DE4320889C2 - Neue extrahierte Substanz mit Anti-HIV-Aktivität - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer neuen Substanz, die zur antiviralen Inhibition des humanen Immundefizienzvirus (HIV) nützlich ist, sowie auf die nach diesem Verfahren erhältliche Substanz. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Extraktion einer Substanz aus einem Gemisch nicht-fetthaltiger Stärke von Ricini-Samen und Coptis sp.-Wurzel, welche geeignete anti-HIV-Aktivität ohne irgendwelche Nebenwirkungen aufweist.

Stand der Technik

1983 wurde entdeckt, daß HIV-1 das ursächliche Mittel des erworbenen Immundefektsyndroms (AIDS) ist. Darauf folgten mehrere Versuche, das Genom des Virus und antivirale Inhibitoren dafür zu finden.

Die selektive HIV-Infektion bei der Helfer-T-Zelle (TH) leitet eine Erkrankung des Immunsystems ein und führt anschließend zu AIDS. Während der Latenzphase bleibt üblicherweise ein revers transkribiertes virales Genom des Virus. Am Ende dieser Phase leitet die virale Proliferation eine Zellfusion zur Bildung von Synzytien und anschließend von Killerzellen durch eine akute Infektion ein. Andernfalls wird die virale Proliferation ohne irgendwelche bedeutsamen cytopathischen Wirkungen durch eine chronische Infektion fortgesetzt.

Wenn das Membranprotein gp120 des Virus CD4-Rezeptoren, die in Wirtszellen vorhanden sind, erkennt, dann befestigt es sich daran. Der Virus dringt in Zellen ein, und dann ändert sein Gen unter Anwendung von reverser Transkriptase RNA in DNA, und schließlich dringt es in das Chromosom von Wirtszellen ein.

Das virale Genom wird in den Zellen durch mehrere Signale und Faktoren, die bei einer Wirtszellen-Proliferation erforderlich sind, repliziert, und dann wird eine lange Proteinkette durch Wirkung eines Regulatorproteins, das durch das Virusgen exprimiert wird, produziert. Es wirkt dann als eine spezifische HIV-Protease auf die für die virale Replikation wesentlichen Proteine, wobei einige dieser Proteine in Glykoproteine übergeführt werden und anschließend sich aneinanderfügen, um den ganzen Virus zu bilden.

Um anti-HIV-Arzneimittel zu entwickeln, sollten dementsprechend folgende Hemmfunktionen den viralen Replikationscyclus durch eine chemische Therapie geschaffen werden.

• (a) Hemmung des Wirkmechanismus zwischen gp120 des Virus und CD4-Rezeptoren von Wirtszellen;
• (b) Hemmung des Wirkmechanismus einer reversen Transkriptase zur Umwandlung der RNA des Virus in provirale DNA;
• (c) Hemmung des Wirkmechanismus viraler Regulationsproteine;
• (d) Hemmung der Spaltung viraler Vorstufenproteine;
• (e) Hemmung des Wirkmechanismus einer Glucosidase oder einer Mannosidase zur Verhinderung von Modifikationen in Glykoproteinen; und so weiter.

Bis jetzt ist eine Reihe von Arzneimitteln mit selektiver antiviraler Wirksamkeit entwickelt worden, die die Unterschiede zwischen HIV und menschlichen Wirtszellen ausnutzen. Solche Arzneimittel, die besonders die virale Zellproliferation hemmen, schließen Dextransulfate und Peptid T mit der oben beschriebenen Hemmfunktion (a) ein; Dideoxycytidine, Dideoxyinosine und Phosphonoformate mit der Funktion (b). Außer diesen sind Beispiele Ribavirin, Castanospermin, GLQ 223, Antisense-Oligonucleotide, Protease-Inhibitor usw. Allerdings sind diese Arzneimittel gegen AIDS im Handel noch nicht erhältlich.

Außerdem wird Zidovudin (Azidothymidin, AZT) gleichzeitig als AIDS-Medikament verwendet; allerdings hat es ernste Nachteile, dadurch, daß es normalerweise Nebenwirkungen verursacht, die Symptome wie Kopfweh, Erbrechen, hohes Fieber und Flecken, Schädigungen des blutbildenden Systems, des Nervensystems und Unterdrückung der Leberfunktion einschließen, und daß in einer Langzeit-Therapie häufig eine Resistenz gegen Arzneimittel beobachtet wird.

Wir, die Erfinder der vorliegenden Erfindung, haben in großem Umfang intensiv Versuche durchgeführt, um wirksame Inhibitoren mit hoher Behandlungswirkung zu entwickeln. Als Ergebnis haben wir herausgefunden, daß eine neue extrahierte Substanz, die aus Semen Ricini und Coptis sp.-Wurzel isoliert wird, eine deutlich verbesserte Aktivität aufweist; so konnten wir die vorliegende Erfindung vollenden.

Eine Aufgabe der Erfindung besteht daher in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung einer Substanz aus einem Gemisch nicht-fetthaltiger Stärke von Semen Ricini und Coptis sp.-Wurzel, die geeignete anti-HIV- Aktivität ohne irgendwelche Nebenwirkungen aufweist.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung einer neuen, nach diesem Verfahren erhältlichen Substanz, welche als Inhibitor der HIV- Proliferation verwendbar ist und keine Nebenwirkungen verursacht.

Zusätzliche Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden beim lesen des Restes der Beschreibung offenkundig.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist ein Schaubild, das ein Extraktionsverfahren für ein Produkt gemäß der Erfindung zeigt;

Fig. 2 stellt eine mikroskopische Aufnahme der Testgruppe für HIV-infizierte Zellen dar, die in der Erfindung als Kontrolle verwendet wird;

Fig. 3 stellt eine mikroskopische Aufnahme der Testgruppe dar, die in 10 µg/ml verabreicht wird;

Fig. 4 stellt eine mikroskopische Aufnahme der Testgruppe dar, die in 50 µg/ml verabreicht wird;

Fig. 5 stellt eine mikroskopische Aufnahme der Testgruppe dar, die in 100 µg/ml verabreicht wird;

Fig. 6 ist ein Schaubild, das ein Fraktionierungsverfahren für ein Produkt der Erfindung in Abhängigkeit von der Polarität darstellt;

Fig. 7 stellt ein Dünnschicht-Chromatogramm für eine Fraktion, wie sie in Fig. 6 dargestellt ist, und für Berberin dar;

Fig. 8 stellt ein Dünnschicht-Chromatogramm für Fraktionen der Fraktion 6 dar, die durch Ionenaustauscherchromatographie fraktioniert wurden;

Fig. 9 stellt ein Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatogramm (HPLC) für Fraktion 6 dar;

Fig. 10 stellt IR-Spektren für Fraktion 6-5 und Berberin dar;

Fig. 11 stellt ein ¹H-NMR-Spektrum für Fraktion 6-5 dar;

Fig. 12 stellt ein ¹H-NMR-Spektrum für Berberin dar;

Fig. 13 stellt ein ¹³C-NMR-Spektrum für Fraktion 6-5 dar;

Fig. 14 stellt ein ¹³C-NMR-Spektrum für Berberin dar;

Fig. 15 stellt Massenspektren für Fraktion 6-5 und Berberin dar.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine neue extrahierte Substanz bereitgestellt, die aus Semen Ricini und Coptis sp.-Wurzel isoliert wird.

Die erfindungsgemäße extrahierte Substanz ist geeignet, eine bestimmte Stufe im viralen Replikationszyklus zu hemmen. Sie weist im Vergleich zu anderen herkömmlichen Inhibitoren höhere Hemmaktivität bei der HIV-Proliferation auf. Darüber hinaus ist die erfindungsgemäß extrahierte Substanz anderen herkömmlichen dahingehend überlegen, daß sie bei Testtieren keine Nebenwirkungen verursacht.

Die extrahierte Substanz der vorliegenden Erfindung wird aus einer Mischung aus nicht-fetthaltiger Stärke von Semen Ricini und Coptis sp.-Wurzel hergeleitet. Das Mischungsverhältnis von Semen Ricini zu Coptis sp.-Wurzel beträgt vorzugsweise 2 : 5 bis 5 : 2.

Toxische Komponenten wie Ricinprotein und Ricinin-Alkaloid, welche in dem Gemisch enthalten sein können, werden durch ein in Fig. 1 veranschaulichtes Verfahren abgebaut.

Seinen Ricini, die in der Erfindung verwendet werden, enthalten 30 bis 50% Fette. Sie enthalten auch Proteine wie Globulin, Nucleoalbumin, Glycoprotein, Ricin, Lipase usw. und ein toxisches Ricinin-Alkaloid. Die Ricinus-Staude stammt aus Indien und dem tropischen Afrika und ist außer in den kalten Breiten weit verbreitet. Sie wird insbesondere in den nordöstlichen Regionen in großem Rahmen angebaut und kommt reichlich in Amerika und Java vor. In den Tropen und Subtropen kommt sie überwiegend als Strauch vor, in den gemäßigten Breiten hingegen als einjähriges Kraut. Repräsentatives Beispiel für Semen Ricini ist Ricinus Communis L.

Coptis sp., die andere in der Erfindung verwendete Pflanze, ist ein perennierendes Kraut, welches natürlich wächst oder auf kleinen Hügeln in vielen Ländern Asiens angebaut wird. Beispiele chinesischer Herkunft sind z. B. Coptis chinensis FRANCH, Coptis deltoidis C.Y. CHENG et HSIAO, Coptis quinquesecta W.T. WANG, Coptis Teetoide C.Y. CHENG und Coptis chinensis FRANCH var brevisepala W.T. WANG et HSIAO; ein Beispiel indischer und nepalesischer Herkunft ist Coptis teeta WALL; Beispiele japanischer Herkunft sind Coptis japonica MAKINO var dissecta NAKAI, Coptis japonica MAKINO var japonica SATAKE; ein Beispiel koreanischen Ursprungs ist Jeffersomia dubia BENTHAN et Hooker; und so fort. Die gelben oder gelblich-braunen Bestandteile von Coptis sp.-Wurzeln bestehen hauptsächlich aus Berberin-Alkaloide; sie enthalten Palmatine, Rateorrhizine, Captisine, Magnoflorine usw. Es wird angenommen, daß diese Komponenten eine stimulierende Wirkung auf die Galle und die Pankreatin-Sekretion, vorbeugende Wirkung gegen Arteriosklerose sowie antiphlogistische Wirkung haben. Deshalb wird Coptis sp. als antiphlogistisches Magenmittel und Beruhigungsmittel bei Hyperämie und Entzündungen eingesetzt.

Die extrahierte Substanz der Erfindung wird durch eine Misch-Extraktion von Ricinus Communis L. und Coptis sp.-Wurzel erhalten. Im Fall einer getrennten Extraktion hat der Extrakt starke Nebenwirkungen und eine schlechte anti-HIV- Aktivität.

Gemäß Fig. 1, einem Schaubild, das ein Extraktionsverfahren für ein erfindungsgemäßes Produkt zeigt, kann die neue extrahierte Substanz der Erfindung durch ein Verfahren hergestellt werden, das die folgenden Schritte umfaßt:

• a) Vermischen von nicht-fetthaltiger Stärke von Semen Ricini und Coptis sp.-Wurzel in einem Gewichtsverhältnis von 2 : 5 bis 5 : 2,
• b) Eluieren des Gemisches mit einem organischen Lösungsmittel bei Raumtemperatur von 20-25°C für 20 bis 25 Stunden,
• c) wiederholtes Filtrieren des erhaltenen Filtrates unter reduziertem Druck unter Abtrennung des Rückstandes,
• d) Trocknung des Rückstandes und anschließende Zugabe von destilliertem Wasser,
• e) 3-4stündige Extraktion des Rückstandes unter Erhitzen auf 100°C,
• f) Konzentrieren des erhaltenen Extraktes unter reduziertem Druck und anschließende Entfernung des Präzipitates,
• g) Zugabe von Chloroform zu dem erhaltenen Extrakt, anschließendes Rühren des Gemisches und Auftrennen der Phasen,
• h) Entfernen der Chloroform-Phase, Zugabe von Hexan zur wäßrigen Phase und anschließendes Entfernen des organischen Lösungsmittels,
• i) Reinigen der wäßrigen Phase mit Talk, Filtrieren der erhaltenen Lösung bei reduziertem Druck unter Erhalt eines Filtrates, und
• j) Filtrieren der erhaltenen Lösung durch ein Membranfilter und dann Lyophilisierung unter Erhalt eines gelblich braunen Pulvers.

Als Lösungsmittel können ein oder mehrere Lösungsmittel, ausgewählt aus der aus aliphatischen Kohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, Alkoholen, halogenierten (C₁-C₈)-Kohlenwasserstoffen, die 1 bis 6 gleiche oder verschiedene Halogenatome enthalten, Fettsäureestern, die Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl- oder Amylester umfassen, Essigsäureestern und Ketonen, die aliphatische oder aromatische (C₁-C₈)-Gruppen haben, bestehenden Gruppe, verwendet werden.

Die extrahierte Substanz enthält keine toxischen Komponenten wie Ricinprotein und Ricinin-Alkaloid. Die erfindungsgemäß extrahierte Substanz kann dem menschlichen Körper durch verschiedene Arten der Injektion verabreicht werden, beispielsweise intravenös, intramuskulär, subkutan und intraperitonal, wobei die Substanz in destilliertem Wasser oder physiologischer Salzlösung gelöst ist.

Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der AIDS-Behandlung bereitgestellt, welche die neue extrahierte Substanz der Erfindung als aktives Ingredienz im Gemisch oder in Assoziation mit herkömmlichen Ingredienzien wie Trägerstoffen, Arzneimittelträgersubstanzen und anderen Zusatzstoffen enthält.

Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein AIDS- Behandlungsverfahren bereitgestellt, welches die Verabreichung der neuen extrahierten Substanz der vorliegenden Erfindung in den Körper umfaßt.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die vorliegenden Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele näher erläutert. Die Beispiel dienen nur zur Erläuterung und sollen die Erfindung, welche in den Ansprüchen genau dargestellt wird, nicht beschränken.

BEISPIEL 1 (In-Vitro-Versuch)

Um die Toxizität der extrahierten Substanzen für T-Zellen (Sup T₁ · H9) zu beurteilen, werden die maximal akzeptablen Konzentrationen der antiviralen Mittel wie folgt bestimmt:
Zu 0,5 bis 0,8 × 10⁶ Testzellen wird die Lösung, die die extrahierten Substanzen der Erfindung in verschiedener Konzentration von 1,0 ppm bis 100 ppm enthält, wie es in Tabelle 1 dargestellt ist, zugesetzt und inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Zahl der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers nach der Trypanblau-Ausschluß-Methode gezählt, um so eine vernünftige Konzentration zu bestimmen.

Die Virusrekombination wurde in diesem Beispiel als Kontrolle verwendet. Der Virus ist pSVCAT, in welchem HIV-1 nef, was für eine Selbst-Replikation nicht notwendig ist, durch Chloramphenicol-Acetyotransferase (CAT) ersetzt ist. Dieser Virus hat viele Vorteile, indem ein Syncytium­ bildender Versuch wie auch eine Bestimmung auf dem Level der viralen Replikation durchgeführt werden kann, indem die CAT- Aktivität bewertet wird, und das Problem einer möglichen Unsicherheit beim nef-Gen gelöst werden kann, da davon ausgegangen wird, daß ein nef-Gen zur In-vivo viralen Replikation notwendig ist, was im Fall des Affen- Immundefizienz-Virus bewiesen wurde.

Auf 96-Wells-Platten wurden 5 × 10⁴ Sup T₁-Zellen und verschiedene Konzentrationen der erfindungsgemäßen extrahierten Substanzen gegeben und dann 50 TCID₅₀ pSVCAT hinzugefügt. Nach einer dreitägigen Inkubation wurden die resultierenden vielkernigen Zellen gezählt. Zur Bestimmung einer wirksamen Konzentration wurde das so gemessene Ergebnis mit jenem der AZT-behandelten Kontrolle, das in Tabelle 2 dargestellt ist, hinsichtlich der Inhibition bei der Syncytium-Bildung verglichen.

H9-Wirtszellen wurden mit dem genannten Virus und den erfindungsgemäßen Substanzen in der wirksamen Konzentration behandelt. In 3tägigem Intervall wurde 3/4 des Mediums durch ein frisches Medium, das die gleiche Konzentration der erfindungsgemäßen Substanzen enthielt, ersetzt. Nach einer Inkubation von 9 Tagen wurde 1 ml der Kultur in ein konisches Rohr gegeben und 10 Minuten lang mit 350 g zentrifugiert, um die Aktivität von reverser Transkriptase und CAT zu überprüfen.

Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 bis 3 sowie in den Fig. 2 bis 5 dargestellt. Tabelle 2 gibt die Wirkungen von AZT an und Tabelle 3 jene von Berberin selbst. Fig. 2 ist eine mikroskopische Aufnahme der HIV-Testgruppe, die in der Erfindung als Kontrolle verwendet wird.

Aus Tabelle 1 und den Fig. 3 bis 5 geht hervor, daß mehrkernige Zellen bei der. Konzentration von 10 µg/ml oder mehr (10 µg/ml, 50 µg/ml und 100 µg/ml) nicht auftreten. Die erfindungsgemäßen Substanzen sind hinsichtlich des Wirkungsgrades bei der gleichen Konzentration AZT unterlegen, allerdings verursacht AZT ernste Nebenwirkungen in der Langzeittherapie wie z. B. Kopfweh, Erbrechen, hohes Fieber und Flecken an verschiedenen Körperteilen. Damit hat sich bestätigt, daß die extrahierten Substanzen der vorliegenden Erfindung starke antivirale Aktivität bei der HIV-Proliferation aufweisen, und zwar ohne irgendwelche Nebenwirkungen.

TABELLE 1. Die erfindungsgemäßen Substanzen

TABELLE 2. AZT

TABELLE 3. Berberin

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel erläutert eine Abtrennung aktiver Ingredienzien aus den extrahierten Substanzen. Die Substanzen wurden gemäß einem Verfahren, das in Fig. 6 dargestellt ist, in fünf verschiedene Fraktionen getrennt und dann einer Dünnschichtchromatographie (TSC) unterworfen. Jede Fraktion wurde in destilliertem Wasser gelöst, und zwar in einer Konzentration von 100 g extrahierte Substanz pro 1 l Wasser, außer Fraktion 2, die in einer Konzentration von 50 g/l gelöst wurde (niedrigere Löslichkeit in Wasser). Unabhängig davon wurde das gleiche Verfahren mit Berberin, welches ein quarternäres Hauptalkaloid von Coptis sp. ist, als Vergleich durchgeführt.

10 g der extrahierten Substanz wurden in 100 ml eines Lösungsmittelgemisches von Wasser und Methanol (1 : 1) gelöst und filtriert. Das Filtrat wurde eingedampft, um Methanol zu entfernen, und dann in 100 ml destilliertem Wasser gelöst. Die so erhaltene Lösung wurde als Fraktion 1 definiert. Die Fraktion 1 wurde auf pH 2,0 eingestellt und dann mit Chloroform extrahiert, um sie in eine Chloroformschicht und eine wäßrige Schicht aufzuteilen. Die Chloroformschicht wurde gründlich getrocknet und dann in 100 ml destilliertem Wasser gelöst. Die so erhaltene Lösung wurde als Fraktion 3 definiert. Die wäßrige Schicht wurde auf pH 10,0 eingestellt und dann mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol (3 : 1) extrahiert, um sie in eine Chloroformschicht und eine Methanolschicht aufzuteilen. Die Chloroformschicht wurde getrocknet und dann in 100 ml destilliertem Wasser gelöst, um Fraktion 5 zu ergeben. Die wäßrige Schicht wurde zur Trockene eingedampft und dann in 100 ml destilliertem Wasser gelöst, wobei Fraktion 6 erhalten wurde.

Zusätzlich wurde der Rückstand nach der genannten Filtration mit Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft und in 100 ml destilliertem Wasser gelöst, wobei Fraktion 4 erhalten wurde. Der Rückstand wurde in 100 ml destilliertem Wasser unter Erhalt einer Fraktion 2 gelöst.

Jede Fraktion wurde in üblicher Weise auf eine Normalphasen- Dünnschichtchromatographie (TLC = thin layer chromatography)- Kieselgel-Folie aufgetragen, als Entwicklungslösungsmittel wurde ein Lösungsmittelgemisch aus Butanol, Essigsäure und Wasser (4 : 1 : 1) und zur Detektion der Probe eine UV-Lampe verwendet. Nach dem Auftragen wurde das Probenband unter einem Stickstoffstrom getrocknet. In die Dünnschichtchromatographie-Kammer wurde ein Filterpapier gestellt, und das gleiche Lösungsmittel wurde vor dem Lauf in die Kammer gegeben. Es wurde Vakuumfett benutzt, um die Kammer, die mit dem Glasdeckel bedeckt war, abzudichten.

Die Ergebnisse sind in Fig. 7 dargestellt. Wie Fig. 7 zeigt, haben die Fraktionen 1 und 6 das gleiche Dünnschichtchromatogramm wie die extrahierten Substanzen der Erfindung. Damit ist bewiesen, daß die extrahierten Substanzen der Erfindung im wesentlichen aus polaren Substanzen wie einem quarternären Alkaloid der Fraktion 6 und N-Oxid bestehen und den gleichen R_f-Wert wie Berberin haben.

BEISPIEL 3

Dieses Beispiel erläutert eine Trennung aktiver Ingredienzien aus den extrahierten Substanzen mittels Ionenaustauscherharz. Die Fraktion 6 von Beispiel 2 wurde in die Fraktionen 6-S und 6-Q getrennt, wobei Mono Q- und Mono S-Ionenaustauscherpatronen verwendet wurden.

Die Mono Q- und Mono S-Patronen wurden mit Methanol gewaschen und mit destilliertem Wasser gesättigt. 1,0 ml Fraktion 6 wurde auf jede Säule gegeben und unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches von Butanol, Essigsäure und Wasser (4 : 1 : 1) eluiert. Jedes Eluat wurde einer Dünnschichtchromatographie (TLC = thin layer chromatography) unterworfen. Unabhängig davon wurde dieselbe Arbeitsweise zum Vergleich mit Berberin wiederholt. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 dargestellt.

BEISPIEL 4

Dieses Beispiel erläutert eine Reinigung aktiver Ingredienzien aus den extrahierten Substanzen mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC = high performance liquid chromatography). Die Fraktion 6 des Beispiels 2 wurde nach einem üblichen Verfahren in die Fraktionen 6-1, 6-2, 6-3, 6-4, 6-5 und 6-6 aufgetrennt.

Das organische Lösungsmittel in jeder Fraktion wurde abgeblasen und der Rückstand in 50 ml destilliertem Wasser gelöst. Auf eine Sep-Pak C₁₈-Säule wurden 50 ml der Lösung gegeben und mit einer ausreichenden Menge Wasser zur Entfernung eines Phosphatsalzes in der mobilen Phase gewaschen. Nach Verschwinden eines salzigen Geschmacks wurde die absorbierte Substanz unter Verwendung von Methanol eluiert.

Das resultierende HPLC ist in Fig. 9 dargestellt. Wie aus Fig. 9 zu erkennen ist, hat die Fraktion 6-5 die gleiche Retentionszeit wie Berberin.

BEISPIEL 5

Fraktion 6-5 wurde analysiert, um ihre chemische Struktur zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurden Infrarot- Spektroskopie (IR), ¹H-kernmagnetische Resonanz- Spektroskopie (¹H-NMR), ¹³C-kernmagnetische Resonanz- Spektroskopie (¹³C-NMR) und Massenspektrometrie verwendet. Unabhängig davon wurden die gleichen Verfahren zum Vergleich mit Berberin durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 10 bis 15 dargestellt.

Fig. 10 zeigt die IR-Spektren für Fraktion 6-5 (a) und Berberin (b); Fig. 11 stellt ein ¹H-NMR-Spektrum für Fraktion 6-5 dar; Fig. 12 stellt ein ¹H-NMR-Spektrum für Berberin dar; Fig. 13 stellt ein ¹³C-NMR-Spektrum für die Fraktion 6-5 dar; Fig. 14 stellt ein ¹³C-NMR-Spektrum für Berberin dar; und Fig. 15 stellt die MS-Spektren für die Fraktion 6-5 (a) und Berberin (b) dar.

Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, daß die Fraktion 6-5 Berberin enthält, obgleich es eine geringere Menge an Verunreinigungen aufweist.

Wie oben diskutiert wurde, ist die extrahierte Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet, einen bestimmten Schritt während des viralen Replikationszyklus zu hemmen, und sie weist im Vergleich zu anderen herkömmlichen Inhibitoren höhere Inhibitoraktivität bei der HIV- Proliferation auf. Darüber hinaus ist die extrahierte Substanz der vorliegenden Erfindung anderen herkömmlichen dadurch überlegen, daß sie keine Nebenwirkungen bei Testtieren verursacht. Daher wird erwartet, daß die extrahierte erfindungsgemäße Substanz zur Verwendung in der therapeutischen Behandlung von AIDS geeignet ist.

Claims (7)

1. Verfahren zur Herstellung einer Substanz aus einem Gemisch nicht-fetthaltiger Stärke von Semen Ricini und Coptis sp.-Wurzel, welches die folgenden Schritte umfaßt:

• a) Vermischen von nicht-fetthaltiger Stärke von Semen Ricini und Coptis sp.-Wurzel in einem Gewichtsverhältnis von 2 : 5 bis 5 : 2,
• b) Eluieren des Gemisches mit einem organischen Lösungsmittel bei Raumtemperatur von 20-25°C für 20 bis 25 Stunden,
• c) wiederholtes Filtrieren des erhaltenen Filtrates unter reduziertem Druck unter Abtrennung des Rückstandes,
• d) Trocknung des Rückstandes und anschließende Zugabe von destilliertem Wasser,
• e) 3-4stündige Extraktion des Rückstandes unter Erhitzen auf 100°C,
• f) Konzentrieren des erhaltenen Extraktes unter reduziertem Druck und anschließende Entfernung des Präzipitates,
• g) Zugabe von Chloroform zu dem erhaltenen Extrakt, anschließendes Rühren des Gemisches und Auftrennen der Phasen,
• h) Entfernen der Chloroform-Phase, Zugabe von Hexan zur wäßrigen Phase und anschließendes Entfernen des organischen Lösungsmittels,
• i) Reinigen der wäßrigen Phase mit Talk, Filtrieren der erhaltenen Lösung bei reduziertem Druck unter Erhalt eines Filtrates, und
• j) Filtrieren der erhaltenen Lösung durch ein Membranfilter und dann Lyophilisierung unter Erhalt eines gelblich braunen Pulvers.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das organische Lösungsmittel ausgesucht ist aus aliphatischen Kohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, Alkoholen, (C₁-C₈)-Halogenkohlenwasserstoffen, die 1-6 gleiche oder verschiedene Halogenatome enthalten, Fettsäureestern, die Methylester, Ethylester, Propylester, Butylester oder Amylester umfassen, Essigsäureestern und Ketonen mit aliphatischen oder aromatischen (C₁-C₈)-Gruppen.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt a) das Vermischen von nicht-fetthaltiger Stärke von Semen Ricini und Coptis sp.-Wurzel in einem Gewichtsverhältnis von 4 : 5 bis 5 : 4 erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Semen Ricini Ricinus Communis L. ist.

5. Extrahierte Substanz aus einem Gemisch nicht-fetthaltiger Stärke von Semen Ricini und Coptis sp.-Wurzel, erhältlich durch die Verfahrensschritte gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.

6. Extrahierte Substanz gemäß Anspruch 5, wobei die Substanz Berberin enthält.

7. Verwendung der extrahierten Substanz gemäß Anspruch 5 oder 6 zur antiviralen Hemmung des humanen Immunschwächevirus (HIV).