JP2000503015A - 亜酸化物単位から製造される巨大環式化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 環状オリゴマー化、更に巨大環構造を形成することにより、亜酸化炭素から合成される巨大環状骨格構造を有する生物学的に活性な物質が特定される。これらの活性物質は、そのままの状態で、および／または他の既知の物質との安定な付加物として使用される。これらの活性物質の特性決定について記載するとともに、それらの有機および無機の誘導体、それらの合成、単離、および精製の方法についても記載する。更に、これらの活性物質の酵素調節および生体調節への適用、これらの活性物質を含有する医療用組成物、ならびに診断および治療におけるそれらの使用についても記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 亜酸化物単位から製造される巨大環式化合物 発明の分野 本発明は、生体調節活性のある巨大環状物質、ならびに該巨大環状物質を合成 する方法および種々の出発原料から該巨大環状物質を単離する方法に関する。ま た、これらの活性物質をそれ自体でまたは他の活性物質と組合せて使用し、酵素 調節および生体調節を行うことについても記載する。 発明の背景 生化学過程の適切な経路および生物学的免疫機構の最適な機能は、多数の生体 調節活性物質により確保されている（Rompp Lexikon, p.3826, ”Regulation” ）。化学的立場から見ると、これまでに明らかにされた生体調節活性物質は、ペ プチド、炭水化物、ステロイド、または脂質であるが、これらの構造要素は、一 緒に存在する場合もある（例えば、糖ペプチド、リポタンパク質）。さらに、こ れらの調節機構のうちの１つ以上の機能が障害を受けることによって生じる疾患 を治療するために、生体調節活性物質を適用することは、周知である。ステロイ ドホルモン、コルチコステロイド、および強心配糖体、ならびに成長ホルモンま たは血液凝固因子を治療に使用することは、これに該当する多くの事例の一部で ある。しかしながら、このタイプの物質を用いた薬物療法では、有害な副作用を 起こすことが非常に多いため、かなりの制約を受ける。こうした側面に対する詳 細な考察については、Goodman and Gilman著、”The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 8th Ed., New York, 1991を参照されたい。例えば、強心配糖 体を用いた場合、治療上有用な正の変力作用が心毒性副作用によって抑えられる め、治療用量を非常に大きく制限しなければならない。更なる例としてコルチコ ステロイドの適用が挙げられるが、この場合、筋 障害、骨粗鬆症、精神障害、感染症に対する感受性の増大などの非常に強い一連 の副作用を伴うため、非常に重症の患者に対してだけ、しかも限られた期間だけ 、治療に利用することが推奨される。 免疫学的な原因で起こる疾患症候群を、免疫調節活性物質を用いて治療するた めに、多大な努力が払われてきたが、従来の臨床試験は、納得のいくものではな い。このような免疫療法を適用する目的は、特に、慢性関節リウマチや多発性硬 化症などの自己免疫疾患に対する基本的治療法を確立することであるが、現在ま でのところ、こうした治療法は見出されていない。E. Sercarz and S. K. Datta , ”Autoimmunity”, Current Biology 6, 875-881(1995)によれば、これらの自 己免疫疾患のほとんどは、免疫調節障害が原因であった。免疫系の大きな機能低 下を特徴とする重度疾患症候群（例えば、癌腫症またはAIDS）に対処するために 、従来、免疫調節物質が治療に利用されてきたが、ほとんど効果は得られなかっ た。 M. J. Clemens, ”Cytokines”, Oxford 1991の研究報告に記載されているよ うに、数種の生体調節ペプチドおよび生体調節タンパク質の特性決定が行われた 。また、様々な癌腫症、自己免疫疾患、およびウイルス感染症（AIDSを含む）に おいて、サイトカインが重要な役割を果たすことが、数回、既に報告されている 。これにもかかわらず、これらのおよび他の生体調節タンパク質および生体調節 ペプチドのより広範な治療への適用は、依然としてかなり不足している。こうし た原因の１つは、非常に労力のかかることの多い製造技術：すなわち、ヒトまた は動物の組織液からの生体調節活性物質の抽出およびそれに続く精製、にあるこ とは確かである。この組織液中には、生体調節活性物質が極僅かの量で存在する ため、治療に必要な量を確保するにはまったく不適当である。アレルギー性副作 用および／またはアナフィラキシー反応の危険は、発生することは稀であるが、 ヒトの治療に対してかなりの危険因子となる恐れがあり、こうした危険は、遺伝 子工学的に製造された生体調節ポリペプチドまたは生体調節糖タンパク質を用い る場合にも依然として存在する。「in vitro」においていくつかの 高活性であるポリペプチド因子を治療に使用する際の基本的な問題は、これらの 因子が、「in vivo」においてはまったく異なり、ほとんどが非常に弱い活性を 呈するという事実が存在することである。一方、多数の物理的バリアおよび酵素 的バリアによって、外部から投与されたペプチドおよびタンパク質は、病理的事 象の位置（炎症の病巣、癌性潰瘍などの位置）まで到達するのを妨害される。一 方、内在性酵素およびそこに存在する他の因子によって、これらは迅速に中和お よび代謝される。ペプチド、糖ペプチド、およびグリコシドの性質を有する活性 物質を経口投与した場合、これらの物質は、数種の分解過程を経て、胃腸系で実 際上無効化されてしまう。 しかしながら、「経口的」送達を行う場合、ペプチドおよび糖ペプチドの性質 を有する生体調節活性物質の比較的速い分解についても、考慮に入れなければな らない。病理的事象または症状発現の位置（例えば、炎症の病巣または癌性潰瘍 の位置）に対して治療上有効な濃度を完全に標的化するために、例えば、活性物 質のマスク型送達が行われてきた。R. Collier and D. Kaplan, ”Immuntoxine ”, Heidelberg 1988に、所定の目的に利用可能な毒素をモノクロナール抗体に 結合させて使用することに関連して、類似の報告がなされた（薬物ターゲッティ ング）。しかしながら、この治療技術は、依然として非常に複雑であり、特定の 場合に対してのみ、制限的に適用可能な状態である。調節活性物質に関しては、 その生体内利用率は、安定性に依存するだけではなく、純物理的過程（例えば、 溶解性および膜透過性）にも依存する。このことは、親油性物質に水溶性を持た せて血漿中への溶解を可能にすること、またはNa⁺イオンもしくはK⁺イオンなど の親水性活性成分の膜透過を可能にすること、と関連がある。例えば、ミトコン ドリアの膜は、通常、カリウムイオンを透過しない。ノナクチンまたはバリノマ イシンなどの巨大環状抗生物質は、対応するイオンを有機的に包容することによ り、こうした透過を可能にする。 「クラウンエーテル」の発見された年である1967年以来、巨大環構造を有し、 無機イオンまたはより小さい分子にクラウン様またはクリ プタート様被覆を施す多数の新しい化合物が製造されてきた。しかしながら、こ のようなクリプタート形成性巨大環状物質を治療に直接適用するためには、低い 毒性および良好な生体同化作用を有することが重要な前提条件であるにもかかわ らず、合成により製造されたクリプタンド試薬がこうした前提条件を満足するこ とは極稀である。 多くの基本的な生体調節機構は、いわゆるナトリウムポンプにより制御されて いる。この酵素は、ナトリウムイオンを細胞の内側から外側へ輸送すると同時に 、カリウムイオンを反対方向に輸送する能力を有する。エネルギー消費は、アデ ノシン三リン酸（ATP）の共役加水分解により賄われる。このポンプは、Na⁺,K⁺- ATPアーゼと呼ばれる酵素と同じであり、いたるところに分布している。数種の 重要な細胞の機能は、このNa⁺,K⁺-ATPアーゼにより制御されている。例えば、細 胞の容積、熱の生成、細胞内遊離Ca²⁺イオン濃度、ニューロン伝達、筋収縮、ま たは膜電位は、こうした制御の対象となっている。 また、多数の免疫調節過程の中で、重要な段階が、Na⁺,K⁺-ATPアーゼにより制 御されている。従って、ナトリウムポンプは、免疫調節においても基本的な役割 を担っている。このようにいたるところに分布し、その重要性が分かっているに もかかわらず、この酵素の調節機構については、未だに明らかにされていない。 この酵素のいわゆる「強心配糖体受容体部位」は、ナトリウムポンプの生体調節 に対する機能的な位置であると考えられる。数種の植物種中に存在する強心配糖 体は、この部位と大きな親和性をもって結合し、強心性作用や心毒性作用を示す 。しかしながら、強心配糖体は、それらの毒性から、この酵素の内在性リガンド とは同じでないことが分かっている。Progressin Drug Research, 41, 249-291( 1993)に記載のW. Schonerの論文「内在性ジギタリス様因子」の中には、これら の内在性生体調節物質の化学的性質や構造については、研究に多くの努力が払わ れてきたにもかかわらず、未だに確定できていないと報告されている。現在まで のところ、正確な特性決定や構造決定を可能にするのに十分な量のこうした内在 性因子は、動物の組織や体液から単離できていない。Na⁺,K ⁺ -ATPアーゼの活性およびNa⁺,K⁺-ATPアーゼが関与する数種の生体調節機構は、 これらの内在性リガンドと同じかまたは構造的に類似した因子を用いて効果的に 制御することが可能であろう。 最近、生体調節過程に関与する数種の単純な無機物質が見出された。しかしな がら、これらの無機物質はすべて、単純なメッセンジャー物質またはエフェクタ ーとして使用されるにすぎないことに注意することが重要である。これらの物質 は、基本的に、生体調節作用を示すのに必要な三次元構造を持たず、更に、それ と関連した構造特異性作用を示す能力に欠ける。Scientific American, 1992（5 ）22-29に記載のS. Snyder and D. Bredtの論文「酸化窒素の生物学的役割」の 中には、この気体状化合物は非特異的免疫応答の制御における機能性エフェクタ ーであると報告されている。生物体中では、酸化窒素は、局所的な作用（ほとん どが毒性作用）を示すように非常に短い寿命を有し、常に、「in situ」で産生 される。免疫系の食細胞（いわゆるマクロファージ）が、細菌毒素またはサイト カインにより活性化された場合、食細胞は、数時間のうちに比較的大量の酸化窒 素を産生することができ、この酸化窒素は免疫学的な攻撃手段(immuological we apon)として利用される。この他の単純な気体状化合物も生体調節過程に関与し ていると推定される。例えば、エチレンは、植物生態学上、重要な因子であるこ とが分かっている。A. Verma, Science, 259, 381(1993)に報告されたように、 一酸化炭素は、グアノシン一リン酸（GMP）の環化の生理学的制御に関与する。 現在までのところ、他の酸化炭素の生物学的作用に関する報告は極僅かであり 、C₃O₂に関する報告は更に少なくほとんど見られない。これについては、室温で 気体であり（bp 7℃）、粘膜を刺激し、ならびに、マスタード油およびアクロレ インの臭いがする化合物が関係していることが知られているにすぎない。亜酸化 炭素は、比較的強い血液毒素となり、ヘモグロビンと不可逆的に結合する。マウ スにおけるこの物質の許容限界は、乾燥空気中で0.2%〜0.4% C₃O₂である。C₃O₂ は水と反応してマロン酸を形成する。しかしながら、この反応は、微 量の鉱酸が存在しない場合、既に報告されている程迅速に進行しない。始源的還 元性地球雰囲気下では、かなりの量のC₃O₂が含まれていたと推定され、最近、W. Huntress et al., Nature, 352, 316-318(1991)に報告されたように、星間空間 中にこの物質が存在する可能性があるという証拠が見つかった。しかしながら、 現在までのところ、生体液中にC₃O₂が存在する可能性があるという確固とした証 拠はない。単量体ガスおよび非晶質重合体の感水性を考慮して、可能性のある生 物学的役割のほとんどが先験的に除外された。この水反応性非晶質重合体は、単 純な有機化合物の初期合成に対する出発原料であった可能性があるというPrecam brian Research, 14, 75(1981)に記載のH. YanagawaおよびF. Egamiの仮説は、 基本的に可能性があると考えられてきた。 気体のC₃O₂は、多少は、速やかに非晶質重合体を形成するが、この重合体の色 は、黄色〜濃い赤褐色である。これらの重合体の構造に関する明確な知見は、極 僅かである。一般的には、これらは、非均一非晶質塊として記載されており、以 前は「赤色炭素(red carbon)」と呼ばれていた。亜酸化炭素(carbon suboxide) およびその重合体の化学的性質に関する概説は、T. KappeおよびE. Zieglerの論 文〔Agnew.Chem., 86, 529(1974)〕に記載されている。重合生成物は、水または 希薄アルカリ溶液に部分的に溶解し、濃い黄色〜暗褐色の溶液を生成する。これ らの非晶質不規則性重合体の構造に対する数種の仮説的な式が提案されたが、こ れらはいずれも実験的に確認されていない。最も可能性が高いと考えられるのは 、黒鉛様の六方格子構造であるが、周辺部が不飽和であるため、相応じて不安定 なはずである。この仮説については、Inorganic Chemistry 2, 829(1963)に記載 のN. S. SmithおよびD. A. Youngの論文に詳しく説明された。 更に、血漿中にある数種の生物学的に有効性の高い物質は、そのままの状態と してではなく、複合体(conjugate)として見出されることが知られている。例え ば、ステロイドホルモンは、血漿中でスルフェートまたはグルクロネートと複合 体を形成して存在し、その分解生成物 もまた、こうした複合体として脱離される。米国特許第2,565,115号および米国 特許第2,720,483号に係る複合体化エストロゲンステロイドまたはデヒドロエピ アンドロステロンスルフェート（DHEAS）に対して報告されているように、これ らの複合体化ステロイドは、純活性物質よりも更に良好な治療特性を示すことが 時々ある。上述の複合体形成は、こうしたステロイド活性物質の生物学的利用率 および同化作用を調節し、このことから改善された治療特性を説明することがで きる。ポリペプチド型活性物質の生体内利用率の調節を、対応する複合体の形成 によって行うことについては、あまり知られていない。また、Trends Biochemic al Sciences 15, 195(1990)に報告されたように、タンパク質とユビキチンとの 酵素的複合体化にも、調節機能がある。ポリペプチド型物質の好適な複合体化に よって、こうした活性物質の治療用途における突破口が見出された。公知の例と して、遅延作用型インシュリンの探索について述べる。インシュリンの治療上の 機能時間は、亜鉛塩またはプロタミンスルフェートの添加により、かなり長期化 することがわかっている。しかしながら、これらの添加物は様々な副作用を引き 起こす可能性がある。インシュリンの遅延放出を確実に行う好適な複合体を得る 試みが、多数の発明家によってなされたが、現在までのところ、実現していない 。 発明の説明 発明の分野 本発明の目的は、生体調節活性を有する新しい巨大環状物質を提供することで ある。ただし、この巨大環状物質は、上述の欠点を持たず、かつ疾患において障 害を受けた生体調節機構を回復させる物質である。この他、この活性物質は、公 知の薬剤の治療効果および生体内利用率を明らかに改良しなければならな。 この目的は、本発明に従って、請求項1〜39に記載の39個の特徴により達成さ れる。 図面の簡単な説明 図１：水中でのcom-(C₃O₂)₆の電子イオン化質量スペクトル 図２：アミン複合体com-(C₃O₂)₆・(NH₃)₂およびcom-(C₃O₂)₆・(NH₃)₆のエレク トロスプレー質量スペクトル 図３：com-(C₃O₂)_n〔n=558〕の多電荷単位のLC-結合エレクトロスプレー質量 スペクトル 図４：com-(C₃O₂H)₆₀およびcom-(C₃O₂H)₇₂のMALDI-質量スペクトル 図５：KBrペレット中のcom-(C₃O₂)₁₀の赤外スペクトル 図６：水中でのcom-(C₃O₂)₆のUV-VIS吸収スペクトル 図７：活性物質混合物のHP-ゲル浸透クロマトグラムおよびカラムの分子量標 準曲線 構造の説明 本発明に係る物質は、骨格構造が環状オリゴマー化により単純な無機亜酸化炭 素C₃O₂によって構成される化学的化合物である。亜酸化炭素O=C=C=C=O自体およ びそれから形成された非晶質重合体は、反応性かつ感水性の物質であるが、驚く べきことに、本発明者は、水に安定な環状オリゴマーである特定の亜酸化炭素構 造体を得ることができた。これらが水に安定であるための基本的な前提条件は、 これらの構造体がもはや亜酸化炭素の反応性集積C=CおよびC=O二重結合を含まな いことである。これは、本発明に従って次のように解決される。すなわち、数個 の（好ましくは、4個、6個、8個、または10個の）亜酸化炭素分子を環化し、縮 合4-ピロン環または縮合2-ピロン環を形成するとともに、更に、これらの構造体 を、以下のような二重歪型(double-strained)巨大環の形で閉環する。 基本的には、環状オリゴマー性亜酸化炭素から形成されたこれらの骨格構造体(f rames)は、有機化合物ではなく、亜酸化炭素自体と同じように無機化合物に属す ると考えられる。 環状オリゴマー亜酸化炭素骨格が閉環して巨大環を形成したときの化学式は、 次の通りである： com-(C₃O₂)_n 〔式中、ｎはC₃O₂の環状オリゴマー化度を表し、comは、これらの単位の結合の タイプ、すなわち、上記の特定した環状オリゴマー性巨大環タイプ（cyclooligo meric and macroring type）を示す記号である〕。 更に、本発明者は、環状オリゴマー性亜酸化炭素の原理的に可能な構造体を際 限なく多数閉環して巨大環を形成した場合、所定のｎ値をもつ極僅かの巨大環だ けが安定であることを見出した。これらの環状オリゴマー性巨大環状骨格構造体 の中で、次式： com-(C₃O₂)_n の数値ｎが、4、6、もしくは10に等しいか、または4、6、もしくは10の倍数であ るものが好ましい。また、より大きい好ましいｎ値を有する本発明に係る活性物 質は、より小さい環状オリゴマー性亜酸化炭素単位を複数結合した式com-(C₃O₂)_n で表される物質であると考えられる。本明細書中で規定されたこのような一連 の環状オリゴマー性巨大環型閉環亜酸化炭素の最初のメンバーは、特に重要であ り、これについては、以下で詳細に説明する。 環状六量体亜酸化炭素com-(C₃O₂)₆ マススペクトロメトリーにより実験的に決定されたモル質量M=408.19は、式C_{1 8} O₁₂に対応するとともに、亜酸化炭素のモル質量M=68.0 32の６倍に相当する。この構造に対して、数種の異性体が存在する可能性がある と考えられる。例えば、縮合2-ピロン環もしくは頭-頭縮合4-ピロン環、または ６個が交互に頭-尾縮合した4-ピロン環を有する以下に示された構造（スペクト ル特性および他の性質に基づいて、この構造が最も可能性が高いと推定される） が考えられる。 実際の電子分布は、おそらくはピロンおよびピリリウムと記された上記の限界構 造(limit structure)の間にあるが、溶剤および溶媒依存性の他の多少分極した 互変異性型電子構造をとる可能性もある。 ヒドロキシ-ピラン誘導体およびピリリウム塩誘導体 この他に、一般式(C₃O₂)₆・H_{1 〜6}で表される閉環六量体亜酸化炭素のいくつか の還元型誘導体の存在することが、質量スペクトルに現れている（図１）。水溶 液中では、本発明に係る活性物質はまた、ヒドロキシ-ピラン誘導体として存在 することもできる。水素が数個付加することにより生成する還元型ヒドロキシ- ピラン誘導体の一般式は、次の通りである： com-(C₃O₂)_n・H_m 〔式中、結合水素原子の数ｍは、環外酸素原子の数ｎによる制約を受けるため、 mは≦nとなる〕。 完全還元型ヒドロキシ-ピラン誘導体は、閉環六量体(cyclohexamer) の場合、次式： com-(C₃O₂H)₆ で表され、モル質量M=414.24を有し、更に、無機または有機の誘導体を形成する 上で特に重要であり、com-(C₃O₂H)₆と共に、閉環六量体系列中の基本単位となっ て、自己会合体および異なる誘導体の形成に利用される。閉環六量体亜酸化炭素 の4-ヒドロキシ-ピランcom-(C₃O₂H)₆の推定構造は、次のように表される。 一般的には、酸または塩基ならびに数種の容易に解離する塩などの強イオン性 薬剤の存在下で、アニオンAnおよびカチオンKaを含むピリリウム塩化合物が生成 すると考えられる。本発明に係る活性物質と、酸、塩基、または一般式Ka・Anの 塩化合物とから形成されるピリリウム塩誘導体の化学式は、次の通りである： com-(C₃O₂)_n・Ka n An n 〔式中、KaおよびAnは、ピリリウム骨格の双性イオン電荷の合計2nを中和するカ チオンおよびアニオンの対イオンである〕。ピリリウム塩化合物の構造は、次の ように表すことができる。ただし、対イオンは、水溶液中において厳密に局在化 されるわけではない。アニオンAnおよびカチオンKaの対イオンは、次のような形態で存在することがで きる： −個々の一様な無機または有機のカチオンおよびアニオンとして存在する場合、 例えば、すべてのKa=Na⁺かつすべてのAn=Cl^-の場合； −無機または有機のカチオンおよびアニオンの混合物として存在する場合、例え ば、これらのイオンの生理学的濃度に対応した関係で存在する場合； −両方の対イオンを含有する双性イオン化合物自体として存在する場合、例えば 、アミノ酸、ベタイン、イオン性石鹸などとして存在する場合。 本発明に係る活性物質のピリリウム塩誘導体のほとんどは、水に非常によく溶 ける。クロリドまたはスルフェートなどのアニオンを有するピリリウム塩のアセ トンまたはエタノールに対する溶解性は少し低いが、本発明では、このことを利 用して、本明細書中に記載の活性物質の単離を行う。生理学的な液体中では、活 性物質の双性イオン電荷は、周りに存在するアニオンおよびカチオンによって中 和される。従って、特定のイオンが化学的に結合した塩化合物であると言うより も、対イオンが統計的に分布した状態にあると言う方が、より適切である。 金属イオン、好ましくは、Fe(III)、Sb(III)、Cd(II)、pt(II)、Au(III)、Pb( IV)などの遷移金属イオン、を用いて形成された特定の複合体を使用して、本発 明に係る活性物質の単離および検出を行うことができる。また、複雑な無機また は有機のアニオン、例えば、SCN^-、BF^4-、Cr₂O₇ ^2-、MnO^4-、ピクレート、ライネ ケートなど、を用いて形 成された化合物を使用して、単離および検出を行うこともできる。 付加物、複合体 無機元素または有機化合物との分子付加物の形成は、本発明に係る環状オリゴ マー巨大環型環化亜酸化炭素(cyclooligomeric and macroring closed carbon s uboxide)の強い会合力によって促進される。有機化合物との化学量論的または非 化学量論的付加物は、複合体と呼ばれる。環状オリゴマー巨大環型環化亜酸化炭 素は、アンモニア、有機アミン、アミノ酸、ペプチド、またはアミン官能性を有 する他の物質、の数個の分子（六量体の場合、好ましくは２個〜６個の分子）と 安定な付加物を形成することができる。天然アミノ酸、生体アミン、およびアミ ン官能性を有するそれらの誘導体は、特に、本発明の範囲内に含まれる。これら のアミン付加物の一般式は、次の通りである： com-(C₃O₂)_n・(R¹R²R³N)_m 〔式中、R¹、R²、およびR³はそれぞれ、水素原子または有機残基であり、mは1〜 nの数であるが、nには先に規定した意味が含まれる〕。 式com-(C₃O₂H)₆・(NH₃)₂で表される閉環六量体のジアミン付加物のモル質量は 、ESマススペクトロメトリーを用いて実験的に求めたところ、M=442.2であり、 式com-(C₃O₂H)₆・(NH₃)₆で表されるヘキサミン付加物については、M=510.4であ った（図２）。ジアミン付加物の場合、２個のアンモニア分子またはアミン分子 が、恐らくピロン環のカルボニル基に水素結合によって結合する。ヘキサミン複 合体の場合、巨大環構造の内部空隙は既に利用されているので、これらはまた、 ホスト‐ゲスト複合体とも考えられる。 ホスト‐ゲスト複合体 本発明に係る活性物質の第２の特に重要な構造特性は、縮合ピロン環または縮 合ヒドロキシピラン環が更に、本発明に係る巨大環、好ましくは円筒状の巨大環 、を形成することによって得られる。この環構造の分子サイズは、本発明に係る ホスト‐ゲスト複合体を本発明に従 って形成するのに好適な大きさである。「ゲスト」としては、円筒状の空隙中へ 立体的に嵌入するかおよび／または特定の結合力によりその周りに結合する元素 、小さい分子、または分子断片が考えられる。閉環六量体亜酸化炭素の円筒状巨 大環構造の形状および寸法は、次の図から得られる。 カリウム、アンモニウム、銀、もしくはルビジウムなどのカチオン、またはフル オリド、クロリド、ホルメートもしくはロダネートなどのアニオンは、内径2.9 Å〜3.2Å、高さ4.9Å〜5.2Åの閉環六量体の巨大環の円筒状内部空隙中にうま く嵌入する。本発明に従って適用する場合、イオンまたは中性の元素または分子 は、com-(C₃O₂H)₆単位の円筒状巨大環構造の空隙中に存在し、かつこれにより包 容される。マススペクトロメトリーにより測定されたモル質量は、各成分の合計 に対応するが、これによって、これらのホスト‐ゲスト複合体は独立した化合物 であることが実証される。本発明者は、閉環六量体亜酸化炭素と、より小さい無 機または有機の化合物（一般にYで表す）〔例えば、アンモニア、ヒドロキシル アミン、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、ジクロロメタン、 クロロホルム、アセチルクロリン、蟻酸、酢酸、ならびに数種のアミノ酸および 炭水化物〕とのホスト‐ゲスト複合体が存在することを、実験的に確かめた。本 発明によれば、物質Yまたはその構造の一部分は、本発明に係る活性物質の内部 空隙中に「ゲスト」として存在する。これは、次の図のように考えられる。 この「包容」を介して、物質Yの特定の性質が「マスク」され、本発明により 新たに得られた性質（例えば、改良された膜輸送や生体内利用能）が利用可能と なる。 様々なモル質量の活性物質 M≦2,000ダルトン 式com-(C₃O₂)_n〔式中、ｎは、4、6、10、12、または18である〕を有する上述 の環状オリゴマー亜酸化炭素、もしくは式com-(C３０２H)ｎを有するヒドロキシ ‐ピラン型の環状オリゴマー亜酸化炭素、およびモル質量がこの限界未満である これらの誘導体、付加物、ホスト‐ゲスト複合体は、この低モル質量の範疇に属 する。また、２個〜４個の閉環六量体単位から形成された自己会合体も、低モル 質量活性物質と見なされる。モル質量M=816Dのcom-(C₃O₂)₁₂およびモル質量M=1, 224Dのcom-(C₃O₂)₁₈が存在することが本発明者により確認されたが、これらにつ いても同じように説明できる。 M＞2,000 まず最初に、この範疇に分類される活性物質は、不均一なモル質量を有する化 合物の混合物として現れる。しかしながら、より詳細な分析を行ったところ、原 理的には無限に多くの候補化合物が考えられるが、極僅かの化合物（すなわち、 特定の分子サイズを有する化合物）だけが調製および同定できることが分かった 。 水‐アセトニトリル溶液中の活性物質のLC-MSエレクトロスプレー 質量スペクトル（図３）は、一連の多電荷イオン（m/z）が存在することを示し ている。強度の最も大きい成分A31のm/z測定値=1,225.7Dalは、式com-(C₃O₂)₁₈ のプロトン付加分子に正確に一致する。対応する重合体のモル質量の実験値を、 式M=n[m/z-1]（J. R. Chapmann著、Practical Mass Spectrometry, J. Wiley, N ew York, 1993 の202ページ）を用いて求めると、M=31×1,224.6=37,962.5Dalと なる。 同定されたいくつかの化合物のモル質量は、次の表から選ぶことができる。＊ 既知の標準との比較 ＊＊ MALDIによる３回の実験の測定値の平均値 測定は、MALDIマススペクトロメトリー（MS）、ゲル浸透クロマトグラフィー （GP）、またはポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を用いて行った。MALD Iマススペクトロメトリーから明らかなように、n=60および特にn=72に対応する 化合物が、他のすべての化合物よりも明らかに高濃度で存在する。この方法で測 定されたモル質量は、ヒドロキシ‐ピランオリゴマーの式com-(C₃O₂H)_nにおける n=60およびn =72と非常に良い精度で一致する。これらの化合物は、n=60またはn=72の環状オ リゴマーであるか、または閉環六量体の基本単位{com-(C302)６}ｓのs=10倍量ま たはs=12倍量の自己会合体であると考えられる。これらの化合物com-(C₃O₂H)₆₀ およびcom-(C₃O₂H)₇₂の物理化学的性質および分光学的性質は、構造の対称性が 高いことを示唆しており、例えば、10個、12個、またはそれ以上のcom-(C₃O₂H)₆ 単位が球状に配置されたものとして説明することが可能である。また、五角形ま たは六角形の対称性を有するサンドイッチ型配置により、多数の双性イオンの電 荷の中和を説明することができる。 ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）による測定では、M〜5kDの領域に強 いバンドが現れ、場合により更に、モル質量値約10kD、12.5kD、15kD、30kD、60 kD、および120kDの位置にラインが現れた。これらの数値は、オリゴマー化度n=7 2、144、180、216、432、864、および1,728と許容しうる精度で一致する。大変 不思議なことに、これらの数値は、数値６および12の特定の倍数になっている。 ゲルのポリアクリルアミド濃度が16.5%の場合、際だって強いバンドがM〜5kDの 領域に存在する。しかしながら、同じサンプルを異なるゲル（例えば、ポリアク リルアミドの含有量がより少ないゲル）に適用すると、主バンドは、２倍の大き さの領域（〜10kDの領域に）に現れることがある。この異常は、活性物質に特異 的な会合‐解離平衡により説明される。 会合平衡および膜輸送 この他、本発明者は、より大きい分子量をもつ化合物の透析および限外濾過に おいても、特定の異常を観測した。所定の時間透析を行った後、大きな活性物質 （通常は膜非透過性である活性物質）が膜の両側に検出された。これについては 次のように説明される。すなわち、次の式１に従って、より大きい会合体が解離 して、より小さい膜透過性の形態になり、これらが外側の透析液中で再び合体し て、より大きな自己会合体を形成する。透析時間を長くすると、膜の両側で平衡 が進行する。 {com-(C₃O₂)_n}_s ⇔{com-(C₃O₂)_n}_s-p＋ {com-(C₃O₂)_n}_p (1) 式中、s=2、3、4、5、6、10、または12、あるいはこれらの数の倍数であり、p<s である。単純な環状オリゴマーと、それらが複数会合したより大きいモル質量を 有する誘導体との平衡は、多数の要因に依存し、例えば、溶剤の性質、pH値、ア ルカリ金属イオンおよび他のイオンの濃度、温度、ならびに溶液中に存在する他 の物質との複合体により影響を受けることがある。平衡(1)により、本発明に係 るより大きいモル質量の活性物質が、通常は侵入が阻害される細胞空間中へ浸透 することが可能となる。膜の外側の空間において、本発明に係る活性物質は、よ り大きなcom-(C₃O₂)_n化合物として存在できる。式(1)による解離を介して、これ らの活性物質は、膜を通過することができ、従って、膜の内側の空間に到達し、 そこで会合により再び形を変えてより大きな化合物になることができる。 安定性にもよるが、より大きな自己会合体はまた、活性物質の生理学的貯蔵お よび輸送を行う働きするため、病状発現場所まで到達することができる。これら の自己会合体は、到達場所において、それ自体としてまたは他の活性物質との複 合体として、生体調節による治療効果を呈する。膜非透過性物質Yの「マスク型 」膜輸送は、本発明に従って、この物質を活性物質の円筒状内部空隙中に「隠蔽 」することに よって行うことができる。 分光学的特性決定 一般的には、本発明に係る活性物質の分子スペクトルは、バンドが比較的少な く、対応する構造の対称性が高いことと一致する。KBrペレット中で測定された 赤外スペクトル（図５）は、3500〜3000cm^-1、1680〜1620cm^-1、1400〜1385cm^-1 、1210cm^-1、1100cm^-1、および830〜600cm^-1に数種の特徴的な吸収バンドを示す が、このうちの1660cm^-1の強いバンドは、4-ピロン環の「環呼吸振動」と解釈さ れる。1720cmにIR吸収バンドが存在しないことから、2-ピロン構造である可能性 はない。 UV-VISスペクトルの最も強い吸収極大は、約190nmにあり、約220nmおよび265n mに肩を有する（図６）。明らかなように、共役二重結合から期待される約320nm の強い吸収の代わりに、240nm〜400nmの非特異的ななだらかな吸収が存在する。 しかしながら、本発明者は、いくつかの付加物に対して310nm〜340nmの励起放射 線を照射すると400nm〜450nmの領域に蛍光が発せられるのを見出した。このこと は、より強い遷移（ただし、対称性に関しては禁制遷移）が存在することを示唆 する。 分析反応 式com-(C₃O₂)_nで表される活性物質は、薄層クロマトグラフィーにおいて五塩 化アンチモンまたはリーベルマン‐ブルヒアルト試薬による陽性反応から同定す ることができる。すぐ使用できるシリカゲル-60プレート（Merck）および1-プロ パノール：エチルアセテート：20%酢酸の比が60:10:30である溶離混合液を用い て分離を行う。スプレー試薬として、四塩化炭素を溶剤とした五塩化アンチモン の飽和溶液、または2mlの無水酢酸および2mlの濃硫酸を20mlの無水エタノールに 溶解した混合液を使用する。スプレーの後、120℃において約10分間、プレート を加熱し、λ=365nmのUV光を用いて調べる。蛍光を発するス ポットは、本発明に係る活性物質が存在することを示す。 アミン付加物の形態の活性物質は、陽性のニンヒドリン反応を呈するが、この 反応を利用して、分析的検出または分光学的アッセイを行うことができる。この 反応はまた、ほとんどのアミノ酸およびペプチドによっても起こるので、分析に 利用する場合は、クロマトグラフィーによる分離を行った後でのみ有効である。 薄層クロマトグラフィーの場合、すぐ使用できるシリカゲル-60プレート（Merck ）および溶離剤として1-ブタノール：エタノール：水の比が50:30:20(v/v)であ る混合液を使用する。スプレー試薬として、エタノールを溶剤とした0.1%ニンヒ ドリン溶液（ただし、この他に、2%(v/v)の氷酢酸および0.5%(v/v)のsym-コリジ ンを含有する）を使用する。Rf領域0.32〜0.45の黄色のスポットは、本発明に係 るいくつかの活性物質が存在することを示す。 本発明に係る活性物質のヒドロキシ‐ピラン基は、フォリン‐チオカルト試薬 により僅かに陽性のフェノール反応を呈するが、この反応を利用して、同定を行 うことができる。タンパク質測定のための既知のローリー法も、この反応に基づ いているため、クロマトグラフィーによるタンパク質またはフェノール性物質か らの分離を最初に行わなければならない。 本発明に係る物質の分子サイズにより分析的分離を行うために、HP-GP法（高 性能ゲル浸透クロマトグラフィー）を使用する。この分離は、好ましくは、TSK G-2000 SW（Toso-Haas）カラム600×7.5mm中で、50mMホウ酸緩衝溶液（pH=8.1） を溶離剤として用いて行う。混合物中の活性物質成分のモル質量は、保持体積の 測定値（図７）を用いて検量図（図7A）から求める。既知の分子量のポリエチレ ングリコール標準を用いて検量線を作成する。 成分の極性によりクロマトグラフィー分離を行うために、逆相のHPLC法を利用 するが、好ましくは、固相としてNucleosil ５Ｃ１８カラム（Macherey Nagel） を使用し、好ましくは、溶離剤として10%〜90%の濃度勾配をもつアセトニトリル の水溶液を使用する。 本発明に係るピリリウム塩誘導体は、対イオンの既知の分析反応（例えば、銀 イオンによるハロゲン化物イオンの沈殿、またはバリウムイオンによるスルフェ ートイオンの沈殿）を呈することが特徴である。 本発明に係る活性物質は、ウワバイン、ジゴキシンなどの強心性ステロイド配 糖体の抗体との高感度の交差反応を呈する。これらの有機化合物はこのままでは 免疫原性がないので、最初に、BSAまたはアビジンなどのより大きなタンパク質 分子と化学的に結合させる。これらの複合体をウサギに数回投与すると、特異的 な抗ウワバイン抗体または抗ジゴキシン抗体が得られる。これらの抗体と本発明 に係る活性物質との交差反応は、酵素様イムノアッセイELISAまたはラジオイム ノアッセイ(RIA)の方法を用いて調べられる。これらの技法を用いると、非常に 少量の活性物質のアッセイを高感度で行うことができる（pg領域）。ヒト体液の アッセイは、心臓疾患に特異的な内科療法においてのみ利用される強心配糖体の 存在により妨害を受けることがある。 より大きなモル質量（M＞2.0kD）を有する本発明に係る活性物質は、免疫グロ ブリンとの顕著な特異反応を示す。ヒトまたは動物の免疫グロブリンとのこうし た免疫特異的沈殿は、分光測光、およびアガロースゲル中でのオクタロニー法ま たはLaure11による免疫電気泳動法によって調べられる。正常な血清または病理 的血清から得られた免疫グロブリンとの反応に顕著な差異があれば、種々の免疫 疾患の診断にこうした反応を適用することができる。 O-アルキルおよびO-アシル誘導体 Rで表される残基の無機または有機の分子と、基本骨格の酸素原子との結合を 介して、一般式： com-(C₃O₂)_n・R_m で表される無機および／または有機の誘導体または複合体が形成される。ただし 、R=無機または有機の分子、および／または有機の残基、好ましくは、メチル、 エチル、アセチル、ベンジル、ならびにm≦2nである。 製造 本発明によれば、亜酸化炭素（これに関するかぎり、公知の方法で製造するこ とができる）を出発原料として使用し、本発明に係る巨大環状物質を合成により 製造することができる。 本発明によれば、分別蒸留により精製されたC₃O₂を、光化学的にまたは好適な 助剤を用いて環状オリゴマー誘導体へ転化する。亜酸化炭素の合成は、従来の方 法を用いて、五酸化リンの存在下でおよび／または加熱により、マロン酸または その誘導体などのより小さいジカルボン酸から２倍量の水を除去することにより 行う。しかしながら、この方法では、望ましからぬ非晶質重合体亜酸化炭素の生 成が進行する。これとは対照的に、本発明者は、非プロトン性溶剤中で酸または そのエステルの熱的脱水を行う方が、本発明の活性物質の形成にははるかに好適 であることを見出した。本発明によれば、酸または対応する誘導体を、加熱およ び撹拌を行いながら、非プロトン性溶剤（好ましくは、ジメチルホルムアミドま たは無水酢酸）に溶解する。この混合物を120℃〜150℃まで加熱するが、この際 、数分で、既にC₃O₂の生成が見られる。このようにして得られた亜酸化炭素を、 本発明に係る環状オリゴマー活性物質に変換するために、本発明では、光化学的 活性化を行うかおよび／または好適な助剤の添加を行う。巨大環構造の形成のた めの一種の鋳型として働く物質が、効果的な助剤であることが分かった。好まし い助剤は、巨大環com-(C₃O₂)₆の内部空隙（内径2.9Å〜3.1Å）に対応した半径 を有するイオンの安定な塩化合物である。好ましいイオンは、ルビジウム（2.94 Å）、カリウム（2.66Å）、アンモニア（2.86Å）、およびフッ化物（2.72Å） である。 本発明者は、いくつかの酵素（好ましくは、「ポリケチドシンターゼ」（PHS ）のクラスに属する酵素）を利用して、本発明に係る亜酸化炭素の環状オリゴマ ー巨大環型環化誘導体を合成できることを見出した。数種のカルボン酸誘導体（ 好ましくはマロン酸、好ましくはマロニル‐補酵素Aとして）を利用した。この マロニル補酵素Aは、ビオチ ンの存在下で、アセチル‐補酵素AおよびCO₂から容易に調製することができる。 本発明によれば、本発明に係る生体調節活性物質はまた、一酸化炭素を出発原 料として得られるいくつかの大量生成物の副産物から単離できる。本発明者は、 驚くべきことに、一酸化炭素または合成ガスを出発原料として工業的に製造され る数種の既知の有機合成生成物の中に、本発明に係る活性物質が少量（ただし、 検出可能な量）含まれる場合があることを見出した。このことは、COおよび合成 ガス中に少量の亜酸化炭素が含まれると考えることにより説明できる。これらの 大量生成物中に含まれる本発明に係る極めて少量の活性物質を増量するために、 分別蒸留を適用する。２部〜60部（他に記載のない限り、「部」は「重量部」で ある）、好ましくは20部、の水または水性緩衝溶液を、100部の出発原料（好ま しくは、合成ガスから製造された工業用メタノール）に添加し、蒸留塔に通して この混合物から最初にメタノールを留去する。残りの水相では、本発明に係る活 性物質の含有量が増大する。新しいメタノール相を添加して蒸留を多数回繰り返 すことにより、本発明に係る活性物質がかなりの濃度で得られる。本発明に係る 活性物質は、分別蒸留を行うか、または固相への吸着（好ましくは木炭または逆 相シリカ）および溶剤混合液（好ましくは、水‐エタノール）を用いた脱離を行 うことにより、この溶液から単離される。 本発明によれば、本発明に係る活性物質はまた、植物抽出液、植物細胞培養液 、または細菌培養液から単離することもできる。多数の植物種を調べたが、こう した植物種の中では、本発明に係る活性物質はそのままでは存在せず、その代わ りに、他の未定義の複合体（好ましくは、毒性の植物成分）として存在する。好 ましい粗製原料の供給源は、アルカロイドまたは心毒性配糖体などの毒性成分を 含有する植物種である。また、比較的高含有量のサポニンまたはタンニンを含む 植物種も、本発明に係る活性物質の単離に好適な出発原料を提供する。根、根茎 、茎、葉、樹皮、もしくは種子、またはこれらに対応した植物細胞培養液（既知 の方法を用いてカルス生成により開始される）は、 植物供給源として好適である。 分子の小さい亜酸化炭素誘導体分子、好ましくはcom-(Ｃ３０２)ｎ、の製造が 望まれる場合、本発明に従って以下の方法を適用する。すなわち、10部の抽出剤 （好ましくは、30%のアルコール‐水混合液）を、ヘキサンで脱脂した乾燥植物 材料１部に添加し、更に、軽く加熱しながら24時間組織解離する。この処理を数 回（好ましくは、2〜3回）繰返し、アルコール性抽出液を合わせて濃縮する。濃 縮されたチンキに、チンキを基準に0.01%〜5%、好ましくは1%の量の酸（好まし くは、酢酸または塩酸）を添加し、その後、煮沸し、短時間（好ましくは、10分 間〜30分間）、80℃〜100℃に保つ。冷却した溶液を、塩基（好ましくは、NH 4 OH）で中和し、液体100部あたり１部〜20部、好ましくは５部〜10部の木炭で処 理する。濾過した木炭を再び水で洗浄し、更に濾過する。減圧下で乾燥した木炭 を、沸騰させた抽出剤（好ましくは、1:1エタノール‐水）で処理する。この処 理を２回繰り返す。このようにして得られた本発明に係る活性物質の溶液は、安 定であり、長期間の保存に適す。また、溶液を合わせて濃縮し、凍結乾燥させて もよい。固体残渣の精製は、再結晶（好ましくは、アルコール‐エーテル混合液 から）を繰り返すことにより行う。このようにして単離された付加物は、長期間 保存しても安定である。 高分子環状オリゴマー亜酸化炭素化合物の製造が望まれる場合、本発明に従っ て以下の方法を適用する。すなわち、５部〜20部、好ましくは８部のメタノール を、石油エーテルで脱脂した乾燥植物材料１重量部に添加し、更に、軽く加熱し ながら１時間〜36時間、好ましくは16時間組織解離する。この処理を数回（好ま しくは、２回）繰返し、抽出液を合わせて濃縮する。濃縮した溶液を、水と混和 する有機溶剤（好ましくはアセトンまたはエタノール）に、1:20〜1:2、好まし くは1:8の比で添加する。生成した沈殿を濾過または遠心により分離し、最小量 の水または緩衝溶液に溶解する。これらの全処理を１回〜５回（好ましくは２回 ）繰り返す。こうして得られた粗生成物を最小量の水（pH9〜10.5の緩衝液でア ルカリ性にしたもの）に溶解し、膜（好ましくは、 排除限界が3kDの膜）を使用して、蒸留水（pH9〜10.5の緩衝液でアルカリ性にし たもの）に対する透析を行う。膜の外側の水を数回交換しながら、より長い透析 を行った後（好ましくは３日間〜４日間の透析を行った後）、膜の内側の溶液を 濾過し、注意深く濃縮し、更に、凍結乾燥した。 本発明によれば、イオン交換機能を有する樹脂、ゲル、または改質多糖などの 中性吸収剤またはイオン性固体相を利用して、様々なモル質量を有する本発明に 係る活性物質の単離を行う。本発明に係る活性物質が双性イオンの特性を有する ため、アニオン交換相−ならびにカチオン交換相−または混合床交換相を適用で きる。最初に、野菜または他の材料の抽出物をイオン交換相で処理する。成分が 固体相に結合した後、溶出液中に通常の内容物（炭水化物、アミノ酸）が検出さ れなくなるまで、過剰の中性または弱酸性の溶離剤（好ましくは、水または緩衝 溶液）を用いてカラムをよく洗浄する。カチオン交換相からの脱離は、希鉱酸（ 好ましくは、希塩酸）または希有機酸（好ましくは、希蟻酸または希酢酸）を用 いて行う。アニオン交換相に結合した本発明に係る活性物質の放出は、希アルカ リ（好ましくは、0.1モル〜0.3モルの水酸化アンモニウム溶液または水酸化カリ ウム溶液）を用いて行う。逆相シリカからの脱離は、溶剤（好ましくはメタノー ルまたは水性アセトニトリル）を用いて行う。 本発明によれば、中性相（例えば、シリカゲル、ポリアミド、または種々の多 糖）からの脱離は、0.2%〜5%、好ましくは1.2%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS) 溶液または１モル〜12モル、好ましくは８モルの尿素溶液を用いて行う。 本発明によれば、本発明に係る様々なモル質量を有する活性物質の分離および 精製は、ゲル濾過によりまたは膜透析および限外濾過により行う。本発明に係る 活性物質をそれらの分子サイズにより分離するために、合成固相（好ましくは、 Sephacryl 200、Sephadex LH-20、またはTSK HW-60）を用いてゲルクロマトグラ フィーを行う。溶離剤として、弱塩基性の緩衝溶液（好ましくは、酢酸アンモニ ウムもしくは重 炭酸アンモニウム）または0.01モル〜0.3モル（好ましくは0.15モル）のNaCl溶 液もしくはKCl溶液を使用する。これらの分離方法では、分子量のより大きい化 合物が最初に溶離し、com-(C₃O₂)₆またはcom-(C₃O₂)₁₀などのより小さい化合物 は遅れてカラムから流出する。 本発明によれば、野菜の成分を含む本発明に係る活性物質から形成された数種 の複合体も、直接単離することができる。ほとんどが粘着性で黄掲色のこれらの 複合体は、有機溶剤（好ましくは、ジエチルエーテルを含むアセトン）を利用し て、濃縮されたメタノール性植物抽出液から沈殿させることができる。数回（好 ましくは、３回〜５回）の沈殿を繰返すことにより、こうして得られた複合体は 比較的均一なものとなる。本発明によれば、次のような塩析法を用いて、本発明 に係る複合体の切断を行うことができる。複合体を水に溶解し、更に、最終溶液 を基準に、5%〜50%(w/w)、好ましくは15%の量の無機塩、好ましくは硫酸アンモ ニウムを添加する。この溶液に、有機溶剤、好ましくはn-ブタノールまたは2-プ ロパノール、を添加し、これを強く振盪する。相を分離させ、この処理を２回〜 ５回、好ましくは３回繰り返す。ただし、この際、水性相のpH値を酸を用いて１ に調節する。本発明に係る切断処理を更に行った後、複合体を水に溶解し、アン モニアを用いてpH値を調節してpH10とし、次いで、撹拌しながら、この溶液を塩 素化溶剤（好ましくはジクロロメタンまたはクロロホルム）に1:0.5〜1:6、好ま しくは1:2の比で添加する。強力に振盪することにより生成した非常に安定で泡 の多いエマルションを分離し、減圧下でエマルションから有機溶剤を除去する。 この他、本発明に係る活性物質は、細菌に由来する出発原料から単離すること もできる。このために、種々のタイプの細菌培養液、好ま またはEscherichia coliを、本発明に従って使用することができる。最初に、物 理的処理（好ましくは、超音波処理）および希鉱酸（好ましくは希塩酸）を利用 した加水分解処理を行う。濾過された加水分解物を必要に応じて中和し、固相（ 好ましくは順相または逆相のシリカ ゲル）に通す。アミノ酸、炭水化物、および他の単純な加水分解生成物が溶出液 中に検出されくなくなるまで、種々の中性溶離剤を用いて固相を処理する。本発 明に係る活性物質の脱離は、希アルカリ（好ましくは、0.1モルから0.2モルの水 酸化アンモニウム）を用いて、または逆相の場合は、メタノールもしくは水性エ タノールもしくはアセトニトリルを用いて行う。 動物の組織および組織液には、未定義の複合体として本発明に係る活性物質が 少量含まれる場合がある。本発明によれば、注意深く凍結乾燥された有機液体（ 好ましくは尿）の組織の有機抽出を最初に行う。本発明に係る活性物質は、選択 的アフィニティークロマトグラフィー法を用いて、濃縮された有機抽出液から単 離および精製する。この目的のために、既知の強心配糖体（好ましくは、ウワバ インまたはヘレブリン(hellebrin)）を、固相（好ましくはSepharose）に共有結 合させる。このアフィニティー相は、濃縮された粗製材料溶液からの本発明に係 る活性物質を保持する。弱酸性または中性の緩衝溶液を用いてカラムを多数回洗 浄した後、酸性またはアルカリ性の緩衝溶液を用いて本発明に係る化合物を放出 させる。 生体調節用途 本発明者は、本発明に係る活性物質がナトリウムポンプとしても知られるNa⁺, K⁺-ATPアーゼ酵素の活性を効果的に制御することを見出した。広範に分布するこ の酵素は、いわゆる能動膜輸送により、最も重要なアルカリ金属イオンの細胞外 および細胞内の濃度を制御する。このために必要なエネルギーは、この酵素の活 性と直接的に結びついたATPの加水分解によって供給される。本発明に係る活性 物質は、この酵素の複合体の活性を制御することができる。この制御の方向およ び強さは、本発明に係る活性物質の濃度およびモル質量に依存する。存在するア ルカリ金属イオンおよび他の無機イオンの性質および濃度は、この制御作用に実 質的な影響を与える可能性がある。本発明に係る活性物質を赤血球懸濁液に添加 したところ、細胞外Na濃度の増大、 すなわち、ナトリウムポンプの活性化が観測された。これとは対照的に、本発明 に係るより小さいモル質量の活性物質が特定の濃度にあるときに、Na⁺,K⁺-ATPア ーゼ酵素の抑制がin vitroで観測された。 ウワバインまたは他の強心配糖体の中毒性副作用の軽減は、本発明に係る活性 物質をこれらの配糖体と併用した場合にも観測された。本発明に係る活性物質を 、0.02〜2モル／配糖体１モルのモル比、好ましくは1:1のモル比で添加すると、 ヘレブリンのLD₅₀値が著しく高くなるが、これは急性毒性の低下を意味する。更 に、本発明に係る活性物質は、経験的に確立されたものであるが、数種の他の必 須酵素（例えば、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ホスホキナーゼ、および他 の酵素）の活性を制御することができる。いずれの場合からも示唆されるように 、本発明に係る活性物質は、Na⁺,K⁺-ATPアーゼ酵素の内在性リガンドとして利用 可能である。 免疫調節 本発明者は、本発明に係る活性物質に対して数種の免疫調節作用を見出した。 これらの機構はまた、部分的には、上述したNa⁺,K⁺-ATPアーゼの制御により説明 することができる。なぜなら、この酵素は、多数の免疫学的過程に実質的に関与 するからである。 更に、本発明に係る活性物質の新しい免疫調節作用は、これらの物質がFc受容 体に対して特異的な親和性を有するという点にも見られる。これらの受容体は、 種々の免疫細胞に係留されており、それらの占有状態または非占有状態が、これ らの細胞の活性を制御するうえで基本的な役割を果たしている。臨床試験におい て、本発明に係る活性物質は、抗体依存性細胞障害作用（ADCC）に関して、病理 学的に活性化されたキラー細胞（K細胞）および他のリンパ球の活性を著しく抑 制した。これとは対照的に、自発的細胞障害作用（SCMC）に関するナチュラルキ ラー細胞（NK細胞）の活性は、本発明に係る活性物質により、様々な影響を受け た。例えば、リウマチ性疾患の患者では、病理学的に過剰刺激された自発的細胞 障害作用は、明らかに抑制される。健康診断 の被検者では、自発的細胞障害作用は、極僅かに影響を受けるにすぎない。こう した臨床データから、本発明に係る活性物質は、病理学的な自己攻撃過程を抑制 するため、リウマチ疾患の原因療法、または組織もしくは器官移植拒絶反応の防 止に好適であることが分かる。ここで特筆すべき重要な点は、これらの効果のす べてが、μg/kg程度の極めて少量の活性物質を用いて得られることである。一方 、本発明に係る化合物の毒性は、極めて低い。従って、本発明をヒトの治療に適 用するにあたり、最も重要な薬物毒性学上の前提条件が満たされる。本発明に係 る活性物質をリウマチ疾患の治療に使用すると、この他にも明らかな利点が得ら れる。小さい環状オリゴマーcom-(C３０２)ｎ（好ましくはn=6）およびその付加 物は、極めて強い鎮痛作用および鎮痙作用を呈する。この鎮痛作用および鎮痙作 用は、局所投与を行った直後に現れ、リウマチ疾患の治療に適用するうえで重要 な利点となる。痛みや痙攣を迅速に軽減する働きは、通常の免疫調節を回復させ れば、長期間持続する。本発明に係るより大きい分子質量の活性物質は、免疫刺 激作用とそっくりの顕著な非特異的作用を示すことができる。このことは、細菌 感染に関する動物実験において確認されており、疑う余地はない。活性物質で処 理された動物は、致死量のPseudomonas aeruginosaを投与した場合、対照グルー プの動物よりも生存率がかなり長い。 本発明に係る生体調節活性物質は、純粋な物質としてまたは物質の混合物とし て別々に投与することもできるし、あるいは医薬品組成物の形態で投与すること もできる。ただし、後者の組成物には、医薬品として安全な１種および／または 数種のアジュバント、および／または本発明に係る物質以外の担体、が含まれて いてもよい。こうした物質としては、0.9_%塩化ナトリウム溶液、1_%〜5_%グルコー スまたはフルクトース溶液、カルボキシメチルセルロース、ジャガイモデンプン 、ラクトース、ラノリン、マンニットステアリン酸マグネシウム、1,2-プロピレ ングリコール、グリセリン、セチルステアリルアルコール、ニパギン（nipagin ）、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクが挙げ られる。場合に応じて、こうして製造された組成物へ、医薬品として有効な他の 物質またはアジュバントを更に添加することができる。これらのガレノス製剤と しては、非経口注射、筋肉内注射、静脈注射、皮下注射、関節周囲もしくは関節 内注射；錠剤、カプセル剤、もしくは滴剤などによる経口投与；または軟膏、ク リーム、ゲル剤、もしくは坐薬などによる外用施用、に好適な製剤すべてが含ま れる。 以下の実施例の中で本発明を更に説明する。 実施例１ 亜酸化炭素からの合成による製造 水冷式還流冷却器を備えたガラス反応器中で、油浴（80℃）を用いて加熱し、 更に撹拌を行うことにより、マロン酸15部を無水酢酸80部に溶解する。還流冷却 器から延長して２つのドライアイス冷却トラップを連結し、発生する揮発性化合 物を回収する。全量の酸が溶解した後、フッ化ルビジウム0.2部を添加し、250W 太陽灯を用いて光化学線を照射する。油浴温度は130℃〜150℃まで上昇し、反応 混合物は暗褐色になる。高減圧下で揮発性である亜酸化炭素およびその誘導体を 、ドライアイスおよびアセトンで冷却されたトラップ中で凝縮させる。分別減圧 蒸留により凝縮物を精製する。こうして得られた活性成分の精製および分析を、 既知のクロマトグラフィー法を用いて行う。 実施例２ 工業用メタノールからの単離 pH9の0.1モル酢酸アンモニウム緩衝溶液250部を、合成ガスから製造されたメ タノール1000部に添加し、蒸留カラムを利用して、この混合物から最初にメタノ ールを除去する。残存する水相にメタノール1000部を再び添加し、メタノールの 蒸留を３回〜４回繰り返す。最終的に残存する水相を注意深く濃縮し、木炭で処 理する。濾別および空気乾操された木炭50部を、80%(v/v)エタノールを含む水40 0部を用いて80 ℃〜90℃で処理し、30分間温浸を行った後、熱時濾過する。抽出を２回繰り返す 。エタノール性抽出液を合わせて、注意深く濃縮および凍結乾燥を行う。 実施例３ Helleborus種からの単離 Helleborus purpurascens（Ranunculaceae科）の根および根茎を乾燥させて粗 く刻んだものを、ヘキサン120部で脱脂し、続いて、塩化メチレン80部で予備抽 出する。抽出剤を除去した後、残渣を乾燥させ、30%(v/v)エタノールを含む水20 0部を用いて、室温において24時間浸溶を行う。抽出を２回繰り返し、続いて、 抽出物を合わせて濾過し、減圧下で濃縮する。こうして得られた抽出物250部を 濃塩酸３部に添加し、95℃において20分間加熱する。中和後、少量の木炭で処理 し、濾過する。濾液を減圧下で濃縮して８倍容量のアセトン中に注ぎ、沈殿物を 遠心して最小量の水で溶解し、更に、アセトンを用いて２回〜３回繰返し沈殿さ せる。沈殿物を最小量の0.1モル塩化ナトリウム溶液に溶解し、TSK HW-60を充填 したゲルカラム上へ供給する。0.125モルアンモニア水（10%(v/v)2-プロパノー ルも含まれる）を用いて、5cm／時の流量で溶離させる。230nmにおける光学濃度 を測定することにより、検出を行う。 実施例４ Vitis viniferaの種子からの活性物質の単離 Vitis vineferaの種子を乾燥および粉砕したもの25部を、pH=9.6の0.5モルホ ウ酸緩衝液150部に添加し、加熱して90℃において30分間温浸する。濾液を濃縮 して、８倍量の冷却されたエタノール中に攪拌しながら注ぐ。その際に生じた沈 殿を遠心し、最小量の水に溶解し、それぞれ６倍量の冷却されたエタノールを用 いて２回沈殿させる。最小量の酢酸アンモニウム緩衝溶液（僅かにアルカリ性の pHを有する）に溶解された沈殿物を、限外濾過による分離処理にかける。ただし 、30k D、10kD、3kD、1kDの分子排除限界を有する膜を使用する。こうして分離された 画分のpHを調節して弱酸性pH値をとるようにし、次いで凍結乾燥する。 実施例５ Phytolacca americanaからの活性物質の単離 Phytolacca americanaの根の乾燥物100部を刻んで粒子サイズを0.5mm〜1.2mm にし、ヘキサン600部を用いて24時間かけて脱脂処理した。最初に、押圧してヘ キサンを除去し、次いで、ヘキサンの臭いがしなくなるまで植物材料を空気乾燥 する。乾燥された植物材料を、室温において、5%(v/v)酢酸の含まれた水800部を 用いて４時間温浸し、更に、この処理を２回繰り返す。抽出物を合わせて濾過し 、減圧下で濃縮する。この水溶液100部に、硫酸アンモニウム15部〜50部を滴下 し、溶解させる。塩析により沈殿させたタンパク質を、遠心および濾過により除 去する。1-ブタノール50部を上澄み50部に加え、これを強力に振盪する。しばら くしてから、有機相を分離し、更に、ブタノールによる抽出を２回繰り返す。ブ タノール溶液を合わせて、0.1%アンモニアの含まれた水で逆抽出する。水相を減 圧下で濃縮し、ゲル濾過により精製する。 実施例６ Escerichia coliからの製造 トリプロトン20部、酵母抽出物10部、NaCl 20部、および寒天30部を含有し、 更に、好適な栄養添加剤が補充されてなる高圧滅菌培地2000容量部に、Escheric hia coli株K-12を1:100の希釈比で接種する。細胞数2×10⁹個／mlの飽和濃度に 達するまで、培養株を37℃に保持する。反応混合物に超音波処理を施し、90℃に おいて1.0N酢酸と共に20分間加熱し、冷却後、濾過し、更に、減圧下で濃縮する 。濃縮された溶液150部を、カラムクロマトグラフィー用の逆相シリカ(RP18)（M erck）上に吸収させ、最初に、2%(v/v)酢酸を含む水で固相を洗浄し、 その後、n-プロパノール：酢酸エチル：20mMホウ砂／ホウ酸緩衝液を600%:100%: 300%(v/v)の比で含んでなる緩衝混合液1000部で洗浄し、最後に水で洗浄する。 アミノ酸、炭水化物、および他の単純な加水分解生成物が溶出液中に検出されな くなるまで十分な時間をかけて、これらの中性溶離剤を用いて固相を洗浄する。 本発明に係る活性物質の脱離は、アセトニトリルを用いて行い、過剰のアセトニ トリルは減圧下で濃縮することにより除去する。こうして得られた本発明に係る 活性物質の溶液を、濃縮する。 実施例７ 動物体液からの単離 ブタ尿10,000部を凍結乾燥し、固形残渣をメタノール600部で３回抽出する。 メタノール抽出物を20部まで濃縮する。臭化シアン活性化Sepharose 4B 100部を 、適切に活性化されたヘレブリンの溶液を用いて、使用される配糖体の80％が固 相に共有結合されるまで90分間処理する。こうして調製されたアフィニティーク ロマトグラフィーカラムに、濃縮されたメタノール溶液10部を注ぎ、化合物が溶 出液中に検出されなくなるまで十分な時間をかけて溶離する。本発明に係る活性 物質を、0.5モル〜0.2モルの蟻酸を用いて濃度勾配溶離によりカラムから溶離さ せ、凍結乾燥する。Sephadex LH-20（Pharmacia）が充填されたカラムを用いて 、活性物質の精製を行う。最初に、活性物質をカラム上に吸収させ、次いで、20 〜60(v/v)%の濃度勾配を有するアセトンの水溶液を用いて溶離する。 実施例８ 免疫調節への適用 100/1〜10/1のエフェクター細胞／標的細胞比においてＫ５６２標的細胞から 放出される⁵¹Cr同位体のアッセイを行うことにより、NK細胞の自発的細胞媒介性 細胞障害（SCMC）を測定した。健常な被検者10人中８人について、本発明に係る 活性物質を評価したところ、平均15 %の細胞溶解活性を呈した。病理学的に平均141%まで増大した16人のリウマチ病 患者の病理学的SCMC活性は、本発明に係る活性物質の投与により、明らかに正常 化された。抗体依存性細胞障害（ADCC）のエフェクター細胞は、本発明に係る活 性物質により、更に一様な影響を受ける。次のダイアグラム１から明らかなよう に、ADCC活性は、健常人においても、更に、リウマチ病患者においも低下する。 ダイアグラム１ 活性物質処理を行った場合と行わなかった場合における健常人 およびリウマチ病患者の細胞障害 ADCC抗体依存性細胞障害 SCMC自発的細胞媒介 性細胞障害 こうした活性の正常化は、Fc受容体に対する活性物質の特異的親和性により説 明することができる。 実施例９ 臓器移植のための免疫抑制への適用 本発明に係る活性物質の免疫抑制作用により、臓器移植において、移植片拒絶 反応が明らかに軽減された。このことは、マウスにおける一連の心臓移植実験を 利用して実験的に証明された。 病原体を含まない週齢5〜6週のSprague Dawley DBA/2系統のマウスをドナーと し、C57BL/6系統のマウスをレシピエントとして、Corry,R., Winn, H. and Ress el, P., Transplantation 16, 343(1973)に記載の同種心臓移植法を適用した。 ドナーとして使用される動物の静脈内ヘパリン化を行った後、それらの心臓を 取出して、C57BL/6レシピエント動物の準備ができるまで、氷冷乳酸リンゲル液 中に保持した。ドナーの大動脈および肺動脈と、レシピエントの腹大動脈および 大静脈と、の吻合は、顕微手術法により行った。 血液の流れが回復した後、心拍動の頻度および強度を観測し、0〜+4の等級付 けを行った。脈が停止した後、拒絶が成立したとみなし、開腹して調べた。試験 グループのマウスに、以下の量の活性物質を皮下投与により与えた。 − 2.0mg/kg 移植３日前 − 3.0mg/kg 手術当日 − 2.5mg/kg 手術後３日目 − 1.5mg/kg その後、３日ごと 対照グループの動物は、プラセボとしてクエン酸緩衝液だけを用いて処理した。 これらの移植実験において、次の結果が得られた。 動物番号 処理に使用した物質 生存期間（日数） 1 活性物質 24 2 活性物質 31 3 活性物質 18 4 活性物質 21 5 活性物質 42 6 活性物質 18 7 活性物質 6 8 活性物質 33 9 活性物質 12 10 活性物質 22 11 プラセボ 8 12 プラセボ 6 13 プラセボ 10 14 プラセボ 9 プラセボで処理した動物の平均生存日数は、8.2日であった。活性物質で処理 した動物は、平均値が22.7日であり、プラセボで処理した動物の生存期間の明ら かにほぼ３倍の生存期間を呈した。この効果は、Tリンパ球の引き起こす拒絶反 応が特異的に抑制されることから説明される。 実施例10 マクロフアージの刺激 HEPESで緩衝され、かつ10％ウシ胎児血清が補充されたRPMI１６４０培地中に 、10匹の健常マウスから得られた脾臓リンパ球を懸濁した。この懸濁液を１時間 、37℃に保ち、マクロファージを付着させた。試験グループでは、5mg/kgの活性 物質を用いてマウスに腹腔内処理を施し、その後、24時間にわたり活性物質の作 用時間を確保した。対照グループの動物には、活性物質を全く与えなかった。両 方のグループから得られたリンパ球を、5×10⁵個の付着性マクロファージの入っ た管中で培養した。 マクロファージの刺激指数 LPS PHA 対照グループ 288% 165% 活性物質グループ 402% 1,346% 明らかなように、活性物質で処理された動物では、LPS（リポ多糖）おょびPHA（ フィトヘマグルチニン）により得られる刺激指数(SI)が、有意に大きくなる。 実験11 見掛けの免疫刺激への適用 致死量のPseudomonas aeruginosaを感染させた動物の生存率を測定することに より、非特異的な見掛けの免疫刺激を調べた。 それぞれ30匹〜100匹のマウスから成る３つの試験グループにおいて、各動物 に致死量のPseudomonas aeruginosaを投与した。 I．Pseudomonas致死感染を行う７日前、14日前、および28日前に、２μｇの活 性物質を第１のグループに投与し、21日前に0.25mlの生理的NaCl溶液を投与した ； II.第２のグループでは、第１のグループと同じ活性物質の用量を使用したが 、ただし、21日前に0.06mgのシクロホスファミドを投与した； III．対照グループでは、活性物質を全く投与しなかった。 Pseudomonas致死感染時の生存率% III．-#−#−#− 対照グループ 本発明に係る活性物質は、明らかに生存率を増大させた。既に知られているシ クロホスファミドの免疫抑制作用により生存率が低下したが、活性物質によって 、明らかに対照グループの値よりも大きい値が保持される。この相互作用は、本 発明に係る活性物質の非特異的な見掛けの免疫刺激を示しているが、これまでの ところ、新規な免疫機構についての報告はなく、想像の域を出ない。最近、致死 量のPseudomonasを投与した直後にサイトカインが爆発的に放出されることが実 証さ れた。これにより引き起こされるサイトカインショック状態は、突然死の直接の 原因になると推定される。本発明による免疫抑制作用は、このサイトカインショ ックを防ぐことができ、真の免疫刺激が行われないでも、生存率が驚くほど増大 する。 実施例12 競合ELISA法を利用した活性物質のアッセイ アッセイを行うために、本発明に係る活性物質と抗ウワバイン（a-OU)抗血清 との交差反応を使用する。Harris et al., Hypertension 17,930(1991)に記載の 方法に従って、分析用ウワバイン（Sigma）およびアビジン（Fluka）からウワバ イン‐アビジン複合体（OU-con）を合成した。対応する抗ウワバイン血清の調製 において、V. DiBartolo etal., Life Sciences, 57, 1417(1995)に記載の改良 法を適用した。 最初に、ELISAマイクロタイタープレートを、それぞれ0.1μg/50μｌ OU-con 複合体溶液を用いて４℃で一晩インキュベートした。リン酸緩衝液（PBS，pH=7. 4）を用いて非結合複合体を洗い流し、非占有結合部位を1%ゼラチン溶液でブロ ックした。 未知量の活性物質を含むサンプル溶液から50μｌを採取し、ポリプロピレン管 中において、一定量の抗ウワバイン血清（0.5μg/50μｌ）と共に混合し、室温 で２時間保持した。その後、各活性物質抗血清サンプルから50μｌを採取してプ レートに注ぎ、更に３時間インキュベートした。PBSを用いて非結合抗血清を洗 い流した後、プロテインAアルカリ性ホスファターゼ（Sigma）の1:500溶液を用 いて室温で２時間プレートを処理した。非結合酵素を除去した後、プレートをそ れぞれ50μｌのp-ニトロフェニルホスフェート溶液（1mg/ml）で処理し、30分間 のインキュベーションを行った後、405nmにおける吸光度（A）を自動で読み取っ た。 検量線を作成するために、5ng/ml〜0.1mg/mlの既知量の活性物質を一定量の抗 血清と混合し、上述の方法に従って処理し、吸光度の測定値を、対応する濃度の 関数として表した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/35 Ａ６１Ｋ 31/00 ６３７ 31/35 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＬ，ＡＵ，ＡＺ，Ｂ Ａ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ ，ＨＵ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＫ，ＭＸ， ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．骨格構造が、環状オリゴマー化により無機亜酸化炭素C₃O₂から構築される 巨大環状物質であって、しかも、該環状オリゴマー化は、縮合4-ピロン環または 縮合2-ピロン環の生成を伴うとともに、該ピロン環は更に結合して、この基本化 合物の集積C=O二重結合および集積C=C二重結合がもはや存在しない形態で巨大環 構造を形成し；かつ、この骨格構造は、一般式： com-(C₃O₂)_n 〔式中、comは、C₃O₂単位の上述した環状オリゴマー性巨大環結合を示す記号で あり；ｎは亜酸化炭素の環状オリゴマー化度を表す〕に対応する、ことを特徴と する前記巨大環状物質。 ２．前記数ｎが、前記環状オリゴマー性亜酸化炭素骨格構造の式において、4 、6、もしくは10、または、4、6、もしくは10の倍数に等しいことを特徴とする 請求項１記載の巨大環状物質。 ３．前記巨大環状物質が、溶液中で互いに平衡関係を保ちうるピロン、ピリリ ウム、またはその他の互変異性限界構造体により表される媒体依存性電子分布を 有することを特徴とする請求項１または２記載の巨大環状物質。 ４．交互に頭‐尾縮合された６個の4-ピロン環から構成された環状六量体亜酸 化炭素com-(C₃O₂)₆に対して溶液中で存在するピロン‐ピリリウム平衡が、以下 の構造： で表されることを特徴とする請求項３記載の巨大環状物質。 ５．前記巨大環状物質が、骨格の環外酸素原子に水素が付加することにより形 成される一般式： com-(C₃O₂)_n・H_m 〔式中、ｍは結合水素原子の数で、m≦nであり；Ｈは水素原子であり；comおよ びｎは先に記載した通りである〕 で表されるヒドロキシ-ピラン誘導体として存在することを特徴とする請求項１ 〜４のいずれか１項記載の巨大環状物質。 ６．式com-(C₃O₂)_nで表される環状オリゴマー性亜酸化炭素、または式com-(C₃ O₂H)_nで表されるそのヒドロキシ‐ピラン誘導体が、付加物、ピリリウム塩、ホ スト‐ゲスト複合体、自己会合体、および無機もしくは有機の誘導体を形成する ための基本単位であり、comおよびｎは先に記載した通りであるを特徴とする請 求項１〜５のいずれか１項記載の巨大環状物質。 ７．前記環状オリゴマー基本単位が、内部空隙を有する円筒状巨大環構造を提 供することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載の巨大環状物質。 ８．前記巨大環状物質が、式： com-(C₃O₂)_n・Ka_nAn_n 〔式中、Kaはカチオン性イオン、Anはアニオン性の対イオンであり、これらのイ オンが一緒になって、ピリリウム骨格の双性イオン電荷を中和する〕 で表されるピリリウム塩として存在することを特徴とする請求項１〜７のいずれ か１項記載の巨大環状物質。 ９．前記巨大環状物質が、式： com-(C₃O₂)_n・(R¹R²R³N)_m 〔式中、R¹、R²、およびR³はそれぞれ、水素原子または有機残基であり、ｍは１ 〜ｎの数であるが、ただし、前記巨大環状物質は、環状オリゴマー性亜酸化炭素 骨格と、アンモニア、有機アミン、アミノ酸、ペプチド、または他のアミン官能 基含有物質の１個〜ｎ個の分子とから 成るものとする〕。 で表されるアミン付加物の形態で存在することを特徴とする請求項１〜８のいず れか１項記載の巨大環状物質。 １０．無機もしくは有機の分子または有機の残基Ｒが、前記基本骨格の酸素原 子に結合し、これにより、一般式： com-(C₃O₂)_n・R_m 〔式中、Ｒは、無機もしくは有機の分子および／または有機の残基であり、かつ m≦2nである〕 で表される無機および／または有機の誘導体あるいはコンジュゲートが形成され ることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項記載の巨大環状物質。 １１．前記基本単位com-(C₃O₂)_nまたはcom-(C₃O₂H)_nが、式： {com-(C₃O₂)_n}_s または {com-(C₃O₂H)_n}_s 〔式中、s＝2、3、4、5、6、10、もしくは12、ならびにこれらの数の倍数である 〕 で表される安定な自己会合体の形態で存在することを特徴とする請求項１〜１０ のいずれか１項記載の巨大環状物質。 １２．値s=12およびn=6ならびにモル質量4,898もしくは4,970に対応する前記 化合物が、高い構造対称性を備えた骨格を有することを特徴とする請求項１１記 載の巨大環状物質。 １３．前記巨大環状物質が、式： {com-(C₃O₂)_n}_s ⇔ {com-(C₃O₂)_n}_s-p ＋ {com-(C₃O₂)_n}_p 〔式中、ｓは請求項１１に与えられた値を有し、かつp＜sである〕 に従って、より小さい化合物とより大きい化合物との動的平衡状態を保って溶液 として存在することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項記載の巨大環状 物質。 １４．前記巨大環状物質が、個々の物質またはそれらの混合物によってもたら される生体調節活性を有することを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項記 載の巨大環状物質。 １５．巨大環の空隙中に嵌入する半径をもつイオンの塩の形態で補 助剤を使用することによって、前記亜酸化炭素を、巨大環構造の形成下で、光化 学的に活性化する、および／または、環状オリゴマー化することを特徴とする請 求項１〜１４のいずれか１項記載の生体調節活性を有する巨大環状物質の製造方 法。 １６．マロニル‐酵素Ａのような脂肪酸誘導体を、ポリケチドシンターゼ（PK S）のクラスに属する酵素で処理することを特徴とする請求項１〜１４のいずれ か１項記載の生体調節活性を有する巨大環状物質の製造方法。 １７．−合成ガスから、またはオキソ合成によって、大量に製造された有機生 成物を利用すること、 −該有機生成物中に含まれる生体調節活性物質を分別蒸留により濃縮すること 、 −該生体調節活性物質を、低温において減圧蒸留および凝縮により単離するこ と、ならびに −該生体調節活性物質を、固相上への吸収および種々の溶剤を用いた脱離によ り精製すること、 を特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項記載の生体調節活性を有する巨大環 状物質の単離方法。 １８．−毒性のあるグリコシド、アルカロイド、もしくはタンニンを含有する 植物、または植物細胞の培養体を、粗原料として使用すること、 −該粗原料中に含まれる化学的に未定義のコンジュゲートを、水性溶液で抽出 すること、 −該コンジュゲートを加水分解により切断すること、および／または該複合体 を、アセトン、アルコール、もしくは他の溶剤を用いて沈殿させること、 −得られた混合物をイオン交換体または中性吸収剤に結合させ、他の成分を洗 い流すこと、 −塩基性緩衝液または選択的に機能する溶剤混合物により、活性物質を脱離す ること、ならびに −透析、膜濾過、ゲルクロマトグラフィー、または他の方法により、該活性物 質を精製すること、更に、場合に応じて、分子サイズに従って該活性物質を分別 すること、 を特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項記載の生体調節活性を有する巨大環 状物質の単離方法。 １９．前記活性物質を細菌培養株から得るが、この際、 −培養ブロスを超音波で処理すること、および／または酸性pH値において加水 分解すること、 −前記活性物質を液‐液抽出により粗製物として単離すること、 −前記活性物質を木炭または他の吸収剤に結合すること、 −加温したアルコール‐水の溶液、または他の溶剤混合液を用いて、前記活性 物質を選択的に溶解すること、ならびに −クロマトグラフィーまたは他の分離方法により前記活性物質を精製すること 、 を特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項記載の生体調節活性を有する巨大環 状物質の単離方法。 ２０．前記活性物質を、動物に由来する組織、組織液、または組織培養体から 抽出するが、この際、 −水性抽出液を濃縮および／または凍結乾燥すること、 −液‐液抽出および固‐液抽出により、水性抽出物を予備精製すること、 −水性抽出物を、共有結合で結合された特異的グリコシドまたはタンパク質を 含んでなるアフィニティー固相に結合すること、ならびに −溶剤混合物により選択的に水性抽出物を放出させること、 を特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項記載の生体調節活性を有する巨大環 状物質の単離方法。 ２１．−Na⁺,K⁺-ATPアーゼおよび他の酵素の生体調節を行うための治療薬、ま たは −自己免疫疾患における有害な自己攻撃過程を抑制するための治療薬、または −Fc受容体への結合による免疫調節を行うための治療薬、または −神経受容体への結合による疼痛治療のための治療薬、または −筋痙攣または血管痙縮を消散するための治療薬、 を調製するための、請求項１〜１４記載の巨大環状活性物質の使用。 ２２．−Na⁺,K⁺-ATPアーゼおよび他の酵素を制御するための治療薬、または −免疫系を刺激するための治療薬、または −食作用を制御するための治療薬、 としての、請求項１〜１４記載の活性物質の使用。 ２３．環状オリゴマーの付加物、ピリリウム塩、ホスト‐ゲスト複合体の誘導 体を利用することを特徴とする請求項２１または２２記載の使用。 ２４．前記巨大環状活性物質と； −強心配糖体、アルカロイド、または他の薬剤の急性および／または慢性の毒 性を低減するための、または −ステロイド系、ペプチド系、または他の系の活性物質の生物学的利用率を改 良するための、 薬理学上活性な既知の物質と；のコンジュゲートもしくは付加物である医薬品を 調製するための、請求項１〜１４のいずれかに記載の巨大環状活性物質の使用。 ２５．膜不透過性のイオンまたはより小さい物質とホスト‐ゲスト複合体を形 成することにより、細胞膜を介した輸送を可能にする医薬品を調製するための、 請求項１〜１４のいずれかに記載の巨大環状活性物質の使用。 ２６．炎症性疾患、リウマチ性疾患、および自己免疫性疾患を治療するための 、前記請求項のいずれかに記載の活性物質の使用。 ２７．リウマチ様動脈炎、多発性硬化症、紅斑性狼瘡、重症筋無力症、および 他の自己免疫疾患を治療するための、前記請求項のいずれかに記載の活性物質の 使用。 ２８．器官または組織の移植時の移植片拒絶反応を抑制するための、 前記請求項のいずれかに記載の活性物質の使用。 ２９．急性的または慢性的に衰弱した免疫防御またはサイトカイン媒介性ショ ック現象により引き起こされる疾患を治療するための、前記請求項のいずれかに 記載の活性物質の使用。 ３０．Na⁺,K⁺-ATPアーゼ系の生体調節の欠陥により引き起こされる心血管障害 を治療するための、前記請求項のいずれかに記載の活性物質の使用。 ３１．請求項１〜１４記載の生体調節活性物質と、生理学的に許容しうる担体 とを共に含むことを特徴とする製剤。 ３２．前記製剤を、経口投与、局所投与、静脈内投与、または動脈内投与する ことを特徴とする請求項３１記載の製剤。 ３３．前記製剤を、錠剤、カプセル剤、軟膏、ゲル剤、または注射剤により投 与することを特徴とする請求項３１または３２記載の製剤。 ３４．前記製剤が、他のアジュバントを含むことを特徴とする請求項３１〜３ ３記載の製剤。 ３５．血液プローブまたは組織プローブを調べるために、請求項１〜１４のい ずれか１項記載の活性物質を、そのままの状態で、または標識化された形態で利 用することを特徴とする自己免疫性障害を有する疾患のための診断用薬。 ３６．請求項１〜１４記載の活性物質を、そのままの状態で、または標識化さ れた形態で利用する、および／または、ゲルクロマトグラフィー、ELISA、もし くはラジオイムノアッセイにより分析する、ことを特徴とする心血管障害を有す る疾患のための診断用薬。 ３７．請求項１〜１４記載の活性物質と免疫グロブリンまたはその断片との特 異的沈殿反応を使用することを特徴とする免疫学的に引き起こされる疾患のため の診断用薬。 ３８．血液プローブもしくは組織プローブを調べるために、請求項１〜１４の いずれか１項記載の活性物質を、そのままの状態で、または標識化された形態で 利用することを特徴とする自己免疫性障害を有する疾患の診断方法。 ３９．請求項１〜１４のいずれか１項記載の活性物質を、そのままの状態で、 または標識化された形態で利用する、および／または、ゲルクロマトグラフィー 、ELISA、もしくはラジオイムノアッセイにより分析することを特徴とする心血 管障害を有する疾患の診断方法。