FI98889C - Menetelmä kasviuuteperäisen antineoplastisen lääkkeen valmistamiseksi - Google Patents

Description

98889

Menetelmä kasviuuteperäisen antineoplastisen lääkkeen valmistamiseksi - Förfarande för framställning av ett antineo-plastiskt läkemedel frän växtextrakt 5

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää uuden terapeuttisen lääkkeen valmistamiseksi, jolla on antineoplastista aktiivisuutta, joka on uutettu Palma-heimon, alaheimon Phoenicoi-deae ja Phoenix-suvun kasvien hedelmistä.

10

Tutkimuksessa, joka kohdistuu taisteluun syöpää vastaan, eräs tyypillisimmistä tutkimuslinjöistä on kasvaimenvastai-nen kemoterapia. Tähän päivään mennessä eristetyt antiblas-tiset, kemoterapeuttiset aineet ovat mitä laajimpia alkupe-15 rältään ja kemiallisilta ominaisuuksiltaan. Tietyt näistä lisääntymistä estävistä aineista uutetaan kasveista, kuten esimerkiksi kolkisiini Colchium autumnalelta ja vinkaleuko-plastiini Vinca rosealta. Kuitenkin kaikilla näillä aineilla yhdessä tietyn, spesifisen kasvaimenvastaisen aktiivisuuden 20 kanssa on alhainen selektiivisyys degeneroitujen solujen suhteen, mistä syystä näiden aineiden sekaantuminen terveiden solujen metaboliaan on suurena esteenä aineiden rajoittamattomalle käytölle.

25 Esillä olevan keksinnön tekijä on jo patentoinut toisen kas-vaimenvastaisen lääkkeen, joka on kasviperäinen (tarkemmin sanottuna aine CIDI, joka on uutettu Pittosporum tobiran hedelmästä) ja jolla on erittäin selektiivistä kasvaimenvas-taista aktiivisuutta ja jonka toksisuustaso on suuresti 30 alentunut kaikkiin muihin antiblastiinilääkkeisiin verrattuna. Tätä tutkimuslinjaa jatkaen, esillä olevan keksinnön tekijä on eristänyt antineoplastisen kemoterapeuttisen aineen, joka jälleen on kasviuuteperäinen ja jolla on myös erittäin korkeaa selektiivistä kasvaimenvastaista aktiivi-35 suutta ja erittäin alhainen toksisuus.

98889 2

Esillä olevan keksinnön ensimmäisenä kohteena sen tähden on menetelmä aineiden ja/tai koostumusten, joilla on antineo-plastista aktiivisuutta, saamiseksi ja joille on luonteenomaista se, että Palma-heimoon kuuluvien kasvien osille 5 ja/tai tuotteille - missä tahansa niiden kehitys- tai kyp-syysvaiheessa, suoritetaan oleellisesti seuraavat toimenpiteet : a) komponenttien uuttaminen maseroimalla alkoholissa; b) liuoksen, joka sisältää uutteen, sekoittaminen ja ravis- 10 telu kloroformin kanssa uutteen komponenttien jakamiseksi muodostuviin faaseihin; c) kunkin faasin käsittely, toisistaan riippumatta, käyttäen isopropyylialkoholia, minkä jälkeen mahdollinen muodostuva saostuma suodatetaan ja saostuma ja/tai kelluva jäännös 15 haihdutetaan kuivaksi; d) kunkin nestefaasin komponenttien erottaminen; ja e) erotettujen komponenttien, joilla on antineoplastista aktiivisuutta, ja niiden komponenttien, joilla ei ole antineoplastista aktiivisuutta, kokoaminen.

20

Uutteet voidaan kuivata ja puhdistaa ennen menettelytavan kutakin peräkkäistä vaihetta.

Palma-heimon kasvit ovat mieluummin Phoenicoideae-alaheimon 25 ja Phoenix-suvun kasveja. Tässä suhteessa kasvit voidaan valita esimerkiksi useiden lajien, joihin kuuluvat Phoenix canadiensis, Phoenix dactylifera, Chamaerops excelsa, Cha-maerops humilis ja monet muut lajit, joukosta.

30 Liuotin voi olla alkoholi. Hyviä tuloksia voidaan saada . etyylialkoholia käyttämällä.

3 98399

Orgaanisen liuottimen ja kasvinosien välinen tilavuussuhde on mieluummin 1:10 - 10:1.

5 Käsittelyajat on mieluummin 5 minuutista 3 kuukauteen. Käsit-telylämpötilat voivat vaihdella mieluummin 5 - 100°C:n välillä.

Lääkkeen kokonaisalkoholiuute, laimennuksena 1 mg/ml, voidaan 10 analysoida HPLC:llä (Perkin Elmer -sarjan 250 nestekromato- grafialla) käyttämällä 125 - 4 mm:n RP 18-pylvästä, metanoli-H20:a (80:20) liikkuvana jakeena ja aallonpituutta 210 nm. Mainittu kokonaisalkoholiuute antaa arviolta 14 huippua RT-arvojen ollessa 1,123 (ensimmäinen huippu) - 33,461 (14.

15 huippu): Tyypillisimpien huippujen RT-arvot ovat RT 1,123 (3,36 %:a pinta-alasta); RT 1,301 (3,01%:a pinta-alasta); RT 1,583 (63,34 %:a pinta-alasta); RT 2,133 (14,88 %:a pinta- alasta) ja RT 2,636 (3,33 %:a pinta-alasta).

20 Uutteen komponenttien erottaminen voi mieluummin olla tyypiltään kromatografinen. Hyviä tuloksia voidaan saada käyttämällä kromatografiaa silikageelipylväässä tai valmistavassa HPLC-pylväässä.

25 Uuttaminen voidaan suorittaa metanolia käyttämällä ja keräämällä komponentit, joilla retentioarvot ovat noin 1,123, 1,301, 1,583, 2,133 ja 2,636.

Etanolilla suoritetun uuttamisen jälkeen saatua liuosta voi-30 daan ravistella kloroformilla, jolloin muodostuu kaksi jaet-ta, alkoholi-kloroformijae, joka on väriltään vihreä, sekä bordeaux-punainen vesijae. Tässä tapauksessa komponentit, joilla on antineoplastista aktiivisuutta löytyvät vesijakees-ta.

35

Vesiliuos voidaan väkevöidä haihduttamalla pyöröhaiduttajässä, ja sitä voidaan käsitellä tässä vaiheessa seuraavasti: 4 98389 1) pulloon voidaan lisätä etyylialkoholia, jolloin muodostuu suspensio; tämän jälkeen voidaan lisätä petrolieetteriä, joka sekoittamisen jälkeen antaa suuren saostuman, joka, sitten 5 kun se on liuotettu uudelleen etanoli-vedessä ja väkevöity noin 30 ml:ksi, lietetään isopropyylialkoholiin ja kuivataan. Kelluva osa voidaan vuorostaan haihduttaa ja kuivata, mikä johtaa punaisen, amorfisen aineen muodostumiseen; lopuksi tämä aine voidaan kiteyttää jos, sen jälkeen kun se on liuo-10 tettu pieneen määrään metanolia, se kuivataan isopropyylial-koholin lisäyksen, joka aiheuttaa erittäin hienon suspension muodostumisen, jälkeen; 2) tai mieluummin, sen jälkeen kun vesiliuos on konsentroitu, pulloon voidaan lisätä metyylialkoholia, jolloin muodostuu 15 suspensio; tämän jälkeen voidaan lisätä etyylieetteriä, joka sekoittamisen jälkeen aiheuttaa suuren, hiutaleisen saostuman muodostumisen; kelluvan osan poistamisen jälkeen saostuma lietetään isopropyylialkoholiin ja kuivataan pyöröhaihdutti-mella, mikä aiheuttaa vaaleanruusunpunaisen jauheen muodostu-20 inisen.

Esillä oleva keksintö koskee sinänsä aineita ja koostumuksia, joille on ominaista, että ne voidaan saada yllä kuvattua menettelyä käyttämä1lä.

25

Esillä oleva keksintö koskee myös aineita ja koostumuksia, joilla on antineoplastista aktiivisuutta ja joille on luonteenomaista se, että ne voidaan saada yllä esitetyllä menetelmällä.

30

Aineita ja koostumuksia, joilla on antineoplastista aktiivisuutta, voidaan käsitellä niiden tekemiseksi vesiliukoisiksi, siten että ne muodostavat suoloja, yhdisteitä tai komplekseja.

35

Esillä olevan keksinnön lisäkohteena on farmaseuttinen valmiste, jolle on luonteenomaista, että se sisältää ainakin li 98889 5 yhtenä lääkkeen tärkeimmistä, aktiivisista ainesosista, ainetta tai koostumusta, joka valitaan aineiden ja koostumusten ryhmästä, jolla on antineoplastista aktiivisuutta, joka voi-5 daan saada yllä kuvatulla menetelmällä, tai niiden yhdistelmiä.

Farmaseuttinen valmiste voidaan valita ryhmästä, joka käsittää vesiliuoksia parenteraalista käyttöä varten, kapseleita 10 suun kautta suoritettavaa käyttöä varten, peräpuikkoja peräsuolen kautta tapahtuvaa käyttöä varten, munanmuotoisia puikkoja emättimen kautta tapahtuvaa käyttöä varten, voiteita, salvoja, kermamaisia voiteita ja geelejä.

15 Vesiliuos voidaan pakata pulloihin. Klikin pullo sisältää 0,5 - 2,5 g, mieluummin 1,2 - 1,7 g lääkkeen tärkeintä, aktiivista ainesosaa.

Siinä tapauksessa, että farmaseuttinen valmiste on kapselei-20 den muodossa, kukin kapseli sisältää 0,1 - 2 g, mieluummin 0,8 - 1,2 g lääkkeen tärkeintä, aktiivista ainesosaa.

Siinä tapauksessa, että farmaseuttinen valmiste on peräpuikkojen muodossa peräaukon kautta tapahtuvaa käyttöä varten, 25 kukin peräpuikko sisältää 0,5 - 2,5 g, mieluummin 1,2 - 1,7 g lääkkeen tärkeintä, aktiivista ainesosaa.

Siinä tapauksessa, että farmaseuttinen valmiste on pienten pallojen muodossa emättimen kautta tapahtuvaa käyttöä varten, 30 kukin pallo sisältää 0,5 - 2,5 g, mieluummin 1,2 - 1,7 g lääkkeen tärkeintä, aktiivista ainesosaa.

Siinä tapauksessa, että farmaseuttinen valmiste on voiteen, salvan, kermamaisen voiteen tai geelin muodossa, paikallista 35 käyttöä varten täyteaine sisältää 0,5 - 12 prosenttia, mieluummin 3-7 prosenttia lääkkeen tärkeintä, aktiivista ainesosaa.

9888° e

Esillä oleva keksintö koskee myös komponenttien, jotka saadaan yllä mainittuja uuttamis-, erottamis- ja talteenottamis-menettelyjä käyttämällä, käyttöä yksinään tai yhdistelmänä, 5 lääkkeiden valmistamiseksi patologisten, muiden kuin neoplas-tisten tilojen hoitoon.

Tähän kohtaan mennessä on annettu esillä olevaa keksintöä koskeva yleinen kuvaus. Seuraavien esimerkkien avulla tullaan 10 antamaan yksityiskohtaisempi kuvaus esillä olevan keksinnön kohteiden, ominaisuuksien, etujen ja työskentelymenetelmien selvittämiseksi lähemmin.

Esimerkki 1 15 Menetelmä lääkkeen tärkeimpien ainesosien uuttamiseksi ja puhdistamiseksi

Chamaerops exelsan hedelmiä asetetaan tietty määrä niiden uuttamiseksi huoneenlämpötilassa 95°:isella etyylialkoholil-, la, jonka määrä on riittävä peittämään hedelmät (tilavuussuh-20 teessä noin 1:1, painosuhteessa noin 7:1). Ne jätetään mase-roitumaan ainakin 30 päivän ajaksi, sitten ne suodatetaan.

Yllä kuvatulla tavalla saatu 500 ml:n suuruinen alkoholiuute kaadetaan erotussuppiloon yhdessä yhtä suuren määrän kanssa kloroformia. Useiden tuntien mittaisen sekoituksen jälkeen 25 tapahtuu erottuminen, joka on täydellinen 24 tunnin kuluttua: Suppilon alemmassa osassa erottuu vihreänvärinen alkoholi-kloroformiliuos; vesiliukoiset aineet, jotka uutettiin vedestä, jota alunperin oli hedelmässä, muodostivat ylemmässä osassa väriltään bordeaux-punaisen (punainen, liukoinen jae = 30 RSF) vesiliuoksen. RSF:ää on läsnä noin 20 prosenttia tilavuudesta, ja se muodostuu lähes yksinomaan komponenteista, joilla HPLC:ssä RT-arvo on 1,175 (22,04 prosenttia pinta-alasta) , 1,575 (67,47 prosenttia pinta-alasta) ja 2,284 (10,49 prosenttia pinta-alasta). Aine RSF, kun se kuivataan, 35 koostuu punaisenvärisestä, amorfisesta aineesta. Vihreänvärinen (liukenematon vihreä jae = IGF) alkoholi-kloroformiliuos, joka erottuu erotussuppilon alempaan osaan, kun se on kuivat-

II

98889 7 tu, on veteen liukenematon, ja kun se liuotetaan metanoliin, sillä on HPLC:ssä 4 huippua, joiden RT-arvot ovat seuraavat: 1,089 (14,17 prosenttia pinta-alasta); 1,299 (8,29 prosenttia 5 pinta-alasta); 1,600 (68,10 prosenttia pinta-alasta); 2,268 (9,43 prosenttia pinta-alasta).

Esimerkki 2

Menetelmä lääkkeen tärkeimmän, aktiivisen ainesosan puhdista-10 miseksi 1) Ensimmäinen menetelmä.

Vesiliuos (RSF), joka jää jäljelle yllä esimerkissä 1 suoritettujen toimenpiteiden jälkeen (koostuu kokonaisalkoholiuut-teesta, vähemmän IGF:stä), sitä väkevöidään haihduttamalla 15 voimakkaasti pullossa, pyöröhaihduttajassa, 45°C:ssa, mikä laskee sen tilavuuden noin 30 ml:aan. Tässä vaiheessa lisätään pulloon 300 ml:a etyylialkoholia. Suspensio muodostuu. Lisätään yhtä suuri tilavuus (300 ml) petrolieetteriä. Seosta sekoitetaan. Suuri saostuma muodostuu. Läpikuultava, kelluva 20 osa kootaan, suodatetaan ja kuivataan pyöröhaihduttajassa.

Saadaan amorfinen, väriltään punainen aine, joka liukenee veteen.

Punainen, amorfinen aine liuotetaan metanoliin ja väkevöidään 25 pyöröhaihduttajassa useita kertoja, kunnes saadaan voimak kaasti väkevöity, täysin metanoliliuos. Tässä vaiheessa pulloon lisätään isopropyylialkoholia (noin 200 ml), joka aiheuttaa äärimmäisen hienon suspension muodostumisen. Tämä kuivataan. Täten saadaan äärimmäisen hieno, väriltään vaalean-30 ruusunpunainen jauhe, joka itse asiassa on puhdistettua ja kiteytettyä RSF:ää.

RSF-jauhe liukenee veteen, metanoliin ja etanoliin; se on isopropyylialkoholiin liukenematonta. Sen liuokset saavat 35 loistavan punaisen värin.

8 98889 RSF-jauhe, metyylialkoholiin liuotettuna ja HPLC:llä tutkittaessa, tavallisia menetelmiä käyttäen, antaa yhden ainoan huipun, jonka RT on 1,591.

5 RSF-jauhe on erittäin hygroskooppista, ja sen jälkeen kun se on ollut tyhjiökuivaajassa, se tulisi säilyttää suljetuissa pulloissa, tyhjössä.

10 Saostuma, joka muodostuu pullossa, liuotetaan myös erikseen etyylialkoholi-veteen (3:1) ja väkevöidään haihduttamalla se pyöröhaihduttajassa tavallisen menetelmän mukaisesti, kunnes tilavuus on noin 30 ml. Tässä vaiheessa pulloon lisätään iso-propyylialkoholia, saadaan hieno suspensio, ja koko erä kui-15 vataan. Saadaan vaaleanruusunpunainen jauhe, jolla on HPLCrllä määritettynä sama RT-arvo, kuin kuvataan toisen menetelmän kohdassa a).

2) Toinen menetelmä 20 Vesiliuos (RSF), joka jää jäljelle esimerkissä 1 suoritettujen toimenpiteiden jälkeen (koostuu kokonaisalkoholiuuttees-ta, jossa on vähemmän IGF:ä), haihdutetaan pullossa, pyöröhaihduttajassa, 45°C:ssa, mikä laskee tilavuuden 30 ml:ksi.

25 Tässä vaiheessa lisätään pulloon 300 ml metyylialkoholia.

Muodostuu hieno suspensio. Seosta sekoitetaan. Lisätään yhtä suuri tilavuus etyylieetteriä. Seosta sekoitetaan. Jäykkä, suuri, hiutaleinen saostuma muodostuu. Kelluva osa poistetaan. Kaikki saostamistoimenpiteet, joita kuvataan kohdassa 2 JO tähän vaiheeseen saakka, voidaan toistaa useita kertoja, jotta saadaan yhä puhtaampi lääkkeen tärkein, aktiivinen ainesosa.

Sen jälkeen kun kelluva osa on poistettu, saostuma lietetään 35 noin 100 ml:aan isopropyylialkoholia ja kuivataan sitten pyöröhaihduttajassa. Täten saadaan väriltään vaaleanruusun-

II

98889 9 punainen, hieno jauhe, jota tämän jälkeen nimitetään DEGU:ksi.

5 DEGU-jauhe on asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyli- eetteriin, petrolieetteriin, etyylialkoholiin, metyylialkoholiin, isopropyylialkoholiin liukenematonta; se liukenee veteen.

10 Kemialliset ja kemiallis-fysikaaliset ominaisuudet DEGU-jauhe, joka on saatu yhdestä ainoasta saostamisesta: a) HPLC.

Pylväs RP 18, 125 mm x 4 mm, metanoli-vesi liikkuvana jakeena (80:20), aallonpituus 210 nm, pitoisuus 1 mg/ml: RT 0,728 15 (2,18 %:a pinta-alasta); RT 0,994 (40,89 %:a pinta-alasta); RT 1,452 (56,93 %:a pinta-alasta).

Sama menetelmä, pitoisuus 2 mg/ml; RT 1,031 (40,75 %:a pinta-alasta; RT 1,457 (59,26 %:a pinta-alasta).

20

Pallomainen pylväs Supelcosil LC-NH2 5 μ, liikkuva jae CH3CN-H20 (3:1), virtausnopeus 1,5 ml/min), UV-ilmaisin 217 nm: RT 1,702 (kons. 15,823); RT 1,958 (kons. 75,7988); RT

5,039 (kons. 9,1218).

25

Epäsäännöllinen Chromopack Lichrosorb Rp 18 - 10 μ -pylväs, liikkuva jae CH3CN-H20 (3:1), virtausnopeus 1,5 ml/min, UV-ilmaisin 217 nm:ssä: RT 1,503 (kons. 15,3867); RT 1,826 (kons. 42,5747); RT 2,019 (kons. 38,1984); RT 4,132 (kons.

30 3,8399).

b) IR-spektri (Spektrofotometri IR Perkin Elmer, malli 683) KBr-väliainees-sa, konsentraatio 1 mg/100 mg.

35 Havaittavat vyöhykkeet: 3350 cm-1 OH:n liittyvä venytysvärähdys (stretching) 28900 cm-1 venytysvärähdys (stretching), CH3 ja CH2 98389 10 1600 cm-1 venytysvärähdys (stretching), C=C 1510 cm-1 OH:n liittyvä taipuminen (bending) 1400 cm-1 taipuminen (bending), CH 5 1380 cm-1 taipuminen (bending), CH3 1250 cm-1 taipuminen (bending), vapaa OH 1050 cm-1 venytysvärähdys (stretching),0-0 c) UV-spektri 10 (UV:n ja näkyvän valon alueella toimiva Perkin Elmer -spekt-rofotometri, malli Lambda 5).

Liuos CH3CN-H20:ssa (4:1), pitoisuus 5xl0~2 mg/ml. maksimiabsorptio: tärkein 204 nm:ssä 15 sekundaarinen 279 nm:ssä

Liuos CH3OH-H20 (3:1), konsentraatio 5xl0-2 mg/ml: maksimiabsorptio: tärkein 202 nm:ssä sekundaarinen 279,5 nm:ssä 20 d) NMR-spektrit.

NMR-spektrit muodostettiin käyttämällä Bruker AC -laitetta 200 MHz:lla (protoni) ja 50 MHz:lla (hiili). Näytteet valmistettiin liuottamalla 55 mg ainetta 0,6 ml:ssa DMSO-d6:tta lisäten 3-(trimetyylisiliili)propaanisofonihapon (DSS) nat-25 riumsuolaa sisäisenä standardina.

1H-spektriä varten kerättiin 3668 pulssia käyttäen 30°:n impulssia. Liikkuvien protonien vaihto suoritettiin lisäämällä näytteeseen 5 pisaraa D20:ta, ja suhteellinen 1H-spektri saa-30 tiin aikaan keräämällä 212 pulssia.

13C-spektri saatiin aikaan keräämällä 11,565 pulssia 90°:n impulssia käyttäen, mitä seurasi 1,4 sekunnin viive.

35 Protonispektrejä tutkittaessa voidaan havaita useita signaa leja 2,5-4 miljoonasosan alueella (mikä luultavasti johtuu alkoholi- ja eetterityyppisestä C-H:sta); läsnä on myös liik- 11 98389 kuvia protoneja, luonteeltaan luultavasti hydroksyylin protoneja, 4-5 miljoonasosan alueella. Spektrissä on myös heikkoja signaaleja vinyylin protonin alueella.

5 13C-spektri antaa käyttöön samanlaista informaatiota ilmaisten joitakin huippuja vinyylihiilen alueella sekä useita signaaleja alkoholin ja eetterin hiilen alueella.

10 e) Sentesimaalinen analyysi: C% 38,48 H% 5,72 N% ---- 0% 55,80 15 Empiirinen vähimmäiskaava, joka lähinnä vastaa yllä esitettyä analyysiä: C9H16O10.

f) Sulamispiste: 95° - 130°C (hajoaa) .

g) Vesiliuoksen pH: 6,05.

20 DEGU-aineen yllä mainitut kemiallis-fysikaaliset ominaisuudet voivat kärsiä suoritetun puhdistusasteen vaihtelusta (saostuksen ja pesun nro), kuten seuraavassa taulukossa esitetään yhteenvetona: 12 98839 n) U — — — -p O ^- <*><*> <*> in o <*> CO) O H H σι -h c rt ('Jf-ai^Tir-iincoo 0 in G -P J i>-ov«a'-r--ro-H0 O) -H rt M o r- - o h in «h ^ VO *!· o

Ä ae B 3 O -O - rH -M· 'OJ

3 P H W If) O ^ H w H w CM ^ VO A

(0 0) O 0) H

Ir> ft.* ft u _ o ~ * " C rt 2 » VO i •h 4-> rt vcovomc^ovcoi o WUI+J n CO Π CO ' Γ" ' I Ln o 0) -H Q) U) o O - O Γ- in H I LO o £ :rt IA d M - o .. r- - cm I - «g 3 P -h in ω h°wh^h^i o λ rt a) o 0) id ft-P ft :rt

P

(0 Q) Q — (0 o —^ λ» <##> G -H o <*> •h ao rt r» σ n i

ΙΠ β -P rH 00 CO *J· CO N OI I O

O) -H B (0 I CM ιΗ σ LO - I LO Q

ΛΛ-η d o r- - oi o tj- vo i o 0 3 M ω M CV) in -CM »M1 -in I - ro rt <1) C 0) h σν o o —· h —· i vo a

Id ft 0) ft w —

0) H

Ό

3 -H

3 ,* — — M Λί rj ^ <#> <* •HM o <#>

rt 0) in f- ον I

·. G B [s iflif i o O G -h i r- - r- - eo - i o IM^rtW VO o HIMinf-CMO I CM o

to O rt 0) CM O -CM -VO -H I - (M

« .* in γ-η'-τη—ιμ—'Ι vo λ s •H t. (Ό rt -H <0 ft ·Η ®

rt(U -0)0 W <3 G

> +) CO rt CM O I O tr -H in «H -ID E O 3 m -P .* :rt 3 ·η ft I H · *H tn 'P '—· B .* ft~ Η««·Η Nfflr, H M D>

rH rH W <U 0ί > Ή CH -Ha0>S

a) C^-Hio vro 3 o -e o g tn m Pi

•P 0) Qv BO «iiCOOXs O) rt -H

O) <D βη 0>ϋβΝΛ t? > o P -P

G G rH rt JH -H -p ·· B - B ΙΛ-Ρ in οι -h 3 Λ ft >i-h oiortB KQCa) g < KftHBeHCH ft 1-3 -H in li 98889 13

Esimerkki 3 Lääkkeen tärkeimmän, aktiivisen ainesosan kromatografinen erottami smenetelmä Lääkkeen kokonaisalkoholiuute kuivataan pyöröhaihduttajassa ja liuotetaan uudelleen pieneen määrään metanolia ja vettä.

Tälle liuokselle kromatografinen erottaminen suoritetaan sekä silikageeli 60 -pylväässä ja - suuremmalla tarkkuudella -valmistavassa HPLC-pylväässä. Täten saadaan puhtaita jakeita, jotka, kuten yllä mainittiin, vastaavat huippuja, joiden RT-arvot ovat 1,123, 1,301, 1,583, 2,133 ja 2,636.

Esimerkki 4

Kokeet, jotka korostavat antineoplastista aktiivisuutta sekä in vitro että in vivo

Aineilla ja/tai koostumuksilla, jotka saatiin aiempien esimerkkien mukaisesti, liukoisilla tai etyylialkoholia käyttäen veteen liuotetuilla, oli huomattavaa antineoplastista aktiivisuutta yhdessä hyväksyttävän toksisuuden kanssa sekä ilman immuunivastetta heikentävää aktiivisuutta. Esillä olevan keksinnön tekijä on jo havainnut nämä luonteenomaiset ominaisuudet lääkkeen tärkeimmissä, aktiivisissa ainesosissa, jotka eristettiin toisesta kasvista, joka, kuten yllä mainittiin, muodosti aiemman patentin kohteen; tämä luultavasti johtuu siitä seikasta, että tällä aineryhmällä on ennen kaikkea : hajoittavaa aktiivisuutta neoplastisen solun kaikkia membraa- neja kohtaan, parietaalisesta membraanista sytoplasmassa sijaitsevien erilaisten organellien membraaneihin, tumamem-braaniin saakka.

Selvät muutokset, jotka kohdistuvat kasvainsoluihin, joiden tilavuus näyttää kasvavan ja joissa ilmenee solumembraanin ulospäin suuntautuneisuutta ja rikki kulumista, äärimmäisen rakkulainen ja vaahtoava sytoplasma, jonka tuman kromatiinil-la on hypokromiaa ja vaaleat nukleolit, ovat havainnollistaneet huomattavan selektiivisen, antineoplastisen aktiivisuuden kasvainsoluja kohtaan histologisella tasolla sekä in 98889 14 vitro että in vivo. Se seikka, että kaikki yllä luetellut vauriot puuttuvat normaaleista soluista, joita käsitellään samalla tavalla, havainnollistaa näiden aineiden korkean selektiivisyyden.

Yllä mainittujen aineiden antineoplastinen aktiivisuus tutk-littiin in vivo Swiss-hiirellä Sa 180, yleensä käyttäen annosta, joka on välillä 20 - 1000 mg/kg/matriisi, käytetyn aineen mukaisesti, ja jota annetaan intraperitoneaalisesti 8 peräkkäisenä päivänä aloittaen kudoksen siirtämisen jälkeisestä päivästä. Käyttäen vertailuna kontrollieläinten keskimääräistä elinaikaa, joka oli 23,0 päivää, kasvaimen hyljintä havaittiin 80 prosentilla käsiteltyjä eläimiä, joita sen tähden voidaan pitää varmasti eloonjääneinä.

Yksi ainoa ihonalainen ruiske, joka annetaan 24 tunnin kuluttua kasvaimen siirtämisestä, annoksena, joka on kahdeksanker-tainen yksinkertaiseen intraperitoneaaliseen annokseen verrattuna, pystyy aiheuttamaan kasvaimen hyljinnän 100 prosentissa tapauksista.

Terapeuttista käyttöä varten esillä olevan keksinnön mukaisia aineita, niiden suoloja, yhdisteitä tai komplekseja käytetään mieluummin vesiliuoksen muodossa lihaksensisäisiin, laskimon-: sisäisiin tai ontelonsisäisiin ruiskeisiin.

«

Claims (18)

98889

1. Menetelmä uutteiden, joilla on antineoplastista aktiivisuutta, saamiseksi, tunnettu siitä, että kasvien, jotka kuuluvat Palma-heimoon, osille ja/tai tuotteille, missä ta- 5 hansa niiden kehitys- ja kypsyysvaiheessa, suoritetaan oleellisesti seuraavat toimenpiteet: a) komponenttien uuttaminen maseroimalla alkoholissa; b) liuoksen, joka sisältää uutteen, sekoittaminen ja ravistelu kloroformin kanssa, uutteen komponenttien jakamisek- 10 si muodostuviin faaseihin; c) kunkin faasin käsittely, toisistaan riippumatta, käyttäen isopropyylialkoholia, minkä jälkeen seuraa mahdollisen muodostuvan saostuman suodatus ja saostuman ja/tai kelluvan jäännöksen haihduttaminen kuivaksi; 15 d) kunkin nestefaasin komponenttien erottaminen; ja e) erotettujen komponenttien, joilla on antineoplastista aktiivisuutta, sekä niiden, joilla ei ole antineoplastista aktiivisuutta, kokoaminen, mainittujen uutteiden ollessa valinnaisesti kuivattuja ja 20 puhdistettuja ennen kutakin lisäkäsittelyä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasvit kuuluvat alaheimoon Phoenicoidae ja ovat Phoenix-lajeja. 25

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasvit valitaan ryhmästä, johon Phoenix canadien-sis, Phoenix dactylifera, Chamaerops excelsa, Chamaerops humilis ja niiden yhdistelmät kuuluvat. 30

4. Minkä tahansa edellä esitetyn patenttivaatimuksen mu- • kainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen liuotin valitaan alkoholien ryhmästä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että alkoholi on etanoli. 9888?

6. Minkä tahansa edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että orgaanisen liuottimen ja käsiteltävien kasvinosien välinen tilavuussuhde on 1:10 -10:1. 5

7. Minkä tahansa edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittelyajat ovat 5 minuutista 3 kuukauteen.

8. Minkä tahansa edellä esitetyn patenttivaatimuksen mu kainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittelylämpötila on 5°C - 100°C.

9. Minkä tahansa edellä esitetyn patenttivaatimuksen mu- 15 kainen menetelmä, tunnettu siitä, että uutteen komponenttien erottaminen on tyypiltään kromatografinen.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uutteen komponenttien erottaminen tapahtuu silika- 20 geelipylväässä.

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uutteen komponenttien erottaminen suoritetaan pre-paratiivisessa HPLC-pylväässä. 25

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erottaminen suoritetaan HPLC-tekniikalla ja kootaan komponentit, joiden retentioajat ovat arvojen 1,123; 1,301; 1,583; 2,133 ja 2,636 ympärillä. 30

13. Minkä tahansa edellä esitetyn patenttivaatimuksen mu- . kainen menetelmä, tunnettu siitä, että uuttaminen suorite taan etanolilla, saatua liuosta ravistellaan kloroformin kanssa, jolloin muodostuu kaksi jaetta, vihreänvärinen alko- 35 holi-kloroformijae ja bordeaux-punainen vesijae, bordeaux- punaisessa vesijakeessa sijaitsevien yhdisteiden ollessa an-tineoplastisesti aktiivisia. 98389

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että komponenttien, joilla on antineoplastista aktiivisuutta, erottaminen suoritetaan kromatografiaa käyttämällä sen jälkeen, kun vesijae on kuivattu ja kiinteä aine on uu- 5 delleenliuotettu metanoli-veteen.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että komponenttien, joilla on antineoplastista aktiivisuutta, erottaminen suoritetaan HPLC-tekniikkaa käyttämäl- 10 lä ja kootaan komponentit, joiden retentioajat ovat arvojen 0,777; 1,044; 1,175, 1,575 ja 2,284 ympärillä.

16. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesiliuos väkevöidään haihduttamalla pullossa 15 pyöröhaihduttajalla ja lisätään etyylialkoholia ja petroli- eetteriä, jolloin muodostuu saostuma, joka haihdutetaan kuivaksi jättäen jäljelle vaaleanpunaisen jauheen, joka, kun se tutkitaan HPLCtllä, antaa RT-arvot 0,728; 0,994; 1,452, samalla kun kelluva osa vuorostaan haihdutetaan, jolloin saa-20 daan amorfinen, punainen aine, joka HPLCrssä tuo esiin yhden ainoan huipun, jonka RT-arvo on 1,591.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saostuma sekä amorfinen aine, joka on peräisin 25 kelluvasta jäännöksestä, kiteytetään punaisen jauheen muodossa metyylialkoholiin ja isopropyylialkoholiin suoritetun suspendoinnin jälkeen.

18. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu 30 siitä, että vesiliuos väkevöidään haihdutuspullossa, johon sitten lisätään metyylialkoholia ja etyylieetteriä, mikä • muodostaa saostuman; saostuma, kun kelluva jäännös on pois tettu, suspendoidaan isopropyylialkoholiin ja kuivataan, jolloin saadaan vaaleanruusunpunainen jauhe, joka HPLC:ssä 35 antaa seuraavat RT-arvot: 0,728 (2,18 % pinta-alasta); 0,994 (40,89 % pinta-alasta); 1,452 (56,93 % pinta-alasta). 98889