PL168929B1 - Sposób otrzymywania kompozycji i/iub substancji o aktywnosci przeciwnowotworowej PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób otrzym ywania kompozycji i/lub substancji o aktywnosci przeciw- nowotworowej, znam ienny tym, ze owoce Chamaerops excelsa na dowolnym etapie ich rozwoju i dojrzalosci poddaje sie a/ ekstrakcji skladników przez maceracje w rozpuszczalniku organicznym, b/ ewentualnie mieszaniu i wytrzasaniu roztworu zawierajacego ekstrakt z innym rozpuszczalnikiem, co najmniej czesciowo mieszajacym sie z pierwszym rozpuszczal- nikiem aby rozdzielic skladniki ekstraktu w tworzacych sie fazach, c/ewentualnie traktowaniu kazdej fazy, niezaleznie od siebie, z zastosowaniem co najmniej jednego lub dwóch plynów organicznych posiadajacych aktywnosc rozpuszczalnika w odniesieniu do co najmniej jed- nego ze skladników ekstraktu, a nastepnie odsaczeniu kazdego osadu, jaki powstaje, i odparowaniu do stanu suchego osadu i/lub plynnych pozostalosci, d / ewentualnie rozdzieleniu skladników znajdujacych sie w kazdej fazie cieklej i e/ zbieraniu rozdzielonych skladników posiadajacych aktywnosc przeciwnowotworowa i tych bez aktywnosci przeciwnowotworo- wej, przy czym ekstrakt ewentualnie odparowuje sie i oczyszcza przed kazdym etapem traktowania. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania kompozycji i/lub substancji o aktywności przeciwnowotworowej użytecznej jako nowy lek chemioterapeutyczny.

W badaniach mających na celu walkę z rakiem, jedną z najbardziej reprezentatywnych linii badań jest ta dotycząca chemioterapii przeciwnowotworowej. Przeciwnowotworowe czynniki chemioterapeutyczne wyizolowane do tej pory mają najbardziej zróżnicowane pochodzenie i właściwości chemiczne. Pewne z tych czynników antyproliferacyjnych ekstrahuje się z roślin, takie jak, na przykład kolchicynę z Colchicum autumnale i winblastynę z Vinca rosea. Jednakże, wszystkie te substancje, wraz z pewną aktywnością specyficznie przeciwnowotworową, wykazują niską selektywność w odniesieniu do zdegenerowanych komórek: z tego powodu ich zakłócenie metabolizmu zdrowych komórek stanowi znaczącą ich przeszkodę ich masowego stosowania.

Znany lek przeciwnowotworowy pochodzenia roślinnego (a bardziej szczegółowo substancja CIDI wyekstrahowana z owocu Pittosporum tobira) charakteryzuje się wysoce selektywnością przeciwnowotworową i poziomem toksyczności znacznie obniżonym w porównaniu z wszystkimi innymi lekami przeciwdziałającymi wzrostowi komórek. Kontynuując tę linię wyizolowano nowy przeciwnowotworowy czynnik chemioterapeutyczny, ponownie w wyniku ekstrakcji roślin, który także wykazuje wysoce selektywną aktywność przeciwnowotworową i skrajnie niską toksyczność.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania substancji i/lub kompozycji o aktywności przeciwnowotworowej, polegający na tym, że owoce Chamaerops excelsa na dowolnym etapie ich rozwoju i dojrzałości poddaje się a/ ekstrakcji składników przez macerację w rozpuszczalniku organicznym, b/ ewentualnie, mieszaniu i wytrząsaniu roztworu zawierającego ekstrakt z innym rozpuszczalnikiem, co najmniej częściowo mieszającym się z pierwszym rozpuszczalnikiem, w celu rozdzielenia składników ekstraktu w tworzących się fazach, c/ ewentualnie traktowaniu każdej fazy, niezależnie od siebie, z zastosowaniem co najmniej jednego lub dwóch płynów organicznych posiadających aktywność rozpuszczalnika w odniesieniu do co najmniej jednego ze składników ekstraktu, a następnie odsączeniu każdego osadu, jaki powstaje, i odparowaniu do stanu suchego płynnych pozostałości, d/ ewentualnie rozdzielaniu składników znajdujących się w każdej fazie ciekłej i e/ zbieraniu rozdzielonych składników posiadających aktywność przeciwnowotworową i tych bez aktywności przeciwnowotworowej.

Ekstrakty można doprowadzić do stanu suchego i oczyścić przed każdym kolejnym etapem procesu.

Rozpuszczalnikiem może być alkohol. Dobre wyniki uzyskano, stosując alkohol etylowy.

Korzystne jest, aby stosunek objętości rozpuszczalnika organicznego i części traktowanej rośliny zawierała się pomiędzy 1:10 a 10:1.

Korzystne jest:, aby czasy traktowania zawierały się pomiędzy 5 minutami a 3 miesiącami. Temperatury traktowania mogą być różne, korzystnie pomiędzy 5°C a 100°C.

Całkowity ekstrakt alkoholowy leku, przy rozcieńczeniu 1 mg/ml, można analizować stosując HPLC (chromatograf cieczy Perkin-Elmer model 250), stosując 125 mm - 4 mm

168 929 kolumnę RP 18 z fazą ruchomą metanol-HLO (80:20) i długość fali równą 210 nm. Całkowity ekstrakt alkoholowy wykazuje około 14 pików o czasach retencji od 1,123 (pierwszy pik) do 33,461 (czternasty pik); najbardziej reprezentatywnymi pikami są te o czasach retencji 1,123 (3,36% pola powierzchni), 1,301 (3,01% pola powierzchni), 1,583 (63,34% pola powierzchni), 2,133 (14,88 pola powierzchni i 2,636 (3,33% pola powierzchni).

Korzystne jest, aby rozdział składników ekstraktu przeprowadzano chromatograficznie. Dobre wyniki otrzymano stosując chromatografię na kolumnie z żelem krzemionkowym lub na preparatywnej kolumnie HPLC.

Ekstrakcję można przeprowadzić stosując metanol i zbierając składniki, które w HPLC mają w przybliżeniu czasy retencji 1,123, 1,301, 1,583, 2,133 i 2,636.

Po ekstrakcji etanolem otrzymany roztwór można wytrząsać z chloroformem, tworząc dwie fazy, fazę alkoholowo-chloroformową o barwie zielonej i fazę wodną o barwie bordowoczerwonej, W tym przypadku składniki posiadające aktywność przeciwnowotworową stwierdzono w fazie wodnej.

Roztwór wodny można zatężyć przez odparowanie w wyparce obrotowej i, na tym etapie:

1/ do kolby można dodać alkoholu etylowego, tworząc zawiesinę; po tym można dodać eteru naftowego, który po mieszaniu powoduje utworzenie obfitego osadu. Osad ten ponownie rozpuszczony w roztworze etanolo-wodnym i zatężony do objętości około 30 ml, zawiesza się w alkoholu izopropylowym, a następnie odparowuje. Część płynną można z kolei odparować i wysuszyć, w wyniku czego powstaje amorficzna substancja o barwie czerwonej; ostatecznie, substancję tę można wykrystalizować, jeśli po rozpuszczeniu w małej ilości metanolu, odparowuje się ją po dodaniu alkoholu izopropylowego, który powoduje tworzenie bardzo drobnej zawiesiny;

2/ lub korzystnie, po otrzymaniu stężonego roztworu wodnego, do kolby można dodać alkoholu metylowego, tworząc zawiesinę; po tym można dodać eteru etylowego, który, po mieszaniu, powoduje utworzenie obfitego, płatkowatego osadu; po usunięciu części płynnej, osad zawiesza się w alkoholu izopropylowym i odparowuje w wyparce obrotowej, w wyniku czego powstaje proszek o barwie jasno różowej.

Substancje i kompozycje posiadające aktywność przeciwnowotworową otrzymane sposobem według wynalazku można poddawać obróbce w celu przeprowadzenia w postać rozpuszczalnych w wodzie soli, związków lub kompleksów. Substancje i kompozycje mogą być użyteczne również do leczenia stanów patologicznych innych niż nowotwory.

Preparat farmaceutyczny zawiera jako co najmniej jeden z jego aktywnych składników substancję lub kompozycję wybraną z grupy substancji lub kompozycji posiadających aktywność przeciwnowotworową, które można otrzymać stosując sposób według wynalazku, lub ich kompozycję.

Poniższe przykłady dokładniej ilustrują sposób według wynalazku.

Przykład I. Metoda ekstrakcji i oczyszczania aktywnych składników.

Do pewnej ilości owoców Chamaerops excelsa dodano w temperaturze pokojowej 95% alkoholu etylowego w ilości wystarczającej do ich pokrycia (około 1:1 objętościowo, około 7:1 wagowo). Pozostawiono je do maceracji na co najmniej 30 dni, a następnie odsączono. 500 ml alkoholowego ekstraktu otrzymanego jak opisano powyżej nalano do rozdzielacza wraz z identyczną ilością chloroformu. Po wielokrotnym mieszaniu zachodzi rozdział, który jest całkowity po 24 godzinach: w dolnej części rozdzielacza roztwór alkoholowo-chloroformowy o barwie zielonej, w górnej roztwór wodny o barwie bordowo-czerwonej (rozpuszczalna czerwona frakcja = RSF) tworzony przez substancje rozpuszczalne w wodzie ekstrahowano z wody początkowo obecnej w owocach. RSF stanowi około 20% objętości, i tworzy się prawie wyłącznie ze składników, które podczas HPLC mają czasy retencji 1,175 (22,04% pola powierzchni), 1,575 (67,47% pola powierzchni) i 2,284 (10,49% pola powierzchni). Substancja RSF, po odparowaniu, ma postać amorficznej substancji o barwie czerwonej. Roztwór alkoholowochloroformowy o barwie zielonej (nierozpuszczalna zielona frakcja = IGF) ulegający rozdzieleniu w dolnej części jest po odparowaniu nierozpuszczalny w H2O i, po rozpuszczeniu w metanolu, wykazuje podczas HPLC 4 piki o czasach retencji: 1,089 (14,17% pola powierzchni),

168 929

1,299 (8,29% pola powierzchni), 1,600 (68,10% pola powierzchni), 2,268 (9,43% pola powierzchni).

Przykład II. Metody oczyszczania aktywnego składnika.

1/ Metoda pierwsza

Roztwór wodny (RSF) pozostający po operacjach przeprowadzonych w przykładzie I (złożony z ekstraktu alkoholowego pozbawionego IGF) zatęża się znacznie przez odparowanie w kolbie w wyparce obrotowej w temperaturze 45°C do objętości około 30 ml. Na tym etapie do kolby dodaje się 300 ml alkoholu etylowego. Tworzy się zawiesina. Dodaje się równą objętość (300 ml) eteru naftowego. Mieszaninę miesza się. Tworzy się obfity osad. Płynną klarowną część zbiera się, odsącza i odparowuje w wyparce obrotowej. Otrzymuje się amorficzną substancję o barwie czerwonej, która jest rozpuszczalna w H2O.

Amorficzną substancję o barwie czerwonej rozpuszcza się w metanolu i zatęża wielokrotnie w wyparce obrotowej do otrzymania silnie zatężonego, w pełni metanolowego roztworu. Na tym etapie do kolby wprowadza się alkohol izopropylowy (około 200 ml), powodujący tworzenie bardzo drobnej zawiesiny. Zawiesinę tę odparowuje się. Otrzymuje się w ten sposób bardzo drobny proszek o barwie różowej, który jest w rzeczywistości oczyszczoną i wykrystalizowaną RSF.

Proszek RSF jest rozpuszczony w H2O, metanolu i etanolu; nieprzepuszczalny w alkoholu izopropylowym. Jego roztwory przybierają barwę jaskrawo czerwoną.

Proszek RSF, rozpuszczony w alkoholu metylowymi badany techniką HPLC, wykazuje pojedynczy pik o czasie retencji równym 1,591.

Proszek RSF jest bardzo silnie higroskopijny i, po pozostawieniu w suszarce próżniowej, powinno się przechowywać pod zmniejszonym ciśnieniem w zatopionych butelkach.

Osobno, osad utworzony w kolbie rozpuszcza się również w alkoholu etylowym H2O (3:1) i zatęża przez odparowanie w wyparce obrotowej, zgodnie ze zwykłą metodą, do osiągnięcia objętości około 30 ml. Na tym etapie do kolby dodaje się alkohol izopropylowy, powodujący powstanie drobnej zawiesiny, i całość odparowuje się. Otrzymuje się proszek o barwie bladoróżowej wykazujący ten sam czas retencji podczas HPLC, jak opisany w punkcie a/ metody drugiej.

2/ Metoda druga

Wodny roztwór (RSF) pozostały po operacjach przeprowadzonych w przykładzie I (złożony z pełnego ekstraktu alkoholowego pozbawionego IGF) odparowuje się w kolbie w wyparce obrotowej w temperaturze 45°C, do objętości 30 ml.

Na tym etapie do kolby dodaje się 300 ml alkoholu metylowego. Tworzy się drobna zawiesina. Mieszaninę miesza się. Dodaje się równą objętość eteru etylowego. Mieszaninę miesza się. Tworzy się spójnym, obfity, płatkowaty osad. część płynną usuwa się. Wszystkie operacje wytrącania opisane w punkcie 2 aż do tego momentu można powtarzać wiele razy w celu otrzymania coraz bardziej czystego aktywnego składnika.

Po usunięciu części płynnej, osad zawiesza się w około 100 ml alkoholu izopropylowego, a następnie odparowuje się w wyparce obrotowej. W ten sposób otrzymuje się proszek o barwie różowej, który określany jest tu DEGU.

Proszek DEGU jest nierozpuszczalny w acetonie, benzenie, chloroformie, eterze etylowym, eterze naftowym, alkoholu etylowym, alkoholu izopropylowym; jest on rozpuszczalny w H2O.

Właściwości chemiczne i fizykochemiczne

Proszek DEGU z pojedynczego preparatu: a/HPLC

Kolumna RP 18 125 mm x 4 mm, faza ruchoma metanol-woda (80:20), długość fali 210 mm, stężenie 1 mg/ml: czas retencji 0,728 (2,18% polapowierzchni), czas retencji 0,994 (40,89% pola powierzchni), czas retencji 1,-452 (56,93% pola powierzchni).

Ta sama metoda, stężenie 2 mg/ml: czas retencji 1,031 (40,75% pola powierzchni), czas retencji 1,-457 (59,26% polapowierzchni).

168 929

Sferyczna kolumna Supelcosil LC-NH2 pm, faza ruchoma CH3CN - H2O (3:1), przepływ 1,5 ml/minutę, detektor UV 217 nm: czas retencji 1,0702 (stężenie 15,823), czas retencji 1,98 (stężenie 75,7988), czas retencji 5,039 (stężenie 9,1218).

Kolumna Irregular Chrompack Lichrosorb RP 18-10 pm, faza ruchoma CH3CN - H2O (3:1), przepływ 1,5 ml/minutę, detektor UV przy długości fali 217 nm: czas retencji 1,503 (stężenie 15,3867), czas retencji 1,826 (stężenie 42,5747), czas retencji 2,019 (stężenie 38,1984), czas retencji 4,132 (stężenie 3,8399).

b/Widmo IR (Spektrofotometr IR Perkin Elmer model 683) w środowisku KBr, stężenie 1 mg/100 mg.

Obserwowane pasma:

3350 cm'1 drgania rozciągające związanych grup OH

2900 cm'1 drgania rozciągające CH3 i CH2

1600 cm ί drgania rozciągające C=C

1510 cm'1 drgania deformacyjne związanych grup OH

1400 cm'1 drgania deformacyjne CH

1380 cm'¹ drgania deformacyjne CH3

1250 cm'1 drgania deformacyjne wolnych grup OH

1050 cm'1 drgania rozciągające C-O d Widmo UV (Spektrofotometr UV-VIS Perkin Elmer model Lambda 5).

Roztwór w CH3CN-H2O (4:1), stężenie 5x10'² mg/ml:

maksimum absorbcji: główne przy długości fali 204 nm dodatkowo przy długości fali 279 nm.

Roztwór w CH3OH-H2O (3:1), stężenie 5x10'2 ,g/ml:

maksimum absorbcji: główne przy długości fali 202 nm dodatkowe przy długości fali 279,5 nm.

d/ Widmo NMR

Widmo NRM otrzymano stosując aparat Bruker AC przy częstotliwości 200 MHz (proton) i 50 MHz (węgiel). Próbki przygotowano przez rozpuszczenie 55 mg substancji w 0,6 ml DMSO-d6 z dodaniem 15 mg soli sodowej kwasu 3-/trimetylosililo/propanosofonowego (DSS) jako wewnętrznego standardu.

Dla widma Ή akumulowano 3668 przemiatań stosując 30° impuls. Wymianę ruchliwych protonów przeprowadzono przez dodanie do próbki 5 kropli D2O, a względnie widmo ^]H otrzymano przez akumulację 212 przemiatań.

Widmo ^l3C otrzymano akumulując 11 565 przemiatań, stosując 90° impuls z następującym opóźnieniem 1,4 sekundy.

Na podstawie badań widm protonowych widm można stwierdzić liczne sygnały w obszarze zawartym pomiędzy 2,5 a 4 ppm (prawdopodobnie spowodowane przez wiązania C-H typu alkoholowego lub eterowego); stwierdza się również obecność ruchliwych protonów, o charakterze prawdopodobnie, hydroksylowym, w obszarze zawartym pomiędzy 4 a 5 ppm. W widmie występują także słabe sygnały w obszarze protonów winylowych.

Widmo 13(2 dostarcza podobne informacje, wykazując pewne piki w obszarze winylowych atomów węgla i liczne sygnały w obszarze alkoholowych lub eterowych atomów węgla, e/ Analiza centezymalna: C% 38,48

H% 5,72 N% —

0% 55,80

Najprostszy wzór empiryczny najbliższy wynikom powyżej analizy: C9H16O10. f/Temperatura topnienia: 95°-130°C g/ pH roztworu wodnego: 6,05.

Podane powyżej właściwości chemiczne i fizykochemiczne substancji DEGU mogą się różnić w zależności od uzyskanego stopnia oczyszczenia (wielokrotności wytrąceń lub przemywań), jak podsumowano w poniższej tabeli.

168 929

Tabela

Metoda	RSF pełna (przykład I)	Proszek pochodzący z pierwszego przemycia	Proszek pochodzący z drugiego przemycia	Proszek pochodzący z trzeciego przemycia
Masa suchej substancji w g/litr	-26	-12	-8	-5
Temperatura topnienia	70-75°C	95-130°C	130-150°C	170-200°C
HPLC (czasy	1,175	0,728	0,088	0,777
retencji)	I22,4%l	/2,18%/	/0,36%/	/0,99%/
(kol.RP18 faza ruchoma	1,575	0,994	1,085	1,044
metanol	ΠΑΊ<%Ι	/40,89%/	/77,78%/	/41,41%/
H2O 80:20, dł.fali 210 nm,	2,284	1,452	1,579	1,571
stężenie 1 mg/ml	/10,49%/	/56,93%/	/21,86%/	/11,51%/
				2,438
	___	___	___	/46,09%/
pH roztworu wodnego	6,2	6,05	6,55	6,41
LD 5 dla myszy Swiss śródotrzewnowo mg/kg	>2000	>2000	>2000	>2000

Przykład III. Metoda chromatograficzna rozdziału aktywnych składników. Całkowity ekstrakt ekstrakt alkoholowy leku odparowany w wyparce obrotowej i ponownie rozpuszczony w małej ilości metanolu i wody. Przeprowadza się rozdział chromatograficzny tego roztworu zarówno na kolumnie żelu krzemionkowego 60 i - z większą dokładnością - na preparatywnej kolumnie HPLC. W ten sposób otrzymuje się czyste frakcje, które jak podano powyżej, odpowiadają pikom o czasach retencji 1,123, 1,301, 1,583, 2,133 i 2,636.

Przykład IV. Testy wykazujące aktywność przeciwnowotworową zarówno in vitro, jak i in vivo.

Substancje i/lub kompozycje otrzymane według uprzednich przykładów, rozpuszczalne, lub rozpuszczone z zastosowaniem alkoholu etylowego w wodzie, wykazują znaczną aktywność przeciwnowotworową oraz możliwą do zaakceptowania toksycznego i brak aktywności immunosupresyjnej. Te specyficzne właściwości zaobserwowano już w przypadku znanych aktywnych składników wyizolowanych z innej rośliny. Wynika to prawdopodobnie z faktu, że ta grupa substancji posiada przede wszystkim aktywność lityczną wobec wszystkich błon komórek nowotworowych, począwszy od błony komórkowej, do błon różnych organelli cytoplazmatycznych, włącznie z błoną jądrową.

Wykazano znaczną selektywną aktywność przeciwnowotworową wobec komórek nowotworowych na poziomie histologicznym, zarówno in vitro, jak i in vivo, przez wyraźne zmiany komórek nowotworowych, które wydają się zwiększać objętość, zlepiają się, wykazują ekstrawersję i postrzępienie błony komórkowej oraz silną wakuolizację cytoplazmy i pienistość cytoplazmy z hipochromią chromatyny jądrowej i jasnymi jąderkami. Wysoką selektywność tych substancji wykazano poprzez fakt, że wszystkie wymienione powyżej zmiany patalogiczne nie występują w normalnych komórkach poddanych podobnemu traktowaniu.

168 929

In vivo aktywność przeciwnowotworową substancji wymienionych powyżej testowano na myszach Sa 180 Swiss, ogólnie stosując dawkę pomiędzy 20 a 1000 mg/kg, w zależności od stosowanej substancji, podawaną śródotrzewnowo w ciągu 8 kolejnych dni, począwszy od dnia po transplantacji. W porównaniu ze średnim czasem przeżycia 23 dni dla zwierząt kontrolnych, odrzucenie nowotworu było widoczne u 80% traktowanych zwierząt, które można dlatego uważać jako pozostałe przy życiu.

Pojedyncza injekcja podskórna, podana 24 godziny po transplantacji nowotworu, w dawce osiem razy większej od pojedynczej iniekcji śródotrzewnowej, zdolna jest do spowodowania odrzucenia nowotworu w 100% przypadków.

Do zastosowań terapeutycznych korzystne jest stosowanie substancji otrzymanych sposobem według wynalazku oraz ich soli, związków lub kompleksów w postaci wodnego roztworu do iniekcji domięśniowej, dożylnej lub wewnątrzjamowej.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,50 zł

Claims (16)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania kompozycji i/lub substancji o aktywności przeciwnowotworowej, znamienny tym, że owoce Chamaerops excelsa na dowolnym etapie ich rozwoju i dojrzałości poddaje się a/ ekstrakcji składników przez macerację w rozpuszczalniku organicznym, b/ewentualnie mieszaniu i wytrząsaniu roztworu zawierającego ekstrakt z innym rozpuszczalnikiem, co najmniej częściowo mieszającym się z pierwszym rozpuszczalnikiem aby rozdzielić składniki ekstraktu w tworzących się fazach, c/ ewentualnie traktowaniu każdej fazy, niezależnie od siebie, z zastosowaniem co najmniej jednego lub dwóch płynów organicznych posiadających aktywność rozpuszczalnika w odniesieniu do co najmniej jednego ze składników ekstraktu, a następnie odsączeniu każdego osadu, jaki powstaje, i odparowaniu do stanu suchego osadu i/lub płynnych pozostałości, d/ ewentualnie rozdzieleniu składników znajdujących się w każdej fazie ciekłej i e/ zbieraniu rozdzielonych składników posiadających aktywność przeciwnowotworową i tych bez aktywności przeciwnowotworowej, przy czym ekstrakt ewentualnie odparowuje się i oczyszcza przed każdym etapem traktowania.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik stosuje się rozpuszczalnik alkoholowy.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się etanol.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek objętości pomiędzy rozpuszczalnikiem organicznym a częściami traktowanych roślin utrzymuje się pomiędzy 1:10 a 10:1.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że traktowanie prowadzi się w czasie pomiędzy 5 minutami a 3 miesiącami.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że traktowanie prowadzi się w temperaturze pomiędzy 5°C a 100°C.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeprowadza się chromatograficzny rozdział składników ekstraktu.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że rozdział składników ekstraktu przeprowadza się na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym.
9. 9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że rozdział składników ekstraktu przeprowadza się na preparatywnej kolumnie HPLC.
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że rozdział przeprowadza się stosując technikę HPLC i zbiera się składniki posiadające czasy retencji o wartościach w przybliżeniu 1,123, 1,301, 1,583, 2,133, i 2,636.
11. 11. Sposób według zastrz, 1, znamienny tym, że ekstrakcję przeprowadza się stosując etanol, otrzymany roztwór wytrząsa się z chloroformem tworząc dwie fazy, fazę alkoholowochloroformową o barwie zielonej i fazę wodną o barwie bordowo-czerwonej, przy czym związki posiadające aktywność przeciwnowotworową są obecne w fazie o barwie bordowo-czerwonej.
12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że rozdział składników posiadających aktywność przeciwnowotworową przeprowadza się stosując chromatografię po odparowaniu fazy wodnej i ponownym rozpuszczeniu substancji w fazie metanol-woda.
13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że rozdział składników posiadających aktywność przeciwnowotworową przeprowadza się stosując technikę HPLC i zbiera się składniki i czasach retencji o wartościach w przybliżeniu 0,777, 1,044, 1,175, 1,575 i 2,284.
14. 14. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że roztwór wodny zatęża się przez odparowanie w kolbie wyparki obrotowej i wprowadza się alkohol etylowy i eter naftowy, tworząc osad, który po odparowaniu do sucha daje proszek o barwie bladoróżowej, który badany techniką HPLC wykazuje czasy retencji 0,728, 0,994, 1,-452, podczas gdy płynną część z kolei

    168 929 odparowuje się otrzymując amorficzną substancję o barwie czerwonej, która podczas HPLC wykazuje pojedynczy pik o czasie retencji równym 1,591.
15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że zarówno osad, jak i amorficzna substancja pochodząca z płynnej pozostałości poddaje się krystalizacji w postaci proszku o barwie czerwonej przez zawieszenie w alkoholu metylowym i alkoholu izopropylowym.
16. 16. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że roztwory zatęża się w kolbie do odparowywania, do której dodaje się następnie alkoholu metylowego i eteru etylowego, tworząc osad, który po usunięciu płynnych pozostałości, zawiesza się w alkoholu izopropylowym i odparowuje otrzymując proszek o barwie bladoróżowej, który podczas HPLC wykazuje następujące czasy-retencji 0,728 (2,18% pola powierzchni); 0,994 (40,89% pola powierzchni), 1,452 (56,93% pola powierzchni).