NO832811L

NO832811L - Fremgangsmaate ved fremstilling av anti-tumor glykoproteiner

Info

Publication number: NO832811L
Application number: NO832811A
Authority: NO
Inventors: Haruo Ohnishi; Kazuo Yamaguchi; Yasuo Suzuki; Ei Mochida; Nobuo Mochida
Original assignee: Mochida Pharm Co Ltd
Priority date: 1982-08-04
Filing date: 1983-08-03
Publication date: 1984-02-06
Also published as: DD213440A5; KR840006127A; NL8302765A; IT8348806A0; BR8304143A; DE3328239A1; LU84946A1; YU161983A; PL243306A1; DK356483A; BE897470A; FR2531435A1; JPS5925332A; FI832776A0; GR78638B; SE8304276D0; DK356483D0; GB2125048A; SE8304276L; FI832776A

Abstract

Anti-tumorglycoproteiner med redusert molekylvekt som erholdes ved nedbrytning av minst ett utgangsanti-tumorglycoprotein. Dette stammer igjen fra et ekstrakt eller en kultursupernatant av reticuloendoteliale celler, lymfoblaster, leukemiceller eller fibroblaster fra varmblodige dyr. Anti-tumorglycoproteiner med redusert molekylvekt fremstilles ved å omsette utgangsanti-tumorglycoproteinet med et reduksjonsmiddel og deretter gjenvinne ett eller flere anti-tumorglycoproteiner med redusert molekylvekt.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved fremstilling av et anti-tumorglykoprotein med en mindre molekylvekt enn utgangsmaterialets, hvilket omfatter reduksjon av molekylvekten til et anti-tumorglykoprotein med en større molekylvekt ved behandling med et reduserende middel, og deretter isolering av anti-tumorglykoproteiner med redusert molekylvekt fra reaksjonsblandingen.

Til tross for at mange terapeutiske midler mot tumorer

hittil er fremlagt av en rekke forskere i verden, er hel-bredelsesandelen av tumorer med slike terapeutiske midler mot tumorer fortsatt meget lav, og utvikling av ytterligere forbedrede terapeutiske midler søkes sterkt.

Et formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe~en fremgangsmåte ved fremstilling av anti-tumorglykoproteiner .

Et annet formål for oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av anti-tumorglykoproteiner med mindre molekylvekter ut fra et anti-tumorglykoprotein med en større molekylvekt.

Et videre formål for oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte for å fremstille CB i høyt utbytte.

Enda et mål for oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av CB^ i et høyt utbytte.

Et ytterligere mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte ved fremstilling av CB i høyt utbytte.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte ved fremstilling av ett eller flere anti-tumorglykoproteiner med mindre molekylvekt enn utgangsmaterialets, hvilket består i å omsette et anti-tumorglykoprotein med en større molekyl-

vekt med et reduserende middel og deretter erholdte anti-Itumorglykoproteinene med en redusert molekylvekt fra rejak-

sjonsblandingen. '

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan et anti-tumorglykoprotein CB med en ønsket molekylvekt fremstilles i høyt utbytte.

Det er funnet at reticuloendoteliale celler som spiller en viktig rolle i den biofylaotiske mekanisme muligens kunne gi en substans som kan kurere tumorer etter lange sammen-" hengende og intense studier av dette emnet. Det ble nå funnet at fire typer anti-tumorglykoproteiner med forskjellige molekylvekter fra et ekstrakt eller en kultur-supernatant av reticuloendoteliale celler, lymfoblaster, leukemiceller eller fibroblaster fra varmblodige dyr, hvilken ble kalt Carcino-Breaker X (molekylvekt 12.000 - 17.000), X1(molekylvekt 70.000 - 90.000), X2(molekylvekt

-40.000 - 50.000) og X3(molekylvekt 7.000 - 9.000) (Se japanske patentansøkninger nr. 28992/1982, 28993/1982, 87674/1982, 87675/1982, 10846/1982 og den samtidige

"US patentansøkning nr. 467.840 av 18. februar 1983. Disse glykoproteiner kalles i det følgende CBX, CB^, CBX209 nennoldsvis CBx3'og i tilfeller hvor de nevnes samlet CB).

Da CBX - CBX2foreligger i blanding i et ekstrakt eller en kultursupernatant av reticuloendoteliale celler, lymfoblaster, leukemiceller eller fibroblaster fra varmblodige dyr, har det vært vanskelig effektivt å utelukkende å oppnå en "carcino-breaker" med en ønsket molekylvekt, "spesielt slike med mindre molekylvekter, f.eks. CBXeller CBX2i større mengder.

Foreliggende oppfinnelse er tilstrebet en effektiv prosess for fremstilling og rensing av CBX, CB^ og/eller CB^ og som et resultat kommet til at ved nedbrytende behandling av et anti-tumorglykoprotein (d.v.s. en "carcino-breaker") erholdt fra et ekstrakt eller en kultursupernatant av

reticuloendoteliale celler, lymfoblaster, leukemiceller jeller fibroblaster fra varmblodige dyr med et reduksjorjs-

middel, får man fra denne liten reaksjonsblanding et anti- ^ tumorglykoprotein med en molekylvekt på 40.000 - 50.000, d.v.s. CBX2/ et anti-tumorglykoprotein med en molekylvekt 12.000 - 17.000, d.v.s. CBX og/eller et anti-tumorglykoprotein med en molekylvekt 7.000 - 9.000, d.v.s. CB^

lett og i et høyt utbytte, hvilket utgjør foreliggende oppfinnelse.

Uttrykkene CBX, CBxl, CBx2 og CBx3som brukes i denne - søknad defineres som "carcino-breaker" anti-tumorglykoproteiner som omtales i det foregående avsnitt og med følgende egenskaper:

CBX:

(1) Molekylvekt: 12.000 - 17.000; (2) Fargereaksjoner: viser en farge som indikerer proteiner i Lowry-reaksjonen, viser en fargereaksjon som er typisk for peptidbindinger og aminosyrer i ninhydrinreaksjon etter hydrolyse med saltsyre, og viser en s fargereaksjon typisk for sukkere i fenol - svovel-syrereaks jonen , antron - svovelsyrereaksjonen, indol - svovelsyrereaksjonen og tryptofan - svovelsyrereaksjonen; (3) Utseende og oppløselighet: hvitt pulver oppløselig i vann, vandig natriumklorid og fosfatpuffer og lite løse-lig i benzen, heksan og kloroform; (4) Sukkerinnhold: 27 - 33 %, sukkersammensetning 17 - 10 % heksoser, 5 - 7 % heksosaminer og 5 - 6 % sialsyrer; (5) Isoelektrisk punkt: 4,3 - 7,3; (6) Adsorberbarhet: adsorberbar på Ulex europeus agglutinin-korrigert Sefadex i 0,01 M fosfatpuffer (pH 7,2); (7) Stabilitet: stabil i en vandig løsning med pH 2,0, pH \ 7,0 eller pH 11,0 ved 4°C i 24 timer eller lenger^gg i en vandig løsning med pH 7,0 ved 60°C i 3 timer eller lenger;

( 8) Cytotoksisitet: ødelegger selektivt tumorceller uten i

vesentlig grad å ødelegge normale celler; og

(9) Differensiering: induserer differensiering av tumorceller, d.v.s. overfører tumorceller til normale celler.

(1) Molekylvekt: 70.000 - 90.000; (2) Fargereaksjoner: viser en farge typisk for proteiner i Lowry-reaksjonen, viser en farge typisk for peptidbindinger og aminosyrer i ninhydrinreaksjon etter hydrolyse med saltsyre, og viser en farge typisk for sukkere i fenol - svovelsyrereaksjoner, antron - svovelsyrereaksjoner, indol- svovelsyrereaksjonen og tryptofan - svovelsyrereaksjonen; (3) Utseende og løselighet: hvitt pulver oppløselig i vann, vandig natrium-klorid og fosfatpuffer og lite løselig i benzen, heksan og kloroform; (4) Sukkerinnhold: 35 - 45 %, sukkersammensetning 23 - 28 % heksoser, 8 - 11 % heksosaminer og 4 - 6 % sialsyrer; (5) Isoelektrisk punkt: 4,3-6,2; (6) Adsorberbarhet: Adsorberbar på Ulex europeus agglutinin-konjugert Sefadex i 0,01 M forsfatpuffer (ph 7,2); (7) Stabilitet: stabil i en vandig løsning med pH 2,0, pH 7,0 eller pH 11,0 ved 4°C i 24 timer eller lengre og i en vandig løsning med pH 7,0 ved 60°C i 3 timer eller

lenger; og

1(8) Cytotoksisitet:ødelegger selektivt tumorceller ut^n

å vesentlig ødelegge normale celler. '

CBX2 :

(1) Molekylvekt: 40.000 - 50.000; (2) Fargereaksjoner: viser en fargereaksjon typisk for proteiner i Lowry reaksjonen, viser en fargereaksjon typisk for peptidbindinger og aminosyrer i ninhydrinreaksjonen etter hydrolyse med saltsyre, og viser en farge typisk for sukker i fenol - svovelsyrereaksjonen, antron - svovelsyrereaksjonen, indol - svovelsyrereaksjonen og tryptofan - svovelsyrereaksjonen; (3) Utseende og løselighet: hvitt pulver oppløselig i vann, vandig natriumklorid og fosfatpuffer og lite løselig i benzen, heksan og kloroform; (4) Sukkerinnhold: 30 - 37 %, sukkersammensetning 20 - 23 % heksoser, 6 - 8 % heksosaminer og 4 - 6 % sialsyrer; (5) Isoelektrisk punkt: 4,2 - 7,3; (6) Adsorberbarhet: adsorberbar på Ulex europeus agglutinin-konjugert Sefadex i 0,01 M fosfatpuffer (pH 7,2); (7) Stabilitet: stabil i en vandig løsning med pH 2,0, pH 7,0 eller pH 11,0 ved 4°C i 24 timer eller lenger og i en vandig løsning med pH 7,0 ved 60°C i 3 timer eller lenger; og (8) Cytotoksisitet: ødelegger selektivt tumorceller uten vesentlig å ødelegge normale celler.

(1) Molekylvekt: 7.000 - 9.000;

!

(2) Fargereaksjoner: viser en farge typisk for proteiner i Lowry reaksjonen, viser en- farge typisk for peptidbindinger og aminosyrer i ninhydrinreaksjonen etter hydrolyse med saltsyre, og viser en farge som er typisk for sukkere i fenol - svovelsyrereaksjonen, antron - svovelsyrereaksjonen, indol - svovelsyrereaksjonen og tryptofan - svovelsyrereaksjonen; (3) Utseende og løselighet: hvitt pulver løselig i vann, vandig natriumklorid og fosfatpuffer og lite løselig i benzen, heksan og kloroform;

(4) Sukkerinnhold: 8 - 15 %, hvorav sammensetningen er

6 - 10 % heksoser, 1 - 2 % heksosaminer og 1 - 3 % sialsyrer; (5) Adsorberbarhet: adsorberbar på karboksymetylcellulose i ionebytterkromatografi med karboksymetylcellulose i 0,05 M fosfatpuffer (pH 6,4); (6) Stabilitet: stabil i en vandig løsning med pH 2,0, pH 7,0.eller pH 11,0 ved 4°C i 24 timer eller lenger og i en vandig løsning med pH 7,0 ved 60°C i 3 timer eller lenger; (7) Cytotoksisitet: ødelegger selektivt tumorceller uten vesentlig å ødelegge normale celler; og (8) Aminosyresekvensen til den N terminale delen av proteinet er alanin-alanin-.

Foreliggende oppfinnelse utføres generelt som følger:

Et anti-tumorglykoprotein CB med en større molekylvekt enn den ønskede molekylvekt, som er adskilt og renset fra et celle-ekstrakt eller en kultursupernatant, oppløses ved en passende konsentrasjon på f.eks. 10-10.000 ug/ml og nedbrytes ved omsetning med en passende mengde reduksjonsmiddel. Reaksjonsblandingen dialyseres, dialysatet utsaltes og de dannede

'utfellinger filtreres fra. Deretter o<p>pløses disse utfejll-

ingene i en liten mengde fysiologisk saltvann eller en pufferet løsning og etter dialyse gelfiltreres løsningen

med Sefadex G-50, hvilket gir et anti-tumorglykoprotein med den ønskede molekylvekt.

Uttrykket "nedbrytning" betyr her en behandling som over-fører et glykoprotein med en større molekylvekt i et glykoprotein med en mindre molekylvekt ved kjemisk bryting av de intramolekylære bindinger såsom disulfidbindinger.

Utgangsmateriale i foreliggende oppfinnelse er gjerne CB^^ eller CB^' selv om CBXogså kan brukes når CB^ er et ønsket produkt. Selv om det som utgangsmateriale foretrekkes å bruke en løsning av renset CBX^ og/eller CB^ i puffer, fysiologisk saltvann, destillert vann o.s.v., er det også mulig å bruke et celle-ekstrakt eller en kultursupernatant som inneholder CB per se.

CB kan fremstilles fra et ekstrakt eller en kultursupernatant av reticuloendoteliale celler, lymfoblaster, leukemiceller eller fibroblaster fra varmblodige dyr. Detaljer ved denne prosess for fremstilling av anti-tumor-virkning av CB er beskrevet i US patentansøkning 467.840,

av 18. februar 1983.

Eksempler på reduksjonsmidler som kan brukes i foreliggende oppfinnelse innbefatter tiolforbindelser såsom 2-merkaptoetanol, ditiotreitol, ditioerytritol, tioglykolsyre, monotiofosforsyre o.s.v., metallhydrogenkomplekser såsom natriumborhydrid, tertiære fosfiner såsom tri-n-butylfosfin, tris-dietylaminoetylfosfin o.s.v., sulfitter såsom natriumsulfit, cyansyresalter såsom cyanogenbromid, metallioner såsom sølvion o.s.v. Disse forbindelser er slike som i alminnelighet anvendes for spaltning og fjerning av proteinholdige høymolekylarvekts-kontaminanter,

for nedbryting av høyere dimensjonale strukturer i et protein og analysere proteinets grunnstruktur o.s.v.

Proteiner som behandles med disse forbindelser taper ofte I sin biologiske aktivitet, men det er overraskende at ne<j>d-

.brytningsbehandlingen er mulig uten tap av anti-tumor-aktiviteten ved foreliggende oppfinnelse. Betingelsene for å utføre denne oppfinnelse, såsom reduk-sjonsmiddelets konsentrasjon, behandlingstemperaturen, behandlingstypen, behandlings-pH o.s.v., kan passende velges avhengig av formålet, f.eks. om CBVeller CBV_. skal X X j erholdés •■ alene eller begge skal erholdes samtidig, o.s.v. Reduksjonsmiddelet kan anvendes i en konsentrasjon på '10 -9 -5-9 til 10 M, fortrinnsvis f.eks. 10 til 10 M 2-merkaptoetanol, 10~2 - IO-5 M ditiotreitol, 10~<2>- 10~<6>M ditio-1—6 —2 —5 erytritol, 10~ - 10 M monotiofosforsyre, 10 - 10 M — 1 —6 natriumborhydrid eller 10 - 10 M tioglykolsyre. Behandlingstemperaturen er ikke spesielt kritisk så lenge glyko-proteinene ikke denatureres, og 0-37°C, fortrinnsvis tempera-turer rundt 15-25°C kan gjerne brukes. Behandlingstiden kan "velges riktig slik at man får en CB med ønsket molekylvekt, hvilket generelt ligger i området 10 minutter til 2 timer. pH velges fortrinnsvis i området svakt sur til nøytralt, d.v.s. mellom ca. pH 5,5 og 7,5. Ved utførelsen av nedbrytningsbehandlingen kan videre et overflateaktivt middel, f.eks. et ionisk overflateaktivt middel såsom natriumdidecylsulfat (SDS), et ikke-ionisk-overflateaktivt middel såsom Triton X o.s.v. være til- stede i reaksjonsblandingen for å øke utbyttet. Den opti-male konsentrasjonen av det overflateaktive middel varierer avhengig av utgangsmateriale i nedbrytningsbehandlingen, gjerne i området fra 0,001 - 10 %. De ioniske overflateaktive midler omfatter anioniske, kationiske og amfotære sådanne. Eksempler på egnede anioniske overflateaktive midler er SDS, salter av kolinsyre o.s.v. Eksempler på egnede kationiske overlateaktive midler er dodecyltri-metylammoniumbromid o.s.v., og eksempler på egnede amfotære overflateaktive midler er deoksylysolecitin o.s.v. Eksempler på egnede ikke-ioniske overflateaktive midler er Triton, Tween type, Span type o.s.v. De overflateaktive i midler kan brukes enkeltvis eller i blandinger.iI ..Foreliggende oppfinnelse beskrives nærmere ved de følgende ikke-begrensende eksempler.

Eksempel 1

a) Fremstilling av utgangsmaterialer.

CB med større molekylvekt (d.v.s. CBX1, CBx2og CBX)

anvendt som utgangsmaterialer i eksemplene 1-7 ble fremstilt.

Menneskelymfocytter (2 x 10celler) ble oppslemmet i 4.000 ml Eagle's medium inneholdende 10 % kalveserum, og etter tilsetning av fytohemagglutinin (Difco Co.) ved en sluttkonsentrasjon på 50 ug/ml, dyrket ved 37°C i 48 timer~i.en 5 % C02, 9 5 % luftatmosfære. Deretter ble supernatanten av kulturmediet dialysert mot 0,01 M fosfatpuffer (pH 7,2) , og en fraksjon som var utsaltet med 40 - 80 % ammoniumsulfat erholdtes fra dialysatet. Denne fraksjonen ble dialysert på nytt mot samme fosfatpuffer og deretter gelfiltrert på Sefadex G-100 (Pharmacia Co.).

Rått CBjq, CBX2°9CBxernoldtes 1 fraksjoner med moleky1-vekter på 70.000 - 90.000, 40.000 - 50.000 og henholdsvis 12.000 - 17.000.

Rått CBX^ble adsorbert på Ulex europeus agglutinin (Maruzen Oil Co.)-konjugert Sefadex, og eluert med 0,01 M fosfatpuffer inneholdende 0,5 M fucose. Etter fjerning av fucose ved dialyse, ble CBjq adsorbert igjen på Ulex europeus agglutininkonjugert Sefadex, etterfulgt av eluering ved gradientmetoden ved bruk av fosfatpuffer (pH 7,2), hvorunder renset CBX^ble eluert. Renset CBjq med spesifik aktivitet 50.000 enheter pr. ml erholdtes i en totalmengde på 5.000 enheter i en operasjon.

Rått CBx2ble renset på samme måte og renset CBx2med . 'spesifik aktivitet på 20.8 00 enheter/ml erholdtes i en...

totalmengde på 5.200 enheter i en operasjon.

Rått CBVble også renset på samme måte og renset CB med spesifik aktivitet på 10.000 enheter/ml erholdtes i en totalmengde på 10.000 enheter i en operasjon. Renset CBVmed en spesifik aktivitet på 7.500 enheter/mg erholdtes også i en totalmengde av 150 enheter utfra samme antall menneskelymfocytter og ved å følge samme fremgangsmåte bortsett fra at cytohemagglutinin ikke var til stede i-kulturmediet.

Aktiviteten uttrykkes gjennom spesifiteten basert på den konsentrasjon som inhiberer 50 % av formeringen av 105 celler av KB-celler tatt som en enhet.

b) Nedbrytningsbehandling.

200.000 enheter CBxl(molekylvekt 70.000 - 90.000) ble

oppløst i fysiologisk saltvann og omsatt i en time ved

-7

romtemperatur i nærvær av 5 x 10 M 2-merkaptoetanol. Etter omsetningen ble reaks.jonsblandingen dialysert og utsaltet med 80 % ammoniumsulfat, og den utfelte fraksjonen ble frafiltrert. Denne fraksjon ble oppløst i fysiologisk saltvann og gelfiltrert med Sefadex G-50. Fraksjoner tilsvarende molekylvekten 40.000 - 50.000;

12.000 - 17.000 og 7.000 - 9.000 ble oppsamlét og kalt fraksjon A, fraksjon B og henholdsvis fraksjon C. De overnevnte fremgangsmåter ble gjentatt også i nærvær av 0,05 % SDS hvorved de samme fraksjoner erholdtes.

De fysiologiske egenskapene til disse fraksjoner A, B og C ble undersøkt og de viste seg å være henholdsvis CB, CBXog CBx3- Resultatene ble sammenfattet i tabell 1.

1) Ifølge metoden til Seikagaku Jikken Koza, Vol. 1 (Tan-pakushitsu Teiryohou), 1971-2) Ifølge metoden til Seikagaku Jikken Koza, Vol. 4 (To-shitsu Teiryohou), 1971 3) Ifølge metoden til Seikagaku Jikken Koza, Vol. 3 (Shi-shitsu Teiryohou), 1971 4) Spiro, H.A., Methods in Enzymology, Vol. 8, s. 3 - 26, 1966 5) Isoelektrofokusering ved bruk av "Amfolin" (tilgjengelig fra LKB Produkter AB, Sverige) 6) 10 5 celler ble dyrket i 1 ml Eagle's medium inneholdende 10 % kalveserum og hver fraksjon ved 37°C i 48 timer i en 5 % , 95 % luftatmosfære, hvoretter antallet av levende

celler som ikke ble farget med Tryptofanblått ble talt og konsentrasjonen av fraksjonen ved hvilken 50 % av cellene drepes ble tatt som et mål på cytotoksisitet.

Aktivitetsutbyttet for hver fraksjon i eksempel 1 er vist i tabell 2.

Eksempel 2 200.000 enheter CBv0 ble oppløst i fysiologisk saltvann og -7 omsatt 1 time ved romtemperatur i nærvær av 5 x 10 M 2-merkaptoetanol. Etter omsetningen ble dette dialysert og utsaltet med ammoniumsulfat hvilket ga en fraksjon som ble gelfiltrert med Sefadex G-50. Fraksjoner med molekylvekt 12.000 - 17.000 (fraksjon B) og 7.000 - 9.000 (fraksjon C) ble oppsamlet. De overnevnte fremgangsmåter ble gjentatt også i nærvær av 0,05 % SDS. Fraksjonene ble identifisert som CB^og CB^ på den måte som er beskrevet i eksempel 1. Utbyttet av CB^og CB^-j erholdt som resultat er vist i tabell. 3.

Eksempel 3

-7

200.000 enheter CBVble behandlet med 5 x 10 M 2-merkaptoetanol og en fraksjon med molekylvekt 7.000 - 9.000 (fraksjon C) erholdtes på lignende måte som i eksempel 1. Fraksjonen ble identifisert som CBX^som i eksempel 1. Erholdt utbytte av CBx3er vist i tabell 4.

Eksempel 4

En blanding av 100.000 enheter CBX1og 100.000 enheter CBx2ble behandlet med 5 x 10 7M 2-merkaptoetanol på lignende måte som i eksempel 1. Det erholdte utbytte av CBx2/CBXog CBX3er vist i tabell 5.

Eksempel 5

En blanding av 100.000 enheter CBV, og 100.000 enheter CB„

_ 7 Al X ble behandlet med 5 x 10 M 2-merkaptoetanol på lignende måte som i eksempel 1. Utbytte av CBvo, CBVog CBvr> er vist X^ X Xj

i tabell 6.

Eksempel 6

En blanding av 100.000 enheter CBXog 100.000 enheter CBx2ble behandlet med 5 x 10 7 M 2-merkaptoetanol på lignende måte som i eksempel 1. Det erholdte utbytte av CBX og CBX3vises i tabell 7.

Eksempel 7

En blanding av 100.000 enheter CBX1, 100.000 enheter CBx2og 100.000 enheter CB ble behandlet med 5 x 10~<7>M 2-

merkaptoetanol på lignende måte som i eksempel 1. Erholdt utbytte av CBx2, CBXog CBx3er vist i tabell 8.

Eksempel 8

En blanding inneholdene 100.000 enheter CBV, , 100.000 enheter CBx2°9100.000 enheter CBX ble behandlet med hvert reduksjonsmiddel som er oppført i tabell 9 ved en lignende metode som i eksempel 1. Det erholdte utbytte av CBX2, CBXog CBX3er vist i tabell 9.

Eksempel 9

1 x 10"<L1>celler menneske BALL-1 celler (Miyoshi,' Nature,

Vol. 267, s. 843-844, 1977) som hadde formert seg subkutant

i nakne mus ble oppslemmet i 20 1 Eagle's medium inneholdende 10 % kalveserum og, etter tilsetning av 1 x 10 8pfu Sendai-virus, dyrket ved 37°C i en 5 % CC>2, 95 % luftatmosfære i

48 timer. Den derved erholdte kultur-supernatant ble brukt som utgangsmateriale. Denne kultur-supernatant inneholdte— ~ en blariding av CBX1, CBx2,' CBXog CBX3. Nedbrytningsbehandlingen ble utført på denne kultur-supernatant ved tilsetning av 10 — 6 M 2-merkaptoetanol og 0,1 % SDS ved romtemperatur i en time. Reaksjonsblandingen ble dialysert og utsaltet med ammoniumsulfat hvilket ga en fraksjon som ble gelfiltrert med Sefadex C-5 0 og ga CBx2, CBXog CBx3- Resultatene er vist i tabell 10.

Eksempel 10

Fremgangsmåten fra eksempel 9 ble gjentatt, bortsett fra at

-7

5 x 10 M 2-merkaptoetanol ble brukt som reduksjonsmiddel og hver forbindelse angitt i tabell 11 i en gitt konsentrasjon ble brukt som overflateaktivt middel. Resultatene er vist i tabell 11.

Eksempel 11

5 x 10 9celler av perifere lymfocytter av storfe ble oppslemmet i 1.000 ml Eagle's medium inneholdende 10 % kalveserum og dyrket ved 37°C i en 5 % CO,,, 95 % luftatmosfære i 48 timer. Den derfra erholdte kultursupernatant ble brukt som utgangsmateriale. Denne kultursupernatant inneholdt en blanding av CB^, CBX2, CB^og CB^* Nedbrytningsbehandling ble utført på denne kultursupernatanten ved tilsetning av

-3

10 M ditiotreitol ved romtemperatur i 2 timer, etterfulgt

av lignende fremgangsmåter som i eksempel 9, hvilket ga CBx2'CB^ og CBX3- Resultatene er vist i tabell 12.

Eksempel 12

; 3 x 10"^ celler av humane fibroblast Flow 7.000 celler

T (Flow Co.) ble oppslemmet i 6.000 ml Eagle's medium inne-I holdende 10 % kalveserum og, etter tilsetning av fytohema- I gglutinin som ga en sluttkonsentrasjon på 50 ug/ml, dyrket ved 37°C i en 5 % C02, 95 % luftatmosfære i 48 timer. Kultursupernatanten som erholdtes fra dette ble brukt som et utgangsmateriale. Denne kultursupernatant inneholdt en blanding av CBxl, CBx2 i CBXog CBX3. Nedbrytningsbehandling ble utført på denne kultursupernatant i nærvær av 0,1 M natriumborhydrid ved romtemperatur i 2 timer, etterfulgt av lignende metoder som i eksempel 9, hvilket ga CBX2 CB^--og CBx3. Resultatene er vist i tabell 13.

Eksempel 13

2 x 10^ celler av humane perifere lymfocytter ble oppslemmet i 4.000 ml Eagle's medium inneholdende 10 % kalveserum og, etter tilsetning av fytohemagglutinin til en sluttkonsentrasjon på 50 ug/ml, dyrket ved 37°C i en 5 % C02, 95 % luftatmosfære i 48 timer. Den derved erholdte kultursupernatant ble brukt som et utgangsmateriale. Denne kultursupernatant inneholdt en blanding av CBX^, CBX2, CBX og CB . Nedbry tningsbehandling ble utført på denne kultur-supernatant ved tilsetning av 5 x 10 II ditioerytritol ved romtemperatur i 1 time, etterfulgt av lignende metoder som i eksempel 9, hvilket ga CBx2, CBXog CBx3«Resultatene er vist i tabell 14. Eksempel 141x 10"^ menneske Ball-1 celler som hadde formert seg ved cellekultur ble dyrket i 2.000 ml Eagle's medium inneholdende 10 % kalveserum og dyrket ved 37°C i en 5 % C02 , 95 % luftatmosfære i 48 timer. Den derved erholdte kultursupernatant ble brukt som et utgangsmateriale. Denne kultursupernatant inneholdt en bland- "~ ing av CB^, CBx2, CB^ og CB^. Nedbrytningsbehandling ble utført på denne kultursupernatant i nærvær av 5 x 10 ^ M 2-merkaptoetanol ved romtemperatur enten i 2 timer eller 5 minutter, og etterfulgt av lignende metoder som i eksempel 9, hvilket ga CBx2, CBXog CB^. Resultatene er vist i tabell 15.

Når nedbrytningsbehandlingen ble utført i 5 minutter, kunne CBx2og CBX oppnås i høye utbytter, mens 2 timers nedbryt-

ningsbehandling ga CBVog CB _ i høye utbytter.

X X ,3

Eksempel 15 Rensing av CBx2, CBXog CBX^

Rått CBx2, CBX og CBx3erholdt i de foregående eksempler kan renses videre om ønsket på vanlig måte anvendt for rensning av biologiske substanser.

CBx2og CBXble f.eks. renset ved den metode som er beskrevet i eksempel 1 a) ovenfor for fremstilling av utgangsmaterialer ved å bruke Urex europeus agglutinin-konjugert

Isefadex. Man fikk rensede CBV~ og CBVpreparater med s^esi-- A —I

fike aktiviteter på 2.400 enheter/mg og 2.500 enheter/mg.

CBx3ble renset f.eks. ved adsorpsjon på concanavalin A-konjugert Sefalose, etterfulgt av eluering med 0,01 M

fosfatpuffer (pH 7-2) inneholdende 0,5 M a-mety1-D-manno-sid. Etter fjerning av a-mety1-D-mannosid ved dialyse, ble løsningen satt på karboksymetylcellulose ekvilibrert med 0,05 M fosfatpuffer (pH 6,0), etterfulgt av eluering med 0,05 M fosfatpuffer (pH 7,8). Dette resulterte i et renset CBX3preparat med en spesifik aktivitet på 2.100 enheter/mg.

Virkningsgrad, toksisitet, bruksmetode og dosering av CB fra oppfinnelsen

Eksperiment 1 Selektivitet av den cytotoksiske effekt

Prøver av 10^ celler fra hver av flere tumorcellelinjer - innbefattet KB celler (nasofarynxkreft), MX-1 celler (brystkreft, levert fra Dr. Shigery Tsukagoshi, Cancer Institute), HEp-2 celler (strupekreft) og HEL celler (hepatoma, Flow Co.) og fra normale cellelinjer innbefattet innvolds 407 celler, Girardi hjerteceller, Chang lever-celler, Veroceller (apenyre) og MDCK celler (hundenyre)

(Flow Co.), hvorav alle var fordyrket 24 timer, og 10<5>celler av hver av P388 og L1210 celler (leukemi, levert fra Dr. Shigeru Tsukagoshi, Cancer Institute), som ble brukt øyeblikkelig - ble alle dyrket i 1 ml Eagle's medium inneholdende 10 % kalveserum og hver forsøkssubstans ved 37°C i 48 timer i en 5 % C02, 95 % luftatmosfære. Deretter ble antallet levende celler som ikke ble farget av Trypro-fanblått opptalt under et lysmikroskop og konsentrasjonen av forsøkssubstansen ved hvilken 50 % av cellene ble drept, ble beregnet mot en kontroll satt som 100. Som forsøks-substanser anvendtes CB^ r CB^og CBx3fremstilt i eksempel 15, a-, 3~og y-lymfotoksiner fremstilt ved en kjent metode (Granger G.A. et al., Cellular Immunology, Vol. 38, s. 388-402 (1978)) og Mitomycin C. En enhet av lymfotoksinet uttrykkes ved en vanlig index som er basert på cytotoks]isi--

teten på mus L celler (Eds., Bloom, B.R. & Grade, P.R. "In Vitro Methods in Cell-mediated Immunity", Academic Press, 1979). Resultatene er vist i tabell 16.

Som det fremgår av overnevnte resultater, ødelegger CB

selektivt tumorceller uten vesentlig å forårsake noen skader på normale celler. Derimot viste både a-, 0- og y-lymfo-toksin og Mitomycin C ikke selektiv cytotoksisitet overfor normale celler og tumorceller.

Eksperiment 2 Inflytelse på mus transplantert med Sarcoma

180 eller Ehrlich Tumor

Hannmus (ddy-stammen) som veide 25-30 g ble intraperitonealt transplantert med 3 x 10 celler pr. dyr Sarcoma 180 eller Ehrlich acites tumor og overlevelsestiden i dager ble observert. CBX, CB^°g (-Bx3fremstilt i eksempel 13 ble gitt intravenøst til grupper på 5 mus daglig fra 1 dag etter transplantasjon inntil død. Resultatene uttrykt i prosentdeler av gjennomsnittlig overlevelsesdager av forsøks-gruppene i forhold til kontrollgruppen er vist i tabell 17.

Eksperiment 3 Inflytelse på overlevelsesdagen til mus med lungecarcinom

Hannmus av BDF,-stammen som veide 20-25 g ble transplantert med 2 x 10 6 celler av Lewis lungecarcinom intramuskulært i høyre lår, og overlevelsesdagene ble observert. CB , CBv0

X2\Z

og CBx3fremstilt i eksempel 15 ble gitt intravenøst til grupper på 6 mus daglig fra en dag etter transplantasjon

frem til død. Resultatene uttrykt i prosentdeler av over levelsesdagene til forsøksgruppene i forhold til en kontroll-gruppe er oppført i tabell 18.

Eksperiment 4 Inflytelse på lungemetastase i kreft

Grupper av hannmus fra BDF^-stammen som veide 20-30 g, 6 dyr i hver gruppe, ble transplantert subkutant i ryggen med 2 mm kvadratisk segment av Lewis lungekreft. CB^, CB^ og CB^^ fremstilt i eksempel 15 ble gitt intravenøst en

gang om dagen i 12 dager fra 9. dag etter tranplantasjonen.

[ På den 21. dagen etter transplantasjonen ble massen av i primær tumor isolert og veid, og antallet metastasekulejr i

I

dyrets lunge ble beregnet ifølge H. Wexler's metode (J. Nati. Cancer Institute, Vol. 36, 641 1966). Resultatene er vist i tabell 19.

Anmerkninger) Resultatene i tabellen er uttrykt som (gjennomsnitt) + (standard avvik)

Statistisk forskjellig fra kontrollgruppen med en signifikansgrad på p ^ 5 %.

X ^-Statistisk forskjellig fra kontrollgruppen med en signifikansgrad på p ^ 1 %.

Som resultatene ovenfor viser klart undertrykket CBX, CB^ og CBx3med hell primær lungekreft og dens lungemetastase.

Eksperiment 5 Toksisitetsforsøk (engangs administrering)

Tre grupper hannmus av BDF^-stammen som veide 20-25 g, 10 dyr i hver gruppe, fikk intravenøs administrering av henholdsvis 10.000 enheter/kg CBX, 10.000 enheter/kg CBx2

eller 100.000 enheter/kg CB.., og dyrene ble observert i 7

i dager. Alle 10 dyr i de respektive grupper overlevet uten å vise noen forandring i kroppsvekt og generell tilstand

til tross for at så mange enheter glycoproteiner ble gitt.

Eksperiment 6 Toksisitetsforsøk (30 dagers kontinuerlig

administering)

Hannmus av BDF-^-stammen som veide 20-25 g, 10 dyr i hver gruppe, fikk intravenøst CBX, CBx2eller CB^ i 30 dager, og antallet døde dyr, forandring i kroppsvekt og generelle tilstander ble observert. Kroppsvekten ble målt mellom" klokken 9 og 10 om formiddagen, og observasjon av den generelle tilstand ble utført den 10., 20. og 30. dag ifølge Arvien's metode (Science, Vol. 36, s. 123 (1962)). Som et resultat forelå ingen døde dyr i disse 30 dager når 1.000 enheter/kg/dag av CBXeller CBx2, eller 10.000 enheter/kg/dag av CBx3ble gitt, og vektøkningskurven var omtrent den samme som for kontrollgruppen. Videre ble den generelle tilstand funnet å være normal som i kontrollgruppen .

Som man kan se i eksperimentene beskrevet ovenfor, undertrykker CBX, CBx2og CBX3selektivt veksten av tumorceller, og undertrykker videre ikke bare merkbart kreftmetastasene, men er også ekstremt virksom mot forskjellige tumorer og er likevel meget trygg i bruk selv ved høyere doser enn den dose som bevirker farmasøytisk effekt.Derfor er CBX, CBx2og CBx3meget anvendelige for terapi av forskjellige tumorer såsom magekreft, lungekreft, hepatom, tykktarmskreft, brystkreft, livmorkreft, leukemi o.s.v. Videre kan relativt lav-molekylære vektformer av CB (CBX, CBx2, CBX^)avledes fra former med relativt høyere molekylvekt av CB (CBX, CB^ CBx2) ved behandling med et reduksjonsmiddel uten å skade deres evne til å virke på tumorer.

Claims

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et anti-tumorglycoprotein med redusert molekylvekt, karakterisert ved at man utfører nedbrytningsbehandling på minst ett utgangsanti-tumorglycoprotein erholdt fra et ekstrakt eller en kultursupernatant av reticuloendoteliale celler, lymfoblaster, leukemiceller eller fibroblaster av varmblodi-ge dyr r ved å omsette utgangsanti-tumorglycoproteinet med et reduksjonsmiddel, og deretter gjenvinne minst et anti-tumorglycoprotein med redusert molekylvekt.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som utgangsanti-tumorglycoprotein anvender glycoprotein CB^ , og som anti-tumorglycoprotein med redusert molekylvekt erholder minst et av anti-tumorglyco- proteinene CBx2 , CBX og CB^ .

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at glycoproteinet CB^ erholdes fra en kultursupernatant av reticuloendoteliale celler, lymfoblaster, leukemiceller eller fibroblaster fra varmblodige dyr ved utsalt-ning av supernatanten og fraksjonering av en utfelling fra denne ved gelfiltrering, hvilket gir en. fraksjon med en molekylvekt på 70.000 - 90.000 og.deretter adsorbere og eluere denne fraksjon på Ulex europeus agglutinin-konjugert Sefadex.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som utgangsanti-tumorglycoprotein anvender CBx2 ' ocJ s° m anti-tumorglycoprotein med redusert molekylvekt isolerer minst en av CBX og CBX3«

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at utgangsanti-tumorglycoproteinet CBX2 erholdes fra en kultursupernatant av reticuloendoteliale celler, lymfoblaster, leukemiceller eller fibroblaster av varm- •blodige dyr ved utsalting av supernatanten og fraksjonering <1> av en utfelling fra denne ved gelfiltrering, hvilket gir en fraksjon med en molekylvekt 40.000 - 50.000 og deretter adsorbere denne fraksjon og eluere den på Ulex europeus agglutinin-konjugert Sefadex.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som utgangsanti-tumorglycoprotein anvender CBX , og glycoproteinet med "redusert molekylvekt erholder <CB>X3 .

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at man erholder utgangsanti-tumorglycoprotein CBX fra en kultursupernatant av reticuloendoteliale celler, lymfoblaster, leukemiceller eller fibroblaster fra varmblodige dyr ved utsalting av supernatanten og fraksjonering av en utfelling fra denne ved gelfiltrering, hvilket gir en" fraksjon med en molekylvekt 12.000 - 17.000, og deretter ad- sorberer og eluerer denne fraksjon på Ulex europeus agglutinin-konjugert Sefadex.

0. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 2, 4 eller 6, karakterisert ved at reduksjonsmiddelet er minst ett valgt fra gruppen en tiolforbindelse, et metallhydrid-kompleks, et tertiært fosfin, et sulfit, et cyanat og et metallion.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at tiolforbindelsen velges fra gruppen 3-merkaptoetanol, ditiotreitol, ditioerytritol, tioglycolsyre og monotiofosforsyre.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 8, karakterisert ved at nedbrytningsbehandlingen ut-føres i nærvær av et overflateaktivt middel.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at det overflateaktive middel velges fra gruppen ! natriumdodecylsulfat, natriumkolat, dodecyltrimety1ammonium- : bromid, deoksylysolecitin, "Triton X", "Tween 20" og "Span 60".

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 8, karakterisert ved at nedbrytningsbehandlingen ut-føres ved en temperatur mellom 0 og 37°C i et svakt surt til nøytralt pH-område.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at temperaturen velges mellom 15 og 25°C.