NL8302765A

NL8302765A - Werkwijze voor het bereiden van anti-tumor-glycoproteinen.

Info

Publication number: NL8302765A
Application number: NL8302765A
Authority: NL
Original assignee: Mochida Pharm Co Ltd
Priority date: 1982-08-04
Filing date: 1983-08-04
Publication date: 1984-03-01
Also published as: IT8348806A0; GR78638B; BR8304143A; DD213440A5; KR840006127A; PL243306A1; SE8304276D0; GB8320547D0; PT77154B; FI832776A; FI832776A0; SE8304276L; GB2125048A; JPS5925332A; DE3328239A1; AU1759283A; NO832811L; DK356483A; LU84946A1; PT77154A

Description

L i * β vo U986

Titel: Werkwijze voor het "bereiden van anti-tumor-glycoprotexnen.

De uitvinding betreft een werkwijze voor het bereiden van een anti-tumor-glycoprotexne met een kleiner molecuulgewicht dan dat van een uitgangs-anti-tumor-glycoproteïne door verlaging van het molecuulgewicht van een anti-tumor-glycoproteïne met een hoog molecuul-5 gewicht door een behandeling met een reductiemiddel en het vervolgens winnen van anti-tumor-glycoproteinen met een verminderd molecuulgewicht uit het reactiemengsel.

Ondanks het feit dat vele therapeutische middelen tegen tumoren zijn ontwikkeld, is de genezing van tumoren door dit soort therapeute tische middelen nog bijzonder gering, zodat nog altijd naarstig wordt gezocht naar verbeterde therapeutische middelen.

De uitvinding betreft nu een werkwijze voor het bereiden van dit soort anti-tumor-glycoprotexnen.

Deze hebben een lager molecuulgewicht en worden bereid uit anti-t5 tumor-glycoprotexnen met een hoger molecuulgewicht.

De uitvinding betreft daartoe een werkwijze voor het verkrijgen van CB^, CB^ en CB^ in een hoge opbrengst.

Voor het bereiden van de onderhavige glycoprotexnenmet betrekkelijk lage molecuulgewichten wordt een anti-tumor-glycoprotexne met een hoger 2q molecuulgewicht behandeld met een reductiemiddel^ waarna de gevormde anti-tumor-glycoprotexnen met een verminderd molecuulgewicht worden gewonnen. Op deze wijze kan een anti-tumor-glycoprotexne CB met een gewenst molecuulgewicht in een hoge opbrengst worden verkregen.

Bij de uitvinding speelt een rol, dat reticulo-endotheliale cellen 25 die een belangrijke rol spelen bij het biofylactisch mechanisme,een stof kunnen produceren, die tumoren kan genezen, waarbij recentelijk is ontdekt dat er vier soorten anti-tumor-glycoprotexnen zijn met verschillend molecuulgewicht, die uit een extract of een cultuurvloeistof van reticulo-endotheliale cellen, lymfoblasten, leukemiecellen of 2o fibroblasten van warmbloedige dieren kunnen worden verkregen, welke zijn aangeduid als Carcino-3reaker X (molecuulgewicht 12.000 - 17.000), 8302765 » » -2- (molecuulgewicht 70.000 - 90.000), Xg (molecuulgewicht kO.OOO - 50.000) en X^ (molecuulgewicht 7.000 - 9-000) (zie de Amerikaanse octrooiaanvrage Serial No. 1*67.81*0 van 18 februari 1983; deze glycoproteïnen worden hieronder aangeduid als CB^, CB^, GB^ en 0Βχ^ en al omvattend 5 als CB)

Aangezien CB^ - CB^ in een mengsel in een extract van een cultuurvloeistof van reticulo-endotheliale cellen, lymfoblasten, leukemiecellen of 'fibrohlasten van warmbloedige dieren aanwezig zijn, is het bijzonder moeilijk een car'cino-breker met een gewenst molecuul-10 gewicht, speciaal met een geringer molecuulgewicht, zoals CB^.- of CB^.^ in een grote hoeveelheid effectief en exclusief te verkrijgen.

Er is nu gezocht naar een effectief procédé voor het verkrijgen en zuiveren van CB^, CB^p en/of CB^ en daarbij is gesronden, dat door een afbraakbehandeling van een anti-tumor-glycoproteïne (carcino-breker) 15 verkregen uit een extract of een bovenstaande cultuurvloeistof van reticulo-endotheliale cellen, lymfoblasten, leukemiecellen of fibroblasten van warmbloedige dieren met een reductiemiddel,uit het verkregen vloeibare reactiemengsel een anti-tumor-glycoproteïne met een molecuulgewicht van 1*0.000 - 50.000, t.w. CB™, voorts een anti- 20 tumor-glycoproteïne met een molecuulgewicht van 12.000 - 17.000, t.w.

CB^ en/of een anti-tumor-glycoproteïne met een molecuulgewicht van 7.000 - 9.000, t.w. CB^^,gemakkelijk en in een hoge opbrengst kunnen worden verkregen.

De termen 0Βχ, CB^ , CB^ en CB^» die hieronder worden ge-^ bruikt, worden gedefinieerd als de carcino-breker-anti-tumor-glyco-proteïnen die hieronder nader worden beschreven en de volgende eigenschappen bezitten: CBX: (1) Molecuulgewicht : 12.000 - 17.000; 30 (2) Kleurreacties : Vertoont een kleur van proteïnen bij de Lowry-reactie, vertoont een kleur van peptidebindingen en aminozuren bij de ninhydrine-reactie na een hydrolyse met zoutzuur en vertoont een kleur bij de suiker-reactie met fenol-zwavelzuur, anthron-zwavel zuur, indool-zwavelzuur en tryptofan-zwavelzuur; 35 (3) uiterlijk en oplosbaarheid: Wit poeder, dat oplosbaar is in 8302765 -3- * 4 water, waterig natriumchloride en fosfaatbuffer en vrij slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform; (k) suikergehalte: 27-33%, waarbij de suiker voor 17-20$ uit hexosen, voor 5-7$ uit hexosaminen en 5-6$ uit sialinezuren bestaat; 5 (5) isoëlectrisch punt: k,3 - 7,3; (6) adsorbeerbaarheid: Adsorbeerbaar op met Ulex europeus-agglutinine-geconjugeerde Sephadex in een 0,01 M fosfaatbuffer met pH 7,2; (7) stabiliteit: Stabiel in een waterige oplossing met pH 2,0, 10 pH 7,0 of pH 11,0 bij U°C gedurende 2k uren of langer en in een waterige oplossing met pH 7,0 bij 60°C gedurende 3 uren of langer; (8) cytotoxiciteit: Beschadigt:·;tumorcellen selectief zonder een duidelijke beschadiging van normale cellen; en (9) differentiatie: Differentieert de tumorcellen weer tot 15 normale cellen.

CBxr (l) moleeuulgewi'eht: 70.000 - 90.000; (2) kleurreacties: Vertoont een kleur bij de Lovry-reaetie op eiwitten, vertoont een kleur op peptidebindingen en aminozuren bij 20 de ninhydrinereactie na een. hydrolyse met zoutzuur en vertoont een kleur op suikers bij de fenol-zwavelzuurreactie» de anthron-zwavelzuur-reactie, de indool-zwavelzuurreactie en de tryptofan-zwavelzuurreactie; (3) uiterlijk en oplosbaarheid: Wit poeder, dat oplosbaar is in water, een waterige zoutoplossing en fosfaatbuffer en slecht oplos- 25 baar in benzeen, hexaan en chloroform; (4) suikergehalte: 35 - ^5$, waarbij de suiker voor 23 - 28$ uit hexosen, voor 8 - 11$ uit hexosaminen en voor k - 6% uit sialinezuur bestaat; (5) isoëlectrisch punt: ^,3 - 6,2; 30 (6) adsorbeerbaarheid: Adsorbeerbaar op met Ulex europeus- agglutinine-geconjugeerde Sephadex in een 0,01 M fosfaatbuffer met pH 7,2;

(7) stabiliteit: Stabiel in een waterige oplossing met pH 2,0, pH

7,0 of pH 11,0 bij k°C gedurende 2b uur of langer en in een waterige 35 oplossing met pH 7,0 bij 60°C gedurende 3 uren of langer; en 8302765 -k- (8) cytotoxiciteit: Beschadigt tumorcellen selectief zonder normale cellen noemenswaardig te beschadigen.

CBX2: (1) molecuulgewicht: 1*0.000 - 50.000; 5 (2) kleurreacties: Vertoont een kleurreactie op eiwitten hij de Lowry-reactie, vertoont een kleurreactie op peptidehindingen en aminozuren hij de ninhydrinereactie na een hydrolyse met zoutzuur en vertoont een kleurreactie op suikers hij de fenol-zvavelzuurreactie, de anthron-zwavelzuurreactie, de indool-zvavelzuurreactie· en de 10 tryptofan-zwavelzuureactie; (3) uiterlijk en oplosbaarheid: Wit poeder, dat oplosbaar is in water, waterig natriumchloride en fosfaathuffer en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform; (1;) suikergehalte: 30 - 37%, welke suikers voor 20 - 23% uit 15 hexosen, 6-8% uit hexosaminen en k - 6% uit sialinezuur bestaan; (5) isoëlectrisch punt: U,2 - 7,3; (6) adsorbeerbaarheid: Adsorbeerbaar op met Ulex europeus-agglutinine-geconjugeerde Sephadex in een 0,01 M fosfaathuffer met pH 7,2; (7) stabiliteit: Stabiel in een waterige oplossing met pH 2,0, 20 pH 7,0 of pH 11,0 bij U°C gedurende 2k uren of langer en in een waterige oplossing met pH 7,0 bij 6o°C gedurende 3 uren of langer en (8) cytotoxiciteit: Beschadigt tumorcellen selectief zonder normale cellen noemenswaard te beschadigen.

CV

25 (l) molecuulgewicht: 7-000 - 9*000; (2) kleurreacties: Vertoont een kleurreactie op eiwitten bij de Lowry-reactie, vertoont een kleurreactie op peptidehindingen en aminozuren bij de ninhydrinereactie na een hydrolyse met zoutzuur en vertoont een kleurreactie op suikers met de fenol-zwavelzuurreactie.

30 de anthron-zwavelzuurreactie, de indool-zwavelzuurreactie en de tryptofan-zwavelzuurreactie; (3) uiterlijk en oplosbaarheid: Wit poeder, dat oplosbaar is in water, waterig natriumchloride en fosfaathuffer en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform; 35 (U) suikergehalte : 8 - 15%, waarbij de suiker voor 6 - 10% 8302765 -5- « uit hexosen, 1-2% uit hexosaminen en 1 - 3% uit sialinezuur "bestaat; (5) adsorbeerbaarheid: Adsorbeerbaar op carboxymethylcellulose bij ionenuitvisselingschromatografie onder toepassing Tan carboxy- 5 methylcellulose in een 0,05 M fosfaatbuffer met pH 6,k; (6) stabiliteit: Stabiel in een waterige oplossing met pH 2,0, pH 7,0 of pH 11,0 bij k°C gedurende 2b uren of langer en in een waterige oplossing met pH 7,0 bij 6o°C gedurende 3 uren of langer; (7) cytotoxiciteit: Beschadigt tumorcellen selectief zonder 10 normale cellen noemenswaard te beschadigen en (8) de aminozuurrolgorde bij het H-terminale eiwitstuk is alanine-alanine-.

De uitvinding wordt in zijn algemeenheid als volgt uitgevoerd:

Een anti-tumor glycoprotelne CB met een hoger molecuulgewicht dan het 15 gewenste molecuulgewicht, dat is afgescheiden en gezuiverd uit een celextract van een cultuurvloeistof wordt in een passende concentratie, b.v. 10 - 10.000 mg/1 opgelost en vervolgens afgebroken door een reactie met een passende hoeveelheid van een reductiemiddël. Het reactiemengsel wordt gedialyseerd, het dialysaat uitgezouten en het 20 gevormde neerslag afgefiltreerd. Vervolgens worden deze neerslagen opgelost in een kleine hoeveelheid van een fysiologische zoutoplossing of een gebufferde oplossing en na dialyse deze oplossing gegelfiltreerd onder toepassing van Sephadex G-50 waarna een anti-tumor-glycoprotelne met het gewenste molecuulgewicht wordt verkregen.

25 Met het woord '’afbraak1’ wordt hier bedoeld, dat een glycoprotelne met een hoger molecuulgewicht wordt omgezet in een glycoprotelne met een lager molecuulgewicht door een chemische breuk in de intramoleculaire bindingen, zoals disulfidebindingen.

Het uitgangsmateriaal bij de uitvinding is het liefst CB^ of 30 CB^, hoewel ook CB^ kan worden gebruikt, wanneer CB^ een gewenst produkt is. Hoewel als uitgangsmateriaal bij voorkeur een oplossing van gezuiverd CB^ en/of CB^ in een buffer, een fysiologische zoutoplossing of gedestilleerd water wordt gebruikt, is het ook mogelijk een celextract of een cultuurvloeistof met CB daarin te gebruiken.

35 CB fran worden verkregen uit een extract of een cultuurvloeistof 8302765 • * - · * -β- van reticulo-endotheliale cellen, lymfoblasten, leukemiecellen of fibroblasten van warmbloedige dieren. Details omtrent de produktie daarvan en het anti-tumoreffect van CB zijn beschreven in de eerdergenoemde Amerikaanse octrooiaanvrage.

5 Voorbeelden van reductiemiddelen, die kunnen worden gebruikt bij de uitvinding, omvatten thiolverbindingen, zoals 2-mercaptoëthanol, dithiothreitol, dithioerythritol, thioglycolzuur, monothiofosforzuur, enz., metaalwaterstofcomplexen, zoals natriumboorhydride, tertiaire fosfinen, zoals tri-n-butylfosfine, tris-diëthylaminoëthylfosfine 10 enz.; sulfieten, zoals natriumsulfiet, cyaanzuurzouten, zoals cyano-geenbromide, metaalionen, zoals zilverionen, enz. Deze verbindingen zijn dezelfde als gewoonlijk worden gebruikt voor ontleding en verwijdering van eiwitachtige contaminanten met een hoog molecuulgewicht, voor het afbreken van een hogere dimensionale structuur van een eiwit 15 en de analyse van de basisstructuur van een eiwit. Proteïnen die met deze verbindingen zijn behandeld, verliezen vaak hun biologische activiteit, maar het was dan ook verrassend, dat de onderhavige afbraakbehandeling mogelijk is zonder dat de anti-tumoractiviteit teloorgaat.

20 De voorwaarden bij het uitvoeren van de uitvinding, zoals de concentratie van het reductiemiddel, behandelingstemperatuur, de behandelingsduur, de behandelings-pH enz. kunnen passend worden gekozen afhankelijk van het gewenste doel, b.v. of men CB^. danwel CB^ afzonderlijk of beide wenst te verkrijgen. Het reductiemiddel kan . -1 -9 25 worden toegepast in een concentratie van 10 - 10 M, liefst b.v.

van 10-5 - 10~9 M 2-mercaptoëthanol, 10 2 - 10 ^ M dithiothreitol, 10-2 - 10“^ M dithioerythritol, ΙΟ-·*" - 10-^ M monothiof osf orzuur, ÏO-2 - 10-¾ natriumboorhydride of 10“^ - 10-^ M thioglycolzuur.

De behandelingstemperatuur kan binnen vrij ruime grenzen variëren* 30 zolang het glycolproteïne geen denatur.ering ondergaat; meestal wordt 0 - 3T°C, liefst 15 - 25°C toegepast. De behandelingsduur kan passend worden gekozen naargelang een CB met gewenst molecuulgewicht wordt gezocht; gewoonlijk bedraagt deze duur 10 minuten tot 2 uren. De pH wordt gewoonlijk gekozen tussen zwakzuur en neutraal, b.v. tussen 35 5,5 en 7,5. Voorts zorgt men bij het uitvoeren van de afbraakbehandeling 8302765 φ * -τ- bij voorkeur voor een oppervlakte-actief middel, b.v. een ionogeen middel als natriumdodecylsulfaat of een nonionogeen middel als Triton X in het reactiemiddel teneinde de opbrengst te verhogen. De optimale concentratie van het oppervlakteactieve middel varieert afhankelijk 5 van het uitgangsmateriaal bij de afbraakbehandeling, liefst tussen 0,001 en 10%. De ionogene middelen omvatten anionogene, kationogene en amfotere stoffen. Voorbeelden zijn natriumdodecylsulfaat, zouten van cholinezuur enz. Voorbeelden van kationogene middelen zijn 'iodecyltriTnethylammom'nmTrrnmiflp enz. en voorbeelden van amfotere 10 middelen zijn desoxylysolecithine enz. Voorbeelden van passende non-ionogene middelen zijn Triton, de Tweens, de Spans enz. Men kan afzonderlijke middelen toepassen, maar ook mensels van oppervlakteactieve stoffen.

De uitvinding wordt aan de hand van de volgende voorbeelden 15 nader toegelicht. >

Voorbeeld I : a) Bereiding van de uitgangsmaterialen: CB met een vrij hoog molecuulgewicht (t.w. CB^, CB^ en CBjr) gebruikt als uitgangsmateriaal bij de voorbeelden 1 - 7 werd 20 als volgt bereid: 2 x 1010 cellen menselijke lymfocyten werden gesuspendeerd in 1*000 cm^ Eagle's medium met daarin 10% kalverserum en na toevoeging van fytohemagglutinine (Difco) tot een uiteindelijke concentratie van 50 ]Og/cm^ 1*8 uren bij 3T°C gekweekt in een atmosfeer van 5% COg, 25 en 95% atmosferische lucht. Vervolgens werd de bovenstaande vloeistof van het cultuurmedium gedialyseerd tegen een 0,01 M fosfaatbuffer met pH 7,2 en een fractie?uitgezouten met 1*0 - 80$'s ammoniumsulfaat, uit het dialysaat verkregen. Deze fractie werd opnieuw tegen de fosfaatbuffer gedialyseerd en gegelfiltreerd met Sephadex G-100 van 30 Pharmacia.

Aldus werden onzuiver CB^ , CB^ en 0Βχ verkregen in fracties met molecuulgewichten van 70.000 - 90.000, 1*0.000 - 50.000 en 12.000 - 17.000.

Het onzuivere CB^ werd geadsorbeerd op met Ulex europeus 35 agglutinine (Maruzen Oil Co.) geconjugeerde Sephadex en geëlueerd met 8302765 -8- * 0,01 M fosfaat buff er met daarin 0,5 M glucose. Ha wegdialyseren van de glucose werd CB^ opnieuw geadsorbeerd op de met Ulex europeus-agglutinine-geconjugeerde Sephadex, gevolgd door een eluering volgens de gradiëntmethode onder toepassing van een fosfaatbuffer met pH 7 »2, 5 waarbij CB^ werd geëlueerd. Gezuiverd CB^ met een specifieke activiteit van 50.000 eenheden/mg werd in een totale hoeveelheid van 5000 eenheden in een behandeling verkregen.

Onzuivere 0Βχ2 werd op dezelfde wijze gezuiverd en gezuiverd CByp met een specifieke activiteit van 20.800 eenheden/mg werd in een totale hoeveelheid van 5*200 eenheden bij een behandeling verkregen.

Onzuivere CB^. werd eveneens op dezelfde wijze gezuiverd en daarbij gezuiverde CB^ verkregen met een specifieke activiteit van 10.000 eenheden/mg in een totale hoeveelheid van 10.000 eenheden.

]_5 Gezuiverd CB^ met een specifieke activiteit van 7*500 eenheden/mg werd hiernaast nog verkregen in een totale hoeveelheid van 150 eenheden, uitgaande van dezelfde aantallen menselijke lymfocyten^gevolgd door dezelfde behandeling met dit verschil, dat geen fytohemagglutinine in het kweekmedium werd toegepast.

20 De activiteit wordt steeds aangegeven in de concentratie die de proliferatie van 10^ HB^cellen als een geheel voor 50$ remt.

b) Afbraakbehandeling.

200.000 eenheden CB^ met molecuulgewicht 70.000 - 90+000 25 werden opgelost in een fysiologische zoutoplossing en 1 uur bij kamer- J -7 temperatuur bij aanwezigheid van 5 x 10 M 2-mercaptoëthanol omgezet. Ha deze reactie werd het reactiemengsel gedialyseerd en uitgezouten met 80$’s ammoniumsulfaat, waarna de neergeslagen fractie werd afgefiltreerd. Deze fractie werd opgelost in fysiologische 30 zoutoplossing en gegelfiltreerd met Sephadex G-50. Fracties overeenkomende met molecuulgewichten Uo.000 - 50.000; 12.000 - 17.000 en 7-000 - 9*000 werden opgevangen en aangeduid als fractie a» fractie B resp. fractie C. De bovenweergegeven procedures werden tevens herhaald bij aanwezigheid van 0,05$ SDS (natriumdodecylsulfaat), waarbij dezelfde 35 fracties werden verkregen.

8302765 -9-

De fysicochemische eigenschappen van deze fracties A, B en G werden nagegaan, waarna ze werden aangeduid als CB^, CB^ en De resultaten zijn samengevat in tabel A.

8302765 g . oj g <u ft O ft O 3 o cn p

• W -P

O σ\ PQ G

O G

OJ I ft ' •H 03

-PO O

O O ft

GO

G · G

ft t- <ü

O <U

S . 'Ö .

° Ö 1 d «G |

•H *“—· G O

+3 0 +3 <1-1

o O G O

03 o G G

G · W O

ft t- PQ Μ h H O ·Η Λ G « , Si ö

G I OJ

> <U +3 G

•HO (β OJ

G -P O > ^

<U CJ O G

ft G * * G

p+ JH OJ G «8

g ft h oj « O

+3 +3 Φ G

o o g λ oj _ m 2 5* » "2 G —· Λ G o <u ö c vd ^ ,2 60 ·Η 0J O G Ό •H OJ G JU _ 4) G N ·Η G '—· ft «jg p p ra ra ra ra ra ή

φ G OJ OJtOGGGGikH

rj n o ip o OJ OJ OJ OJ OJ

o ra ·ηρ,*ΡΡ,«-Μ£

DJ >—* O G +3 ·Η ·Η ·Η ·Η ·Η ·Η OJ

•Η Ο ι—I ·Η ft § G G Ρ G G <U

β ο c\jft ojGrararararabQ

S Ο X Ο G ftwv-^w'-'WW — ρ · ffl p w O O O «C3 O IA G P .

o oj ra > __ _ -P

•η ι <ö o -30¾ go ra 0) Η t* G ·Η p ·Η Η >s «G O Oft ρ Η P G Ρ o ra ft o ft° g p g h ö ·η o OJ O HIP i° rGl> 0

<t| ·Η · +3 P +3 I I -P I I H

+3 0 p (UraGOjramG

H OH" Ο Η ·<~3 OJ H ·<-} •’•O P

<U CÖ ft OJ Ο ·Η Ο Ο ·Η ·Η OJ

p GO ·ΗΗ •H-^'G G ·Η G G r-j

aj ft S S ra > bO bO !> bQ 60 P

E-· ^ ____ HI 'ί- H CM ·—· OJ ^

ft OJ CM OJ

O OJ > G G G I G

oj c «β 3‘23S3

•H G OJ ·Η > I G HP P GP

ft OJ "Ρ ·Η ·—‘ G«^'CNON|l>3ftN'-' aj ·Η ft ·— 'pIC'JOHPHHHOHrn ϋ vj (U O >s>»H GajftOJOOJftOJft •H -¾ Λ «J G^OGP^G^O^ft^ft

ft -HG OJ gGGP-PGGG'PGftGH

•H HG G 0·Η OJP 5 Is' I·3 ClïGjSO

p GG G G G Gti <!«.·;« hn M

G OJ p p

0) p 03 OJ

φ ·Η Ο Η Η 3 Η Μ __________________._ 8302765 -ΐΐι-

, S

I >s LA

ö o « o ^ | .ri U O · -=f u P P O , " ij ai <ü O Ό 0 ta 03 ai c _ 2 O 60 o >ri W g OS *5 -P <U W CO : o .___. ΗΗΦΜ λ·ΗΟΚ O JnHiUS O^ t- <° * g o a3 <u οι H <u . „ c- 5 °. .3 3 £ ' 2s s “ ' hho.« ·ί 'S S5 s « -I | 5 § i'ii sisals * ® 1 §o «vchh 5 ? g I I g S S l

Sc- < P -H S S . ’Ö S, * S °- I 3

5 η I

Pi fc g <D <“3

_ rt e +J C

o c °" I 1 °. '43 I w s o * - 41 M- * l δ .

(231¾¾.¾¾ 60 Vi t· ί 5 . iS

w 000¾¾.¾¾ cara S tic OO 00 CU C— Ό O I S c a § ί 8 I I I I Ss CU S * g - g S t- C- 1Λ ΙΛ OH « ® «"* ® § 450 ‘S H ° o ~ g .g ° <p § TË 1 Η δ ° S α p S ·Η s o

43 rg U <U CO H

dj ai ® ^ art +3 S <D <0

'o, «J Ό O

_ Qi (ü * ^ f S

o §· m c w g i d ö 'E ^ φ ö ® < * «> pi * ,H i ,ï .2 o 1^¾¾¾.¾¾ p h ' s 5 § ^ e t 2 00 0J CO vo § g 4» CU '|rT ll

g · I I I I « g £ _* £ 0° £ 8 H

Pt, 5 OOVOJ· <C 60 P CQ-=rpPO

CO CU ° Ό

—X (U

ja· P

2 Ü p ^

ί . & -S s ‘I

p c s <u h .¾ <U -H ea <ü ^ pi

60 § 0) P H O

(ü 8 c 2 μ

Otara-H O n idOOH en rl io y

•η W * td « !n g O

ra w w ra “ I £ 8302765 1» ·».

-12- 1) Volgens de methode van Seikagaku Jikken Koza, Vol. 1 (Tanpakushitsu Teiryohou), 1971 2) Volgens de methode van Seikagaku Jikken Koza, Vol. 4 (Toshitsu Teiryohou), 1971 5 3) Volgens de methode van Seikagaku Jikken Koza, Vol. 3 (Shishitsu Teiryohou), 1971 1*) Spiro, H.A., Methods in Enzymology, Vol. 8, hlz. 3-26, 1966 5) Isoëlectrisch focusseren met Ampholine (van LKB Produkter AB,

Zweden)

C O

10 6) 10 cellen werden gekweekt in 1 cm Eagle's medium, met daarin 10$ kalverserum en elke fractie hij 37°C gedurende 1(-8 uren in een 5$ COg, 95$ luchtatmosfeer geïncubeerd, waarna het aantal van de levende cellen, die niet werden gekleurd door Trypan-Blauw werd geteld, en de cpncentratie van de fractie waarbij 50$ van de 15 cellen werd gedood werd gekozen als een maat voor de cytotoxiciteit.

De opbrengst aan activiteit voor elke fractie van voorbeeld X is weergegeven in tabel B.

Tabel B

20 'Afbraakbehandeling Activiteit (eenh.) «ίΊ ÖTT °h 0BX3 voor de behandeling 200.000 - ge 2-mercaptoethanol- behandeling 0 10.000 160.OOO 15.000 2-mercaptoëthanol + o 5.000 150.000 25.000

SDS behandeling 30 Voorbeeld II

200.000 eenheden CB^ werden opgelost in een fysiologische zoutoplossing en 1 uur bij kamertemperatuur bij aanwezigheid van -7 5 x 10 M 2-mercaptoethanol omgezet. Ha afloop van de reactie werd gedialyseerd en uitgezouten met ammoniumsulfaat, waarbij een fractie 35 werd verkregen die met Sephadex G-50 werd gegelfiltreerd.

8302765 -13-

Fracties met molecuulgewicht 12.000 - 17.000 (fractie B) en 7000—9000 (fractie C) werden opgevangen. Deze behandeling werd herhaald hij afwezigheid van 0.05? SDS. De fracties werden "bepaald als CB^ en 0Βχ3 als "beschreven in voorbeeld I. De opbrengst aan 5 CB^ en CB^ is weergegeven in tabel C.

Tabel C

Afbraakbehandeling Activiteit (eenh.) 10 CBX2 CBT CBX3 voor de behandeling 200.000 2-mercatoethanol- behandeling 0 170.000 20.000 2-mercaptoëthanol- 15 + 0 1^0.000 37.000 SDS-behandeÜng

Voorbeeld III

-7 200.000 eenheden CB- werden behandeld met 5 x 10 M 2-mercapto- 20 ^ ethanol en daarbij een fractie met molecuulgewicht 7000-9000 (fractie C) als bij voorbeeld Γ verkregen. Deze fractie werd geïdentificeerd als CB^. De opbrengst aan CB^ is weergegeven in tabel D.

Tabel D

25 afbraakbehandeling Activiteit (eenh.) v66r de behandeling 200.000 2-mercaptoéthanol- 30 behandeling 110.000 58.000 2-mercaptoëthanol- + 90.000 73.000 SDS-behandeling 35 8302765 -lil·-

Voorbeeld IV

Een mengsel van 100.000 eenheden 0Βχι en 100.000 eenheden CBy? werd behandeld met 5 x 10"^ M 2 -mer c apt o ethanol als beschreven in voorbeeld Γ. De opbrengsten aan CB^, 0Βχ en 0Βχ^ zijn weergegeven in 5 tabel E.

Tabel E

Afbraakbehandeling Activiteit (eenh.) 10 CBX1 °\2 CBX CBX3 véör de behandeling 100.000 100,000 2-mercaptoëthanol- behandeling 0 20.000 150.000 ; 20.000 2-mercaptoëthanol- ! 15 i + 0 I 3.000 ; iHo.ooo U2.000 SDS-behandeling j

_^-1-!-^-L

Voorbeeld V

2q Een mengsel van 100.000 eenheden CB^ en 100.000 eenheden 0Βχ werd behandeld met 5 x 10”^ M 2-mercaptoëthanol als beschreven in voorbeeld I. De opbrengsten aan CB^, CB^. en CB^ zijn weergeven in tabel F.

Tabel F

25 Afbraakbehandeling Activiteit (eenh.) CBX2 CBX CBX3 vöör de behandeling 100.000 100.000 0 ,n 2-mercaptoethanol- behandeling 0 120.000 65.000 2-mercaptoëthanol- ί + 0 90.000 . 77.000 SDS-behandeling 35 --- 8302765 -15-

Voorbeeld VI

Een mengsel van 100.000 eenheden CB^ en 100.000 eenheden CByp werd "behandeld met 5 x 10”^ M 2-mercaptoëthanol als "beschreven in voorbeeld I. De opbrengsten aan CB^. en CB^ zijn weergegeven in 5 tabel G.

Tabel G

Afbraakbehandeling Activiteit (eenh.) 1Q CBX2 CBX CBX3 V66r:de behandeling lOOvOOO 100.000 0 2-mercaptoëthanol- q 120.000 65.000 ; behandeling i i ; j I 1 ^ 2-mercaptoëthanol- j + 0 90.000 j TT.000 SDS-behandeling j

Voorbeeld VII

20 Een mengsel van 100.000 eenheden CB^, 100.000 eenheden CBy? en 100.000 eenheden werd behandeld met 5 x 10~^ M 2-mercapto-ethanol als beschreven in voorbeeld 1. De opbrengst aan CB^, 0Βχ en CB^ is weergegeven in tabel H.

Tabel H

25 ______

Afbraakbehandeling Activiteit (eenh.) _[ ^1 ^2 ; cbe : ¾ v66r de behandeling' 100.000 100.000 100.000 i — ! I ί 30 2-mercaptoëthanol- j j behandeling 0 23*000 S 2^0.000 * 22.000 : i 2-mercaptoëthanol- j + | 0 8.000 2^0.000 33.000 i SDS-behandeling ! } 35 ---1-1-^- 8302765 -16-

Voorbeeld VIII

Een mengsel met daarin 100.000 eenheden CB^, 100.000 eenheden CBen 100.000 CB^ werd behandeld met de reductiemiddelen weergegeven in tabel I en wel overeenkomstig voorbeeld I. De opbrengsten aan 5 CBx2’ CBX en CBX3 z^n Oergegeven in tabel I.

Tabel 1'

Reductiemidde'1 Concen- Activiteit (eenh.) tratie _ CBX1 CBX2 CBX3 10 ________ vöor de behandeling - 100.000 100.000 100.000: - _; i

Thiolglycolzuur 10”^ M 0 26.000| 2^0.000 25*000

Monothio-fosforzuur 10”^ M ' 0 27.000 260.000 11.000 15 _!_:_

c ; I

Tri-n-butylfosfine 10 M: ’ * 0 23.000 230.000 32.000 _|_ tri-diethylamino- ^ ethylfosfine 10 M 0 21.000 230.000 27·000 20 natriumsulfiet 1θ"Τ M 0 \ 25-000 220.000 29-000 cyanogeen-bromide 10 0 2h.000 2^0.000 28.000

(L I

zilverionen ·' 10 M | 0 23.000 2^0.000 25-000 j___

25 Voorbeeld IX

1 x 10^ cellen van menselijke BALL-1 cellen (Miyoshi, Nature, 267, 8^3-8½ (1977) die subcutaan waren voortgekweekt in blote muizen^ werden geuspendeerd in 20 1 Eagle'sc medium met daarin \0% kalfserum 8 o

en na een toevoeging van 1 x 10 pfu Sendai-virus 1+8 uren bij 37°C

30 in een 5% COg en 95% luchtatmosfeer geïncubeerd. De bovenstaande vloeistof van de cultuur werd gebruikt als uitgangsmateriaal. Deze vloeistof bevatte een mengsel van CB^ , CB^g, CB^ en CB^ · De afbraak- behandeling wérd bij deze vloeistof uitgevoerd door een toevoeging van 10-^ M 2-mercaptoëthanol en 0,1% SDS gedurende 1 uur bij kamer- 35 8302765 -17- temper atuur. Het reactiemengsel -werd hierna gedialyseerd en uitgezouten met ammoniumsulfaat en daarbij een fractie verkregen die werd ge-gelfiltreerd door Sephadex G-50 en daarbij CB^, CB^ en CR^ verkregen. De resultaten zijn weergegeven in tabel J.

5 Tabel J

ml..... ' — — 11 1 —.......-.......;

Afbraakhehandeling Activiteit (eenh.) _ ' ; CBx1 CBa : CBX ^3 voor de behandeling U7.0QQ ; U9.OOO ; 98*000 500 na de behandeling 0 1.000 150.000 37500 1 1 - —? 1 { 1. π. 1 tu — --T-

Voorbeeld X

-7

Voorbeeld.IX werd herhaald, met dit verschil, dat 5 x 10 M 2-mercaptoethanol als reductiemiddel werd gebruikt en elke verbinding weergegeven in tabel K bij de gegeven concentratie als oppervlakte-actief middel werd toegepast. De resultaten zijn weergegeven in tabel K.

Tabel K

20 -j-:-—-;-

Reductiemiddel | oppervlakte- Activiteit (eenh.) (concentratie) ‘ actief middel -----;- (concentratie) CB^ ; CB^ , 0Βχ j CB^ f · i voor de be- ! :

2^ handeling · U8.000; 51*000‘ 99*000 ; UOO

cholinezuur 0 2.000 15^.000 | 36.000 (0,0lZ) _:_I_ dodecyltrime- 2-mercapto- thylammonium- ! ^ ethanol bromide 0 1.000; 1^9*000 39*000 (5 X 10"T M) :---1- desoxylysoleci- 0 3*000:160.000 | 31*000 thine (0,01$)____i_

Tween 20 (0,01$) ί 0 2.000 i 159-000 ; 29*000 35 Span 60 i 0 1.000 15$.000 ! 31.000 {0,01% j 8302765 -18-

Voorbeêld. XX ο 5 x 10 cellen van runder-perifere lymfocyten werden gesuspen-

O

deerd in 1000 cm-3 Eagle's medium met daarin 10# kalverserum en uren bij 37°C in een 5# COg, 95# luchtatmosfeer gekweekt. De bovenstaande 5 vloeistof van de cultuur werd toegepast als uitgangsmateriaal.

Deze vloeistof bevatte een mengsel van 0Βχι, CBχ2, =¾ ,Ρ “:α·

De afbraakbehandeling werd bij deze vloeistof uitgevoerd door een toevoeging van 10 J ,M dithiothreitol en wel gedurende 2 uren bij kamertemperatuur, gevolgd door de handelingen die zijn beschreven 10 in voorbeeldίκς waarna 0Βχ2, 0Βχ en CB^ verden verkregen. De resultaten zijn weergegeven in tabel L.

Tabel L

afbraakbehandel. Activiteit (eenh.) CBX1 | CBX2 CBX CBX3 v66r de behandel. 13.000 12.000 23.000 200 na de behandel. 0 1.000 32.000 11.000

20 Voorbeeld XII

lu ...

3 x 10 cellen van menselijke fibroblast Flow 7000-cellen

O

(Flow Co.) werden in 6.000 car Eagle's medium met daarin 10# kalvers erum gesuspendeerd en na toevoeging van fytohemagglutinine tot een uiteindelijke concentratie van 50 mg/1 kQ uren bij 37°C 25 in een 5# C0g, 95# luchtatmosfeer gekweekt. De bovenstaande vloeistof werd gebruikt als uitgangsmateriaal. Deze vloeistof bevatte een mengsel van CB^ , CB^g, CB^ en CB^ · De afbraakbehandeling werd bij deze vloeistof uitgevoerd met 0,1 M natriumboorhydride bij kamertemperatuur gedurende 2 uren, gevolgd door een opwerking als in 30 voorbeeld IX Verkregen werden CB^g, CB^ en CB^ j als weergegeven in tabel M.

35 8302765 -19-

Tabel Μ * 11 — ' I ! ι» - ..... 1 1 . 1 < . .

Afbraakbehandel. activiteit (eenii.) 02 X1 I C3T2.

- 5 ------:-- v66r de behandel. 16.000 18.000 35-000 ; 600 na de "behandeling 0 1.700 52.000 17.000

Voorbeeld XIII

10 2 X 101^ cellen van perifere menselijke lymfocyten werden in U.000 cm^ Eagle's medium met daarin 10# kalverserum gesuspendeerd en na een toevoeging van fytohemagglutinine tot een uiteindelijke concentratie van 50 mg/1 kQ uren hij 37°C gekweekt in een atmosfeer van 5# CO2 en 95# lucht. De bovenstaande vloeistof van deze cultuur y. werd als uitgangsmateriaal gebruikt. Deze vloeistof bevatte een mengsel van CB^, CB^j en CB^· De afbraakbehandeling werd uitgevoerd door een toevoeging van 5 x 10”Sl dithioërythritol en wel 1 uur bij kamertemperatuur, gevolgd door een overeenkomstige procedure als bij voorbeeldig waarna CB^, CB^. en CB^ werden 2Q verkregen. De resultaten zijn weergegeven in tabel N.

Tabel N

Afbraakbehandel. Activiteit (eenh.) { —m·· I··· I — —— _ CBX1 f chz CBx =¾ 25 ____[ voor de behandel. 23.000 j25.000 ,51.000 800 na de behandel. 0 2.000 83.000 j 13.000 i _i_[

Voorbeeld XIV

30 lx 10^° menselijke Ball-1 cellen die waren voorgekweekt 3 door een weefselcultuur werden gesuspendeerd in 2.000 cm Eagle's medium met daarin 10# kalverserum en U8 uur bij 37°C in een atmosfeer van 5# CO2 en 95# lucht geïncubeerd.

De bovenstaande vloeistof van deze cultuur werd gebruikt 35 als uitgangsmateriaal. Deze vloeistof bevatte een mengsel van 8302765 -20- 0Βχι, 0Βχ2, 0Βχ en CB^-. De afbraakbehandeling werd Bij deze cultuur uitgevoerd met 5 x 10~ M 2-mercaptoëthanol en wel 2 uren of 5 minuten Bij kamertemperatuur, gevolgd door handelingen als weergegeven in voorbeeld IX Verkregen werden CB^, CB^ en CB^ · De resultaten zijn 5 weergegeven in tabel 0.

Tabel 0

Afbraakbehandeling Activiteit (eenh.) 10 CBX1 ! CBX2 ; CBX3 v66r de behandeling 5-200 · 1)-.900 . 11.000 110 na de behandeling (2 uren) 0 300 13.000 7-100 na de behandeling (5 min) 3.600 5-^00 12.000 120 15 --

Indien de afbraakbehandeling 5 minuten duurde konden CB^, en CB^ in hog£ opbrengsten worden verkregen; daarentegen leverde een 2 uur durende afbraakbehandeling CB^ en CB^ in hoge opbrengsten op. Voorbeeld XV Zuivering van CB^, 0Βχ en CB^.

2Q Onzuiver 0Βχ2, 0Βχ en CB^» verkregen bij de voorgaande voor beelden kunnen verder worden gezuiverd en wel op een gebruikelijke wijze voor het zuiveren van biologische stoffen.

0Βχ2 en 0Βχ werden b.v. gezuiverd volgens de methode van voorbeeld Ia) voor het bereiden van de uitgangsmaterialen door een 2^ toepassing van met Urex europeus agglutinine geconjugeerde Sephadex. Verkregen werden gezuiverd CByg en CB^ met specifieke activiteiten van 2k00 eenh./mg en 2500 eenh./mg.

CBX3 werd· 10,v* gezuiverd door een adsorptie op concanavaline A-houdende Sepharose, gevolgd door elueren met Ο,ΟΙ,Μ fosfaatbuffer 2Q met pH 7»2 met daarin 0,5 M cL-methyl-D-mannoside. Ha verwijdering door een dialyse van hete/ -methyl-D-mannoside werd de oplossing aangebracht op carboxymethylcellulose, geëquilibreerd met een 0,05 M fosfaatbuffer met pH 6,0, gevolgd door elueren met een 0,05 M fosfaatbuffer met pH 7»3. Dit resulteerde in een gezuiverd CB^-P^paraat met een ^cj specifieke activiteit van 2100 eenh./mg.

8302765 -21- ►

Effectiviteit, giftigheid, de wijze ran toepassing en dos erin aan van het CB volgens de uitvinding.

Experiment 1: Selectiviteit van het cytotoxische effekt.

5

Monsters van 10 cellen van elk van diverse tumor cellijnen, 5 t.w. KB-cellen (nasofarynx-kanker), MX-l-cellen (borstkanker afkomstig van Dr. Shigeru Tsukagoshi, Kanker Instituut), HEp-2 cellen (keelkanker) en HEt-cellen (hepatoom van Flow Co.) en normale cellijnen van darm ^07-cellen, Girardi hartcellen, Chang levercellen, Vero-cellen (apennier) en MDCK-cellen öhondenier;van Flow Co.), die alle 10 2h uren tevoren waren vóorgekweekt^ alsmede 10^ cellen van zowel P388 en L1210 cellen (leukemie, geleverd door het Dr.Shigeru Tsukagoshi,

Kanker Instituut), die onmiddellijk werden gebruikt, werden elk gekweekt in 1 crn^ van een Eagle's medium met daarin 10$ kalverserum en elke proefstof en wel bij 37°C gedurende 48 uren in een 5% CC>2, 95% lucht-15 atmosfeer. Vervolgens werd het aantal levende cellen, die niet werden gekleurd door Trypan-Blauw geteld onder een lichtmicroscoop en de concentratie van de proefstof waarbij 50$ van de cellen werd gedood berekend tegen een controle die willekeurig op 100 werd gesteld.

Als proef stoffen werden gebruikt : CB^, CB^. en CB^ verkregen volgens 20 voorbeeld XV, j5- en -lymfotoxinen verkregen volgens een bekende methode (Granger G.A.: Cellular Immunology, 38, 388-1(-02 (1978) )s alsmede Mitomycine C. Een eenheid van de lymf otoxinen wordt aangeduid door een gebruikelijke index die gebaseerd is op de cytotoxiciteit jegens muizen—L—cellen (Eds., Bloom, B.R. & Grade, P. R. "In Vitro Methods 25 in Cell—mediated Immunity", Academic Press, 1979)· De resultaten zijn weergegeven in tabel P.

A

8302765 -22- o

(U

ö

•H

0 _

§gjvOfr--=rHC\JV0· on H o H

8— on h cm on j· on on oj oj la -a-

1 I

0

Ή <D

^ ·Η H t~” C— I I I I H ON II

Η W S CO I

1 O "'s

•H Vs 4J W

<D

0 -------------------------------

U I

bO O <D

j3 —'

8 I’S *3 H ON I I

ioN O LA 1 I I I ON I

S3 I +> H OJ

g ___

bQ I

Ö o

•H Ch Ü H

a g.rl g 1 S, t- i o i i

<U H O H 00 VO I 1 I I t- H

I -P^ H

'pf’__ o

IA

u o o

_ b> 00·—» O O O O O

P-< mh o ia 4· t~ o j o o o en on (U CQ S Λ Λ Λ Λ Λ Λ Ο ΟΟ VO l«f\ Η ·Η ϋ'^-.ΗΗΗΗΟΟοη Η ΗΗ 1 13 5 S ϊ___ S3 Ο

(J

S3 Ο —» Ο CV1 Η Ο Ο Ο Ο Ο XS ο no on no on I—I ο ο o cm la

rn η η λ λ λ λ Ο OO NO SON

ϋ Η HHHHoncO ΗΗΗ * --- Ό

U

<ΰ Ο ---—- >.

(U

hO

-Ρ —» ·Η Η Ο LA CM t— Η Ο Ο ΟΟΟΟ 3 bd g ΛΛΛΛΛΛ Ο OOrH -4* ρί <. Η Η Η Η on 00 ο ο Ο νο ÜA . -Ρ Ο Η ΗΗΗ _0> "" - ’ö -—...... — - ....... I— I - ra

•H

ssss s ' g s -e -P ajcococfl g ffl g . ? U aJcdtdajcaca cofflco Ό 0

O S S B S η ·η S §§&ö S

o 3 3 3 3 0 3 3 3 3 cd ο ·η cq 53ΛΛΛ0Β Λ Λ Λ cd Λ ^ 0) ---------Q.

(U

§ >ü -p

cd CM O i-1 ¢50 ?-i · H

C 'I Η H CO S cd -P S3 <U O S tJ

H ft'! Η I CM CO HIHShSh cd !> ShO

ο ffl 1¾ ' W ^ ^ on ceoHaJ^ooQ

O SS:agi-qft Ό-4·ΟΛΟΗ>§ =

__________ I

0) =

I S3 H S

u <a aj φ Ο Η S Η -Ρ S Η J-t Η Ο 3 <u o ο ο

ËH ο SO S

8302765 -23-

Als "blijkt uit deze resultaten "beschadigt CB selectief de tumorcellen zonder dat noemensvaardige schade wordt berokkend aan de normale cellen. Daarentegen vertoonden de** -, 6- entf -lymfotoxine en het Mitomycine C een niet selectieve cytotoxiciteit tegen de normale 5 en de tumorcellen.

f

Experiment 2 Invloed op muizen, getransplanteerd met Sarcoom l80 of Ehrlich tumor.

Mannelijke muizen van. de ddY-stam met een gewicht van 25-30 σ werden intraperitoneaal getransplanteerd met 3 x 10^ cellen per dier aan 10 Sarcoom l80 of Ehrlich ascites tumor en de overlevingsduur in dagen waargenomen. CB^, CB^ en CB^» verkregen volgens voorbeeld XIII, werden intraveneus toegediend aan groepen van 5 muizen èn vel dagelijks vanaf 1 dag na de transplantatie tot hun dood. De resultaten, uitgedrukt in percentages van de gemiddelde overlevingsduur van de 15 proef groep vergeleken met de controlegroep, zijn weergegeven in tabel Q.

8302765 -2b-

Tabel ' ~~ ' i - gemiddelde !

Tumor proefstof dagelijkse dosis overlevings:- ____tijd ia ai 1.2 E/kg 112 CB k E/kg 132 12 E/kg 16?

Sarcoom _ * 11* 180 ®X2 3 E/kS 13* 10 E/kg 160 CB 1 E/kS 109 X3 3 E/kg 133

10 E/kg 15U

Mitomycine C__0,5 E/kg__1^1 _ Cy clofos f ami de__20 E /kg__j_jn_ 1.2 E/kg lUo CB ^ E/^S 160 X 12 E/kg 186

Ehrlich

Ascites 1 E/kg 13f tumor X?. 3 E/kg 1°^

10 E/kg 1ST

cm 1 E/kg 1^° CBX3 3 E/kg 155 10 E/kg 181

Mitomycine C__0,5E/kg__1^5_

Cyclofosfamide 20 „,, 205 --i_:-E/kg-1 8302765 -25-

Experiment 3 Invloed op de overlevingstijd van longcarcinoom houdende muizen.

BDF.-mannelijke muizen van 20-25 g werden getransplanteerd met 2 x 10 cellen van Lewis' longcarcinoom en wel intramusculair in de 5 rechter dij, waarna het aantal dagen dat ze overleefden, werd waargenomen. CB^, CByp en CB^, verkregen volgens voorbeeld Xy, werden intraveneus toegediend aan groepen van 6 muizen en wel dagelijks vanaf een dag ha de transplantatie tot hun dood. De resultaten weergegeven in de procentuele overlevingstijd van de proef groepen 10 vergeleken met de controlegroep zijn weergegeven in tabel R.

Tabel R

!

Proefstof dagelijkse dosis gemiddelde over- levingsduur in (%) 15 -;-:- , 1,2 E/kg 10*8

CBjj. k E/kg llU

12 E/kg j 150

20 1 E/kg ! 10T

CR£2 3 E/kg I 123 10 E/kg I 1^5 1 E/kg 116

25 CBX3 3 E/kg lfcO

10 E/kg 158 i |

Mitomycine C 0,5 mg/kg j 120 t

Cyclofosfamide 20 mg/kg 162 30 _J_

Experiment 1 Invloed op een longmetastase van kanker.

Groepen BDF^ mannelijke muizen van 20-30 g, 6 dieren in elke groep, werden subcutaan in de rug geënt met 2 mm vierkante 35 segmenten Lewis's longkanker. CB^, CB^ en CB^, verkregen volgens 8302765 w -26- voorbeeld X7 -werden eenmaal per dag gedurende 12 dagen vanaf de negende dag na de transplantatie intraveneus toegediend. Op de 21ste dag na de transplantatie werd de massa primaire tumor geïsoleerd en gewogen en bet aantal gemetastaseerde kernen in de long van bet dier 5 berekend volgens de methode van Wexler (J. Uatl. Cancer Institute, 36, 6Ul (19ββ)). De resultaten zijn weergegeven in tabel S.

Tabel S

ί )

Proefstof Dagel. dosis Tumorgewicht Aantal gemetastaseer- (g) de kernen in de longen

Controle — 8.8 - 0.8 30.1 i 5-6

CBj 3 E/kg b.k t l.l· x 6.7 - 2.9 X

30 E/kg 3.2 ί 0.5 ** 0.5 - 0.3 **

(¾ 3 E/kg i k.5 t 1.5 X 6.9 - 2.1 X

15 30 E/kg : 2.3 * 0.U 20 0.7 - 0.U ** CB^ 3 E/kg Iv.1 - 1.3 X T.0 - 2.8 x 30 E/kg I 2.1 ί 0.3 “ 0.6 - 0.3 **

Cyclofos- 20 E/kg 3.6 * 0.7 “ 0.7 - 0Λ “ famide 20 ___

Hoten: De resultaten in de tabellen zijn weergegeven als (gemiddelde) j, - (standaardafwijking) X ♦

Statistisch verschillend van de controlegroep met een waar-25 schijnlijkheid van p *5%

XX

Statistisch verschillend van de controlegroep met een waarschijnlijkheid van p -1# .

Als uit deze resultaten duidelijk blijkt, onderdrukken CB^, CBV_ en CB_« de primaire longkanker en zijn metastasen zeer succesvol.

30 Experiment 5. Giftigheidsproef (enkelvoudige toediening).

Drie groepen mannelijke muizen van de BDF^-stam met een gewicht van 20-25 g, 10 dieren in elke groep, kregen elk 10.000 E/kg CB^, 10.000 E/kg CBvo of 100.000 E/kg CBV,, waarna de dieren 7 dagen werden geobserveerd. Alle 10 dieren in de telkens gebruikte groepen overleefden 35 zonder enige wijziging in het lichaamsgewicht of de algemene conditie ondanks-.de zeer hoge hoeveelheden glycoproteïnen.

8302765 < -27-

Experiment 6 Giftigheidsproef (30 dagen continue toediening).

Mannelijke muizen van de BDF^-stam. met een gewicht, van 20-25 g, 10 dieren in elke groep, kregen CB^, CB^ of CB^ gedurende 30 dagen intraveneus toegediend, waarna het aantal dode dieren, 5 de verandering in het lichaamsgewicht en de algemene conditie werden waargenomen. Het lichaamsgewicht werd tussen 9 en 10 uur ’s ochtends gemeten en de algemene conditie werd bekeken op de 10e, de 20ste en de 30ste dag en wel volgens de methode van Arvien (Science, 36, 123 (1962)). Het resultaat was, dat er in deze 30 dagen geen dier dood 10 gingjWanneer 1000 E/kg/dag CB^ of CB^ danwel 10.000 E/kg/dag aan 0Βχ3 wert^· toegediend, bovendien was de gewichtstoename zo ongeveer dezelfde als die bij de controlegroep. Ook wat betreft de algemene conditie, deze was nagenoeg gelijk aan die in de controlegroep.

Uit de bovenweergegeven experimenten blijkt, dat CB^ CB^? en 15 CB^g de groei van tumorcellen selectief onderdrukken en bovendien niet alleen een kankermetastase duidelijk tegengaan maar tevens bijzonder effektief zijn tegen diverse tumoren en bijzonder veilig, zelfs in doses die aanmerkelijk hoger zijn dan de dosis waarbij een genezend effekt duidelijk manifest is. 0Βχ, CB^ en CB^ zijn dus bijzonder 20 goed toepasbaar in een therapie voor diverse tumoren, zoals maagkanker, longkanker, hepatoom, dikkedarmkanker, borstkanker, uteruskanker, leukemie enz. Bovendien kunnen betrekkelijk laagmoleculaire gewichtsvormen van CB (0Βχ, CB^ en CB^) worden afgeleid van betrekkelijk hoogmoleculaire vormen (CB^, CB^, CB^) door een behandeling 25 met een reductiemiddel.zonder dat de tumorbestrijdende effectiviteit schade ondergaat.

8302765

Claims

1. Werkwijze voor het bereiden van een anti-tumor-glycoproteïne met verminderd molecuulgewicht, met het kenmerk, dat men uitgaande van tenminste een anti-tumor-glycoproteïne uit een extract of een vloeistof van een cultuur van reticulo-endotheliale cellen, lymfo- 5 blast·? leukemiec ellen of fibroblast en van warmbloedige dieren deze afbreekt door een reactie van dit anti-tumor-glycoproteïne met een reductiemiddel, en vervolgens tenminste een anti-tumor-glycoproteïne met verminderd molecuulgewicht wint.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het 10 · uitgangs-anti-tumor-glycoproteïne glycoproteïne 0Βχι is en het anti-tumor-glycoproteïne met verminderd .molecuulgewicht tenminste een van de glycoproteïnen CB^, CB^ en CB^ is.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het glycoproteïne CB^ werd verkregen uit een bovenstaande vloeistof van een 15 cultuur van reticulo-endotheliale cellen, lymfoblasten, leukemie- cellen of fibroblasten van warmbloedige dieren door uitzouten van de bovenstaande vloèistof en fractioneren van een neerslag daaruit door gelfiltratie waarbij een fractie met een molecuulgewicht van 70.000- 90.000 wordt verkregen, dat vervolgens wordt geadsorbeerd en ge-20 elueerd op en van met Ulex europeus-agglutinine-geconjugeerde Sephadex. h. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het uit-gangs-anti-tumor glycoproteïne CB^ is, en het glycoproteïne met verminderd molecuulgewicht tenminste een van de fracties CB^ en

25 CB^3 is·

5. Werkwijze volgens, conclusie met het kenmerk, dat het uit-gangs-anti-tumor.«glycoproteïne 0Βχ2 werd verkregen uit de bovenstaande vloeistof van een cultuur van reticulo-endotheliale cellen, lymfoblasten, leukemiecellen of fibroblasten van warmbloedige dieren, 30 door uitzouten van de bovenstaande vloeistof en fractioneren van een precipitaat daarvan door een gelfiltratie, waarbij een fractie werd geïsoleerd met een molecuulgewicht van l0.000 - 50.000, waarna deze fractie werd geadsorbeerd en geëlueerd op en van met Ulex europeus-agglutinine-geeonjugeerde Sephadex. 8302765 -29- ► i

6. Werkwijze volgens conclusie 1» met het kenmerk, dat het uitgangs-glycoproteïne CB^ is en het glycoproteïne met verminderd, molecuulge-wicht: CB^2* T· Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat het uit-5 gangs-glycoproteïne CB^ werd verkregen uit de bovenstaande vloeistof van een cultuur van reticulo-endotheliale cellen, lymfohlasten, l,eukemipc<»n.ian of fihroblasten van warmbloedige dieren door een uitzouting van de bovenstaande vloeistof en het fractioneren van het precipitaat daarvan door een gelfiltratie ter isolatie van een 10 fractie met een molecuulgewicht van 12.000 - 17-000, welke fractie vervolgens werd geadsorbeerd en geëlueerd op en van met Ulex europeus-agglutinine-geconjugeerde Sephadex.

8. Werkwijze volgens conclusie 1 , met het kenmerk, dat het re-ductiemiddel tenminste een lid is van de groep van de thiolverbindingen, 15 de metaalhydridecomplexen, de tertiaire fosfinen, de sulfieten, de cyanaten en de metaalionen.

9. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het re-ductiemiddel behoort tot de groep van de thiolverbindingen, de metaal-hydridecomplexen, de tertiaire fosfinen , de sulfieten, de cyanaten 20 en de metaalionen.

10. Werkwijze volgens conclusie b, met het kenmerk, dat het re-ductiemiddel behoort tot de groep van de thiolverbindingen, de metaal-hydridecomplexen, de tertiaire fosfinen, de sulfieten, de cyanaten en de metaalionen.

11. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat het re- ductiemiddel behoort tot de groep van de thiolverbindingen, de metaal-hydridecomplexen, de tertiaire fosfinen, de sulfieten, de cyanaten en de metaalionen.

12. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat een thiol-30 verbinding wordt gebruikt in de vorm van 3-mereaptoëthanol, dithio- threitol, dithioërythritol, thioglycolzuur en monothiofosforzuur.

13. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat als thiol wordt gebruikt: 3-mercaptoëthanol, dithiothreitol, dithio-erythritol, thioglycolzuur of monothiofosforzuur. 35 ik. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat als thiol wordt gebruikt: 3-mercaptoëthanol, dithiothreitol, dithio- 8302765 Λ -30- erythritol, thioglycolzuur of monothiofOsforzuur.

15. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat als thiolverbinding wordt gebruikt: 3-mercaptoëthanol, dithio-thrèitol, dithioërythritol, thioglycolzuur of monothiofosforzuur.

16. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de af- braakbehandeling wordt uitgevoerd bij aanwezigheid van een oppervlakte-actief middel.

17. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de af-braakbehandeling wordt uitgevoerd bij aanwezigheid van een oppervlakte- 10 actief middel.

18. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat de afbraak-behandeling wordt uitgevoerd bij aanwezigheid van een oppervlakte-actief middel.

19. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de af-15 braakbehandeling wordt uitgevoerd bij aanwezigheid van een oppervlakte- actief middel.

20. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat de afbraak-behandeling wordt uitgevoerd bij aanwezigheid van een oppervlakte-actief middel.

21. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat als oppervlakte-actief middel wordt gebruikt: natriumdodecylsulfaat, natriumcholaat, dodecyltrimethylammoniumbromide, desoxylysolecithine, Triton X, Tween 20 of Span δθ.

22. Werkwijze volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat als 25 oppervlakte-actief middel wordt gebruikt: natriumdodecylsulf aat, natriumcholaat, dodecyltrimethylammoniumbromide, desoxylysolecithine, Triton X, Tween 20 of Span 60.

23. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de af-braakbehandeling wordt uitgevoerd bij een temperatuur tussen 0 en 37°C 30 en een pïï tussen zwakzuur en neutraal. 2k. Werkwijze volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat de afbraak- behandeling wordt uitgevoerd bij een temperatuur tussen 0 en 37°c en een pH tussen zwakzuur en neutraal.

25· Werkwijze volgens conclusie 23, met het kenmerk, dat de tem- 35 peratuur is gelegen tussen 15 en 25°C. 8302765 S -31

26. Werkwijze -volgens conclusie 2b, met het kenmerk, dat de temperatuur is gelegen tussen 15 en 25°C. 8302765