JPS6310733A

JPS6310733A - 癌細胞傷害活性物質及びその製法

Info

Publication number: JPS6310733A
Application number: JP62004995A
Authority: JP
Inventors: Masatoshi Yamazaki; 山崎　正利
Original assignee: Kotobuki Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Kotobuki Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1986-03-03
Filing date: 1987-01-14
Publication date: 1988-01-18

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、新たに発見されたタツナミ貝に含まれる癌細
胞傷害活性物質と、その抽出、精製方法に関する。尚、
本明細四では、アミノ酸を以下のように略記する。

Ａｒｇ　：アルギニン；　　　　Ａｓｎ”アスパラギン
Ａｓｐ：アスパラギン酸；　　ＣｙｓニジスティンＧｌ
ｎ　：グルタミン：　　　　　Ｇｌｕ　：グルタミン酸
Ｇｌｙ　ニゲリシン；　　　　　Ｈｌｓ　’ヒスチジン
１１ｃ：インロイシン；　　　Ｌｅｕ　：ロイシンＬｙ
ｓ：リジン：　　　　　　Ｐｒｏ　ニブロリンＳｃｒ　
：セリン；　　　　　　　Ｔｈｒ　：スレオニンＴｙｒ
　：チロシン：　　　　　Ａｌａ　：アラニンＭｅｔ　
：メチオ二ン；　　　　Ｐｈｅ：フェニルアラニンＴｒ
ｐ：　トリプトフアン；　　Ｖａｌ：バリン（従来の技
術）近年、癌治療の分野において癌細胞傷害活性物質の発見
が各種動物又は各種臓器よりなされている。その代表的
な物質は当初ウサギより発見きれたＩＮＦ、インターロ
イキン２（工Ｌ−２）及び癌破壊因子（ＣＢＦ）等があ
る。

（発明の構成）本発明者は、癌細胞を特異的に壊死損傷許せ正常細胞に
は作用しない生理活性物質を探求する一連の研究中にタ
ツナミ貝（Ｄｏｌａｂｅｌｌａ　ａｕｒｉｃｕｌａｒｉ
ａ）の各種臓器（分泌物も含む）より得られる物質が特
異的に癌細胞を傷害し正常細胞に作用を及ぼさない事実
を発見し、かつその有効な抽出、精製方法を見出し本発
明を完成させるに至った。

本発明の要旨は、タツナミ只の臓器、即ちタツナミ貝の
粘液線、卵白腺、体腔液、葉汁液、１偲等の臓器の１種
又は２種以上から、水、生理食塩水、燐酸緩衝液などの
水性系溶媒を用いて抽出精製して得られる癌細胞傷害活
性を有する抽出物質と、タツナミ貝臓器から前記水性系
溶媒を用いて得られる粗抽出物をゲル濾過剤を充填剤と
するカラムクロマトグラフィーによって分画し、癌細胞
傷害活性を有する画分を分取することを内容とする分離
精製方法とにある。

抽出方法は、好ましくは０〜５℃の低温下で、タツナミ
只の臓器に生理食塩水などの抽出溶媒を加えてホモジナ
イズし、濾過、遠心分離等の操作により固形分を除去す
る。この場合、臓器は、一種類のみを用いたものでも、
肥、体腔液、卵白腺その他の複数の臓器の混合物を用い
て得た抽出物でも、顕著なＰ！ｔｆａ胞への傷害活性を
示す、このようにして得られた抽出物は、更に分子篩型
充填剤を用いたカラムクロマトグラフィーによって複数
の画分に分画し、各画分について癌細胞傷害活性をテス
トして、その活性を有する画分を分取すること、或いは
分取したその活性画分について、同様の分画操作を繰り
返すことによって精製される。

かくして得られた本願抽出物は、癌細胞に対して特異的
な傷害作用を有するにも拘らず、正常細胞には、同等傷
害作用を及ぼさず、その上、すでに発見されている癌細
胞傷害性活性を有する生理活性物質、例えばＩＮＦが傷
害を及ぼし得なかったＡ３４９細胞（ｌｕｎｇ　ｃａｒ
ｃｉｎｏｍａ）や、Ｘ−２４１ｍ胞（ｂｌａｄｄｅｒｃ
ａｒｃｉｎｏｍａ）などの癌細胞にも傷害活性を備えて
おり、従来にない幅広い抗癌スペクトルを有する物質で
ある。特に、本願抽出物中、主として、卵白線及び粘液
線の粗抽出物からゲル濾過剤を用いたカラムクロマトグ
ラフィーによって極めて高純度で分離精製される糖蛋白
質を主体とする画分は、２ｎｇ／ｍ１という低濃度でも
有効で、極めて強い癌細胞傷害活性を有している。これ
は、癌細胞膜上に、本願物質に対する特異的受容体が存
在しておリ、本願物質の癌細胞傷害機構は、本願物質が
、この受容体を介して癌細胞のＤＮＡ合成、ＲＮＡ合成
、蛋白質合成を阻害するものと考えられる。

本願抽出物は、これを抗腫瘍剤として、後記実施例にお
いて得られる抽出物を、成人−人当り１００μｇ〜３０
０ｍｇを、経口又は非経口で投与することにより、その
効果が期待されるものである。

本発明をより詳細に説明するため、以下に製造実施例及
び薬理試験例を掲げる。

［実施例１コタツナミ只の臓器として、（ａ）体腔液、（ｂ）紫汁液
、（ｅ）誌、（ｄ）粘液腺及び卵白腺の夫々を約Ｌｏｇ
ずつとり、水冷下において各々にリン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ（−））３０ｍｊ２ずっを加え、ブレンダーに
て１０分間ホモジネートして抽出する。次に、各懸濁液
を４℃、１０．０００ｒ、　ｐ、　ｍ、で３０分間遠心
分離し、上清釜２５ｍ　ｌを目的抽出物として得る。

［試験例１］殺癌細胞活性の検定１１（ｒで８Ｉ識したマウス乳癌細胞ＭＭ４６及び正常
細胞としてマウス胸腺細胞各々５Ｘ１０３個に、上記実
施例１において得た各抽出液を、生理食塩水で様々に希
釈して得られた検体各２０μｐずつを加え、５％牛脂児
血清含有ＲＰＭ１１６４０培地中、３７°Ｃ−Ｃ１２〜
２４時間培養後、死滅細胞より遊離した６　１（ｒの放
射活性を測定し殺癌細胞活性として全細胞が死滅したと
した時の値を１００％として夫々の値を２≦で表わした
０図１はその結果を示す。最も高い殺細胞効果を示した
検体はタツナミ貝粘液腺及び卵白腺より得られた検体で
あり、１０．０００倍に希釈された検体においてもＭＭ
４６細胞を１００％死滅させている（図−１中、一）。

一方この検体は、正常細胞であるマウス胸腺細胞に対し
ては、同一希釈のｔｏ、　ｏｏｏ倍検体で同等殺細胞作
用を示さず、更に高濃度の３００倍希釈検体においても
この正常細胞に何等影唇を与えなかった。各種臓器抽出
物の間での作用の強さの順は、卵白線＋粘液腺抽出物〉
肥抽出物〉紫汁液抽出物〉体腔液抽出物の順であった。

［実施例２コ次いでこれらの活性物質を精製し、又は大略の分子量を
求める目的で各抽出液（上清）を５ｅｐｈａ−ｃｒｙｌ
　　Ｓ−３００＜１＜６　ｘ３０ｃｍ）（スウｘ−ｆン
、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）又はＧ−３０００ＳＷカラ
ム（０，７φｘ６０ｃｍ）（東洋曹達株式会社製）にか
けゲル濾過分間を行ない、得られた各分画について試験
例１に準じて殺癌細胞活性をテストすることにより、各
活性物質の分離精製を行ない、その結果から分子サイズ
を推定した。以下、各臓器に含まれる活性物質の分離精
製の結果を示す。

（ａ）体腔液抽出液中活性物質体腔液をＧ−３０００ＳＷカラムを用い、高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけた。この時、溶出溶
媒として燐酸を含む生理食塩水（ＰＢＳ（−））を用い
た。その結果、保持時間約１７分のフラクションに殺細
胞活性が見られ、この分子量は約３万〜７万であると推
定された。

（ｂ）紫汁液抽出液中活性物質紫汁液を５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−３００カラムにか
け分離精製した各フラクションの殺細胞活性を調べると
、分子量１万〜６万の間に２つの活性ピークが認められ
た（図−２）。

（ｃ）け抽出液中活性物質誌のホモジネートの上清を５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−
３００カラムにかけ分離精製すると、分子量２万〜５万
に活性のピークが見られた（図−３）。

（ｄ）粘液腺及び卵白腺抽出液中活性物質卵白腺・粘液
腺のホモジネートの上清を５ｅｐｈａ−ｃｒｙｌ　Ｓ　
−３００カラムで分画すると、活性ピークは、分子サイ
ズ約２０〜３０万付近に認められた（図−４参照）。

［実施例３］本願抽出物の精製方法を、卵白腺・粘液腺抽出物につい
て、以下にその詳細を示す。

卵白腺・粘液腺を合わせて１ｇとり、これに２０ｍ１の
ＰＢＳ（−）を加えて水冷下で、ポリトロン（商品名Ｋ
ＩＮＥ　ＭＡＴＩＣＡ社製ホモジナイザー）を用いて、
１００分間ホモジナイズ、得られたホモジネートを１０
．０００ｒ、ｐ、ｍ、　、　４℃で３０分間遠心分離し
、その上清をとる。この上清を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）に対して透析後、ＤＥ−５２カラム（Ｗｈａ
ｔｍａｎ社Ｖ）に吸若させ、１５０ｍＭ　ＮａＣ１を含
む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７，４）を用いて溶出させ
た。得られた各画分について、前記試験例１の方法に準
じて殺癌細胞活性を検定して活性画分を分取し、これを
分子サイズ１万カツトの限外”濾過により濃縮し５ｅｐ
ｈａｒｏｓｅ　６Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉ
ｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）でゲル濾過クロマトグ
ラフィーを行ない、同様に殺癌ｍ胞活性をテストしてそ
の活性分画を得る。活性分画を５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ
−３００にて再度クロマトグラフィーを行ない、同様に
溶出画分の活性をテストして活性画分を分取する。この
活性分画を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７，４）に対して
透析後、ＤＥ−５２カラムに再吸着きぜ、０−２００ｍ
Ｍ　ＮａＣ１を含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７，４）
にて連続濃度勾配溶離にかけ、活性物質を溶出させた。

ここで得られた活性分画をＧ−３０００ＳＷカラムのＨ
ＰＬＣにかけ、精製を確認したところ、保持時間１２分
台にニービークで蛋白質の波長２８０ｎｍにおける吸収
と殺癌細胞活性を得た（図−５）。尚、図−５中ＥＤ、
。Ｕは５０％殺癌細胞活性を示す希釈倍率を１０００で
除した値を示す。又、本精製物はドデシル硫酸ナトリウ
ム−ポリアクリルアミド電気泳動においても単一バンド
を得た。上記から本精製物の分子量は、６〜３０万の範
囲にあるものと推定きれた。

本精製物を等電点電気泳動にかけたところｐ１４．５〜
５．０に複数バンドで検出されたく図−７）。複数バン
ドは、本精製物が有する糖鎖（約１０％：フェノール硫
酸法により測定）の多相性に由来するものと推定された
。この様にして得られた本精製物（タツナミ只卵白線・
粘液線由来ガン細胞傷害物質）を用いて、下記の試験を
行なった。

［試験例２］本精製物のアミノ酸組成をダブジルクロライドを使った
プレカラムラベル法（Ｊ、Ｙ、Ｃｈａｎｇ、　Ｒ。

Ｋｎｅｃｈｔ　ａｎｄ　Ｄ、Ｇ、Ｄｒａｕｍ：Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、Ｊ、１９９．５４７−５５５（１９８１））に
て測定した。結果を下表に示す。数値は分析値を四捨五
入した整数値を表わす。

［試験例３］実施例３により得られた精製物について気相式シーケン
サ−によってＥｄｏｍａｎ分解を行ない、得られたフェ
ニルチオヒダントイン−アミノ酸をＨＰＬＣにより同定
分析しアミノ酸配列を決定した。その結果３ケ所を除い
てアミン末端より下式のとおり同定できた。

ＮＨＩ　　（）−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−１
１ｅ−（）　−１４目Ｓｅｔ　−Ｔｈｒ　−Ｐｒｏ　−Ｇｌｎ　−Ａｓｐ　−
（Ｓｅｒ）　−Ａｓｐ　−Ｔｈｒ　−Ｉ！　　　　　　
　　１も　　　　　　　２１Ｇｌｕ　−Ｔｈｒ　−（）
　−Ａｓｐ　−（Ｓｅｒ）　−Ａｓｎ　−（Ｔｈｒ　ｏ
ｒＬＣｕ）−Ａｓｐｌｌ・・・図−４［尚、上式において（）は、構造不明箇所で、アミノ酸
若しくは＠鎖で修飾されたアミノ酸を、（５ｅｒ）はＳ
ｃｒである可能性を、又、（Ｉｈｒ　ｏｒ　Ｌｅｕ）は
Ｔｈｒか又はＬｅｕである可能性が極めて高いことを、
夫々表わす、］［試験例４］本精製物と同様に殺癌細胞活性を有する生体由来生理活
性物質であるＴＮＦ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）と各種癌
細胞に対する効果を比−較検討した。標的細胞としてＴ
−２４細胞（ｂｌａｄｄｅｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、
ＷｉＤｒ細胞（ｃｏｌｏｎ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｌ
Ｓ１７４Ｔ（ｃｏｌｏｎ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ａ５
４９（ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を用いた。いず
れのＭ５胞に対しても本願精製物は２ｎｇ、７ｍ１以下
の低濃度で１゜０％の殺癌活性を示したが、ＴＮＦは５
０ｎｇ／ｍ　１以上の’ａＪｆｉでも殺癌活性を示さな
かった。代表例としてＴ−２４細胞を用いた実験の結果
を図−６に示した。

［試験例５］癌細胞膜上の本癌ｍ胞傷害活性物質特異的受容体の検索受容体検索には、エンザイム・リンクド・イムノ・ソル
ベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ　；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　７０　ｐ、４１９　（１９
８０＞）を応用した。

細胞膜はＮ、キャビテーション（Ｅ、　Ｆｅｂｅｒ　ｅ
ｔ、　ａｌ、　；Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ−Ａ
ｃｔａ　２６６　ｐ、４９４　（１９７２））によって
可溶化膜画分を調整した。この可溶化膜画分をポリビニ
ルクロライドのプレートにコートし、その後、タツナミ
貝由来癌細胞傷害活性物質、マウス抗タツナミ貝由来癌
細胞傷害活性物質血清、アルカリホスファターゼ結合、
抗マウスエｇＧ抗体、ｐ−ニトロフェニルホスフェート
の順にプレートを処置してその発色の吸光度を測定する
ことにより、受容体の存在を確認した。

［試験例６コ癌細胞傷害活性の作用機序の検討本精製物が、殺癌活性を示す際の機序をＤＮＡ合成、Ｒ
ＮＡ合成、蛋白質合成について検討した。

本精製物は、ＭＭ４６細胞に対して３Ｈ標識したチミジ
ン、ウリジン、Ｌｅｕの取り込みを９５０ｎｇ／ｍ　ｊ
２の濃度で完全に阻害していた事から、ＤＮＡ合成から
蛋白質合成に至る一連の反応を阻害しているものと結論
した。

【図面の簡単な説明】

図−１は、本願物質の殺癌細胞効果を示すグラフである
。図−２、図−３、゛図−４は夫々、紫汁液抽出物、誌
抽出物及び粘液線＋卵白線抽出物のゲル濾過分離におけ
る溶出パターンと殺癌細胞活性との関連を示すグラフで
ある。図−５は、粘液線・卵白線抽出物の精製物のＧ−
３０ＱＯ５ＷカラムによるＨＰＬＣのクロマトグラムで
ある０図−６は、実施例３の精製物とＩＮＦとの、Ｔ−
２４細胞に対する殺癌細胞効果を示すグラフである。図
−７は、本願精製物の等電点電気泳動パターンである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）タツナミ貝（Ｄｏｌａｂｅｌｌａ　ａｕｒｉｃｕ
ｌａｒｉａ）の臓器抽出物から成る癌細胞傷害活性物質
。
（２）臓器抽出物が、タツナミ貝体腔液抽出物であって
、ゲル濾過剤を用いたカラムクロマトグラフィーによる
推定分子量が約３万〜７万の範囲にある特許請求の範囲
第１項記載の癌細胞傷害活性物質。
（３）臓器抽出物が、タツナミ貝紫汁液及び／又は紫汁
腺の抽出物であって、ゲル濾過剤を用いたカラムクロマ
トグラフィーによる推定分子量が約１万〜６万の範囲に
ある特許請求の範囲第１項記載の癌細胞傷害活性物質。
（４）臓器抽出物がタツナミ貝腮抽出物であって、ゲル
濾過剤を用いたカラムクロマトグラフィーによる推定分
子量が約２万〜５万の範囲にある特許請求の範囲第１項
に記載の癌細胞傷害活性物質。
（５）臓器抽出物が、主としてタツナミ貝の卵白腺及び
／又は粘液線の抽出物であって、ゲル濾過剤を用いたカ
ラムクロマトグラフィーによる推定分子量が約６万〜３
０万の範囲にあり、紫外部波長２８０ｎｍ付近に吸収極
大を有し、タツナミ貝卵白線及び／又は粘液線の水、生
理食塩水、各種緩衝液等の水性系溶媒への可溶物質をゲ
ル濾過剤を用いたカラムクロマトグラフィーによって分
画し、癌細胞障害活性の最も強い画分を分取することを
繰り返して得られる物質であって、ポリアクリルアミド
電気泳動によって単一バンドを与え、その組成の一部に
、式：ＮＨ＿２−（α）−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
Ｉｌｅ−（β）−Ｓｃｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａ
ｓｐ−（γ）−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−（δ
）−Ａｓｐ−（ε）−Ａｓｐ−（Ｔｈｒ又はＬｃｕ）−
［但し式中、α、β、γ、ｓ及びεは、夫々、アミノ酸
若しくは糖鎖で修飾されたアミノ酸を表わす。］で示されるアミノ酸配列を有する糖蛋白質を含有してい
る特許請求の範囲第１項記載の癌細胞傷害活性物質。
（６）タツナミ貝（Ｄｏｌａｂｅｌｌａ　ａｕｒｉｃｕ
ｌａｒｉａ）の臓器に水、生理食塩水、各種緩衝液等の
水性系溶媒を加えてホモジナイズした後、固形分を除去
して得られる抽出液を、分子篩効果を有するゲル濾過剤
を用いたカラムクロマトグラフィーにかけて分画し、癌
細胞傷害活性を有する画分を分取することを特徴とする
タツナミ貝臓器からの癌細胞傷害活性物質の分離精製方
法。