JPH0686379B2 - グルコ−ス耐性因子およびその製造方法 - Google Patents

グルコ−ス耐性因子およびその製造方法

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JPH0686379B2 JP61506189A JP50618986A JPH0686379B2 JP H0686379 B2 JPH0686379 B2 JP H0686379B2 JP 61506189 A JP61506189 A JP 61506189A JP 50618986 A JP50618986 A JP 50618986A JP H0686379 B2 JPH0686379 B2 JP H0686379B2
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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明はグルコース耐性因子（GTF）、特に哺乳動物に
おける血糖の低下に有用である酵母から単離したグルコ
ース耐性因子、および該GTFフラクションに含有される
キノリン誘導体に関する。さらに、本発明は、実質的に
純粋な形のGTFの単離方法に関する。
背景技術 マッカシーら（McCarthy et al.）、ジャーナル・オブ
・プレベンション・メディスン（J.Prevention Medicin
e）、Vol.2（1983）の「高クロム酵母およびグルコース
耐性因子」と題する論文において、マッカシーは、グル
コース耐性因子の歴史およびシュワルツおよびメルツ
（ScwarzおよびMertz）による1950年代におけるその発
見を論じている。GTFは３価クロムと関連していること
が判明した。
醸造酵母が、クロムを有するGTFの有効源であることが
判明した。トルラ酵母にはクロムが乏しく、トルラ酵母
の飼料を与えられたクロム欠乏ラットは、損なわれたグ
ルコース耐性を示し続けた。
その後のほとんど全ての研究における関心は、醸造酵母
または他の源からのクロム含有フラクションの単離およ
び特性付け、ならびにヒトのクロムの状態およびクロム
およびGTFに富んだ食物の代謝効果の評価に集中した。
スザレイ（Szalay）の米国特許第4343905号において、
該特許権者は、酸化クロムおよびアミノ酸と反応させる
ことにより合成的に処理した醸造酵母からのGTF−クロ
ム複合体の濃縮を試みた。スザレイは、食物中に無機塩
としてのクロムの存在が、特にクロム含有の醸造酵母の
エキスが加えられる場合、ヒトの生物学系におけるグル
コース酸化の増加を引起こすと述べた。
食物中のクロム含有とグルコース酸化活性に対するその
影響との関係が、例えば、トエプフアーら（Toepfer et
al.）の「生物学活性に関するクロム食物」、ジャーナ
ル・オブ・アグリカルチャル・アンド・フード・ケミス
トリィ（L.Agr.Food.Chem.）、21:69（1973）において
論じられている。特に、この論文は、種々のクロム含有
食物の生物学活性、およびクロム含有に対する（クロム
による増加したインシュリン応答の関数として表現し
た）GTF活性の関係を記載している。
他の研究者らも、他の観察に基づき、クロム含有GTFの
存在に同意している。1ppm濃度のクロム塩は、３時間の
遅れで細胞の二酸化炭素生成を増加させたが、クロム含
有の酵母フラクションは直ちに該プロセスを刺激した。
クロム欠乏ラット、マウスおよびリスザルおける損なわ
れたグルコース耐性が、クロム塩および酵母エキスの両
方により一夜で改善できるが、後者はより有効であり、
かつより迅速に作用した。ヒトにおいて、クロムは、あ
る種の栄養不良の子供、および栄養分を全て非経口的に
受けているがクロム欠乏となった患者のグルコース耐性
を改善した。ジージブホイ（Jeejeebhoy）、アメリカン
・ジャナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（A
m.J.Clin.Nutr.）30:531〜538（1977）。クロムの腸管
吸収は、無機塩からよりもGTFからの方がずっと効果的
であった。in vitroにおいて、GTFは、ラットの精巣上
体の脂肪パッドにおけるグルコース摂取およびグルコー
ス炭素の取り込み（脂肪パッド検定法）およびある種の
アミノ酸の蛋白質への組み込みに対するインシュリンの
効果を増加させた。高濃度においてのみであるが、クロ
ム塩もまた有効であった。
困ったことは、クロム欠乏動物におけるグルコース不耐
症が、クロムでもGTFと同等に迅速に矯正できる事実で
あった。効果的であるためには、in vivoにおいてクロ
ムがGTFに組み入れられなければならないということ
は、この観察によりありそうもなくなった。同時に、胎
児のある組織は有意量のクロムを含有するが、無機クロ
ムは胎盤を通過しない一方、GTFは通過するという観察
は、GTFの生物学的な役割の証拠として決定的であるよ
うに思えた。メルツ、ニュートリション・レビュー（Nu
trition Rev.）、33:129〜135（1975）。
発生的に糖尿病のdb/dbマウスによる実験により、さら
に証拠が提供された。腹腔内投与した場合、無機クロム
は効果がなかったのに対して、醸造酵母または豚の腎臓
からのGTFは、血漿グルコースを有意に減少させた（し
かし常態にはできなかった）。その効果は、高血糖症お
よび高インシュリン症の両方を示す動物において最も著
しかった。著者らは、そのような動物はおそらGTFを合
成せず、GTFが内因性インシュリンの効果を強化し、か
くしてインシュリン耐性を消滅または減少させると結論
づけた。ツーマンら（Tuman et al.）、ジアベティス
（Diabetes）、26:820〜826（1977）。
年輩の人々におけるクロムの補足は、炭水化物耐性のい
くらかの改善をもたらした。ポーターら（Potter et a
l.）、メタボリズム（Metabolism）、34:199〜204（198
5）；マーチンスら（Martinez et al.）、ニュートリシ
ョン・リサーチ（Nutr.Reseaech）、5:609〜620（198
5）。高クロム酵母がより一層効果的であった。栄養十
分な年輩の人々では、これらの結果は確認されなかっ
た。オッフェンバッハーら（Offenbacher et al.）、ア
メリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリ
ション（Am.J.Clin.Nutr.）42:454〜461（1985）。
（クロムの乏しいトルラ酵母では改善でかなかったが）
醸造酵母は、年輩のヒトにおけるグルコース耐性および
後グルコース負荷を改善した（オッフェンバッハーら、
ジアベティス、29:919〜925（1980））が、糖尿病患者
では改善されなかった（ラビノウィッツ（Rabinowit
z）、ジアベティス・ケアー（Diabetes care）、6:319
〜327（1983））。同様に、無機クロムは年齢21〜69の
ヒトの絶食および食後の血漿グルコースをわずかに減少
させ、90分後の負荷血漿グルコースは約100mg/dlであっ
た（アンダーソン（Anderson）、メタボリズム（Metabo
lism）、21:984〜899（1983））。糖尿病患者では、こ
の結果は確認されなかった。ウンシツパ（Unsitupa）、
アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュート
リション、38:404〜410（1983）；ラビノウィッツら、
バイオロジカル・トレース・エレメント・リサーチ（Bi
ol.Trace.Elem.Research）、5:449〜466（1983）。
GTFの化学構造の測定および醸造酵母からの純粋なGTFの
単離の両方について、多くの失敗した試みがあった。初
期の方法では、醸造酵母を50％エタノールで抽出し、水
相を酸性化し、木炭に吸収させ、水酸化アンモニウムで
溶出し、カチオンまたはアニオン交換樹脂つづいてゲル
濾過で精製した。推定されるGTFは２分子のニコチン酸
を含有することが判明した。これはクロムに占有されて
いない４個の配位部位を残しているので、これらの部位
はグルタミン酸、グリシンおよびシスティンのような含
硫アミノ酸と結合すると推定された。この結果が、該錯
体を安定化させ、その生物学活性を保存すると推定され
た。事実、これら全ての物質の新たに合成した錯体また
は混合物は、脂肪パッド検定法（トエプファー、（Toep
fer）、ジャーナル・オブ・アグリカルチャーラル・ア
ンド・フード・ケミストリィ（J.Agric.Food.Chem.）2
5:162〜166（1977））およびdb/dbマウスにおいてGTF様
作用を発揮した。しかし、これらの錯体は非常に不安定
であり、10日以内にその活性を完全に失った。加えて、
該生物学活性は、天然のGTFの生物学活性よりも劣っ
た。ツーマン、ジアベティス、27:49〜56（1978）。酵
母中のより多量のクロムはGTF活性を増加させないこと
が明らかになった。この点が、まず、メルツ、ニュート
リション・レビュー、33:129〜135（1975）により注釈
されている。
最近発表されたいくつかのセンターの研究は、GTF問題
に対して１つの新しい傾向をもたらした。１グループ
（ミルスキー（Mirsky）、ジヤーナル・オブ・イノルガ
ニック・バイオケミストリィ（J.Inorganic Bioche
m.）、13:11〜21（1980））が、ブタノール−水で抽出
し、つづいて水に対して透析し、DEAEセルロースカラム
上でクロマトグラフィーに付し、まず水ついで水酸化ア
ンモニウムの濃度を増加させる勾配溶出することにより
１つの因子を単離した。水溶出液においてのみ、生物学
活性が認められた。
ダウェックス（Dowax）−50×８カラム上でさらに精製
を行なった。得られたGTFは、20〜50分の遅れで酵母細
胞による二酸化炭素生成を増加させた。該遅れは、酵母
をグルコースで予備インキュベーションすることにより
なくすことができた。該調製物は、0.3〜6ng/mlのクロ
ム含量範囲で有効性の増加を示した。
GTFが、フルクトース、マンノースおよびラクトースに
対して同一の作用を発揮することは、興味ある知見であ
った。後に、GTFがまた、２−デオキシグルコース摂取
を増加させることが判明し、これはGTFの主要作用が糖
移送にあることを示唆した。酵母におけるGTFの役割
は、動物におけるインシュリンの作用に類似しうること
が示唆された。ミルスキーら、ジャーナル・オブ・イノ
ルガニック・バイオケミストリィ、15:275〜279（198
1）。
しかし、これらのデーターは、他人により完全に確認さ
れなかった。ホルツウォルスら（Holdsworth et al.）
は、同一方法で調製したGTFが、ピルベートのエタノー
ルおよび二酸化炭素への脱炭酸を増加させ、細胞をGTF
自体と共に30〜60分間予備インキュベーションした場
合、グルコース代謝を強化し、かつGTFが、（自由に細
胞に浸透する）エタノールの細胞利用を増加させること
を示した。ホッドスウォルス（Hoodswotrh et al.）、
ジャーナル・オブ・イノルガニック・バイオケミストリ
ィ、21:31〜44（1984）。GTFは、ピルベートのデカルボ
キシラーゼに加え、またピルベートのカルボキシラーゼ
（重炭酸塩の炭素の固定）をも刺激するため、GTFが実
際に１つの物質であるかどうかの問題が生じた。おそら
く入手しうる最も純粋なものの１つであるこの調製物
を、動物細胞またはdb/dbマウスにおいて試験したこと
は報告されていなかった。
同じ生物学モデル（酵母による二酸化炭素生成）を用
い、もう１つのグループ（ハイロック（Haylock）、ジ
ャーナル・オブ・イノルガニック・バイオケミストリ
ィ、18:195〜211（1983））は、天然GTF調製物（メルク
（Merck）酵母エキスから単離）および前記のトエプフ
ァーの合成生成物の両方を研究した。最初、彼らは11個
のクロム含有フラクションを単離したが、アニオンおよ
び中性のフラクションは生物学活性を全く欠いているこ
とを見出した。４個のカチオのフラクションは活性であ
ることが判明した。著者らはまた、糖蜜、ブラックペパ
ーの実および豚の腎臓から活性フラクションを単離し
た。イオン交換カラムの溶出によるピークが、pH1.75〜
12の間に認められ、すなわち活性成分の不均一性を示し
た。さらに重要なことに、トエプファーにより記録され
た262nmの吸収の大部分が、遊離ニコチン酸により引起
こされることが著者らにより見出された。醸造酵母から
得られる天然のGTFの活性主成分が、実際にクロム−ニ
コチン酸−アミノ酸錯体であるとは確定できないと彼ら
は結論した。
同一研究所の他の研究（ハイロックら、ジャーナル・オ
ブ・イノルガニック・バイオケミストリィ、19:105〜11
7（1983））は、該問題に対してさらに光を投げかけ
た。11個のフラクションの大部分は、クロムと培地成分
との直接反応により得られる後生物であることが判明し
た。２個の生物学的に活性なフラクション（P3およびP
4）を単離した。最も活性なフラクション（P3）は、塩
で非常に汚染されており、それ以上精製しなかった。マ
ススペクトルは、チラミンの存在するある証拠を示し
た。P4フラクションは90％チラミン（それ自体は生物学
的に活性でない）から成り、大いに不純であると考えら
れた。最も重要な知見は、生物学的に活性なピークとク
ロムのピークとは明らかに区別されることであった。著
者らは、GTFはクロムを含有しないと結論した。彼ら
は、GTF活性を有するカチオン成分およびカチオン性ク
ロム化合物を別々に溶出できなかったことで他の反対の
知見を説明した。著者らは、酵母のクロム錯体が酵母代
謝で何の役割も果たしておらず、酵母細胞がクロムを特
定の生物学的に活性な形に変えることはないと述べた。
さらに新しい報告では、GTF活性を有する２個のクロム
−遊離アミノ化合物の酵母からの単離を開示している。
デービスら（Davies et al.）、バイオケミカル・メデ
ィスン（Biochem.Med.）、33:297〜311（1985）。精製
には、DEAEセルロースカラム上のアニオンおよびカチオ
ンフラクションの最初の分離が含まれる。カチオン物質
を、勾配溶出法を用いるダウェックス50W−X8（H+）イ
オン交換樹脂上で分画した。活性フラクションの第２の
分離は、ダウェックス50W−X2ホルメイトカラムにて行
なった。バイオゲルＰ−４上のゲル濾過により、活性物
質をさらに精製した。調製ペーパークロマトグラフィー
を用い、GTF活性を有する化合物を単離し、ペーパーク
ロマトグラフィー、13CNMRおよび高速原子衝撃マススペ
クトロメトリーによりオルニチンと同定した。
DEAEセルロースカラムにより得られたアニオン物質を、
勾配溶出法を用いるDEAEセファクレル（sephacrel）カ
ラム上でクロマトグラフィーに付した。活性フラクショ
ンをHClで溶出し、緩和な酸加水分解、つづいてトリエ
チルアミン／アンモニア勾配で溶出するダウェックス50
W−X2カラム上の分画に付した。活性フラクションを調
製ペーパークロマトグラフィーに付し、暫定的にＮ−グ
ルタリルリジンまたは同様な置換リジンと同定される活
性フラクションを得た。
該２個の単離されたフラクションはGTF様活性を有する
が、著者らは、それが実際にGTF活性に関与するオルニ
チンおよび置換リジンであり、その不純物でないことを
証明するいずれのデーターをも示されなかった。加え
て、著者はGTF活性を有する酵母から全ての物質を単離
することを示していない。
発明の開示 本発明は、哺乳動物に与えた場合に血糖を減少させる特
性を有する醸造酵母から、グルコース耐性因子を分離す
る新規な方法からなる。本発明はまた、新規なグルコー
ス耐性フラクションおよび精製したそのキノリン誘導体
に関する。
種々の哺乳動物の健康問題の処置における治療用化合物
としてのGTFに関する薬理学ポテンシャルを確認し、GTF
活性物質を単離および特性付ける方法についての必要性
が存在しつづけたと発明者らは結論した。
本発明の実施の最良態様 グルコース耐性因子（GTF）なる語は、哺乳動物に与え
た場合に血糖減少特性を有する物質を意図する。
本発明のGTFは、その単離および精製方法、並びにその
構造的および物理化学的特性により特徴付けられる。該
用語は、酵母を採取し、溶解し、濾過して細胞残片およ
び微粒子物質を除去し、50000またはそれ以下の分子量
を有する物質を保留することのできるカラム上でゲル濾
過し、該ゲル濾過カラムから溶出し、さらに6000または
それ以下の分子量を有する分子を保留するカラム上のゲ
ル濾過により精製し、さらに2000またはそれ以下の分子
量を有する分子を保留するカラム上でゲル濾過し、さら
に逆相HPLCにより精製する方法により回収できる生成物
を包含する。ついで、この物質は１つの別の逆相分画に
より実質的に精製することができる。
本発明の実施において、限定するものではないが、GTF
は、酵母またはその自己消化エキス、糖蜜、ブラックペ
パーの実、または豚の腎臓を包含する源から単離でき
る。好ましい具体例においては、GTFを、自己消化醸造
酵母エキスまたは新しい醸造酵母から単離する。いずれ
しても、醸造酵母は、当業者により知られた常法で増殖
される。
種々のフラクションにおける推定GTFの生物学活性は、
当業者に知られた検定法により測定できる。限定するも
のではないが、これらの方法には、ラットの脂肪細胞に
おける14C−グルコース摂取、グルコース酸化、および
脂質合成のin vitro測定が挙げられる。また、グルコー
スの減少、酵母における二酸化炭素生成の増加、および
動物の血中トリグリセリドおよびコレステロール濃度の
減少のin vivo測定も挙げられる。
酵母を当業者によく知られた方法により採取し溶解す
る。まずGTF含有物質を処理し、細胞残片および微粒子
物質を除去する。限定するものではないが、分離方法に
は、遠心分離および濾過が挙げられる。好ましい方法は
遠心分離である。
ついで活性GTFフラクション含有の上澄液を、50000また
はそれ以下の分子量の物質を保留することのできるゲル
濾過カラムに付し、適当な溶媒で溶出する。限定するも
のではないが、適当なゲル濾過物質には、セファデック
スＧ−75（Sephadex G−75）およびバイオゲルＰ−60
（Biogol P−60）が挙げられる。好ましいゲル濾過物質
はセファデックスＧ−75である。好ましい溶出溶媒は水
である。
各フラクションの生物学活性は、前記のいずれの方法に
よっても測定できる。好ましい方法は、ラットの脂肪細
胞における14C−グルコース摂取および脂質合成のin vi
tro測定である。
ついで活性物質を含有するフラクションをプールし、当
業者に知られた方法により濃縮する。このような方法に
は凍結乾燥が包含される。
生物学的に活性なフラクションを、不活性物質の選択的
沈澱によりさらに精製する。これは、生物学的に活性な
物質60〜90mgを水１〜10mlに溶かし、つづいて95％エタ
ノール１〜10培容量を加え、酸で酸性化し、最終濃度0.
01〜1Nの酸を得ることにより行なうことができる。限定
するものではないが、適当な酸には、HCl、HBr、HI、H2
SO4、NaHSO4、H3PO4、NaH2PO4、ｐ−トルエンスルホン
酸、酢酸およびHNO3が包含される。好ましい溶媒系に
は、0.15N HClの濃度に酸性化したH2O5mlおよび95％エ
タノール12mlが挙げられる。
限定するものではないが、沈澱物を、濾過および遠心分
離を包含するその分野に公知な方法により除去する。つ
いで可溶性のGTFを凍結乾燥により濃縮する。
ついで精製したGTFを、6000またはそれ以下の分子量の
物質を保留することのできるゲル濾過カラムに付する。
限定するものではないが、適当なゲル濾過物質には、バ
イオゲルＰ−６およびセファデックス25が包含される。
該カラムを適当な緩衝液で溶出する。好ましい緩衝液は
0.1〜100mM酢酸アンモニウムである。さらに好ましい緩
衝液は50mM酢酸アンモニウムである。生物学的に活性な
物質を含有するフラクションを集め、濃縮する。
ついで精製したGTFを、2000またはそれ以下の分子量の
物質を保留することのできるゲル濾過カラムに付する。
限定するものではないが、適当なゲル濾過物質には、バ
イオゲルＰ−２およびセファデックスG15が包含され
る。カラムを適当な緩衝液で溶出する。好ましい緩衝液
は0.1〜100mM酢酸アンモニウムである。さらに好ましい
緩衝液は50mM酢酸アンモニウムである。前記のような検
定法を用い、該フラクションを生物学活性について検定
し、合して濃縮する。典型的な検定法を以下に記載す
る。この部分的に精製したGTFは、血糖減少因子として
の使用に適している。
GTF含有フラクションを、逆相HPLCで分析し、適当な溶
媒系で溶出できる。前記操作の１つを用い、該フラクシ
ョンを生物学活性について検定する。
別法として、最後のゲル濾過カラム（2000またはそれ以
下の分子量の保留）で精製したGTFをさらに、１回また
はそれ以上HPLC分離で精製することもできる。限定する
ものではないが、最初のHPLC分離用の適当なHPLCカラム
には、CMHPLCイオン交換カラムが包含される。典型的な
溶出液は、0.2から2.0Mまで増加する酢酸アンモニウム
のグラジエントからなる。該フラクションは、前記の１
またはそれ以上の操作によりモニターすることも、ま
た、280nmにおける紫外部分析により検出することもで
きる。
ついで該生物学的に活性なフラクションを、逆相HPLCカ
ラム上でさらに精製し、以下の特性を示す実質的に純粋
な物質を得る。限定するものではないが、この２番目の
HPLC分離用に適した逆相HPLCカラムには、C18HPLCカラ
ムが包含される。好ましい溶媒系には、0.1％TFAを含有
する水から、0.1％TFAを含有する水中の70％アセトニト
リルまで増加させたグラジエント溶出液が包含される。
かくして、本発明はさらに、前記の分画法により得られ
る実質的に精製したGTFフラクションを包含する。この
物質はキノリン誘導体であると考えられる。本発明は、
該キノリン誘導体およびそれらの類似体をも包含する。
類似体とは、該アミンおよびアルコキシ位が、低級（炭
素原子数１〜４の）アルキル、アリールまたは複素環基
により置換されているキノリン異性体を意味する。部分
的に精製したGTFフラクションおよびキノリン異性体お
よびそれらの類似体は以下の特性を有する。脂肪細胞に
おける14C−グルコース摂取、グルコース酸化および脂
質合成を高める能力、動物に注射した場合、血液中の
糖、トリグリセリドおよびコレステロール濃度を減少さ
せる能力、および酵母培養に加えた場合、二酸化炭素生
成を増加させる能力。
精製したキノリン誘導体は、分子量が174で、次に示す
生化学および生物物理学的特性を有する。
1.該化合物は、カチオン化合物であり、水溶性である
が、クロロホルムには溶けず、C18逆相カラム上で遅延
し、0.1％トリフルオロ酢酸の40％アセトニトリルで溶
出する。
2.該化合物はニンヒドリン試薬と反応する。酸加水分解
なしでアミノ酸アナライザーに適用すると、アンモニア
のすぐ後にピークとして溶出した。同一位置に溶出する
アミノ酸は知られていない。酸加水分解後、グリシン位
に単一のピークとして溶出した。
3.該化合物は、51Cr同位元素と混合し、C18カラムのク
ロマトグラフィーを繰り返すことで測定されるように、
クロム（III）と結合する。
4.酸性溶液（0.1N HCl）の紫外部スペクトルは、301.
5、258.5および139.0nmで３つの主ピークを示す。アル
カリ性溶液（0.1NaOH）においては、該ピークは各々、3
23.0、263.0および214.5nmにシフトした。
5.電子イオン化後、マススペクトロメトリーにより、分
子質量174のフラクションから、Mr144の断片が検出され
る。
6.in vitroにおけるラットの脂肪パッドの検定（14C−
グルコース摂取および脂質合成）では、該活性フラクシ
ョン５μｇが、生物学活性においてインシュリン0.25ng
にほぼ等しかった。in vivo検定（該フラクションのマ
ウスへの腹腔内注射）は、該フラクション50μｇで、１
つの試験において147から71mg/dl、およびもう１つの試
験において109から80mg/dlの血液グルコースの減少を示
す。
7.1HNMRスペクトル（500mHz）は、（ppm）:3.32（s,3
H）、4.37（S,2H）、7.21（m,2H）、7.45（m,1H）、8.0
1（m,1H）、8.13（s,1H）であった。
8.前記の全ての特性から、該活性成分は、 からなる群より選択される構造式を有するキノリン誘導
体であると判断された。
キノリン誘導体VI、および誘導体VIおよびIIの類似体
は、ウォージャン（Wojahn）、アルツナイミッテェル・
ホルシュング（Arzneimittle Forsch.）、2:163〜165
（1952）に、いくらかの抗結該性活性を有するとして報
告されている。
該精製したGTFフラクション、キノリン誘導体およびそ
れらの類似体は、動物における血糖濃度を減少させるの
に有用である。当業者によって理解されるように、これ
らの物質の有効な用量範囲は、用いられる物質の血糖を
減少させる活性、および年齢および体重のごとき患者の
特性に依存する。さらに、該有効用量は投与経路にも依
存する。限定するものではないが、許容される投与経路
には、経口、皮下、筋肉内、静脈内および腹腔内注射が
包含される。本発明の物質は、適当な賦形剤および補助
剤からなる処方の一部として投与することもできる。こ
れらの処方は、例えば、レミントンズ・ファーマシュー
ティカル・サイエンシス（Remington′s Pharmaceutica
l Sciences）（第16編、1980）に記載のような製薬分野
においてよく知られたいずれかの方法により調製でき
る。
実施例１ 本実施例の目的のために、商業上入手可能な自己消化醸
造酵母エキスであるディフコ酵母エキス（DIFCO YEAST
EXTRACT）を用いた。該化合物は、ミシガン州デトロイ
トのディフコ社より入手可能である。ディフコ酵母エキ
スは、水溶性部の自己消化酵母からなる。セファデック
スＧ−75カラム物質はニュージャージ州のファーマシア
（Pharmacia）より、バイオゲルＰ−２およびＰ−６カ
ラム材料は、カリフォニア州リッチモンドのバイオラド
（Bio−Red）からのものである。
セファデックスＧ−75は、50000分子量カット・オフを
有する多糖類ベースのゲル濾過媒体である。バイオゲル
Ｐ−６およびＰ−２は、各々5000および2000分子量カッ
ト・オフを有するポリアクリルアミド・ベースのゲル濾
過媒体である。CMHPLCカラムおよびアルテックスC18逆
相HPLCカラムは、ベックマン・インストラメント・カン
パニー（Beckman Instrument Company）（カリホルニア
州、フレアートン）から入手可能である。
推定グルコース耐性因子の生物学活性の測定 酵母エキスから単離された推定GTFの生物学活性を、ラ
ット脂肪細胞における14C−グルコース摂取、グルコー
ス酸化および脂質合成の測定で分析した。内部標準とし
てインシュリンを用いた。ラット（体重250〜300g）か
ら摘出した後のラットの精巣上体の脂肪パッドを、２％
ウシ血清アルブミン（BSA）および0.1mg/mlデキストロ
ースを含有するクレブス・リンゲル緩衝液（118.0mM Na
Cl、5.0mM KCl、1.3mM CaCl2、1.2mM KH2PO4、1.3mM Mg
SO4、25.0mM NaHCO3および20mM Hepes、pH7.4）10ml中
のコラゲナーゼ（脂肪パッド1g当たり10mg）で消化し
た。該消化は、37℃の水浴振とう器で100振動／分にて2
0〜30分間行なった。ついで該脂肪細胞をナイロン布の
層を通して濾過し、15mlの遠心管に集めた。該脂肪細胞
を同じ消化緩衝液で５回洗浄し、臨床遠心機で遠心分離
し（スケール２で１分間にセット）、コラゲナーゼを除
去した。
ついで該脂肪細胞を同じ緩衝液に再度懸濁させ、細胞数
を500μｌ容量において２〜2.5×105個の脂肪細胞に調
整した。ついで該脂肪細胞混合物100μｌを10×75mm試
験管に加え、２％BSAおよび0.1mg/mlデキストロースを
含有するクレブス−リンゲル緩衝液300μｌ、インシュ
リン50μｌ（最終濃度、０〜5.0ng/ml）、および14C−
グルコース（0.05μCi、200mCi/mM）50μｌと合した。
該反応混合物に５％CO2でガスを供給し、栓をし、水浴
振とう器中、37℃にておよび80振動／分にて２時間イン
キュベーションした。該細胞を水道水で冷却して反応を
終わらせ、つづいて該細胞250μｌを各反応管からシリ
コーン油150μｌを含有するマイクロフュージ（microfu
ge）管に即座に移しかえた。ついでマイクロフュージ管
をマイクロフュージで１分間遠心分離し、ついでシンチ
レーション流体5mlを含有する液体シンチレーションバ
イアルに移しかえた。脂肪細胞と14C−グルコースとの
係合を、ベックマンの液体シンチレーションカウンター
（モデル9800）で測定した。14 C−グルコース酸化について、７×65mmの濾紙ストリ
ップを含有する10×75mmガラス管をガラス管の内側に据
える以外、14C−グルコース摂取試験における記載と同
じ方法で17×100mm試験管においてその反応を実施し
た。反応が完了した後、メタノール中の25％β−フェニ
ルエチルアミン溶液0.2mlを、シリンジで内部ガラス管
に注入し、濾紙ストリップを湿潤させ、4NH2SO40.4mlを
直接、該反応混合物に注入した。反応をさらに30分間維
持し、脂肪細胞から放出した14CO2ガスを濾紙ストリッ
プにより吸収させた。吸収された14CO2ガスを、シンチ
レーション流体5ml含有の液体シンチレーションバイア
ンにおいて測定した。14 C−脂質合成については、その反応条件は、脂肪細胞
において合成した14C脂質をドール混合物（Dole′s mix
ture）（ヘプタン10部、イソプロパノール40部および1N
H2SO411部）で抽出する以外、脂肪細胞における14C−
グルコース摂取の反応条件と同じであった。反応の完了
後（37℃にて２時間インキュベーション）、前記のよう
にマイクロフュージ管においてシリコーン油により該細
胞を分離し、該脂肪細胞をドール混合物0.8ml含有のガ
ラス管に移しかえた。ついで該試験管を室温にて５分間
保持した。混合物を攪拌し、つづいて各試験管にヘプタ
ン0.5mlおよびH2O 0.5mlを加えた。５分後、該試験管
を再度攪拌し、1/2培容量のヘプタン層325μｌを液体シ
ンチレーション流体5ml含有のバイアルに移しかえた。
脂肪細胞より抽出した14C−脂質を、液体シンチレーシ
ョンカウンターで測定した。
セファデックスＧ−75カラム上の分画 ディフコ・酵母エキス1gをH2O 5mlに溶かし、臨床遠心
機、3000rpmにて５分間遠心分離した。得られた上澄液
を、セファデックスＧ−75カラム（1.5cm×100cm）に付
し、H2Oで溶出した。６個のプールのフラクション（プ
ール当たり約10〜13のフラクション）を集め、凍結乾燥
した。前記のように脂肪細胞における各プールしたフラ
クションの生物学活性を測定した。
ラットの脂肪細胞における14C−グルコース摂取および
脂質合成で測定した場合、６個のプールしたフラクショ
ンのうち、プールＩおよびプールIIのみが生物学活性を
有した。セファデックスＧ−75カラムからのプールＩお
よびプールIIを合し、凍結乾燥した。これらの２個のプ
ールの収量は、酵母エキス1gより約60〜90mlまたは乾燥
物質３〜30mgであった。
酸−エタノール抽出 セファデックスＧ−75カラムクロマトグラフィーより得
られた高生物学活性のフラクションを、酸−エタノール
抽出によりさらに精製した。生物学的に活性な物質60〜
90mgを水5mlに溶かし、つづいて95％エタノール2.4培容
量を加えた。ついて該溶液を、最終濃度0.15N HClに酸
性化した。該混合物を氷水中に１時間保持し、ついで、
４℃にて10分間、3000rpmで遠心分離した（ベックマンT
J6遠心分離機）。酸−エタノールの抽出後、上澄液は、
約15重量％の出発生物学物質を含有した（該沈澱物は85
重量％を構成要素とした）。酸−エタノール抽出の上澄
液は、脂肪細胞において、Ｇ−75カラムのプールＩおよ
びIIよりも1.5〜2.0培高い生物学活性を有した。酸−エ
タノール抽出の沈澱物は、低14C−グルコース摂取活性
を示した。該上澄液を凍結乾燥した。
バイオゲルＰ−６カラム上での分離 酸−エタノール抽出の凍結乾燥した粉末を、50mM酢酸ア
ンモニウムに溶かし、直径1.5cmおよび高さ75cmのバイ
オゲルＰ−６カラム上に装填した。該物質を50mM酢酸ア
ンモニウムで溶出し、2mlづつのフラクションの集め
た。５つのピークが観察され、脂肪細胞の生物学活性に
ついて前記方法（14C−グルコース摂取、グルコース酸
化および脂質合成）により試験した。第４ピークより、
脂肪細胞検定で最も高い生物学活性を得た。第４ピーク
20mlを凍結乾燥し、酵母エキス1g当たり物質0.05〜0.5m
gを得た。
バイオゲルＰ−２カラム上での精製 バイオゲルＰ−６カラムの第４ピークの乾燥粉末を、50
mM酢酸アンモニウムに溶かし、バイオゲルＰ−２物質を
充填したカラム（直径1.5cmおよび高さ75cm）に装填し
た。該カラムを50mM酢酸アンモニウムで溶出し、2mlづ
つのフラクションを集めた。５つのピークが観察され
た。各ピークをプールし、前記の操作により生物学活性
について試験した。第３ピークが脂肪細胞の活性（14C
−グルコース摂取、グルコース酸化および脂質合成）お
よび後記のようなマウスのin vivo検定を示した。第３
ピークを凍結乾燥し、出発の酵母エキス1gから乾燥物質
0.01〜0.1mgを得た。
第３ピークのフラクション分析 第３ピークの乾燥フラクションを水に溶かし、Ｃ−18逆
相HPLCカラム（直径0.46cmおよび高さ15cm）上に装填
し、0.10％TFAおよび0.10％TFAを含有する70％アセトニ
トリルからなる２つの緩衝液の勾配系で溶出した。1ml
づつのフラクションを集め、脂肪細胞の生物学活性（14
C−グルコース摂取、グルコース酸化および脂質合成）
について試験した。最も活性なフラクションが、最初５
分の溶出で現われた。冷蔵庫中４℃にて10日間以上放置
した後、該物質を再クロマトグラフィーに付すと、さら
に多くのピークが現われた。これは、このフラクション
が純粋でなかったか、またある反応が放置により生じた
かのいずれかであることを示した。
プローブ脱着試験後の第３ピークのマススペクトル分析
は、分子イオン1471の主フラクションおよび分子イオン
670および558の２個の副フラクションを示した。
第３ピークの物質は、ニンヒドリン陽性であり、ペプチ
ド結合の可能性を示している。
マウスの試験 前記第３ピークまたは食塩水のいずれかの注射によるマ
ウスのグルコース濃度に関する効果を、第１表に示す。
試験した全ての動物には、第３ピークの物質の0.1％水
溶液0.2mlか、または対照である0.9％食塩水溶液0.2ml
を注射した。動物No.5〜８を、対照および実際の試験の
両方で利用した。第３ピークの物質の注射後、全ての動
物は血糖の減少を示した。特に興味深いことは、ある日
に食塩水を注射し、別の日に生物学的に活性なフラクシ
ョンを注射した動物No.5〜８の比較である。食塩水の注
射後では、血糖の減少のないことが注目に値する。しか
し、生物学的に活性なフラクションの注射後では、３匹
の動物において血糖の明確な減少があり、第４番目では
一時的な降下があった。動物No.1〜４および動物No.9に
おいては、血糖の明らかな減少があった。最も激しい血
糖降下が、最も純粋なフラクション注射後の動物No.5に
おいて観察された。
実施例２ バイオゲルＰ−２の第３ピークのフラクションからのキ
ノリン誘導体の単離 バイオゲルＰ−２の第３ピークのフラクションを、CMHP
LCイオン交換カラム（7.5×75mm）に付し、酢酸アンモ
ニウムを0.2から2.0Mまで増加させてグラジエント溶出
した。280nmにおける紫外部分析で、合計９つのピーク
を検出した。前記のような脂肪細胞検定法（14C−グル
コース摂取、グルコース酸化および脂質合成）を用いる
と、約29分の保持時間を有する第８のピークが最も大き
な生物学活性を有した。
CMHPLCの第８ピークを、（溶媒を0.1％トルフルオロ酢
酸から、0.1％トリフルオロ酢酸を含有する70％アセト
ニトリルまで変化させる）アルテックスC18HPLCカラム
の勾配溶出によりさらに精製し、分子量174および次の
生化学的および生物物理学的特性を有するキノリン誘導
体を得る。
1.カチオン化合物であり、水溶性であるが、クロロホル
ムには溶けずに、C18逆相カラム上で遅延し、0.1％トリ
フルオロ酢酸の40％アセトニトリルで溶出した。
2.ニンヒドリン試薬と反応した。酸加水分解せずにアミ
ノ酸アナライザーに適用すると、アンモニアのすぐ後の
ピークとして溶出した。その同一位置に溶出するアミノ
酸は知られていない。酸加水分解後、グリシン位に単一
のピークを溶出した。
3.該化合物は、51Cr同位元素と混合し、C18カラムのク
ロマトグラフィーを繰り返すことで測定されるように、
クロム（III）と結合した。
4.酸性溶液（0.1N HCl）の紫外部分析は、301.5、258.5
および139.0nmで３つの主なピークを示した。アルカリ
性溶液（0.1NaOH）においては、該ピークは各々、323.
0、263.0および214.5nmにシフトした。
5.電子イオン化後、マススペクトル分析により、分子質
量174のフラクションから、Mr144の断片が検出された。
6.in vitroにおけるラットの脂肪パッドの検定（14C−
グルコース摂取および脂質合成）では、質量174のフラ
クション５μｇが、生物学活性においてインシュリン0.
25ngに等しいことが判明した。in vivo検定（該フラク
ションのマウスへの腹腔内注射）は、該フラクション50
μｇで、１つの試験において147から71mg/dl、およびも
う１つの試験において109から80mg/dlの血液グルコース
の減少を示した。
7.1HNMRスペクトル（500MHz）は、（ppm）:3.32（s,3
H）、4.37（s,2H）、7.21（m,2H）、7.45（m,1H）、8.0
1（m,1H）8.13（s,1H）であった。
8.前記の全ての特性およびNMRスペクトルから、該精製
した成分は、 からなる群より選択される構造式を有するキノリン誘導
体であると判断された。
本発明を、ある好ましい具体例に関して記載したが、示
した特定の形に本発明の範囲を限定する意図ではなく、
それとは逆に、添付した請求の範囲により定義されるよ
うな本発明の精神および範囲内に包含しうるような変
形、修正および均等をも包含する意図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｄ 215/38 215/42 Ｃ０７Ｇ 17/00 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 1/02 8412−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） 7804−4Ｂ (72)発明者 バーセギィアン，ケン アメリカ合衆国カリフォルニア州91207、 グレンデイル、ロス・ストリート404番

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】50000、6000および2000の分子量カット・
    オフを有するゲル濾過媒体上で連続的に分画することを
    特徴とするグルコース耐性因子の天然源から得られるグ
    ルコース耐性因子を単離する方法。
  2. 【請求項２】さらにイオン交換HPLC文画、つづいて２番
    目の逆相HPLC文画からなることを特徴とする前記第１項
    の方法。
  3. 【請求項３】該イオン交換HPLC文画にCMHPLCカラムを用
    いる前記第２項の方法。
  4. 【請求項４】該逆相文画にＣ−18HPLCカラムを用いる前
    記第２項の方法。
  5. 【請求項５】該天然源が酵母またはその自己消化エキ
    ス、糖蜜、ブラックペパーの実、または豚の腎臓である
    前記第１項の方法。
  6. 【請求項６】該天然源が自己消化酵母エキスである前記
    第５項の方法。
  7. 【請求項７】50000の分子量カット・オフを有する該ゲ
    ル濾過媒体がセファデックスＧ−75である前記第１項の
    方法。
  8. 【請求項８】6000の分子量カット・オフを有する該ゲル
    濾過媒体がバイオゲルＰ−６である前記第１項の方法。
  9. 【請求項９】2000の分子量カット・オフを有する該ゲル
    濾過媒体がバイオゲルＰ−２である前記第１項の方法。
  10. 【請求項１０】該工程が： （ａ）醸造酵母の水性エキスを、セファデックスＧ−75
    カラムに通し、 （ｂ）生物学活性を示すフラクションを集め、 （ｃ）集めたフラクション固体を、酸−エタノール混合
    物で抽出し、 （ｄ）酸−エタノール抽出固体の酢酸アンモニウム溶液
    を、中にバイオゲルＰ−６を含有するカラムに通し、 （ｅ）該生物学的に活性なフラクションを集め、 （ｆ）工程（ｅ）において集めた生物学的に活性なフラ
    クションの酢酸アンモニウム溶液を、バイオゲルＰ−２
    カラムで分離し、そして （ｇ）生物学活性であるフラクションを集め、精製した
    グルコース耐性因子を得る。 からなることを特徴とする哺乳動物における血糖を減少
    させる醸造酵母からグルコース耐性因子を得る方法。
  11. 【請求項１１】該工程が、さらに： （ｈ）工程（ｇ）において集めた生物学的に活性なフラ
    クションを、酢酸アンモニウム勾配を用いるCMHPLCカラ
    ムに通し、 （ｉ）生物学活性を有するフラクションを集め、そし
    て、 （ｊ）工程（ｉ）において集めた生物学的に活性なフラ
    クションを、Ｃ−18逆相HPLCカラムに通し、実質上精製
    したグルコース耐性因子を得る。 からなることを特徴とする前記第11項の方法。
  12. 【請求項１２】50000、6000および2000の分子量カット
    ・オフを有するゲル濾過媒体上の連続分画により、天然
    源から得られたグルコース耐性因子。
  13. 【請求項１３】最初にHPLC分画、つづいて２番目の逆相
    HPLC分画からなる精製をさらに行なって得られる前記第
    12項のグルコース耐性因子。
  14. 【請求項１４】該最初のHPLC分画にCMHPLCイオン交換カ
    ラムを用いる前記第13項のグルコース耐性因子。
  15. 【請求項１５】該２番目の分画に逆相C18HPLCカラムを
    用いる前記第13項のグルコース耐性因子。
  16. 【請求項１６】該天然源が酵母またはその自己消化エキ
    ス、糖蜜、ブラックペパーの実、または豚の腎臓である
    前記第12項のグルコース耐性因子。
  17. 【請求項１７】該天然源が自己消化酵母エキスである前
    記第16項のグルコース耐性因子。
  18. 【請求項１８】50000の分子量カット・オフを有する該
    ゲル濾過媒体がセファデックスＧ−75である前記第12項
    のグルコース耐性因子。
  19. 【請求項１９】6000の分子量カット・オフを有する該ゲ
    ル濾過媒体がバイオゲルＰ−６である前記第12項のグル
    コース耐性因子。
  20. 【請求項２０】2000の分子量カット・オフを有する該ゲ
    ル濾過媒体がバイオゲルＰ−２である前記第12項のグル
    コース耐性因子。
  21. 【請求項２１】該工程が： （ａ）醸造酵母の水性エキスを、セファデックスＧ−75
    カラムに通し、 （ｂ）生物学活性を示すフラクションを集め、 （ｃ）集めたフラクション固体を、酸−エタノール混合
    物で抽出し、 （ｄ）該酸−エタノール抽出による固体の酢酸アンモニ
    ウム溶液を、中にバイオゲルＰ−６を含有するカラムに
    通し、 （ｅ）該生物学的に活性なフラクションを集め、 （ｆ）工程（ｅ）において集めた生物学的に活性なフラ
    クションの酢酸アンモニウム溶液を、バイオゲルＰ−２
    カラムで分離し、そして （ｇ）生物学活性を有するフラクションを集め、精製し
    たグルコース耐性因子を得る。 からなることを特徴とする方法により得られる醸造酵母
    からの精製したグルコース耐性因子。
  22. 【請求項２２】（ｈ）（ｇ）の該精製したグルコースを
    耐性因子を、酢酸アンモニウム勾配を用いるCMHPLCイオ
    ン交換カラムに通し、 （ｉ）生物学活性を有するフラクションを集め、 （ｊ）工程（ｉ）において集めた該生物学的に活性なフ
    ラクションを、水−アセトニトリルのトリフルオロ酢酸
    勾配を用いるＣ−18逆相HPLCカラムに通し、そして （ｋ）生物学活性を有するフラクションを集め、実質上
    精製したグルコース耐性因子を得る。 からなる工程によりさらに精製された前記第21項の精製
    したグルコース耐性因子。
  23. 【請求項２３】該実質上精製したグルコース耐性因子が
    以下の： （ａ）哺乳動物の血糖を減少させて； （ｂ）ラットの脂肪細胞における14C−グルコース摂取
    および脂質合成を増加させ； （ｃ）ニンヒドリン陽性であり； （ｄ）水溶性かつクロロホルム不溶性のカチオン化合物
    であり； （ｅ）C18逆相カラム上で遅延し、１％トリフルオロ酢
    酸含有の40％アセトニトリルで溶出し； （ｆ）クロム（III）と結合し； （ｇ）酸性溶液（0.1NHCl）において、301.5、358.5お
    よび139.0nmにて３つの主ピークのある紫外部スペクト
    ルを有し、 （ｈ）アルカリ性溶液（0.1N NaOH）において、323.0、
    263.0および214.5nmにて３つの主ピークのあるシフトし
    た紫外部スペクトルを有し； （ｉ）電子イオン化後、マススペクトル分析により測定
    した場合、分子質量174および娘イオン144であるマスス
    ペクトルを有し；および （ｊ）3.32（s,2H）、4.37（s,2H）、7.21（m,2H）、7.
    45（m,1H）、8.01（m,1H）および8.13（s,1H）の1HNMR
    スペクトル（ppm）を有する。 で示される特性を有する実質上精製したグルコース耐性
    因子。
  24. 【請求項２４】 およびその類似体からなる群より選択された構造式を有
    するキノリン誘導体からなることを特徴とする前記第23
    項の実質上精製したグルコース耐性因子。
  25. 【請求項２５】該類似体がアミンおよびメトキシ位にお
    いて低級アルキル、アリールまたは複素環基により置換
    されている前記第24項の類似体。
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