DE2440942C3 - Fructose-fettsäureester und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Fructose-fettsäureester und Verfahren zu ihrer Herstellung

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Description

CH1OY2
OH H
in der entweder Y1 einen 0-Hydroxyalkanoylrest der allgemeinen Formel
OH
—C— CH- CH- R2
O R1
bedeutet, wobei R1 einen Alkylrest mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen und R2 einen Alkylrest mit 15 bis 61 Kohlenstoffatomen darstellt, und Y2 ein Wasserstoffatom bedeutet oder Y1 und Y2 jeweils den /3-Hydroxyalkanoylres'. Y1 darstellen.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Fructose verwertenden, zur Bildung von Fructose-fettsäureestern fähigen Mikroorganismus der Spezies Arthrobacter paraffineus, Arthrobacttr hydrocarbqglutamicus, Corynebacterium hydrocarboclastus, Corynebacterium ttseudodiphtheriticum, Nocardia paraffinica, Nocardia gloL -rula, Mycobac terium paraffinicum oder Mycobacterium smegmatis in einem Fructose als Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen bei 20 bis 400C und einem pH-Wert von 4 bis 9 züchtet, die intrazellulär entstandenen Fructose-fettsäureester aus den Zellen extrahier: und den erhaltenen Extrakt durch Chromatographie aufarbeitet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen von der Kulturbrühc abtrennt, die abgetrennten Zellen mit einem Gemisch aus einem chlorierten Kohlenwasserstoff und einem niederen aliphatischen Alkohol im Volumenverhältnis von 50:100 bis 100:50 extrahiert, den Extrakt eindampft, den Rückstand mit Chloroform, Hexan oder Essigsäureäthylester extrahiert und durch Chromatographie an Kieselgcl reinigt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Laufmittel für die Chromatographie ein Gemisch aus einem chlorierten Kohlenwasserstoff und einem niederen aliphatischen Alkohol verwendet und das Volumenverhältnis von Kohlenwasserstoff zu Alkohol stufenweise von 99 : I auf 95 :5 ändert.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus
Arthrobacter paraffineus ATCC 15591.
Arthrobacter hydrocarboglutamicus
ATCC 15583,
Corynebacterium hydrocarboclastus
ATCC 21628,
Corynebacterium pseudodiphtheriticum
ATCC 10701,
Nocardia paraffinica ATCC 21198,
Nocardia globerula ATCC 13130,
Mycobacterium paraffinicum ATCC 12670,
Mycobacterium smegmatis ATCC 21293 oder
Mycobacterium smegmatis ATCC 607
einsetzt
Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
E>. ist bekannt, daß Glucose-fettsäureester als. Hauptbestandteile der löslichen Lipide von Corynebacterium diphlheriae, Mycobacterium smegmatis und Mycobacterium tuberculosis, BCG, gebildet werden, wenn diese Bakterien in Gegenwart von Glucose gezüchtet werden; vgl. P. J. Brennan u. Mitarb., Eur. j.Biocheia, Bd. 13 (!970), Seiten !!7 bis !23. Aus der US-PS 36 37 461 ist femer ein Verfahren zur Herstellung von Glucose, Trehalose- oder Rohrzucker-fetisäureestern unter Verwendung von Kohlenwasserstoffe verwertenden Mikroorganismen aus n-Paraffinen bekannt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde. Iructoscfettsäureester der in Anspruch 1 angegebenen allgemeinen Formel I zu schaffen. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß Mikroorganismen der in Anspruch 2 genannten Arten, die Fructose verwerten können, in einem Fructose als Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium Glycolipide bilden, die sich von den unter Verwendung von η-Paraffinen als Kohlenstoffquelle erhaltenen Verbindungen unterscheiden. Diese Glycolipide wurden als Frr .uose-fettsäureester identifiziert.
.m erfindungsgemäßen Verfahren werden Mikroorganismen der in Anspruch 2 Rannten Arten eingesetzt Spezielle Beispiele für verwendbare Mikroorganismen sind die in Anspruch 5 genannten.
Zur Züchtung der Mikroorganismen können entweder synthetische oder natürliche Nährmedien verwendet werden, sofern die Medien die entsprechende Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und andere Nährstoffe für den jeweils verwendeten Stamm enthalten. Das Nähnnediiim muß als Kohlenstoffquelle Fructose oder Fructose enthaltende Produkte enthalten. Ein Beispiel für Fructose enthaltende Produkte ist Melasse.
Als Stickstoffquellen kommen Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat, Ammoniak und Harnstoff in Frage. Ferner können stickstoffhaltige natürliche Substanzen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton und Casaminosäurc verwendet werden. Die Verbindungen können entweder allein oder im Gemisch eingesetzt werden.
Als anorganische Verbindungen können Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisen- und Mangansal/e. Calciumchlorid, Natriumchlorid und Zinksulfat verwendet werden.
Wenn der verfahrensgemäß eingesetzte Mikroorganismus einen Nährstofrbedarf beispielsweise für Aminosäuren und Vitamine besitzt, müssen diese Nährstoffe dem Nährmedium einverleibt werden.
Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen
bei Temperaturen von 20 bis 40°C durchgeführt. Während der Fermentation wird der pH-Wert der Kulturbrühe auf 4 bis 9, vorzugsweise 6 bis 8, mit einer Harnstofflösung, wäßriger Ammoniaklösung oder wäßriger Ammoniumcarbonatlösung eingestellt. Gewöhnlich ist die Fermentation innerhalb I bis 7 Tagen beendet. Sobald die Ausbeute an Fructose-fettsiiureestern ein Maximum erreicht, wird die Fermentation abgebrochen. Das Produkt bildet sich vorwiegend in den Zellen. Nach beendeter Fermentation werden die Zellen von der Kulturbriihe beispielsweise durch Zentrifugieren abgetrennt. Hierauf werden die Zellen mit einem Gemisch aus einem chlorierten Kohlenwasserstoff und einem niederen aliphatischen Alkohol, vorzugsweise einem Gemisch aus Chloroform und Methanol, in einem Volumenverhältnis von 50 : 100 bis 100 :50 extrahiert. Der Extrakt wild unter vermindertem Druck, beispielsweise bei 20 bis 30 Torr, eingedampft und der Rückstand mit einem Lösungsmittel, wie Chloroform, Hexan oder Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird erneut eingedampft und der Rückstand in einer geringen Menge eines Lösungsmittels, wie Chloroform, Hexan oder Äthylacetat, aufgenommen und filtriert. Das Filtrat wird auf eiiic mit Kieselgel gefüllte Säule gegeben, welche anschließend eluiert wird. Zunächst werden die unpolaren Verbindungen, wie Pigmente und freie Fettsäuren, mit Chloroform eluiert. Sodann wird mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol eluiert, wobei das Volumenverhältnis von Chloroform zu Methanol stufenweise von 99 : 1 auf 95 :5 geändert wird. Das Eluat wird eingedampft, und der Rückstand in warmem Aceton gelöst. Die Acetonlösung wird in der Kälte, beispielsweise bei -15°C, etwa 5 bis 24 Stunden stehengelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert und getrocknet.
Das Produkt fällt als weißes Pulver an. Dieses weiße Pulver wird zur weiteren Reinigung der Dünnschichtchromatographie mit einem Gemisch aus Chloroform, Methanol und Essigsäure als Laufmittel unterworfen werden.
Wenn das Pulver zwei verschiedene Produkte enthält, wird es in η-Hexan gelöst, die Lösung auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule gegeben und zunächst mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol in einem bestimmten Volumenverhältnis, beispielsweise von 98 :2 und 99 :1, und hierauf mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol in einem bestimmten Volumenverhältnis, beispielsweise von 95 : 5 und 97 : 3, eluiert. Die verschiedenen Eluate werden eingedampft, und die Konzentrate werden in der Kälte, beispielsweise bei - 15°C, stehengelassen. Die entstandenen Fällungen werden abfiltriert und getrocknet. Auf diese Weise werden zwei Produkte isoliert.
Die erhaltenen Produkte zeigen im IR-Absorptionsspektrum die für eine Esterbindung typische Absorptionsbande bei 1700 cm1. Aufgrund der gaschromatographischen Analyse enthält das Produkt in seinem Molekül I Mol Fructose. Zur Identifizierung wird das Produkt mit 0,5 η-Natronlauge verseift und das entstandene Reaktionsgemisch papierchromatographisch analysiert. Das Reaktionsgemisch enthält Fructose. Das Reaktionsgemisch wird mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt und sodann mit Diäthyläther extrahiert. Der Ätherextrakt wird der Dünnschichtchromatographie unterworfen. Hierbei wird festgestellt, daß der Ätherextrakt Fettsäuren enthält. Der Ätherextrakt wird ferner der IR-Absorptionsspcktroskopie. tier Pyrolyse-Gaschromatographic und der Massensncktroskopie unterworfen. Diese Untersuchungen ergeben, daß die Fettsäure im Extrakt eine «-Alkyl-/3-hydroxycarbonsäure der allgemeinen Formel
OH R1
I I
R1 —CH-CH-COOH
Bei der Umsetzung des Produkts mit 0,5 n-Natronlauge erfolgt glatte Verseifung. Dies zeigt, daß das Produkt ein Fructose-fettsäureester ist. Der Ester wird der Anthron-Reaktion und der Perjodat-Oxidation unterworfen, um das Mengenverhältnis von Fructose zu Fettsäure im Molekül zu bestimmen. Auf diese Weise kann die Struktur des Esters festgestellt werden.
Anthron-Reaktion;
Bestimmung der Veresterungsstelle in Produkt A
1. Molverhältnis von D-Fructose und Fettsäure
10 mg gemäß Beispiel 1 hergesteLüs Produkt A werden in 5 ml Chloroform gelöst. Der Fru-tosegehalt wird aufgrund der Anthron-Reaktion bestimmt. Er beträgt etwa 25,5 Gewichtsprozent. Unter Zugrundelegung eines Molekulargewichts für die Fettsäure von 550 ergibt sich ein Molverhältnis von D-Fructose zu Fettsäure von 1:1.
2. Perjodat-Oxidation
1,9 μΜοΙ (berechnet aus dem Fructosegehali) von Produkt A und 2,0 μΜοΙ Fructose werden jeweils mit 2,5 ml einer 0,01-m Natriumperjodatlösung 15 Stunden bei 200C umgesetzt.
Die verbrauchte Menge an Natriumperjodat beträgt bei Produkt A 53 μΜοΙ und bei Fructose 7,7 μΜοΙ. Somit läßt sich der Verbrauch an Natriumperjodat pro Mol Produkt A auf etwa 3 Mol und pro Mol Fructose auf etwa 4 Mol schätzen. Daraus läßt sich schließen, daß die Fettsäure an die 6-Stellung von Fructofuranose oder an die 1 -Stellung von Fructopyranose gebunden ist.
Um eine dieser beiden möglichen Stellungen zu bestätigen, wird eine Perjodat-Oxidation auf folgende Weise durchgeführt: 68 mg Produkt A werden in 1 ml Äthanol gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit I ml 0,3-m Natriumperjodat vermischt. Das erhaltene Gemisch wird 2 Stunden unter Lichtabschluß bei Raumtemperatur stehengelassen. Der pH-Wert des erhaltenen Reaktionsgemisches wird mit 0,2 n-Schwefeisäure auf 1 eingestellt.
Anschließend wird das Gemisch mit Diäthyläther extrahiert.
Der Extrakt wird zur Entfernung des Äthers destilliert und anschließend 5 Minuten bei 50°C mit 1 ml 0,5 n-Na!oiilauge verseift. Nach dem Verseifen wird die wasserlösliche Fraktion papierchromatographisch unter Verwendung von ri-Propanol/EssigsäureäthjJester/ Wasser (7:1:2) und n-Butanol/Essigsäure/Wasser (4:1 :2) als LaufmiUel untersucht. In beiden Laufmitteln läßt sich mit alkalischer Silbernitratlösung nur ein Flecken nachweisen, der mit Glycerinaldehyd identisch ist. Somit erg'ibt sich, daß das Produkt A der Monofettsäureester von Fructofuranose in der 5-Stel-Iting ist.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Be ispie I I
Arthrobacter paraffineus ATCC 15591 wird in 300 ml eines Nährmediums der nachstehend
Zusammensetzung in einem 2 Liter fassenden Erlenmcycrkolben überimpft.
Hinsaat kulturmedium:
Fructose
Fleischextrakt
Pepton
NaCI
30 g/1.Her
10 g/l.iter
lOg/l.itcr
J g/l.iter
Der pH-Wert des Nährmediums wird vor der Sterilisation auf 7,2 eingestellt. Die Züchtung wird 24 Stunden bei 300C unter Schütteln durchgeführt. Die erhaltene Einsaatkulturflüssigkeit wird in 3 Liter eines Nährmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung in einen 5 Liter fassenden I ermeniei eingegossen.
I lauptfcrmenlaiionsmediiim:
Fructose 100 g/Liter
") g/l.iler
3 g/l.iler
2 g/Liler
2 g/1.iter
1 g/Liter
0.5 g/Liler
20 mg/Liter
10 mg/Liter
I mg/Liter
Maisquellwasser
NaHPO4 I2H:O
KH;PO4
MgSO4
FcSO4
MnSO.
ZnSO4
CaCI ■
7H2O
7H2O
4H..O
7 H.O
Die Fermentation wird 45 Stunden bei 30 C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von bOO U/min und einer Belüftungsgeschwindigkeit von I Liter Luft pro Liter Nährmediuni/Minute durchgeführt. Während der Fermentation wird der pH-Wert der Kulturbrühe mil Ammoniak automalisch auf 6,8 bis 7,2 eingestellt. Nach beendeter Fermentation werden 2,8 Liter der Kulturbrühe zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert. Ls hinterbleiben 250 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellcn. Die Zellen werden bei Raumtemperatur dreimal mit jeweils 1 Liter eines Gemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis I : 1 extrahiert. Der entstandene Extrakt wird in einem Flashverdampfer konzentriert. 10 g des Rückstands werden mit 100 ml Chloroform extrahiert, und der Chloroformextrakt wird eingedampf*. Der Rückstand wird in 100 ml n-Hexan gelost. Die erhaltene Lösung wird konzentriert und zentrifugiert. F.s werden 20 ml einer n-Hexanlösung erhalten, die auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule mit einem Innendurchmesser von 4 cm und einer Höhe von 20 cm gegeben wird Die Säule wird zur Abtrennung von Pigmenten und freien Fettsäuren mit Chloroform eluiert. Sodann wird mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol eluiert, wobei das Volumenverhältnis von Chloroform zu Methanol stufenweise von 99 : 1 auf 95 :5 geändert wird. Die beim Eluieren mit einem (icmisch aus Chloroform und Methanol im Volumenverhällnis 95 : 5 erhaltenen Fraktionen werden eingedampft. Der Rückstand wird in warmem Aceton gelöst und die Acetonlösung bei -15° C stehengelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert und getrocknet. Ausbeute 2.5 g eines weißen Pulvers.
Das weiße Pulver wird mit einem Gemisch aus Chloroform, Methanol und Essigsäure in Volumenverhältnis 90:10:5 als Entwicklungslösungsmittel der Dünnschichtchromatographie unterworfen. Das weiße Pulver besteht aus zwei Produkten. Das Pulver wird in η-Hexan gelöst und auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule mit einem Innendurchmesser von 4 cm und einer Höhe von JO cm gegossen. Die Säule wird zunächst mit einen Gemisch aus Chloroform und Methanol im Volumen verhältnis 98 :2 eluiert. Das erhaltene Lluat wire eingedampft und bei -15 C stehengelassen. Di entstandene Fällung wird abfillriert und getrocknet Ausbeute 1,2 g Produkt A. Beim weiteren Eluieren de Säule mit einem Gemisch aus Chloroform und Mcthano im Volumenverhältnis 95:5 und Eindampfen de erhaltenen Finals werden 0,5 g Produkt U erhalten.
Aufgrund verschiedener Untersuchungen ist da Produkt Λ ein Fructose-ti-monofettsäurccster. Der Res R1 tier Fettsäure ist ein Alkylresl mit 10, 12 oder l· Kohlenstoffatomen und der Resl R-' isl ein Alkylresl mi 15 oder 17 Kohlenstoffatomen. Das Produkt I! isl en I riiclosc-l.b-difcttsäiircesier. Die Fettsäurerestc sini identisch mit dem Fettsäurercsi des Produkts A.
Die Produkte A und B haben folgende Eigenschaften
I)TtS !Ywdüki A rSi ifi ΐΜίίΑυί'ιύι iftii'ii ein Ptnvci. UiI beim Stehen an der Luft [ dichtigkeit adsorbiert um sich in eine Paste verwandelt Ls ist bei Kaunitcnipera tür löslich in Diäthylather. Chloroform und η-Hexan um löslich in Methanol. Äthanol und Aceton bei eine Temperatur von 40 bis MV C. Ferner ist das Produkt ii heißem Wasser löslich. Die Farbe des Produkts is hellgelb. In der Figur ist das IR-Absorplionsspekiriin des Esters angegeben. Das Produkt I! liegt in Form cmc Paste vor Das Produkt ist bei Raumtemperatur ii Diäthyläther. Chloroform und n-Hexan sowie be Temperaturen von 40 bis 60 C in Methanol. Athano und Aceton löslich. Es isl hellgelb gefärbt. Da IR-Absorptionsspektrum des Produkts B ist praktiscl identisch mit dem des Produkts A.
Beispiel 2
Beispiel 1 wird unter Verwendung von Arthrobacie hydrocarboglutamicus ATCC 15583 wiederholt. E werden 220 g (Fcuchtgcwicht) Mikrobenzcllen crhaltei Aus diesen Zellen können gemäß Beispiel 1 /wc Produkte in Mengen von 1.0 bzw. 0.4 g isoliert werden Aufgrund verschiedener Untersuchungen haben du Produkte die gleiche chemische Zusammensetzung wii die Produkte A und B in Beispiel I.
Beispiel 3
Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 urne Verwendung von Coryncbactcrium hydrocarboclastu ATCC 21628 während 30 Stunden durchgeführt. E werden 220 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen erhalten Aus diesen Zellen werden 1.7 g eines Produkts Ai un 0.3 g eines Produkts Bi gemäß Beispiel 1 isoliert.
Verschiedene Untersuchungen haben ergeben, dal das Produkt Ai ein Fructose-b-monofettsäurcesler ist Der Rest R1 der Fettsäure ist ein Alkylrest mit 8.10 ode 12 Kohlenstoffatomen und der Rest R- ein Alkylrest mi 33. 35 oder 37 Kohlenstoffatomen. Das Produkt Bi is ein Fructose-1.6-difettsäureester. Die Fettsäureresti sind identisch mit dem Fettsäurerest des Produkts A1.
Beispiel 4
Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 unte Verwendung von Corynebacterium pseudodiphtheriti cum ATCC 10701 während 48 Stunden durchgeführt. E: werden 260 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen erhalten Aus diesen Zellen werden gemäß Beispiel 1 zwei Produkte in einer Menge von 0.7 bzw. 0.2 g isoliert. Verschiedene Untersuchungen haben ergeben, daß die Produkte die gleiche chemische Struktur wie die Produkte A und B von BeisDiel 1 haben.
Beispiel 5
Die Fermentation wird gemäß Beispiel I mit Nocardia paraffinica ATCC 21198 während 38 Stunden durchgeführt. Es werden 190 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellcc: erhalten. Aus diesen Zellen werden 1,3 g eines Produkts A2 gemäß Beispiel 1 isoliert. Verschiedene Untersuchungen haben ergeben, daß das Produkt A2 ein Fructose-6-monofettsäureester ist. Der Rf.it R1 der Fettsäure ist ein Alkylrest mit 10. 12 oder 14 Kohlenstoffatomen und der Rest R2 ein Alkylrest mit 33, 35 oder 37 Kohlenstoffatomen.
Die Alkylreste in dem Fettsäurerest von Produkt A2 enthalten mehr Kohlenstoffatome als der Fettsäurerest der Produkte A und B von Beispiel 1. Derartige Fettsäuren mit Alkylresten mit einer großen Zahl von ISÜMICMSILII I atWlllCII WCIULtI atlgLllltlM au ItUVUIUUiIiJ
colsäure bezeichnet.
Beispiel 6
Die Fermentation wird gemäß Beispiel I mit Nocardia globerula ATCC 13130 während 53 Stunden durchgeführt. Es v/erden 200 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzcllen erhalten. Aus diesen Zellen werden ein Produkt A j und ein Produkt Bj gemäß Beispiel I in einer Menge von 0,8 bzw. 0,2 g isoliert.
Verschiedene Untersuchungen haben ergeben, daß das Produkt Aj ein Fructose-6-monofettsäureester ist. Der Rest R1 der Fettsäure ist ein Alkylrest mit 10, 12 oder 14 Kohlenstoffatomen und der Rest R2 ein Alkylrest mit 35, 37 oder 39 Kohlenstoffatomen. Das Produkt Bj ist ein Fructose-1,6-difettsäureester. Die Fettsäurereste sind identisch mit dem Fettsäurerest des Produkts Aj.
Beispiel 7
Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 mit Mycobacterium paraffinicum ATCC 12670 während 40 Stunden durchgeführt. Es werden 190 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen erhalten. Aus diesen Zellen werden gemäß Beispiel 1 2,7 g eines Produkts A4 und Spurenmengen eines Produkts B4 isoliert.
■ Untersuchungen haben ergeben, daß das Produkt A4 ein Fructose-6-monofettsäureester ist. Der Rest R1 der Fettsäure ist ein Alkylrest mit 20 oder 22 Kohlenstoffatomen und der Rest R2 ein Alkylrest mit 57,59 oder 61 Kohlenstoffatomen. Das Produkt B« ist ein Fructose-1,6-difettsäureester. Die Fettsäurereste sind identisch mit dem Fettsäurerest des Produkts A4.
Beispiel 8
Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 mit Mycobacterium smegmatis ATCC 21293 wiederholt. Es werden 165 g(Fcüch;gcvicrii) Mikrobcnzcllcn erhalten. Aus diesen Zellen werden 0,8 g eines Produkts A5 und Spurenmengen eines Produkts B5 isoliert.
Untersuchungen haben ergeben, daß das Produkt A5 ein Fructose-6-monofettsäureester ist. Der Rest R1 der Fettsäure ist ein Alkylrest mit 10, 12 oder 14 Kohlenstoffatomen und der Rest R2 ein Alkylrest mit 15, 17 oder 19 Kohlenstoffatomen. Das Produkt B5 ist ein Fructose-1,6-difettsäureester. Die Fettsäurereste sind identisch mit dem Fettsäurerest des Produkts A 5.
Beispiel 9
Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 mit Mycobacterium smegmatis ATCC 607 wiederholt. Es werden 250 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen erhalten Aus diesen Zellen wird 1 g eines Produkts A<-, und eine Spurenmenge eines Produkts Bs isoliert.
Untersuchungen haben ergeben, daß das Produkt A-ein Fructose-6-monofettsäureester ist. Der Rest R1 der Fettsäure ist ein Aäkylrcst mit 10, 12 oder 14 Kohlenstoffatomen und der Rest R2 ein Alkylrest mit 15 17 oder 19 Kohlenstoffatomen. Das Produkt B5 ist ein Fructose-1,6-difettsäureester. Die Fettsäurereste sind identisch mit dem Fettsäurerest des Produkts A,.
Tabelle I
Ausbeuten an Mikroorganismenzellen und Glykolipiden bei Züchtung von verschiedenen Stämmen gemäß Beispiel 1
Stamm
ATCC-Nr. Menge der
Mikro
organismen
zellen
19065
15590		 230 g
220 g
15592
15110
15109		 250 g
200 g
200 g
15076 200 g
21199 180 g
10143 150 g
Menge an Glykolipid
Arthrobacter paraffineus
Cornynebacterium hydrocarboclastus
Nocardia globeruia
Nocardia parafTinica
Mycobacterium smegmatis
A 0,9 g B 0,25 g
A 1,2 g B 0,3 g
A1 1,8 g B1 0,2 g
A, 1,1 g B1 0,15 g
A1 0,7 g B1 Spuren
A1 0,5 g B3 Spuren
A3 1,1 g B2 Spuren
A5 0,4 g B5 Spuren
Tabelle II
Molekulargewicht und Elementaranalyse der Verbindungen der Erfindung
Verbin- Durchschnittliches C
dung Molekulargewicht
Elementaranalyse H O
A 714
B 1240
A1 882
A. 910
A, 939
A4 1373
A. 658
B1 1584
B: 1640
B, Ί696
B4 2566
B; 1135
69,6
74,7 74,5 74,3 74,5 77,0 71.0 78,0 77,0 78,5 81,2 75,2
11,5 12,6 12,1 12,1 12,0 12,9 11,3 12,0 12.5 i 2.6 13,1 11,7
19,9 12,7 13,4 13,6 13,5 10,1 17,7 10,0 10,5 8,9 5,6 13,1
Die erfindungsgemäß hergestellten Fructose-fettsäureester sind Netzmittel. Sie können daher in Wasch- und Reinigungsmitteln verwendet werden.
Tabelle III
Oberflächenspannung von Fructose-6-fettsäureestcrn bei einer Konzentration von 200 ug/ml und einer Temperatur von 20X.
Beispiel
Verbindung
Oberflächenspannung
A,
Aj
A,
A4
A5
27,4 dyn/cni
27,5
28,2
28.5
29,0
27,7
Versuchsbericht
Adjuvans-Wirkung der Produkte A (Beispiel 1) und A4 (Beispiel 7)
Es wird der Einfluß der Produkte auf die Überempfindlichkeitsreaktion vom Spättyp im Hautreaktionstest festgestellt. Dazu werden 4 Gruppen von jeweils 4 oder 3 Meerschweinchen mit einem Gewicht von 250 bis 300 g verwendet.
Ein Gemisch aus jeweils 300 μg Produkt A bzw. Produkt A4 und 300 μg bakterielle «-Amylase wird mit der kleinstmöglichsten Menge Mineralöl versetzt Das
10
erhaltene Gemisch wird sodann mit physiologischer Kochsalzlösung versatzt, die 0,2% Polyoxyäthylensorbitan-monooleat enthält, und anschließend homogenisiert. 0,2 ml der erhaltenen Öl-in-Wasser-Emulsion werden in 4 Anteile zu je 0,05 ml unterteilt. Jeder dieser Anteile wird intramuskulär in die vier Fußballen der Meerschweinchen injiziert, um diese zu sensibilisieren. 4 Wochen später wird den Tieren intradermal in den Rücken eine Lösung von 100 μg bakterielle a-Amylase als Antigen in 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung injiziert. Das Ausmaß der Hauptreaktion an der Injektionsstelle 48 Stunden nach der Injektion des Antigens ist in Tabelle IV angegeben.
Es werden die Abmessungen des gebildeten Erythems
' [größere Achse (mm) χ kleinere Achse (mm)] bestimmt.
Als bekannte Vergleichsverbindung wird Trehalose-6,6'-dimycolat verwendet. Die Herstellung dieser
-" Bd. 52 (1974). S. 95'bis 101. beschrieben.
Tabelle IV
Cilu'olipid Meerschweinchen Fntinem
-"' 1.100 :j. κ ι nach 48 Std.
Trehalose-Lipid
.,ι (Vergleichsverbindung)
Produkt A
Produkt A4
Kontrolle
(ohne Lipidzusatz)
17 X 14
16 X 14
15 X 12
14 X 10
16 X 14
14 X 12
13 X 10
10 >: 8
20 >: 20
19 >: 18
19 X 17
16 X 13
4 X 4
7 X 7
0
Aus Tabelle IV geht hervor, daß das Produkt A4 dem bekannten Adjuvans deutlich überlegen ist, während das Produkt A etwa die gleiche Adjuvanswirkung besitzt wie das Trehalose-Lipid.
Akute Toxizität
Die LDso-Werte von Produkt A und Produkt A4 liegen bei Mäusen über 500 mg/kg. Der LDso-Wert von Trehalose-6,6'-dimycoIat beträgt 1,5 mg/kg.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

  1. Patentansprüche:
    I. Fructose-fettsäureesterder allgemeinen Formel O
    Y1 OCH,
    \
    H
    OH
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