DE2440942B2

DE2440942B2 - Fructose-fettsaeureester und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2440942B2
Application number: DE19742440942
Authority: DE
Inventors: Takeo Hofu Yamaguchi; Ito Seiga Machida Tokio; Suzuki (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1973-08-29
Filing date: 1974-08-27
Publication date: 1977-11-24
Also published as: DE2440942C3; US3909356A; JPS5048186A; DE2440942A1; GB1477880A; FR2270321A1; CA1032101A; FR2270321B1

Description

in der entweder Y¹ einen /J-Hydroxyalkanoylrest der ι ■'■ allgemeinen Formel

OH
—C— CH- CH- R²

Il I

O R¹

bedeutet, wobei R¹ einen Alkylrest mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen und R² einen Alkylrest mit 15 bis 2 > 61 Kohlenstoffatomen darstellt, und Y² ein Wasserstoffatom bedeutet oder Y¹ und Y² jeweils den ß-Hydroxyalkanoylrest Y¹ darstellen.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Fructose verwertenden, zur Bildung von Fructose-fettsäureestern fähigen Mikroorganismus der Spezies Arthrobacter paraffines», Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Corynebacteiium hydrocarboclastus, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, i"> Nocardia paraffinica, Nocardia globerula, Mycobacterium paraffinicum oder Mycobacterium smegmatis in einem Fructose als Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen bei 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert von 4 bis 9 züchtet, die intrazellulär entstandenen Fructose-fettsäureester aus den Zellen extrahiert und den erhaltenen Extrakt durch Chromatographie aufarbeitet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen von der Kulturbrühe abtrennt, die abgetrennten Zellen mit einem Gemisch aus einem chlorierten Kohlenwasserstoff und einem niederen aliphatischen Alkohol im Volumenverhältnis von 50:100 bis 100:50 extrahiert, den Extrakt eindampft, den Rückstand mit ^r>o Chloroform, Hexan oder Essigsäureäthylester extrahiert und durch Chromatographie an Kieselgel reinigt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Laufmittel für die Chromato- ^r>^r> graphie ein Gemisch aus einem chlorierten Kohlenwasserstoff und einem niederen aliphatischen Alkohol verwendet und das Volumenverhältnis von Kohlenwasserstoff zu Alkohol stufenweise von 99 :1 auf 95 : 5 ändert. w)

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus

Arthrobacter paraffineus ATCC 15591,
Arthrobacter hydrocarboglutamicus μ

ATCC 15583,
Corynebacterium hydrocarboclastus

ATCC 21628.

Corynebacterium pseudodiphtheriticum

ATCC 10701,

Nocardia paraffinica ATCC 21198,
Nocardia globerula ATCC 13130,
Mycobacterium paraffinicum ATCC 12670,
Mycobacterium smegmatis ATCC 21293 oder
Mycobacterium smegmatis ATCC 607

einsetzt.

10 Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Es ist bekannt, daß Glucose-fettsäureester als Hauptbestandteile der löslichen Lipide von Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium smegmatis und Mycobacterium tuberculosis, BCG, gebildet werden, wenn diese Bakterien in Gegenwart von Glucose gezüchtet werden; vgl. P. J. B r e η η a η u. Mitarb., Eur. I Biochem.. Bd. 13 (1970), Seiten 117 bis 123. Aus der US-PS 36 37 461 ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von Glucose, Trehalose- oder Rohrzucker-fettsäureestern unter Verwendung von Kohlenwasserstoffe verwertenden Mikroorganismen aus η-Paraffinen bekannt, j

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Fructosefettsäureester der in Anspruch 1 angegebenen allgemeinen Formel 1 zu schaffen. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß Mikroorganismen der in Anspruch 2 genannten Arten, die Fructose verwerten können, in einem Fructose als Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium Glycolipide bilden, die sich von den unter Verwendung von η-Paraffinen als Kohlenstoffquelle erhaltenen Verbindungen unterscheiden. Diese Glycolipide wurden als Fructose-fettsäureester identifiziert.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden Mikroorganismen der in Anspruch 2 genannten Arten eingesetzt. Spezielle Beispiele für verwendbare Mikroorganismen sind die in Anspruch 5 genannten.

Zur Züchtung der Mikroorganismen können entweder synthetische oder natürliche Nährmedien verwendet werden, sofern die Medien die entsprechende Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und andere Nährstoffe für den jeweils verwendeten Stamm enthalten. Das Nährmedium muß als Kohlenstoffquelle Fructose oder Fructose enthaltende Produkte enthalten. Ein Beispiel für Fructose enthaltende Produkte ist Melasse.

Als Stickstoffquellen kommen Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat, Ammoniak und Harnstoff in Frage. Ferner können stickstoffhaltige natürliche Substanzen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton und Casaminosäure verwendet werden. Die Verbindungen können entweder allein oder im Gemisch eingesetzt werden.

Als anorganische Verbindungen können Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisen- und Mangansalze, Calciumchlorid, Natriumchlorid und Zinksulfat verwendet werden.

Wenn der verfahrensgemäß eingesetzte Mikroorganismus einen Nährstoffbedarf beispielsweise für Aminosäuren und Vitamine besitzt, müssen diese Nährstoffe dem Nährmedium einverleibt werden.

Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen

bei Temperaturen von 20 bis 40⁰C durchgeführt. Während der Fermentation wird der pH-Wert der Kulturbrühe auf 4 bis 9, vorzugsweise 6 bis 8, mit einer Harnsiofflösung, wäßriger Ammoniaklösung oder wäßriger Ammoniumcarbonatlösung eingestellt. Gewöhnlich ist die Fermentation innerhalb 1 bis 7 Tagen beendet. Sobald die Ausbeute an Fructose-fettsäureestern ein Maximum erreicht, wird die Fermentation abgebrochen. Das Produkt bildet sich vorwiegend in den Zellen. Nach beendeter Fermentation werden die Zellen von der Kulturbrühe beispielsweise durch Zentrifugieren abgetrennt. Hierauf werden die Zellen mit einem Gemisch aus einem chlorierten Kohlenwasserstoff und einem niederen aliphatischen Alkohol, vorzugsweise einem Gemisch aus Chloroform und Methanol, in einem Volumenverhältnis von 50 : 100 bis 100 :50 extrahiert. Der Extrakt wird unter vermindertem Druck, beispielsweise bei 20 bis 30 Torr, eingedampft und der Rückstand mit einem Lösungsmittel, wie Chloroform, Hexan oder Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird erneut eingedampft und der Rückstand in einer geringen Menge eines Lösungsmittels, wie Chloroform, Hexan oder Äthylacetat, aufgenommen und filtriert. Das Filtrat wird auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule gegeben, welche anschließend eluiert wird. Zunächst werden die unpolaren Verbindungen, wie Pigmente und freie Fettsäuren, mit Chloroform eluiert. Sodann wird mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanoi eluiert, wobei das Volumenverhällnis von Chloroform zu Methanol stufenweise von 99 : 1 auf 95 :5 geändert wird. Das Eluat wird eingedampft, und der Rückstand in warmem Aceton gelöst. Die Acetonlösung wird in der Kälte, beispielsweise bei -15°C, etwa 5 bis 24 Stunden stehengelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert und getrocknet.

Das Produkt fällt als weißes Pulver an. Dieses weiße Pulver wird zur weiteren Reinigung der Dünnschichtchromatographie mit einem Gemisch aus Chloroform, Methanol und Essigsäure als Laufmittel unterworfen werden.

Wenn das Pulver zwei verschiedene Produkte enthält, wird es in η-Hexan gelöst, die Lösung auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule gegeben und zunächst mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol in einem bestimmten Volumenverhältnis, beispielsweise von 98 :2 und 99 :1, und hierauf mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol in einem bestimmten Volumenverhältnis, beispielsweise von 95 :5 und 97 :3, eluiert. Die verschiedenen Eluate werden eingedampft, und die Konzentrate werden in der Kälte, beispielsweise bei — 15°C, stehengelassen. Die entstandenen Fällungen werden abfiltriert und getrocknet. Auf diese Weise werden zwei Produkte isoliert.

Die erhaltenen Produkte zeigen im IR-Absorptionsspektrum die für eine Esterbindung typische Absorptionsbande bei 1700 cm-'. Aufgrund der gaschromatographischen Analyse enthalt das Produkt in seinem Molekül 1 MoI Fructose. 21ur Identifizierung wird das Produkt mit 0,5 η-Natronlauge verseift und das entstandene Reaktionsgemisch papierchromatographisch analysiert. Das Reaktionsgemisch enthält Fructose. Das Reaktionsgemisch wird mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt und sodann mit Diäthyläther extrahiert. Der Ätherextrakt wird der Dünnschichtchromatographie unterworfen. Hierbei wird festgestellt, daß der Ätherextrakt Fettsäuren enthält. Der Ätherextrakt wird ferner der IR-Absorptionsspektroskopie, der Pyrolyse-Gaschromatographie und der Massenspektroskopie unterworfen. Diese Untersuchungen ergeben, daß die Fettsäure im Extrakt eine «-AlkyI-/?-hydroxycarbonsäure der allgemeinen Formel

OH R¹

R²— CH— CH- COOH

ist.

Bei der Umsetzung des Produkts mit 0,5 n-Natronlau-Hi ge erfolgt glatte Verseifung. Dies zeigt, daß das Produkt ein Fructose-fettsäureester ist. Der Ester wird der Anthron-Reaktion und der Perjodat-Oxidation unterworfen, um das Mengenverhältnis von Fructose zu Fettsäure im Molekül zu bestimmen. Auf diese Weise ι ι kann die Struktur des Esters festgestellt werden.

Anthron-Reaktion;
Bestimmung der Veresterungsstelle in Produkt A

1. Molverhällnis von D-Fructose und Fettsäure

10 mg gemäß Beispiel 1 hergestelltes Produkt A werden in 5 ml Chloroform gelöst. Der Fructosegehalt wird aufgrund der Anthron-Reaktion bestimmt. Er beträgt etwa 25,5 Gewichtsprozeni. Unter Zugrundej") legung eines Molekulargewichts für die Fettsäure von 550 ergibt sich ein Molverhältnis von D-Fructose zu Fettsäure von 1:1.

2. Perjodat-Oxidation

in 1,9 μΜοΙ (berechnet aus dem Fructosegehalt) von Produkt A und 2,0 μΜοΙ Fructose werden jeweils mit 2,5 ml einer 0,01-m Natriumperjodatlösung 15 Stunden bei 20° C umgesetzt.

Die verbrauchte Menge an Natriumperjodat beträgt

)■> bei Produkt A 5,3 μΜοΙ und bei Fructose 7,7 μΜοΙ. Somit läßt sich der Verbrauch an Natriumperjodat pro Mol Produkt A auf etwa 3 Mol und pro Mol Fructose auf etwa 4 Mol schätzen. Daraus läßt sich schließen, daß die Fettsäure an die 6-Stellung von Fructofuranose oder an

to die 1 -Stellung von Fructopyranose gebunden ist.

Um eine dieser beiden möglichen Stellungen zu bestätigen, wird eine Perjodat-Oxidation auf folgende Weise durchgeführt: 68 mg Produkt A werden in 1 ml Äthanol gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 1 ml

4') 0,3-m Natriumperjodat vermischt. Das erhaltene Gemisch wird 2 Stunden unter Lichtabschluß bei Raumtemperatur stehengelassen. Der pH-Wert des erhaltenen Reaktionsgemisches wird mit 0,2 n-Schwefelsäure auf 1 eingestellt.

^r)0 Anschließend wird das Gemisch mit Diäthyläther extrahiert.

Der Extrakt wird zur Entfernung des Äthers destilliert und anschließend 5 Minuten bei 50°C mit 1 ml 0,5 η-Natronlauge verseift. Nach dem Verseifen wird die

ν; wasserlösliche Fraktion papierchromatographisch unter Verwendung von n-Propanol/Essigsäureäthylester/ Wasser (7:1:2) und n-Butanol/Essigsäure/Wasser (4:1 :2) als Laufmittel untersucht. In beiden Laufmitteln läßt sich mit alkalischer Silbernitratlösung nur ein

bo Flecken nachweisen, der mit Glycerinaldehyd identisch ist. Somit ergibt sich, daß das Produkt A der Monofettsäureester von Fructofuranose in der 6-Stellungist.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Arthrobacter paraffineus ATCC 15591 wird in 300 ml eines Nährmediums der nachstehend angegebenen

Zusammensetzung in einem 2 Liter fassenden Erlen meyerkolben überimpft.

Einsaatkulturmedium:

Fructose

Fleischextrakt

Pepton

NaCl

30 g/Liter 10 g/Liter

10 g/Liter 3 g/Liter

Der pH-Wert des Nährmediums wird vor der Sterilisation auf 7,2 eingestellt. Die Züchtung wird 24 Stunden bei 30⁰C unter Schütteln durchgeführt. Die erhaltene Einsaatkulturflüssigkeit wird in 3 Liter eines Nährmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung in einen 5 Liter fassenden Fermenter eingegossen.

Hauptfermentationsmedium:	100 g/Liter
Fructose	5 g/Liter
(NH₄J₂SO₄	3 g/Liter
Maisquellwasser	2 g/Liter
NaHPO₄ · 12H₂O	2 g/Liter
KH₂PO₄	1 g/Liter
MgSO₄ · 7H₂O	0,5 g/Liter
FeSO₄ · 7H₂O	20 mg/Liter
MnSO₄ · 4H₂O	10 mg/Liter
ZnSO₄ · 7H₂O	1 mg/Liter
CaCl 2H₂O

Die Fermentation wird 45 Stunden bei 30⁰C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 600 U/min und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 1 Liter Luft pro Liter Nährmedium/Minute durchgeführt. Während der Fermentation wird der pH-Wert der Kulturbrühe mit Ammoniak automatisch auf 6,8 bis 7,2 eingestellt. Nach beendeter Fermentation werden 2,8 Liter der Kulturbrühe zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert. Es hinterbleiben 250 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellcn. Die Zellen werden bei Raumtemperatur dreimal mit jeweils 1 Liter eines Gemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis 1 :1 extrahiert. Der entstandene Extrakt wird in einem Flashverdampfer konzentriert. 10 g des Rückstands werden mit 100 ml Chloroform extrahiert, und der Chloroformextrakt wird eingedampft. Der Rückstand wird in 100 ml n-Hexan gelöst. Die erhaltene Lösung wird konzentriert und zentrifugiert. Es werden 20 ml einer n-Hexanlösung erhalten, die auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule mit einem Innendurchmesser von 4 cm und einer Höhe von 20 cm gegeben wird. Die Säule wird zur Abtrennung von Pigmenten und freien Fettsäuren mit Chloroform eluiert. Sodann wird mit einem Gemisch aus Chloroform ui.d Methanol eluiert, wobei das Volumenverhältnis von Chloroform zu Methanoi stufenweise von 99 : 1 auf 95:5 geändert wird. Die beim Eluieren mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis 95 :5 erhaltenen Fraktionen werden eingedampft. Der Rückstand wird in warmem Aceton gelöst und die Acctonlösung bei -15⁰C stehengelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert und getrocknet. Ausbeute 2,5 g eines weißen Pulvers.

Das weiße Pulver wird mit einem Gemisch aus Chloroform, Methanol und Essigsäure in Vclumcnverhältnis 90:10:5 als Entwicklungslösungsmittel der Dünnschichtchromatographie unterworfen. Das weiße Pulver besteht aus zwei Produkten. Das Pulver wird in η-Hexan gelöst und auf eine mit Kiesclgel gefüllte Säuin mit einem Innendurchmesser von 4 cm und einer Höhe von 30 cm gegossen. Die Säule wird zunächst mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis 98 :2 eluiert. Das erhaltene Eluat wird eingedampft und bei -15°C stehengelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert und getrocknet. Ausbeute 1,2 g Produkt A. Beim weiteren Eluieren der Säule mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis 95:5 und Eindampfen des erhaltenen Eluats werden 0,5 g Produkt B erhalten.

Aufgrund verschiedener Untersuchungen isi das Produkt A ein Fructose-6-monofettsäureester. Der Rest R¹ der Fettsäure ist ein Alkylrest mit 10, 12 oder 14 Kohlenstoffatomen und der Rest R² ist ein Alkylrest mit 15 oder 17 Kohlenstoffatomen. Das Produkt B ist ein Fructose-1,6-difettsäureester. Die Feltsäurereste sind identisch mit dem Fettsäurerest des Produkts A.

Die Produkte A und El haben folgende Eigenschaften: Das Produkt A ist in trockener Form ein Pulver, das beim Stehen an der Luft Feuchtigkeit adsorbiert und sich in eine Paste verwandelt. Es ist bei Raumtemperatur löslich in Diäthyläther, Chloroform und η-Hexan und löslich in Methanol, Äthanol und Aceton bei einer Temperatur von 40 bis 60°C. Ferner ist das Produkt in heißem Wasser löslich. Die Farbe des Produkts ist hellgelb. In der Figur ist das IR-Absorptionsspektrum des Esters angegeben. Das Produkt B liegt in Form einer Paste vor. Das Produkt ist bei Raumtemperatur in Diäthyläther, Chloroform und η-Hexan sowie bei Temperaturen von 40 bis 60⁰C in Methanol, Äthanol und Aceton löslich. Es ist hellgelb gefärbt. Das lR-Absorptionsspektrum des Produkts B ist praktisch identisch mit dem des Produkts A.

Beispiel 2

Beispiel 1 wird unter Verwendung von Arthrobacter hydrocarboglutamicus ATCC 15583 wiederholt. Bs werden 220 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen erhalten. Aus diesen Zellen können gemäß Beispiel 1 zwei Produkte in Mengen von 1,0 bzw. 0,4 g isoliert werden. Aufgrund verschiedener Untersuchungen haben die Produkte die gleiche chemische Zusammensetzung wie die Produkte A und B in Beispiel 1.

Beispiel 3

Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 unter Verwendung von Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 21628 während 30 Stunden durchgeführt. Es werden 220 g (Feuchtgewicht) Mikrobcr.zellen erhalten. Aus diesen Zellen werden 1,7 g eines Produkts Ai und 0,3 g eines Produkts B, gemäß Beispiel 1 isoliert.

Verschiedene Untersuchungen haben ergeben, daß das Produkt A, ein Fructose-6-monofettsäureestcr ist. Der Rest Ri der Fettsäure ist ein Alkylrest mit 8,10 oder 12 Kohlenstoffatomen und der Rest R² ein Alkylrest mit 33, 35 oder 37 Kohlenstoffatomen. Das Produkt Bi ist ein Fructose-1,6-difettsäurecster. Die l-'etisäurereste sind identisch mit dem Fettsäurerest des Produkts Ai.

Beispiel 4

Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 unter Verwendung von Corynebaclerium pseudodiphlheriticum ATCC 10701 während 48 Stunden durchgeführt. Ks werden 260 g (Feuchtgewicht) Mikrobcnzellen erhalten. Aus diesen Zellen werden gemäß Beispiel 1 zwei Produkte in einer Menge von 0,7 bzw. 0,2 g isoliert. Verschiedene Untersuchungen haben ergeben, daß die Produkte die gleiche chemische Struktur wie die Produkte A und B von Beispiel I haben.

■■»*·>'■«-■

Beispiel 5

Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 mit Nocardia paraffinica ATCC 21198 während 38 Stunden durchgeführt. Es werden 190 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen erhalten. Aus diesen Zellen werden 1,3 g eines Produkts A₂ gemäß Beispiel 1 isoliert. Verschiedene Untersuchungen haben ergeben, daß das Produkt A₂ ein Fructose-6-monofettsäureester ist. Der Rest R¹ der Fettsäure ist ein Alkylrest mit 10, 12 oder 14 Kohlenstoffatomen und der Rest R-' ein Alkylrest mit 33, 35 oder 37 Kohlenstoffatomen.

Die Alkylreste in dem Fettsäurerest von Produkt Aj enthalten mehr Kohlcnstoffatome als der Fettsäurerest der Produkte A und B von Beispiel 1. Derartige Fettsäuren mit Alkylrestcn mit einer großen Zahl von Kohlenstoffatomen werden allgemein als Nocardomyeclsäure bezeichnet.

Beispiel 6

Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 mit Nocardia globerula ATCC 13130 während 53 Stunden durchgeführt. Es werden 200 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen erhalten. Aus diesen Zellen werden ein Produkt A) und ein Produkt Bj gemäß Beispiel 1 in einer Menge von 0,8 bzw. 0,2 g isoliert.

Verschiedene Untersuchungen haben ergeben, daß das Produkt Aj ein Fructose-6-monofettsäureester ist. Der Rest R¹ der Fettsäure ist ein Alkylrest mil 10. 12 oder 14 Kohlenstoffatomen und der Rest R² ein Alkylrest mit 35, 37 oder 39 Kohlenstoffatomen. Das Produkt Bj ist ein Fructose-1,6-difettsäureestcr. Die Fettsäurereste sind identisch mit dem Fettsäurerest des Produkts Aj.

Beispiel 7

Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 mit Mycobacterium paraffinicum ATCC 12670 während 40 Stunden durchgeführt. Es werden 190 g (Feuehtgewieht) Mikrobenzellen erhalten. Aus diesen Zellen werden gemäß Beispiel 1 2,7 g eines Produkts A.₍ und Spurenmengen eines Produkts B4 isoliert.

Untersuchungen haben ergeben, daß das Produkt A.₍ ein Fructose-6-monofettsäurecster ist. Der Rest R¹ der Fettsäure ist ein Alkylrest mit 20 oder 22 Kohlenstoffatomen und der Rest R² ein Alkylrest mit 57, 59 oder 61 Kohlenstoffatomen. Das Produkt B₄ ist ein Fructose-1,6-difettsäureester. Die Fettsäurereste sind identisch mit dem Fettsäurerest des Produkts A₄.

Beispiel 8

Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 mit Mycobacterium smegmatis ATCC 21293 wiederholt. Es werden 165 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen erhalten. Aus diesen Zellen werden 0,8 g eines Produkts A5 und Spurenmengen eines Produkts Br, isoliert.

Untersuchungen haben ergeben, daß das Produkt A5 ein Fructose-6-monofetlsäureester ist. Der Rest R¹ der Fettsäure ist ein Alkylrest mit 10, 12 oder 14 Kohlenstoffatomen und der Rest R² ein Alkylrest mit 15, 17 oder 19 Kohlenstoffatomen. Das Produkt Bs ist ein Fructose-l.ö-difettsäureester. Die Fettsäurereste sind identisch mit dem Fettsäurerest des Produkts A··,.

Beispiel 9

Die Fermentation wird gemäß Beispiel 1 mit Mycobacterium smegmatis ATCC 607 wiederholt. Es werden 250 g (Feuchtgewicht) Mikrobenzellen erhalten. Aus diesen Zellen wird 1 g eines Produkts A5 und eine Spurenmenge eines Produkts B5 isoliert.

Untersuchungen haben ergeben, daß das Produkt A--ein Fructose-6-monofettsäureester ist. Der Rest R¹ der Fettsäure ist ein Aäkylrest mit 10, 12 oder 14 Kohlenstoffatomen und der Rest R² ein Alkylrest mit 15 17 oder 19 Kohlenstoffatomen. Das Produkt B--, ist eir Fructose-1,6-difettsäureester. Die Fettsäurereste sine identisch mit dem Fettsäurerest des Produkts A5.

Tabelle I

Ausbeuten an Mikroorganismcnzcllcn und Glykolipiden bei Züchtung von verschiedenen Stämmen gemäß Beispiel 1

Stamm	ATCC-Nr.	Menge der Mikro-	Menge an	Glykolipid
		organismcn-
		zellcn
Arthrobactcr paraffincus	19065	230 g	A 0,9 g	B 0,25 g
	15590	220 g	Λ 1,2 g	B 0,3 β
Cornyncbaeterium hydroatrboclastus	15592	25Og	A, 1,8 g	B ι 0,2 g
	15110	200 g	A, 1,1 g	B₁ 0,15 g
	15109	200 g	A₁ 0,7 g	B ι Spuren
Nocardia globerula	15076	200 g	Aj 0,5 g	B, Spuren
Nocardia paraffinieii	21199	180 g	A₃ 1,1 g	Bi Spuren
	10143	150 g	As 0,4 g	B₅ Spuren

709 547/:

Tabelle II

Molekulargewicht und ElcincnUiranalyse der Verbindungen der Erfindung

Verbin- Durchschnittliches C
dung Molekulargewicht

lilemcntarunalyse Il O

A₁
A,
Α.,
A₄
As
B,
B,
B₁
B.,

714

124Ü

882

910

939

1373

658

1584

1640

1696

2566

1135

69,6

74,7 74,5 74,3 74,5 77,0 71,0 78,0 77,0 78,5 81,2 75,2

11,5 12,6 12,1 12,1 12,0 12,9 11,3 12,0 12,5 12,6 13,1 11,7

19,9 12,7 13,4 13,6 13,5 10,1 17,7 10,0 10,5 8,9 5,6 13,1

Die erfindungsgemäß hergestellten Fructose-fettsäureester sind Netzmittel. Sie können daher in Wasch- und Reinigungsmitteln verwendet werden.

Tabelle III

Oberflächenspannung von Fructose-6-fcttsäureestern bei einer Konzentration von 200iJ.g/ml und einer Temperatur von 20' C.

Beispiel

Verbindung

Oberflächenspannung

Λ,
A₁
A.,
A₄
As

27,4 dyn/cm

27,5

28,2

28,5

29,0

27,7

Versuchsbericht

ίο

Adjuvans-Wirkung der Produkte A (Beispiel I) und A₄ (Beispiel 7)

Es wird der Einfluß der Produkte auf die Übercmpfindlichkeitsreaktion vom Spättyp im Hautreaktionstcst festgestellt. Dazu werden 4 Gruppen von jeweils 4 oder 3 Meerschweinchen mit einem Gewicht von 250 bis 300 g verwendet.

Ein Gemisch aus jeweils 300 ng Produkt A bzw. Produkt A₄ und 300 ng bakterielle -x-Amylasc wird mil der kleinstmöglichsten Menge Mineralöl versetzt. Das erhaltene Gemisch wird sodann mit physiologischer Kochsalzlösung versetzt, die 0,2% Polyoxyä thylensorbitan-monooleat enthält, und anschließend homogenisiert. 0,2 ml der erhaltenen Öl-in-Wasser-Emulsion werden in 4 Anteile zu je 0,05 ml unterteilt. Jeder dieser Anteile wird intramuskulär in die vier Fußballen der Meerschweinchen injiziert, um diese zu sensibilisiercn. 4 Wochen später wird den Tieren intradermal in den Rücken eine Lösung von 100 μg bakterielle «-Amylasc als Antigen in 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung injiziert. Das Ausmaß der Hauptreaktion an der Injektionsstelle 48 Stunden nach der Injektion des Antigens ist in Tabelle IV angegeben.

Es werden die Abmessungen des gebildeten Erythems [größere Achse (mm) χ kleinere Achse (mm)] bestimmt.

Als bekannte Vergleichsverbindung wird Trehalosc-6,6'-dimycolat verwendet. Die Herstellung dieser Verbindung ist in Journal of National Cancer Institute, Bd. 52(1974),S. 95 bis 101,beschrieben.

Tabelle IV

Glyeolipid
(300 (J.g)

Meerschweinchen

l-rythem mich 48 Sld.

Trehalose-Lipid

(Vergleichsverbindung)

Produkt A

Produkt A₄

Kontrolle

(ohne Lipidzusatz)

2
3
4

1
2
3
4
1
2
3

17 X 14 !6X 14

15 X !2 14 X K)

16 X 14 14 X 12 !3X 10 K)X 8

20 X 20 19 X 18 19 X 17 16 X 13

4X4

7X7

Aus Tabelle IV geht hervor, daß das Produkt A₄ den bekannten Adjuvans deutlich überlegen ist, während da: Produkt A etwa die gleiche Adjuvanswirkung besitz wie das Trehalose-Lipid.

Akute Toxizität

Die LD™-Werte von Produkt A und Produkt A. liegen bei Mausen über 500 mg/kg. Der l.l>,(i-Wert vor Trehalose-6,6'-dimycolat beträgt 1,5 mg/kg.

Blatl /ciL-hnungcn

Claims

Patentansprüche:
. Fructose-fettsäureester der allgemeinen Formel

Y¹ OCH₂

OH

H I I CH₁OY²

OH H