy polyketid-syntas (PKS).
17. 17. Spôsob na izoláciu makrocyklických zlúčenín s bioregulačnou aktivitou podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 14 vyznačujúci sa tým, že

    - sú použité organické produkty produkované v priemyselnom meradle zo syntézneho plynu alebo z oxosyntézy,

    - bioregulačne aktívne zlúčeniny tu obsiahnuté sú obohatené frakčnou destiláciou.

    - tieto aktívne zlúčeniny sú izolované vákuovou destiláciou a kondenzáciou pri nízkych teplotách a

    - aktívne zlúčeniny sú prečistené absorpciou na pevnej fáze a desorpciou rôznymi rozpúšťadlami.
18. 18 Spôsob na izoláciu makrocyklických zlúčenín s bioregulačnou aktivitou podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 14 v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že

    - rastliny obsahujúce toxické glykozidy, alkaloidy alebo taníny, alebo kultúry rastlinných buniek, sú použité ako surový materiál,

    - chemicky nedefinovaný konjugát obsiahnutý v tomto surovom materiáli je extrahovaný vodnými roztokmi,

    - konjugát je štiepený hydrolýzou a/alebo vyzrážaný acetónom, alkoholom alebo inými rozpúšťadlami,

    - získaná zmes je naviazaná na iónomenič alebo na neutrálny absorbent a ostatné zložky sú vymyté,

    - aktívna zlúčenina je desorbovaná roztokmi bázického pufru alebo selektívne pôsobiacimi zmesami rozpúšťadiel, a

    - aktívna zlúčenina je prečistená dialýzou, membránovou filtráciou, gélovou chromatografiou alebo inými metódami a voliteľne je separovaná podľa veľkosti molekuly
19. 19. Spôsob na izoláciu makrocyklických zlúčenín s bioregulačnou aktivitou podľa akéhokoľvek z nárokov I až 14 v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že aktívna zlúčenina je získaná z bakteriálnych kultúr, kde

    - kultivačná pôda je ošetrená ultrazvukom a/alebo je hydrolyzovaná pri kyslých hodnotách pH,

    - aktívna zlúčenina je zhruba izolovaná extrakciou kvapalina-kvapalina,

    - aktívna zlúčenina je naviazaná na živočíšne uhlie alebo na iný absorbent,

    - aktívna zlúčenina je selektívne uvedená do horúceho roztoku alkohol-voda alebo do inej zmesi rozpúšťadiel a

    - aktívna zlúčenina je prečistená chromatografiou alebo inými metódami separácie.
20. 20. Spôsob na izoláciu makrocyklických zlúčenín s bioregulačnou aktivitou podľa akéhokoľvek z nárokov I až 14 vyznačujúci sa tým, že aktívna zlúčenina je extrahovaná z tkanív, telesných tekutín alebo tkanivových kultúr zvieracieho pôvodu, kde

    - vodný extrakt je koncentrovaný a/alebo sušený sublimáciou zo zmrazeného stavu,

    -je predčistený extrakciou kvapalina-kvapalina alebo kvapalina-pevná látka,

    - je naviazaný na afmitnú pevnú fázu s kovalentne viazanými špecifickými glykozidmi alebo proteínmi a

    -je selektívne uvoľnený zmesou rozpúšťadiel.
21. 21. Použitie makrocyklickej aktívnej zlúčeniny podľa nárokov I až 14 na prípravu terapeutického činidla

    - na bioreguláciu Na⁺, K⁺ ATPas a iných enzýmov, alebo

    - na potlačenie škodlivých autoagresívnych procesov pri autoimunitných ochoreniach, alebo

    - na imunoreguláciu prostredníctvom väzby na Fc receptory, alebo

    - na liečbu bolesti prostredníctvom väzby na neuroreceptory, alebo

    - na lýzu spasmu svalov alebo ciev.
22. 22. Použitie aktívnej zlúčeniny podľa nárokov 1 až 14 ako terapeutické činidlo

    - na kontrolu NA⁺, K⁺ ATPas alebo iných enzýmov, alebo

    - na stimuláciu imunitného systému, alebo

    - na kontrolu fagocytózy.
23. 23. Použitie podľa nárokov 21 alebo 22, v ktorom sú využité adukty, pyiyliové soli, deriváty komplexov darca-prijemca cyklooligomérov.
24. 24. Použitie makrocyklickej aktívnej zlúčeniny podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 14 na prípravu farmaceutického prípravku, ktorý je konjugát alebo adukt tejto zlúčeniny so známymi farmakologicky aktívnymi zlúčeninami na

    - zmiernenie akútnej a/alebo chronickej toxicity srdcových glykozidov, alkaloidov alebo iných medicínskych činidiel, alebo

    - zlepšenie biodostupnosti steroidných, peptidových alebo iných aktívnych látok.
25. 25. Použitie makrocyklickej aktívnej zlúčeniny podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 14 na prípravu farmaceutického prípravku, ktorý tvorí komplexy darca-prijemca s iónmi neprechádzajúcimi membránou alebo s menšími látkami, čim umožňuje ich transport cez bunkovú membránu.
26. 26. Použitie aktívnej zlúčeniny podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov na liečbu zápalov, reumatizmu a autoimunitných ochorení.
27. 27. Použitie aktívnej zlúčeniny podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov na liečbu reumatoidnej artritídy, roztrúsenej sklerózy, lupus erythematodes, myastenia gravis a iných autoimunitných ochorení.
28. 28. Použitie aktívnej zlúčeniny podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov na potlačenie reakcii odhojovania štepu pri orgánových alebo tkanivových transplantáciách.
29. 29. Použitie aktívnej zlúčeniny podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov na liečbu ochorení, ktoré sú spôsobené akútne alebo chronicky oslabenou imunitnou obranou alebo fenoménom cytokinmi sprostredkovaného šoku.
30. 30. Použitie aktívnej zlúčeniny podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov na liečbu kardiovaskulárnych patológií, ktoré sú spôsobené defektnou bioreguláciou Na⁺, K⁺ ATPasového systému.
31. 3 1. Farmaceutické činidlo, ktoré obsahuje bioregulačne aktívnu zlúčeninu podľa nárokov 1 až 14 spolu s fyziologicky prijateľným nosičom.
32. 32. Farmaceutické činidlo podľa nároku 31, ktoré je podané perorálne, lokálne, intravenózne alebo intraarteriálne.
33. 33. Farmaceutické činidlo podľa nárokov 31 a 32, ktoré je podané vo forme tablety, kapsle, masti, gélu alebo injekcie.
34. 34. Farmaceutické činidlo podľa nárokov 3 I až 33, ktoré obsahuje ďalšie prísady
35. 35. Diagnostické činidlo na ochorenia s autoimunitnou patológiou, kde je aktívna zlúčenina podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 14 použitá ako taká alebo v značenej forme na vyšetrovanie krvi alebo vzoriek tkaniva.
36. 36. Diagnostické činidlo na ochorenia s kardiovaskulárnymi patológiami, kde je aktívna zlúčenina podľa nárokov I až 14 použitá ako taká alebo v značenej forme a/alebo je analyzovaná gélovou chromatografiou, ELISA alebo rádioimunotestom.
37. 37. Diagnostické činidlo na imunologický spôsobené ochorenia, kde je použitá špecifická zrážacia reakcia aktívnej zlúčeniny podľa nárokov I až 14 s imunoglobulínmi alebo ich fragmentárni.
38. 38. Spôsob na diagnostiku ochorení s autoimunitnými patológiami vyznačujúci sa t ý m, že aktívna zlúčenina podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 14 ako taká alebo v značenej forme je použitá na vyšetrenie krvi alebo vzorky tkaniva.
39. 39. Spôsob na diagnostiku ochorení s kardiovaskulárnymi patológiami vyznačujúci sa t ý m, že aktívna zlúčenina podľa akéhokoľvek z nárokov I až 14 ako taká alebo v značenej forme je použitá a/alebo je analyzovaná gélovou chromatografiou, ELISA alebo rádioimunotestom.