DE3328239A1

DE3328239A1 - Verfahren zur herstellung eines antitumor-glykoproteins

Info

Publication number: DE3328239A1
Application number: DE19833328239
Authority: DE
Inventors: Ei Mochida; Nobuo Tokyo Mochida; Haruo Funabashi Chiba Ohnishi; Yasuo Kawaguchi Saitama Suzuki; Kazuo Koganei Tokyo Yamaguchi
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1982-08-04
Filing date: 1983-08-04
Publication date: 1984-02-16
Also published as: IT8348806A0; GR78638B; NL8302765A; BR8304143A; DD213440A5; KR840006127A; PL243306A1; SE8304276D0; GB8320547D0; PT77154B; FI832776A; FI832776A0; SE8304276L; GB2125048A; JPS5925332A; AU1759283A; NO832811L; DK356483A; LU84946A1; PT77154A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Antitumor-Glykoproteins mit einem kleineren Molekulargewicht als das Ausgangs-Antitumor-Glykoprotein und ist dadurch gekennzeichnet, dass man das Molekulargewicht eines Antitumor-Glykoproteins mit einem grossen Molekulargewicht durch Behandeln mit einem Reduktionsmittel verkleinert und anschliessend Antitumor-Glykoproteine mit einem verminderten Molekulargewicht aus dem Reaktionsgemisch gewinnt. 10

Trotz der Tatsache, dass zahlreiche Arzneimittel von einer Reihe von Forschern zur Bekämpfung von Krebs

entwickelt worden sind, ist die Heilungsrate bei Krebs durch solche therapeutischen Mittel immer noch sehr gering und es besteht ein grosses Bedürfnis nach verbesserten therapeutischen Mitteln zur Behandlung von Krebs.

Aufgabe der Erfindung ist es, Verfahren zur Herstellung eines Antitumor-Glykoproteins zu zeigen.

Verbunden mit dieser Aufgabe ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines Antitumor-Glykoproteins mit einem kleineren Molekulargewicht aus einem Antitumor-Glykoprotein mit einem grösseren Molekulargewicht zu zeigen.

Eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren zur Herstellung von CB , CB und CB- in jeweils hohen Ausbeuten zur Verfügung zu stellen.

0 ' Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung eines oder mehrerer Antitumor-Glykoproteine mit einem kleineren Molekulargewicht als die Ausgangs-Antitumor-Glykoproteine und ist dadurch gekennzeichnet, dass man ein Antitumor-Glykoprotein mit einem grösseren Molekulargewicht mit einem Reaktionsmittel behandelt und anschliessend Antitumor-Glykoproteine mit einem verkleinerten Molekulargewicht aus dem Reaktionsgemisch gewinnt.

Durch das erfindungsgemässe Verfahren kann ein Antitumor-Glykoprotein CB mit dem gewünschten Molekulargewicht in hoher Ausbeute erhalten werden.

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben festgestellt, dass die reticulo-endothelialen Zellen eine wichtige Rolle im biophylaktischen Mechanismus spielen und dass diese möglicherweise eine Substanz erzeugen, die Tuinore heilen kann und sie haben dieses Problem ständig und sehr intensiv untersucht. Dabei haben die Erfinder dieser Anmeldung kürzlich vier Arten von Äntitumor-Glykoproteinen mit unterschiedlichen Molekulargewichten aus einem Extrakt oder der überstehenden Flüssigkeit über einer Kultur von reticulo-endothelialen Zellen, Lymphoblasten, Leukämiezellen oder Fibroblasten von Warmblütern gefunden und sie haben diese als Carcino-Breaker X (Molekulargewicht 12.000 bis 17.000), X₁ (Molekulargewicht 70.000 bis 90.000),

X₂ (Molekulargewicht 40_o000 bis 50.000) und X₃ (Molekulargewicht 7.000 bis 9.000) bezeichnet (deutsche Patentanmeldung P 33 06 297.8 und schwebende US-Patentanmeldung, Serial Nr. 467 840, eingereicht am 18, Februar 1983)„ Diese Glykoproteine werden nachfolgend als CB , CB_v1 , CB_vO bzw. CB _v., bezeichnet und wenn

X Λ Ι Λ.Δ AJ

sie insgesamt bezeichnet werden, werden sie als CB bezeichnet.

Da CB - CB- in einem Gemisch in einem Extrakt oder

X XJ

einer' überstehenden Flüssigkeit über einer Kultur von reticulo-endothelialen Zellen, Lymphoblasten, Leukämiezellen oder Fibroblasten von Warmblütern vorliegt, war es sehr schwierig, wirksam und exklusiv einen Carcinom-Brecher mit dem gewünschten Molekulargewicht, insbesondere mit einem kleinen Molekulargewicht, nämlich CB oder CB-, in grossen Mengen zu erhalten.

Λ XJ

Intensive Forschungen der Erfinder zum Auffinden eines wirksamen Verfahrens zum Herstellen und erhalten von CB , CB 2 und/oder CB ₃ haben nun zu der vorliegenden Erfindung geführt, die darin besteht, dass man durch eine Abbaubehandlung eines Antitumor-Glykoproteins (d.h.

einem Carcino - Brecher), erhalten aus dem Extrakt oder einer überstehenden Flüssigkeit einer Kultur für reticuloendothelialen Zellen, Lymphoblasten, Leukämiezellen oder Fibroblasten von Warmblütern, mit einem Reduktionsmittel aus der flüssigen Reaktionsmischung ein Antitumor-Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 40.000 bis 50.000, d.h. CB ₂, ein Antitumor-Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 12.000 bis 17.000, d.h. CB und/oder ein Antitumor-Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 7.000 bis 9=000, d.h. CB-, einfach und in hohen Ausbeuten gewinnen kann.

Die Bezeichnungen CB , CB ., CB „ und CB _, wie sie

A. A I A.A X..J

in der vorliegenden Anmeldung verwendet werden, stehen 0 ' für die im vorstehenden Abschnitt erwähnten Carcino-Brecher Antitumor-Glykoproteine und haben die folgenden Eigenschaften:

CB_Y:

(1) Molekulargewicht: 12.000 bis 17.000;

5 (2) Farbreaktion; entwickelt eine Farbe, welche Protein bei der Lowry-Reaktion anzeigt, entwickelt eine Farbe, welche Peptidbindungen und Aminosäuren bei der Ninhydrin-Reaktion nach der Hydrolyse mit Salzsäure

anzeigt und entwickelt eine Farbe, welche

Zucker bei der Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, bei der Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, bei der Indol-Schwefelsäure-Reaktion und der Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion

anzeigt;

(3) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer und kaum löslich in

' Benzol, Hexan und Chloroform;

(4) Zuckergehalt: 27 bis 33 %, wobei der Zucker sich aus 17 bis 20 % Hexosen, 5 bis 7 % Hexosaminen und 5 bis 6 % Sialylsäuren zusammensetzt?

(5) isoelektrischer Punkt: 4,3 bis 7,3;

(6) Adsorbierbarkeit: adsorbierbar auf Ulex

0 europeus agglutinin-konjugiertem Sephadex

in 0,01M Phosphatpuffer (pH 7,2);

(7) Stabilität: stabil in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4⁰C während 24 Stunden oder mehr und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei

60⁰C während 3 Stunden oder mehr;

(8) Cytotoxizität: schädigt selektiv Tumorzellen, ohne im wesentlichen Normalzellen

zu schädigen; und
10

(9) Differenzierung: induziert Differenzierungen bei Tumorzellen, d.h. dass es die Tumorzellen in normale Zellen überführt;

CB_X1:

(1) Molekulargewicht; 70.000 bis 90.000;

(2) Farbreaktion: zeigt eine Farbe, die Pro-0 teine bei der Lowry-Reaktion anzeigt,

zeigt eine Farbe, die Peptidbindungen und Aminosäuren bei der Ninhydrin-Reaktion nach der Hydrolyse mit Salzsäure anzeigt und zeigt eine Farbe, die Zucker bei der Phenol-Schwefelsäure-Reaktion,

der Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, der Indol-Schwefelsäure-Reaktion und der Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion anzeigt;

(3) . Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver,

löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer und wenig löslich in

Benzol, Hexan und Chloroform; 5

(4) Zuckergehalt: 35 bis 45 %, wobei sich der Zucker aus 23 bis 28 % Hexosen, 8 bis 11% Hexosaminen und 4 bis 6 % Sialylsäuren

zusammensetzt;
10

(5) isoelektrischer Punkt: 4,3 bis 6,2;

(6) Ädsorbierbarkeit: wird auf Ulex europeus agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01M Phosphatpuffer (pH 7,2) adsorbiert;

(7) Stabilität: stabil in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4⁰C während 24 Stunden oder mehr und ' in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei

60⁰C während 3 Stunden oder mehr; und

(8) Cytotoxizitäts schädigt selektiv Tumorzellen, ohne dass es im wesentlichen Normalzellen schädigt;

wobei das durch die Abbaubehandlung erhaltene Antitumor-Glykoprotein wenigstens ein Glied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Antitumor-0 Glykoproteinen CB , CB und CB- mit den folgenden Eigenschaften ist:

^CBX2 ^:

(1) Molekulargewicht: .40.000 bis 50.000;

(2) Farbreaktionen: entwickelt eine proteinanzeigende Farbe bei der Lowry-Reaktion, entwickelt eine Peptidbindungen und Aminosäuren anzeigende Farbe bei der Ninhydrin-Reaktion nach der Hydrolyse mit Salzsäure 0 und entwickelt eine zuckeranzeigende Farb

reaktion bei der Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, der Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, der Indol-Schwefelsäure-Reaktion

und der Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion; 15

(3) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer und wenig löslich

in Benzol, Hexan und Chloroform; 20

(4)· Zuckergehalt: 30 bis 37 %,'wobei die

Zuckerzusammensetzung 20 bis 23 % Hexosen, 6 bis 8 % Hexosamine und 4 bis 6 % Sialyl-

säure ist; 25

(5) isoelektrischer Punkt: 4,2 bis 7,3;

(6) Adsorbierbarkeit: adsorbierbar auf Ulex europeus agglutinin-konjugiertem Sephadex

³⁰ in 0,01M Phosphatpuffer (pH 7,2);

(7) Stabilität: stabil in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4⁰C während 24 Stunden oder mehr und in einer wässrigen Lösung von pH. 7,0 bei 60⁰C während 3 Stunden oder mehr; und

(8) Cytotoxizität: schädigt selektiv Tumorzellen ohne im wesentlichen Normalzellen zu schädigen;

CB_X3,

(1) Molekulargewicht: 7.000 bis 9.000;

(2) Farbreaktion: entwickelt eine Farbe, wel-

0 ' ehe Protein bei der Lowry-Reaktion anzeigt,

entwickelt eine Farbe, welche Peptidbindungen und Aminosäuren bei der Ninhydrin-Reaktion nach der Hydrolyse mit Salzsäure anzeigt, und entwickelt eine Farbe, welehe Zucker bei der Phenol-Schwefelsäure-

Reaktion, der Anthon-Schwefelsäure-Reaktion, der Indol-Schwefelsäure-Reaktion und der Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion anzeigt;

(3) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver,

löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid

3328233

und Phosphatpuffer und kaum löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

(4) Zuckergehalt: 8 bis 15 %, wobei der

Zucker sich aus 6 bis 10 % Hexosen, 1 bis

2 % Hexosaminen und 1 bis 3 % Sialylsäuren zusammensetzt;

(5) Adsorbierbarkeit: adsorbierbar auf Carboxymethylzellulose bei der Ionenaustausch-

chromatografie unter Verwendung von Carboxymethylzellulose in 0,05M Phosphatpuffer (pH 6,4);

(6) Stabilität: stabil in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4⁰C während 24 Stunden oder mehr und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C während 3 Stunden oder mehr;

(7) Cytotoxizitäti schädigt selektiv Tumorzellen, ohne im wesentlichen Normalzellen zu schädigen;

(8) die Aminosäuresequenz im Endteil des Proteinanteils ist Alanin-Alanin.

Die Erfindung wird im allgemeinen wie folgt durchgeführt: Ein Antitumor-Glykoprotein CB mit einem grösse-0 ren Molekulargewicht als dem gewünschten Molekulargewicht, das aus dem Zellextrakt oder der überstehenden

Flüssigkeit über einer Kultur durch Abtrennen und Reinigen erhalten wurde, wird in einer geeigneten Konzentration von z.B. 10 bis 10.000 μg/ml gelöst und einer Abbaubehandlung unterworfen, indem man es mit einer geeigneten Menge eines Reduktionsmittels umsetzt. Das Reaktionsgemisch wird dialysiert und das Dialysat wird ausgesalzen und der Niederschlag wird abfiltriert. Anschliessend wird der Niederschlag in einer kleinen Menge physiologischer Kochsalzlösung oder einer gepufferten Lösung gelöst und nach Durchführen der Dialyse einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-50 unterworfen, wobei man ein Antitumor-Glykoprotein mit dem gewünschten Molekulargewicht erhält.

Der hier verwendete Begriff "Abbaubehandlung" bedeutet die Behandlung eines Glykoproteins mit einem grösseren Molekulargewicht unter Umwandlung in ein Glykoprotein mit einem geringeren Molekulargewicht, wobei intramolekulare Bindungen, wie Disulfidbindungen, chemisch

20 aufgebrochen werden.

Das erfindungsgemäss verwendete Ausgangsmaterial ist geeigneterweise CB_v1 oder CB , obwohl man auch CB

X I Λ.Δ X

verwenden kann, wenn CB ₃ das gewünschte Produkt ist. Zwar wird bevorzugt als Ausgangsmaterial eine Lösung von gereinigtem CB . und/oder CB „ in einem Puffer,

X I Xi

einer physiologischen Kochsalzlösung, in destilliertem Wasser etc., verwendet, jedoch ist es auch möglich, einen Zellextrakt oder die überstehende Flüssigkeit über einer Kultur, die CB per se enthält, zu verwenden.

CB kann aus einem Extrakt oder der überstehenden

Flüssigkeit über einer Kultur von reticulo-endothelialen Zellen, Lymphoblasten, Leukämiezellen oder Fibroblasten von Warmblütern erhalten werden. Die Einzelheiten des Verfahrens und die Antitumorwirkung von CB werden in der schwebenden US-Patentanmeldung, Serial Nr. 467 840, eingereicht am 18. Februar 1983, und der deutschen Patentanmeldung P 33 06 297.8 beschrieben und der Inhalt dieser Patentanmeldungen wird hiermit einbezogen.

Beispiele für verwendbare Reduktionsmittel sind Thiolverbindungen, wie 2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol, Dithioerythrit, Thioglykolsäure, Monothiophosphorsäure etc., Metallwasserstoffkomplexe, wie Natriumborhydrid,

15 tertiäre Phosphine, wie Tri-n-butylphosphin, Tris-

diethylaminoethylphosphin etc., Sulfite, wie Natriumsulfit, Cyanide, wie Cyanogenbromid, Metallionen, wie Silberionen etc.. Diese Verbindungen sind solche, wie man sie im allgemeinen zum Zersetzen und zur Ent-

20 fernung von proteinhaltigen hochmolekulargewichtigen

Verunreinigungen, zum Abbauen von höherdimensionierten Proteinstrukturen und zum Analysieren der Grundstruktur des Proteins anwendet. Die mit diesen Verbindungen behandelten Proteine verlieren häufig ihre biologische Aktivität/aber überraschenderweise ist es möglich, die Abbaubehandlung durchzuführen, ohne dass die erfindungsgemäss angestrebte Antitumoraktivität verloren geht.

Die Bedingungen zur Durchführung des erfindungsgemäs-. sen Verfahrens, z.B. die Konzentration des Reduktionsmittels, die Behandlungstemperatur, die Behandlungszeit,

der Behandlungs-pH und dergleichen, werden dem jeweiligen Zweck angepasst und hängen z.B. davon ab, ob man CB oder CB , einzeln oder zusammen erhalten will. Das Reduktionsmittel kann in einer Konzentration von

10" bis 10"⁹M, vorzugsweise 10"⁵ bis 10~⁹M im Falle

—2 —5 von Mercaptoethanol, von 10 bis 10 M im Falle von Dithiothreitol, von 10 bis 10*" M im Falle von Dithio-

— 1 —6
erythrit, von 10 bis 10 M im Falle von Monothio-

phosphorsäure, von 10 bis 10 M im Falle von Natriumborhydrid oder von 10 bis 10 M im Falle von Thioglykolsäure verwendet werden. Die Behandlungstemperatur ist nicht besonders beschränkt, solange die Glykoproteine nicht einem Abbau unterworfen werden und liegt im allgemeinen bei 0 bis 37⁰C; vorzugsweise wird Raumtemperatur um 15 bis 25⁰C angewendet. Die Behandlungszeit wird in geeigneter Weise ausgewählt und liegt im allgemeinen im Bereich von 10 Minuten bis 2 Stunden. Der pH wird vorzugsweise im Bereich von schwach sauer bis zum Neutralpunkt gewählt und liegt beispielsweise bei etwa 5,5 bis 7,5 pH.

Zur Durchführung der Abbaubehandlung kann es vorteilhaft sein, ein oberflächenaktives Mittel, z.B. ein ionisches oberflächenaktives Mittel, wie Natriumdodecylsulfat (SDS), ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, wie Triton X, in dem Reaktionsgemisch zu verwenden, um die Ausbeute zu erhöhen. Die optimale Konzentration des oberflächenaktiven Mittels hängt vom Ausgangsmaterial bei der Abbaubehandlung ab und liegt im allgemeinen im Bereich von 0,001 bis 10 %. Die ionischen oberflächenaktiven Mittel schliessen anionische,

kationische und amphotere ein. Beispiele für geeignete anionische oberflächenaktive Mittel sind SDS, Salze von Cholinsäure etc., Beispiele für geeignete kationische oberflächenaktive Mittel sind Dodecyltrimethylammoniumbromid etc., und Beispiele für geeignete amphotere oberflächenaktive Mittel sind Deoxylysolecithin. Beispiele für geeignete nicht-ionische oberflächenaktive Mittel schliessen Triton, Tween-Typ, Span-Typ (alles eingetragene Warenzeichen) etc. ein. Die oberflächenaktiven Mittel können einzeln oder in. Mischung verwendet werden.

Die Erfindung wird in den Beispielen näher beschrieben.
15

Beispiel 1
20 (a) Herstellun2_des_Aus2an2sinaterialsj_

CB mit höherem Molekulargewicht (d.h. CB .. , CB ₂ und CB_V), wie es als Ausgangsmaterial in den Beispielen 1 bis 7 verwendet wird, wird wie folgt hergestellt.

Humanlymphocyten (2 χ 10 Zellen) wurden in 4.000 ml Eagle's Medium, enthaltend 10 % Kälberserum, suspendiert und nach Zugabe von Phytohämagglutinin (Difco Co.) bis zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml 48 Stunden bei 37⁰C in einer Atmosphäre aus 5 % CO „ und 95 % Luft kultiviert. Dann wurde die überstehende Flüssigkeit

über dem Kulturmedium gegen 0,01M Phosphatpuffer (pH 7,2) dialysiert und aus dem Dialysat wurde eine Fraktion mit 40 bis 80 % Ammoniumsulfat ausgesalzen. Diese Fraktion wurde nochmals gegen den Phosphatpuffer dialysiert und dann einer Gelfiltration unterworfen, unter Verwendung von Sephadex G-100 (Pharmacia Co.) .

Rohes CB₁, CB £ und CB wurde in Fraktionen mit Molekulargewichten von 70.000 bis 90.000, 40.000 bis 50.000 bzw. 12.000 bis 17.000 erhalten.

Rohes CB₁ wurde auf Ulex europeus agglutinin (Maruzen Oil Co.)-konjugiertem Sephadex adsorbiert und mit 0,01M Phosphatpuffer, enthaltend 0,5M Fucose, eluiert. Nachdem die Fucose durch Dialyse entfernt worden war, wurde CB₁ nochmals auf Ulex europeus agglutinin-konjugiertem Sephadex adsorbiert und anschliessend gradienteneluiert, unter Verwendung eines Phosphatpuffers (pH ' 7,2), unter Erhalt von gereinigtem CB_v1 . Man erhielt

χ ι

gereinigtes CB mit einer spezifischen Aktivität von 50.000 Einheiten/mg in einer Gesamtmenge von 5.000 Einheiten bei einem Verfahrensgang.

Rohes CB „ wurde auf gleiche Weise gereinigt, wobei Xz

man ein gereinigtes CB „ mit einer spezifischen Aktivität von 20.800 Einheiten/mg in einer Gesamtmenge von 5.200 Einheiten in einem Verfahrensgang erhielt.

Ebenso wurde rohes CB gereinigt und man erhielt ein gereinigtes CB mit einer spezifischen Aktivität von

10.000 Einheiten/mg in einer Gesamtmenge von 10.000 Einheiten. Gereinigtes CB mit einer spezifischen Aktivität von 7.500 Einheiten/mg wurde in einer Gesamtmenge von 150 Einheiten erhalten, nachdem man von dergleichen Anzahl von Humanlymphocyten ausgegangen ist und das gleiche Verfahren anwendete, mit der Ausnahme, dass im Kulturmedium das Phytohämagglutinin nocht vorhanden war.

0 Die Aktivität wird in der gesamten Beschreibung auf die Konzentration bezogen, welche 50 % der Proliferation von 10 Zellen auf KB-Zellen inhibiert und diese Menge wird als eine Einheit bezeichnet.

(b)

200.000 Einheiten ΟΒ_χ1 (Molekulargewicht 70.000 bis 90.000) wurden in physiologischer Kochsalzlösung ge-' löst und 1 Stunde bei Raumtemperatur in Gegenwart von 5x10 M 2-Mercaptoethanol umgesetzt. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch dialysiert und mit 80 % Ammoniumsulfat ausgesalzen und die ausgefallene Fraktion wurde abfiltriert. Diese Fraktion wurde in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und unter Verwendung von Sephadex G-50 einer Gelfiltration unterworfen. Die Fraktionen, die einem Molekulargewicht von 40.000 bis 50.000, 12.000 bis 17.000 bzw. 7.000 bis 9.000 entsprachen, wurden gesammelt und als Fraktion A, 0 Fraktion B bzw. Fraktion C bezeichnet. Das obige Verfahren wurde auch in Gegenwart von 0,05 % SDS wiederholt, wobei man die gleichen Fraktionen erhielt.

Die physiko-chemischen Eigenschaften der Fraktionen A, B und C wurden untersucht und man stellte fest, dass sie identisch waren mit denen von CB_v0, CB und CB_. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Physiko-chemische Eigenschaften der Fraktionen A bis C

	Fraktion A Molekulargewicht 40.000 - 50.000	Fraktion B Molekulargewicht 12.000 - 17.000	Fraktion C Molekulargewicht 7.000 - 9.000
Identifizierung	^CBX2	^CBx	^CBX3
Aussehen und Lös lichkeit	weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigen Natrium chlorid und Phosphatpuffer und kaum löslich in Bentol, Hexan und Chloroform
Farbreaktionen . Lowry* Ninhydrin* Phenol-Schwefelsäure Anthron-Schwef elsäure ei· -Naphthol-Schwef el säure i Indol-Schwefelsäure Tryptophan-Schwefel säure Holff*	blau (Peptidbindungen) violett-blau (Aminosäuren) grau-braun (Zucker) grünlich blau (Zucker) violett (Zucker) grau-braun (Zucker) grau-violett (Zucker) farblos (keine Lipide)

CO CJ NJ OO hO CO CD

Fortsetzung Tabelle 1

	Fraktion A Molekulargewicht 40.000 - 50.000	Fraktion B Molekulargewicht 12.000 - 17.000	4,2 - 7,3	Fraktion C Molekulargewicht 7.000 - 9.000
Zuckergehalt**** Hexose Hexosamin Sialylsäure	30 - 37 % 20 - 23 % 6-8 % 4-6 %	27 - 33 %. 17 - 20 % 5-7 % 5-6 %	8 - 15 % 6 - 10 % 1-2 % 1-3 %
Adsorbierbarkeit	Adsorbierbar auf ülex europeus agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01M Phosphatpuffer (pH 7,2)	Adsorbierbar auf Carboxymethylzel- lulose bei der Ionenaustauschchro- matografie unter Verwendung von Carboxymethylzel- lulose in 0,05M Phosphatpuffer (pH 6,4)
isoelektrischer Punkt*****	4,2 - 7,3	6,3 — 7,8
Stabilität	stabil in wässriger Lösung bei pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4⁰C während 24 Stunden oder mehr und in einer wässrigen Lösung bei pH 7,0 bei 60⁰C während 3 Stunden oder mehr
Cytotoxiz ität* *****	schädigt selektiv Tumorzellen ohne im wesentlichen norma le Zellen zu schädigen

OO KJ OJ CO

gemäss der Methode von Seikagaku Jikken Koza, Band 1 (Tanpakushitsu Teiryohou), 1971;

gemäss der Methode von Seikagaku Jikken Koza, Band 4 (Toshitsu Teiryohou), 1971;

gemäss der Methode von Seikagaku Jikken Koza, Band 3 (Shishitsu Teiryohou), 1971;

Spiro, H.A., Methods in Enzymology, Band 8, Seiten 3 bis 26, 1966;

Isoelektrofokusierung unter Verwendung von Ampholine ^ (erhältlich von LKB-Produkter AB, Schweden);

****** το Zellen wurden in 1 ml Eagle's Medium, enthaltend 10 % Kälberserum und die jeweiligen Fraktionen, bei 37°C während 48 Stunden in einer Atmosphäre aus 5 % CO₂ und 95 % Luft kultiviert und anschliessend wurde die Zahl der lebenden Zellen, die nicht von Trypan Blau gefärbt waren, gezählt und die Konzentration der Fraktion, bei welcher 50 % der Zellen abgetötet wurden, wurde als Mass für die Cytotoxizität angesehen.

Die Erholung der Aktivität bei den jeweiligen Fraktionen des Beispiels 1 wird in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Abbaubehandlung	A] ^CBX1	ttivität ( ^CBX2	.000	Einheit) ^CBx	CB	X3
vor der Behand lung	200.000
2-Mercaptoetha- nolbehandlung	0	10	,000	160.000	15	.000
2-Mercaptoetha- nolbehandlung
SDS-Behandlung	0	5	150.000	25	.000

Beispiel 2

200.000 Einheiten CB „ wurden in physiologischer Koch-' Salzlösung gelöst und 1 Stunde bei Raumtemperatur in Gegenwart von 5x10 M 2-Mercaptoethanol umgesetzt. Nach der Umsetzung wurde dialysiert und mit Ammoniumsulfat ausgesalzen, wobei man eine Fraktion erhielt, die unter Verwendung von Sephadex G-50 einer Gelfiltration unterworfen wurde. Es wurden die Fraktionen mit Molekulargewichten von 12,000 bis 17.000 (Fraktion B) und 7.000 bis 9.000 (Fraktion C) gesammelt. Das obige Verfahren wurde nochmals in Gegenwart von 0,05 % SDS wiederholt. Die Fraktionen wurden als CB_V und CB_V-. in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise identifiziert.

Die Erholung von CB und CB _, die man erhielt, werden in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Abbaubehandlung

vor der Behandlung

2-Mercaptoethanolbehandlung

+
SDS-Behändlung

Aktivität (Einheit)

CB

X2

200.000

CB,

170.000

140.000

CB

20.000

37.000

Beispiel 3

200.000 Einheiten CB_V wurden mit 5 χ 10~ M 2-Mercaptoethanol behandelt, wobei man Fraktionen mit einem 20 Molekulargewicht von 7.000 bis 9.000 (Fraktion C), ähnlich wie in Beispiel 1, erhielt. Die Fraktion wurde als CB_ in Beispiel 1 identifiziert. Die Aktivität des erhaltenen CB ₃ wird in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Abbaubehandlung	Aktivität ι ^CBx	000	Einheit) ^CBX3	—
vor der Behandlung	200	000		000
2-Mercaptoethanolbehand- lung	110	000	58	.000
2-Mercaptoethanolbehand- lung + SDS-Behandlung	90	73

Beispiel 4

Eine Mischung aus 100.000 Einheiten CB.,., und 100.000 Einheiten CB_V„ wurde mit 5x10 M 2-Mercaptoethanol, ähnlich wie in Beispiel 1, behandelt. Die Aktivität von CB _o, CB und CB-. wird in Tabelle 5 gezeigt.

Tabelle 5

Abbaubehandlung

vor der Behandlung

2-Mercaptoethanolbehandlung

2-Mercaptoethanolbehandlung + SDS-Behandlung

Aktivität (Einheit)

CB

X1

100.000

CB

X2

100.000 20.000 3.000

CB

150.000

140.000

CB

X3

20.000

42.000

Beispiel 5 -

Eine Mischung aus 100.000 Einheiten CB_V. und 100.000

__ xi

Einheiten CB wurde mit 5x10 M 2-Mercaptoethanol, ähnlich wie in Beispiel 1, behandelt. Die Aktivität des erhaltenen CB „, CB und CB _ werden in Tabelle gezeigt.

Tabelle 6

20.

Abbaubehandlung

vor der Behandlung

2-Mercaptoethanolbehandlung

2-Mercaptoethanolbehandlung + SDS-behandlung

Aktivität (Einheit)

CB

X1

100.000

CB

X2

19.000

7.000

CB

100.000

130.000

120.000

CB

X3

40.000

57.000

Beispiel 6

Eine Mischung aus 100.000 Einheiten CB_V und 100.000

-7 Einheiten CB „ wurde mit 5x10 M 2-Mercaptoethanol· wie in Beispiel 1 behandelt. Die Aktivitäten des erhaltenen CB und CB ₃ werden in Tabelle 7 gezeigt.

Tabelle

Abbaubehandlung

vor der Behandlung

2-Mercaptoethanolbehandlung

2-Mercaptoethanolbehandlung + SDS-Behandlung

Aktivität (Einheit)

CB

100.000 CB,

100.000

120.000

90.000

CB

X3

65.000

77.000

Beispiel 7

Eine Mischung aus 100.000 Einheiten ( Einheiten CB „ und 100.000 Einheiten CB wie in Beispiel 1, mit 5x10 M 2-Mercaptoethanol behandelt. Die Aktivität des erhaltenen CB_V„, CB_V und

ΛΖ Λ

CB-. wird in Tabelle 8 gezeigt. und 100.000 wurde, ähnlich

Tabelle

Abbaubehandlung

vor der Behandlung

2-Mercaptoethanolbehandlung

2-Mercaptoethanolbehandlung + SDS-Behandlung

Aktivität (Einheit)

CB

X1

100.000 CB

X2

100.000

23.000

CB,

100.000

240.000

8.000 !240.000

CB

X3

22.000

33.000

Beispiel 8

Eine Mischung aus 100.000 Einheiten 100.000

Einheiten CB_V„ und 100.000 Einheiten CB_V wurde mit den

Λ/ Α

in Tabelle 9 angegebenen Reduktionsmittel ähnlich wie in Beispiel 1 behandelt. Die Aktivitäten von CB „, CB und CB_V_ werden in Tabelle 9 gezeigt.

Tabelle

Abbaubehandlung

vor der Behandlung

Thioglykolsäure

Monothiophosphorsäure

Tri-n-butylphosphin

Tris-diethylamino-ethyl-

phosphin

Natriumsulfit

Cyanogenbromid

Silberion

Konzentration

10"⁶M

10 ⁵M

10 ⁶M

10~⁷M

10 ⁶M 10~⁶M Aktivität (Einheit)

CB

X1

100.000

0 0 CB

X2

100.000 26.000 27.000 23.000 21.000

25.000

24.000 23.000

CB

100.000 240.000 260.000 230.000 230.000

220.000

240.000 240.000

CB

X3

25.000 11.000 32.000 27.000

29.000

28.000 25.000

_ OT _

Beispiel 9

1 χ 10¹¹ Human-BALL-1-Zellen (Miyoshi, Nature, Bd. 267, Seiten 843-844, 1977), die subkutan in nackten Mäusen vermehrt worden waren, wurden in 20 1 Eagle's Medium, enthalten 10 % Kälberserum, suspendiert und nach Zu-

gäbe von 1x10 pfu Sendai-Virus bei 37°C in einer Atmosphäre aus 5 % CO₂ und 95 % Luft 48 Stunden kultiviert . Die hierbei erhaltene über der Kultur stehende

Flüssigkeit wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Diese überstehende Flüssigkeit enthielt ein Gemisch aus CB ₁, CB_X2, CB_x und CB . Mit der überstehenden Flüssigkeit aus der Kultur wurde eine Abbaubehandlung durchgeführt durch Zugabe von 10 M 2-Mercaptoethanol und 0,1 % SDS bei Raumtemperatur während 1 Stunde. Das Reaktionsgemisch wurde dialysiert und mit Ammoniumsulfat ausgesalzen und die erhaltene Fraktion wurde einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-50 unterworfen, wobei man CB „, CB und CB ₃ erhielt. Die Ergebnisse

werden in Tabelle 10 gezeigt.

Tabelle 10

Abbaubehandlung

vor der Behandlung nach der Behandlung

Aktivität (Einheit)

CB.

i7.000 0

CB

X2

49.000 1 .000

CB,

98.000 150.000

CB

500 37.000

Beispiel 10

Das Verfahren von Beispiel 9 wurde wiederholt, wobei jedoch 5 χ 10 M 2-Mercaptoethanol als Reduktionsmittel und jede der in Tabelle 11 angegebenen Verbindungen in den genannten Konzentrationen als oberflächenaktives Mittel verwendet wurden. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 11 gezeigt.

Tabelle 11

Reduktions mittel (Konzentration)	oberflächen aktives Mittel (Konzentration)	vor der Behandlung	Cholinsäure (0,01 %) Dodecyltrimethyl- ammoniumbromid (0,01 %) Deoxylysolecithxn (0,01 %) Tween 2 0 (0,01 %) Span 60 (0,01 %)	A ^CBX1	ktivität ^CBX2	(Einheit) ^CBx	^CBX3
2-Mercapto- ethanol (5 χ 1O^-7M)	48.000	51 .000	99.000	400
OO O O O	2.000 1 .000 3.000 2.000 1 .000	154.000 149.000 160.000 159.000 158.000	36.000 39.000 31 .000 29.000 31.000

OO OJ KJ OD NJ OJ CO

Beispiel 11

5x10 Zellen von peripheren Lymphocyten vom Rind wurden in 1.000 ml Eagle's Medium, enthaltend 10 % Kälberserum, suspendiert und 48 Stunden in einer Atmosphäre aus 5 % CO₂ und 95 % Luft bei 37⁰C kultiviert. Die über der Kultur stehende Flüssigkeit wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Diese über der Kultur stehende Flüssigkeit enthielt ein Gemisch aus CB₁, CB _, CB und CB_V_. Mit der über der Kultur

λ Ι λ/ Λ Aj -,

stehenden Flüssigkeit wurde durch Zugabe von 10 M Dithiothreitol bei Raumtemperatur während 2 Stunden eine Abbaubehandlung durchgeführt und anschliessend wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 9 angewendet, wobei man CB _o, CB und CB _ erhielt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 12 gezeigt.

Tabelle 12

Abbaubehandlung

vor der Behandlung nach der Behandlung

Aktivität (Einheit)

CB

X1

13.000
0

CB

X2

12.000 1 .000

CB

23.000 32.000

CB

200 11.000

Beispiel 12

3x10 Zellen von humanen Fibroblast-Flow 7000-Zellen (Flow Co.) wurden in 6.0 00 mg Eagle's Medium, enthaltend 10 % Kälberserum, suspendiert und nach
Zugabe von Phytohämagglutinin bis zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml in einer Atmosphäre von 5 %
CO₂ und 95 % Luft während 48 Stunden bei 37⁰C kultiviert. Die über der Kultur stehende Flüssigkeit wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Diese über der
Kultur stehende Flüssigkeit enthielt ein Gemisch aus CB _Λ , CB _o, CB und CB_V_.. Die Abbaubehandlung wurde

Λ I A.c. λ XJ

mit dieser über der Kultur stehenden Flüssigkeit in
Gegenwart von 0,1M Natriumborhydrid bei Raumtemperatur während 2 Stunden durchgeführt und anschliessend folgte man der Arbeitsweise gemäss Beispiel 9, wobei man CB ₂, CB und CB _ erhielt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 13 gezeigt.

Tabelle 13

Äbbaubehandlung

vor der Behandlung nach der Behandlung

Aktivität (Einheit)

CB

X1

16.000
0

CB

X2

18.000 1 .700

CB

35.000 52.000

CB

X3

600 17.000

Beispiel 13

2x10 Zellen von humanen peripheren Lymphocyten wurden in 4.000 ml Eagle's Medium, enthaltend 10 % Kälberserum, suspendiert und nach Zugabe von Phytohämagglutinin auf eine Endkonzentration von 50 μg/ml in einer Atmosphäre aus 95 % Luft und 5 % C0„ während 48 Stunden bei 37°C kultiviert. Die über der Kultur stehende Flüssigkeit wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Diese über der Kultur stehende Flüssigkeit enthielt ein Gemisch aus CB.,.. , CB_V~, CB_V und CB„_.

Λ. Ι Λ.Δ Λ Xj

Mit dieser über der Kultur stehenden Flüssigkeit wurde eine Abbaubehandlung durch Zugabe von 5 χ 10~ M Dithioerythrit bei Raumtemperatur während 1 Stunde durchgeführt und anschliessend arbeitete man wie in Beispiel 9, wobei man CB_V„, CB_V und CB.,., erhielt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 14 gezeigt.

Tabelle 14

Abbaubehandlung

vor der Behandlung nach der Behandlung

Aktivität (Einheit)

CB

23.000
0

CB

X2

25.000
2.000

CB

51.000
83.000

CB

800 13.000

Beispiel 14

1 0

1 χ 10 humane Ball-1-Zellen, die auf einer Gewebekultur vermehrt worden waren, wurden in 2.000 ml Eagle's Medium, enthaltend 10 % Kälberserum, suspendiert und bei 37⁰C in einer Atmosphäre aus 5 % CO₂ und 95 % Luft 48 Stunden kultiviert. Die über dieser Kultur stehende Flüssigkeit wurde als Ausgangsmaterial verendet. Sie enthielt eine Mischung aus CB _Λ, CB , CB_V und CB . Die Abbaubehandlung wurde mit dieser überstehenden Flüssigkeit in Gegenwart von 5 χ 10~ M 2-Mercaptoethanol bei Raumtemperatur entweder während

2 Stunden oder während 5 Minuten durchgeführt und anschliessend folgte man der Arbeitsweise gemäss Beispiel 9, wobei man CB ~ / ^CB _X ^un<^ ^CBv3 erhielt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 15 gezeigt.

Tabelle 15

Abbaubehandlung

vor der Behandlung

nach der Behandlung (2 Stunden)

nach der Behandlung (5 Minuten)

Aktivität (Einheit)

CB

X1

5.200

3.600

CB

X2

4.900 300

5.400

CB,

11.000

13.000

12.000

CB

110

7.100

120

Wurde die Abbaubehandlung während 5 Minuten durchgeführt, erhielt man CB ₂ und CB in hohen Ausbeuten, während bei einer 2-stündigen Abbaubehandlung CB und CB -. in hohen Ausbeuten gebildet wurden.

Beispiel 15
10 Reinigung von CB _o, CB_V und CB _:

Das gemäss den vorhergehenden Beispielen erhaltene rohe CB ₂, CB und CB ₃ kann gewünschtenfalls in der zur Reinigung von biologischen Substanzen üblichen Weise gereinigt werden.

CB 2 ^un<ä CB wurden beispielsweise nach der in Beispiel 1(a) für die Herstellung des Ausgangsmaterials beschriebenen Weise unter Verwendung von Urex europeus agglutinin-konjugiertem Sephadex gereinigt. Auf diese Weise erhielt man gereinigte CB „- und CB -Zubereitungen, die eine spezifische Aktivität von 2.400 Einheit/mg bzw. 2.500 Einheit/mg aufwiesen.

^CBy·? ^wurde beispielsweise durch Adsorption auf Concanavalin-A-konjugierter Sephalose und anschliessendem Eluieren mit 0,01M Phosphatpuffer (pH 7,2), enthaltend 0,5M o6-Methyl-D-mannosid, gereinigt. Nach Entfernung des d> -Methyl-D-mannosids durch Dialyse wurde die Lösung auf Carboxymethylzellulose, die mit 0,05M Phosphatpuffer (pH 6,0) ins Gleichgewicht gebracht worden

war, aufgebracht und anschliessend mit 0,05M Phosphatpuffer (pH 7,8) eluiert. Man erhielt eine gereinig te CB -,-Zubereitung mit einer spezifischen Aktivität von 2.100 Einheit/mg.

Wirksamkeit, Toxizität, Anwendungsweise und Dosierung des erfindungsgemässen CB
10

Versuch 1

Proben von jeweils 10 Zellen von verschiedenen Krebszellinien - einschliesslich KB-Zellen (Nasenkrebs), MX-1-Zellen (Brustkrebs, erhalten von Dr. Shigeru Tsukagoshi, Cancer Institute), HEp-2-Zellen (Kehlkopfkrebs) und HEL-Zellen (Hepatoma, Flow Co.) und von

20 ' normalen Zellinien, einschliessend Eingeweide-407-

Zellen, Girardi-Herzzellen, Chang-Leberzellen, Verozellen (Affennieren) und MDCK-Zellen (Hundenieren) (Flow Co.), die alle jeweils 24 Stunden vorkultiviert worden waren, sowie 10 Zellen von P388-Zellen und

25 L1210-Zellen (Leukemia, erhalten von Dr. Shigeru

Tsukagoshi, Cancer Institute), die unmittelbar verwendet wurden - wurden jeweils in 1 ml Eagle's Medium, enthaltend 10 % Kälberserum und die jeweilige Testsubstanz, bei 37°C während 48 Stunden in einer Atmosphäre aus 5 % CO₉ und 95 % Luft kultiviert. Anschliessend wurde die Zahl der lebenden, nicht durch Trypan Blau

gefärbten Zellen unter einem Lichtmikroskop gezählt und die Konzentration der Testsubstanz, bei welcher 50 % der Zellen abgetötet waren, wurde gegenüber einer Kontrolle, die mit 100 eingesetzt wurde, festgestellt. Als Testsubstanzen wurden CB _o, CB und CB , erhalten gemäss Beispiel 15, co-, ß- und f-Lymphotoxine, erhalten nach einer bekannten Methode (Granger G. A. et al., Cellular Immunology, Bd. 38. Seiten 388-402 (1978)) und Mitomycin C verwendet.

Eine Einheit der Lymphotoxine wird durch einen üblichen Index, der aufdie Cytotoxizität bei Maus-L-Zellen abgestellt ist, ausgedrückt (Eds., Bloom, B.R. & Grade, P.R. "In Vitro Methods in Cell-mediated Immunity", Academic Press, 1979). Die Ergebnisse werden in Ta-

15 belle 16 gezeigt.

Tabelle 16

	Zellname	Species	^cv	Konzentration einer 50 %	^CBX3*	oO-Lym- photo xin*	-igen Wachstumsinhibierung	y-Lym- photo xin*	Mitomy cin C (ug/ml)
	KB	Human	1,0	^CBX2*	1,0	18	ß-Lym- photo- xin*	7	36
	HEp-2	Human	1,5	1,0	1,5	6	20	7	17
Tumor zellen	HEL MX-I	Human Human	1,2 1,7	1,6	1,4 1,7	_	5	_	24 . 31
	L1210	Maus	3,1	1,3 1,6	3,0	-		-	42
	P388	Maus	3,0	3,3	3,4	-	-	-	36
	Darm 407	Human	M.000	3,1	>1.000	77	-	81	33
	Girardi- Herz	Human	>1.000	>1.000	>1.000	_	91	_	21
Normal zellen	Chang- Leber	Human	>1.000	>1.000	>1.000	10	_	9	20
	Vero	Affe	610	>1.000	630	-	9	-	51
	MDCK	Hund	540	620	530	-	-	-	43
		550	-

Anmerkung: * Einheit/ml - bedeutet, dass der Versuch nicht durchgeführt wurde

CaJ KJ OO KJ CO CO

Aus den vorstehenden Ergebnissen geht eindeutig hervor, dass CB selektiv Tumorzellen schädigt, ohne dass ein grösserer Schaden bei Normalzellen verursacht wird. Dagegen weisen sowohl ei/-, ß- als auch Jf-Lymphotoxin und Metomycin C keine selektive Cytotoxizität zwischen Normalzellen und Tumorzellen auf.

10 Versuch 2

Tumor transglantiert worden war

Männliche Mäuse (ddY-Stamm) mit einem Gewicht von 25 bis 30 g erhielten intraperitoneal 3x10 Zellen pro Tier Sarcoma 180 oder Ehrlich Ascites-Tumor transplantiert und die Überlebenszeit in Tagen wurde festgestellt. CB , CB und CB_, erhalten gemäss Beispiel ' 15, wurde Gruppen von fünf Mäusen täglich 1 Tag nach der Transplantation bis zum Tode verabreicht. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz der durchschnittlichen Überlebenstage der Versuchsgruppe im Vergleich zu der Kontrollgruppe ausgedrückt und werden in Tabelle

25 17 gezeigt.

Tabelle 17

Tumor	Testsubstanz	Tagesdosis	durchschnitt liche Überle benstage (%)
Sarcoma 180	^CBx	1,2 * 4 * 12 *	112 132 165
Ehrlich Asci- tes- Tumor	^CBX2	1 * 3 * 10 *	114 134 160
^CBX3	1 * 3 * 10 *	109 133 154
Mitomycin C	0,5 mg/kg	141
Cyclophos- phamid	20 mg/kg	170
^CBx	1,2 * 4 * 12 *	140 160 186
^CBX2	1 * 3 * 10 *	136 164 187
^CBX3	1 * 3 * 10 *	140 155 181
Mitomycin C	0,5 mg/kg	165
Cyclophos- phamid	20 mg/kg	205

* Einheit/kg

- 50 -

Versuch 3

karzinom 5

Männlichen Mäusen vom BDF₁-Stamm, mit einem Gewicht von 20 bis 25 g, wurde intramuskulär in die rechte Hüfte 2x10 Zellen Lungenkarzinom transplantiert und die Überlebenstage wurden festgestellt. CB , CB

Λ. Λώ und CB ₃, erhalten gemä+s Beispiel 15, wurden Gruppen von jeweils 6 Mäusen täglich 1 Tag nach der Transplantation bis zum Tode intravenös verabreicht. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz der durchschnittlichen Überlebenstage der Versuchsgruppe im Vergleich zu der Kontrollgruppe ausgedrückt und werden in Tabelle 18 gezeigt.

Tabelle

Testsubstanz	Tagesdosis	durchschnittliche Überlebenstage (%)
^CBx	1,2 * 4 * 12 *	108 114 150
^CBX2	1 * 3 * 10 *	107 123 145
^CBX3	1 * 3 * 10 *	116 140 158
Mitomycin C	0,5 mg/kg	120
Cyclophos- phamide	20 mg/kg	162

·* Einheit/kg

Versuch

Männlichen Mäusen vom BDF₁-Stamm mit einem Gewicht von 20 bis 30 g wurden in Gruppen von jeweils 6 Tieren subkutan in .den Rücken 2 mm² grosse Segmente von Lewis-Lungenkrebs transplantiert. CB , CB ₀ und CB _,

erhalten gemäss Beispiel 15, wurde einmal täglich während 12 Tagen ab dem 9. Tag nach der Transplantation intravenös verabreicht. Am 21. Tag nach der Transplantation wurde die Masse des primären Tumors isoliert und gewogen und die Anzahl der Metastasenknoten in der Lunge der Tiere wurde nach der Methode von Wexler, H. (J. Natl. Cancer Institute, Bd. 36, 641, 1966) berechnet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 19 gezeigt.
10

Tabelle 19

Testsubstanz	Tagesdosis	Tumorgewicht (g)	+ 0,8	Anzahl knoten	der Metastasen- in der Lunge
Kontrolle		8,8	± 1 ,4*	30,1	+ 5,6
^CBx	3 Einheit/kg '	4,4	+_ 0,5**	6,7	+_ 2,9*
	30 Einheit/kg	3,2	+_ 1,5*	0,5	+_ 0,3**
^CBX2	3 Einheit/kg	4,5	+ 0,4**	6,9	+_ 2,1*
	30 Einheit/kg	2,3	+_ 1 ,3*	0,7	+; 0,4**
^CBX3	3 Einheit/kg	4,1	+_ 0,3**	7,0	± ²'8*
	30 Einheit/kg	2,1	+_ 0,7**	0,6	+ 0,3**
Cyclophos- phamide	20 Einheit/kg	3,6	0,7	H₁ 0,4**

Anmerkungen:

Die in der Tabelle angegebenen Ergebnisse sind als Durchschnitt +_ Standardirrtum ausgedrückt

* statistisch verschieden von der Kontrollgruppe bei einem
Signifikanzniveau von ρ - 5 %

** statistisch verschieden von der Kontrollgruppe bei einem
Signifikanzniveau von ρ - 1 %.

CX) KJ GO CD

Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, dass CB , CB 2 ^und CB _ sehr erfolgreich primären Lungenkrebs und dessen Lungenmetastasen unterdrückten.

Versuch 5

Drei Gruppen männlicher Mäuse vom BDF₁-Stamm, mit einem Gewicht von 20 bis 25 g - 10 Tiere in jeder Gruppe wurde jeweils intravenös CB (10.000 Einheit/kg), CB_X2 (10.000 Einheit/kg) oder CB_x3 (100.000 Einheit/kg) verabreicht und die Tiere wurden 7 Tage beobachtet. Alle 10 Tiere in den jeweiligen Gruppen überlebten ohne jegliche Veränderung des Körpergewichtes und des Allgemeinzustandes, obwohl derart hohe Mengen an Glykoproteinen verabreicht wurden.

Versuch 6

5 ?25i2itätstest_^kontinuierliche_Verabreichun2_während

Männlichen Mäusen vom BDF₁-Stamm, mit einem Gewicht von 20 bis 25 g - 10 Tiere in der Gruppe - wurde intravenös CB , CB _o oder CB 3 0 Tage lang verabreicht

X X^ Xj

und die Anzahl der toten Tiere, die Veränderung des

Körpergewichtes und des Allgemeinzustandes wurden beobachtet. Das Körpergewicht wurde zwischen 9 und 10 Uhr vormittags ermittelt und die Beobachtungen des Allgemeinzustandes wurden am 10., 20. und 30. Tag nach der Methode von Arvien (Science, Bd. 36, Seite 123 (1962)) durchgeführt. In diesen 30 Tagen ist kein Tier gestorben bei einer Verabreichung von 1.000 Einheit/kg/Tag CB oder CB_v0 oder von 10.000 Einheit/kg/ Tag von CB- und die Körpergewichtszunahmekurve war 0 etwa die gleiche wie bei der Kontrollgruppe. Der Allgemeinzustand war ebenso normal wie der der Kontrollgruppe .

Aus diesen Versuchen geht hervor, dass CB , CB _ und

^CBx3 selektiv das Wachstum von Tumorzellen unterdrücken und dass sie nicht nur sehr bemerkenswert Krebsmetastasen unterdrücken, sondern auch sher wirksam gegen andere Tumore sind und dabei eine hohe Sicherheit auch bei hohen Dosierungen aufweisen, die höher sind als die . Dosierungen, bei denen eine pharmazeutische Wirkung eintritt. Infolgedessen sind CB , CB „ und CB _ zur Therapie von zahlreichen Krebsarten, wie Magenkrebs, Lungenkrebs. Häpatoma, Darmkrebs, Brustkrebs, Gebärmutterkrebs, Leukämie etc., geeignet.

Weiterhin kann CB (CB , CB „, CB J mit einem relativ niedrigen Molekulargewicht aus CB (CB₁, CB ) mit relativ hohem Molekulargewicht durch Behandlung mit einem Reduktionsmittel ohne Verminderung der Tumor-

3 0 behandlungswirkung gewonnen werden.

Claims

HOFFMANN · EITLE & PARTNER

PATENT-UND RECHTSANWÄLTE

PATENTANWÄLTE DIPL.-ING. W. EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEHN

DIPL.-ING. K. FÜCHSLE · DR. RER. NAT. S. HANSEN . DR. RER. NAT. H.-A. BRAUNS ■ DIPL.-ΙΝβ. K. SDRG

DIPL.-ING. K. KOHLMANN · RECHTSANWALT A. NETTE

38 955 o/wa

MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD., TOKYO / JAPAN

Verfahren zur Herstellung eines Antitumor-Glykoproteins

PATENTANSPRÜCHE

Verfahren zur Herstellung eines Antitumor-Glykoproteins mit einem kleineren Molekulargewicht als dem Molekulargewicht des Ausgangs-Antitumor-Glykoproteins, dadurch gekennzeichnet , dass man als Ausgangsmaterial ein Antitumor-Glykoprotein verwendet, das erhalten wurde aus einem Extrakt oder der überstehenden Flüssigkeit einer Kultur für retxculoendothelialen Zellen, Lymphoblastzellen, Leukämiezellen oder Fibroblasten von Warmblütern, dass man das Glykoprotein einer Abbaubehandlung unterwirft, indem man es mit einem Reduktions-

LLASTRASSE 4 · D-8OOO MÜNCHEN B1 · TELEFON CO89J 9110 87 · TELEX O5-29619 CPATHE} · TELEKOPIERER 9183

mittel umsetzt und dass man anschliessend wenigstens einen Teil des Antitumor-Glykoproteins mit einem verminderten Molekulargewicht aus dem Reaktionsgemisch gewinnt.
5

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das Antitumor-Glykoprotein ein Glykoprotein CB mit folgenden Eigenschaften ist:
10

(1) Molekulargewicht; 70.000 bis 90.000;

(2) Farbreaktion: zeigt eine Farbe, die Proteine bei der Lowry-Reaktion anzeigt, zeigt eine Farbe, die Peptidbindungen

und Aminosäuren bei der Ninhydrin-Reaktion nach der Hydrolyse mit Salzsäure anzeigt und zeigt eine Farbe, die Zucker bei der Phenol-Schwefelsäure-Reaktion,

0 . der Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, der

Indol-Schwefelsäure-Reaktion und der Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion anzeigt;

(3) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer und wenig löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

(4) Zuckergehalt: 35 bis 45 %, wobei sich

der Zucker aus 23 bis 28 % Hexosen, 8 bis

11 % Hexosaminen und 4 bis 6 % Sialylsäuren zusammensetzt;

(5) isoelektrischer Punkt: 4,3 bis 6,2;

(6) Adsorbierbarkeit: wird auf Ulex europeus agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01M

Phosphatpuffer (pH 7,2) adsorbiert;

(7) Stabilität: stabil in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4⁰C während 24 Stunden oder mehr und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei

60⁰C während 3 Stunden oder mehr; und

(8) Cytotoxizität: schädigt selektiv Tumorzellen, ohne dass es im wesentlichen Nor-

malzeilen schädigt;

wobei das durch die Abbaubehandlung erhaltene Antitumor-Glykoprotein wenigstens ein Glied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Antitumor-2 0 Glykoproteinen CB_V_ , CB_V und CB- mit den folgenden Eigenschaften ist:

^CBX2^:

(1) Molekulargewicht: 40.000 bis 50.000;

(2) Farbreaktionen: entwickelt eine proteinanzeigende Farbe bei der Lowry-Reaktion, entwickelt eine Peptidbindungen und Amino-

30 säuren anzeigende Farbe bei der Ninhydrin-

Reaktion nach der Hydrolyse mit Salzsäure

und entwickelt eine zuckeranzeigende Farbreaktion bei der Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, der Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, der Indol-Schwefelsäure-Reaktion und der Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion;

(3) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer und wenig löslich

10 in Benzol, Hexan und Chloroform;

(4) Zuckergehalt: 30 bis 37 %, wobei die Zuckerzusammensetzung 20 bis 23 % Hexosen, 6 bis 8 % Hexosamine und 4 bis 6 % Sialyl-

15 säure ist;

(5) isoelektrischer Punkt: 4,2 bis 7,3;

(6) Adsorbierbarkeit: adsorbierbar auf Ulex

0 . europeus agglutinin-konjugiertem Sephadex

in 0,01M Phosphatpuffer (pH 7,2);

(7) Stabilität: stabil in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4⁰C während 24 Stunden oder mehr und

in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C während 3 Stunden oder mehr; und

(8) Cytotoxizität: schädigt selektiv Tumorzellen ohne im wesentlichen Normalzellen

zu schädigen;

CB_x:

(1) Molekulargewicht: 12.000 bis 17.000;

(2) Farbreaktion: entwickelt eine Farbe, welche Protein bei der Lowry-Reaktion anzeigt, entwickelt eine Farbe, welche Peptidbindungen und Aminosäuren bei der NinhydrinReaktion nach der Hydrolyse mit Salzsäure anzeigt und entwickelt eine Farbe, welche

Zucker bei der Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, bei der Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, bei der Indol-Schwefelsäure-Reaktion und der Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion

15 anzeigt;

(3) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver, löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer und kaum löslich in

20 .Benzol, Hexan und Chloroform;

(4) Zuckergehalt: 27 bis 33 %, wobei der
Zucker sich aus 17 bis 20 % Hexosen, 5
bis 7 % Hexosaminen und 5 bis 6 % Sialyl-

25 säuren zusammensetzt;

(5) isoelektrischer Punkt: 4,3 bis 7,3;

(6) Adsorbierbarkeit: adsorbierbar auf Ulex
europeus agglutinin-konjugiertem Sephadex

in 0,01M Phosphatpuffer (pH 7,2);

(7) Stabilität: stabil in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4⁰C während 24 Stunden oder mehr und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei

5 60⁰C während 3 Stunden oder mehr;

(8) Cytotoxizität: schädigt selektiv Tumorzellen, ohne im wesentlichen Normalzellen zu schädigen; und

(9) Differenzierung: induziert Differenzierungen bei Tumorzellen, d.h. dass es die Tumorzellen in normale Zellen überführt;

15 · CB_X3:

(1) Molekulargewicht: 7.000 bis 9.000;

(2) Farbreaktion: entwickelt eine Farbe, welehe Protein bei der Lowry-Reaktion anzeigt,

entwickelt eine Farbe, welche Peptidbindungen und Aminosäuren bei der Ninhydrin-Reaktion nach der Hydrolyse mit Salzsäure anzeigt, und entwickelt eine Farbe, welehe Zucker bei der Phenol-Schwefelsäure-

Reaktion, der Anthon-Schwefelsäure-Reaktion, der Indol-Schwefelsäure-Reaktion und der Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion anzeigt;

(3) Aussehen und Löslichkeit: weisses Pulver,

löslich in Wasser, wässrigem Natriumchlorid

und Phosphatpuffer und kaum löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

(4) Zuckergehalt: 8 bis 15 %, wobei der

Zucker sich aus 6 bis 10 % Hexosen, 1 bis

2 % Hexosaminen und 1 bis 3 % Sialylsäuren zusammensetzt;

(5) Adsorbxerbarkeit: adsorbierbar auf Carboxy-0 methylzellulose bei der lonenaustausch-

chromatografie unter Verwendung von Carboxymethylzellulose in 0,05M Phosphatpuffer (pH 6,4);

(6) Stabilität: stabil in einer wässrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4⁰C während 24 Stunden oder mehr und in einer wässrigen Lösung von pH 7,0 bei 60⁰C während 3 Stunden oder mehr;

(7) Cytotoxizität: schädigt selektiv Tumorzellen, ohne im wesentlichen Normalzellen zu schädigen;

(8) die Aminosäuresequenz im Endteil des Proteinanteils ist Alanin-Alanin.

ο Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass das Ausgangs-Antitumor-0 Glykoprotein CB_-1 erhalten wurde aus der überstehen-

X I

den Lösung einer Kultur von reticulo-endothelialen

Zellen, Lymphoblasten, Leukämieζeilen oder Fibroblasten von Warmblütern, indem man die überstehende Flüssigkeit aussalzt und den dabei erhaltenen Niederschlag durch Gelfiltration fraktioniert, unter Erhalt einer Fraktion mit ^feinem Molekulargewicht von 70.000 bis 90.000 und anschliessendem Adsorbieren und Eluieren von Ulex europeus agglutinin-konjugiertem Sephadex.

4. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das Ausgangs-Antitumor-Glykoprotein CB ist und dass das durch die Abbaubehandlung erhaltene Antitumor-Glykoprotein wenigsten

15 ist.

stens ein Glykoprotein aus der Gruppe CB und CB-

5. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , dass das Ausgangs-Antitumor-Glykoprotein CB „ erhalten wurde aus der überstehen-

20 ' den Flüssigkeit über einer Kultur von reticulo-

endothelialen Zellen, Lymphoblasten, Leukämiezellen oder Fibroblasten von Warmblütern, indem man die überstehende Flüssigkeit aussalzt und den erhaltenen Niederschlag durch Gelfiltration fraktionierte, unter Erhalt einer Fraktion mit einem Molekulargewicht von 40.000 bis 50.000, worauf man anschliessend die Fraktion einer Adsorption und Eluierung auf Ulex europeus agglutinin-konjugiertem Sephadex unterwirft.

6. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e η η -

zeichnet , dass das Ausgangs-Antitumor-Glykoprotein CB ist und das durch die Abbaubehandlung erhaltene Antitumor-Glykoprotein CB-. ist.

7 . Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass das Ausgangs-Antitumor-Glykoprotein CB_V erhalten wurde -aus der überstehenden Flüssigkeit über einer Kultur von reticuloendothelialen Zellen, Lymphoblasten, Leukämiezellen

10 oder Fibroblasten von Warmblütern, indem man die

überstehende Flüssigkeit aussalzt und den erhaltenen Niederschlag dann durch Gelfiltration fraktionierte , wobei man eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 12.000 bis 17.000 erhielt und worauf man

1 5 dann die Fraktion einer Adsorption und Eluierung auf Ulex europeus agglutinin-konjugiertem Sephadex unterwirft.

8 - Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7, da-20 durch gekennzeichnet , dass das

Reduktionsmittel wenigstens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Thiolverbindung, einem Metalhydridkomplex, einem tertiären Phosphin, einem Sulfit, einem Cyanid und einem Metallion ist.

9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Thiolverbindung 3-Mercaptoethanol, Dithiothreitol, Dithioerythritol, Thio-0 glykolsäure oder Monothiophosphorsäure ist.

- 10 -

10. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , dass die Abbaubehandlung in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels durchgeführt wird.

11. Verfahren gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , dass das oberflächenaktive Mittel Natriumdodecylsulfat, Natriumcholat, Dodecyltrimethylammoniumbromid, Deoxylys

10 Tween ® 20 oder Span ® 60 ist.

methylammoniumbromid, Deoxylysolecithin, Triton ^ X,

12. Verfahren gemäss Ansprüchen 8 oder 11, dadurch
gekennzeichnet , dass die Abbaubehandlung bei einer Temperatur zwischen 0 und 37⁰C im

Bereich von schwach sauer bis zum Neutralpunkt durchgeführt wird.

13. Verfahren gemäss Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , dass die Temperatur zwischen

20 -15 und 25⁰C liegt.