DE2514984A1

DE2514984A1 - Antibiotikum u-43 795, dessen hydrat, salze und derivate sowie verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2514984A1
Application number: DE19752514984
Authority: DE
Inventors: Ladislav James Hanka; David Glenn Martin
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1974-04-17
Filing date: 1975-04-05
Publication date: 1975-10-30
Also published as: SU736875A3; CA1034524A; JPS50145589A; AU7953875A; CH620243A5; NL7504508A; SE7504413L; FR2267779B1; BE828040A; US3944562A; FR2267779A1; ZA751855B; GB1458340A

Description

Unsere Nr. 19 759 Ec/tk

The Upjohn Company Kalamazoo, Mich., V.St.A.

Antibiotikum U-43 795, dessen Hydrat, Salze und Derivate sowie Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft das neue Antibiotikum U-43 795, dessen Hydrat, Salze und Derivate sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Das neue Antibiotikum U-43 795 hat die Formel

² ι ^CH-CH-CO

und läßt sich durch Züchten von Streptomyces sviceus in einem wäßrigen Nährmedium herstellen. Es ist eine amphotere Verbindung, die je nach dem pH-Wert der Umgebung

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in unterschiedlichen Ionenformen auftreten kann. Bei niedrigem pH-Wert existiert U-43 795 in Form der Säureanlagerungssalze, bei hohem pH-Wert in Form eines Zwitterions und bei noch höherem pH-Wert in Form eines Metallsalzes.

Das Antibiotikum U-43 795 hemmt das Wachstum von grampositiven Bakterien, z.B. Bacillus subtilis und Sarcina lutea. Es ist auch wirksam gegenüber Salmonella gallinarum und Bacillus cereus.

Das Antibitikum U-¹I3 795 ist ein amphoteres Antibiotikum, das gleichzeitig mit dem Antibiotikum AT-125 durch Züchten einer AT-125 produzierenden Actinomycete in einem wäßrigen Nährmedium hergestellt werden kann.

Das Antibiotikum AT-125 (U-42 126), das durch Züchten von Streptomyces sviceus in einem wäßrigen Nährmedium hergestellt werden kann, hat die Strukturformel.:

COä

Aus der Bestimmung der absoluten Konfiguration von AT-125 ergab sich, daß es sich um (ocS, 5S)-^-Amino-3-chlor-2-isoxazolin-5-essigsäure handelt. Wie das Antibiotikum U-43 795 ist auch das Antibiotikum AT-125 eine amphotere Verbindung, die je nach dem pH-Wert der Umgebung in unterschiedlichen Ionenformen auftreten kann. Bei niedrigem pH-Wert existiert AT-125 in Form eines Säureadditionssalzes, bei höherem pH-Wert in Form eines Zwitterions und

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bei noch höherem pH-Wert in Form eines Metallsalzes.

Das Antibiotikum AT-125 hemmt das Wachstum von Bacillus subtilis, Saccharomyces pastorianus, Penicillium oxalicum, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae und Escherichia coli und kann verwendet werden, um das Wachstum dieser Mikroorganismen in verschiedenen Umgebungen zu hemmen.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum U-43 795 kann allein oder in Kombination mit anderen Mitteln gegen Mikroorganismen in unterschiedlichen Umgebungen zur Verhinderung des vorstehenden Bakterienwachstums oder zur Verminderung der Anzahl der Bakterien verwendet werden. Beispielsweise kann es zur Behandlung von Brutstätten der Seidenraupen oder zur Verhinderung oder weitgehenden Verminderung von Infektionen verwendet werden, die durch Bacillus subtilis verursacht werden.

Die Struktur des Antibiotikums U-O 795, die mit den ermittelten Spektraldaten und analytischen Daten übereinstimmt, entspricht der vorstehenden Formel I sowie deren ionischen und zwitterionischen Formen.

Das NMR-Spektrum einer gesättigten Lösung von U-¹13 795 in D₂O wurde mit Hilfe eines Spektrometers Varian XL-100-15 bestimmt. Das 100 MHz-Spektrum war nicht erster Ordnung und zeigte deutlich die Gegenwart von drei nicht austauschbaren Protonen. Das Methin-Proton am C-4 erschien als scheinbares Dublett bei 5,34δ mit einer Linienaufspaltung von 8,2 Hz. Das benachbarte Proton am C-5 erschien als scheinbares Dublett von Dubletten, die bei 5,19 δ zentriert waren, mit Linienaufspaltungen von 3,4 Hz und 8,2 Hz. Das Signal für die Methingruppe der Aminosäure war ein scheinbares Dublett bei 4,43 δ mit einer Linienaufspaltung

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von 3,4 Hz.

Das IR-Spektrum des partiellen Hydrates von U-43 795 in Nujol-Mull wurde mit Hilfe eines Spektrophotometers nach Perkin-Elmer Nr. 421 bestimmt. Spitzen (peaks) wurden (außer denen von Nujol) bei 3620, 3l4O, 2710, 2620, 1660, 1640 sh, 1610 sh, 1585, 1525, 1385, 1325, 1310, 1270, 1255, 1180, 1135, IHO, 1075, 980, 915, 900, 865, 805 und 705 cm" gefunden (sh = Schulter).

Zirkulärer Dichroismus: Das Antibiotikum U-43 795 ergab in Wasser [Qf^ + 60 000 und f&J*^ ~ 47 000.

Dünnschichtchromatographie: Die Dünnschichtchromatographie von U-43 795 auf einer zuvor mit Silikagel überzogenen Platte (Quanta gram) ergab nach Besprühen der Platte mit einer Ninhydrin-Lösung eine einzige Zone. Durch Entwicklung der Platte mit einem Gemisch aus Tetrahydrofuran, Aceton und Wasser im Verhältnis von 50:30:20 a?5 Eluierungsmittel wurde ein Rf-Wert von 0,55 erhalten.

Die chemische Struktur von U-43 795 in der kristallinen Form wurde genau durch Röntgenbeugungsanalyse bestimmt. Kristallines U-43 795 kann chemisch als oCS, 4S, 5R-0C-Amino-3-chlor-4-hydroxy-2-isoxazolin-5-essigsäure bezeichnet werden. Molekulargewicht: Genaue Röntgenanalyse ergab ein Hydrat von U-43 795 mit der Formel C₅H₇ClN₂Ou · H₃O oder dem Molekulargewicht von 212,59.

Löslichkeit: U-43 795 ist löslich in Wasser und etwas löslich in Methanol. Es ist jedoch relativ unlöslich in Äthylacetat, Äther, Benzol und Chloroform.

Wirksamkeit von U-43 795 gegen Mikroorganismen: Die folgen-

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den Ergebnisse wurden mit einem üblichen Plattenversuch unter Verwendung von Rundfiltern (paper discs) mit einem Durchmesser von 13 mm und Anwendung einer Konzentration an ϋ-43 795 von 3 mg/ml erhalten:

Mikroorganismus

Hemmzone um ein mm Rundfilter (mm)

Bacillus cereus

Bacillus subtilis (in synthetischem Agar)

Bacillus subtilis (in Nähragar) Lactobacillus casei Sarcina lutea Staphylococcus aureus Mycobacterium avium Escherichia coli (in Nähragar)

Escherichia coli (in synthetischem Agar)

Salmonella schottmuelleri Salmonella gallinarum Proteus vulgaris Klebsieila pneumoniae Saccharomyces pastorianus Pneicillium oxalicum Saccharomyces cerevisiae Streptococcus faecalis

Pseudomonas fluorescens Glomerella cingulata

Spuren 48 0 0

23

0 verschleiert

0 Spuren

sehr verschleiert

0 Spuren

Die Herstellung von U-¹O 795 erfolgt erfindungsgemäß durch Züchten von Streptomyces sviceus, der zu den Actinomyceten gehört. Eine der Eigenschaften dieses Mikroorganismus besteht in der Erzeugung des Antibiotikums AT-125 und des Antibiotikums U-43 795.

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Eine Subkultur des lebenden Mikroorganismus wurde hinterlegt und kann von der ständigen Sammlung der Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research Services, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, V.St.A. unter der Hinterlegungsnummer NRRL 5439 erhalten werden.

Die Taxonomie von Streptomyces sviceus wurde bestimmt von Alma Dietz und beschrieben in Band 3 von Antimicrobial Agents and Chemotherapy, März 1973, Seiten 425-431.f

Das erfindungsgemäße Antibiotikum U-43 795 wird hergestellt, wenn der erzeugende Mikroorganismus in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen gezüchtet wird. Es versteht sich, daß zur Herstellung begrenzter Mengen auch Oberflächenkulturen und Kolben verwendet werden können. Der Organismus wird in einem Nährmedium gezüchtet, das eine Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder ein proteinhaltiges Material enthält. Zu den bevorzugten Kohlenstoffquellen gehören Glukose, brauner Zucker, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Laktose, Dextrin, Melassen und dgl. Zu den bevorzugten Stickstoffquellen gehören Maisquellwasser, Hefe, autolysierte Brauereihefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, pankreatisch verdautes Kasein, Branntweintrester, tierische Peptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenstückchen und dgl. Vorteilhaft werden Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verwendet. Spurenmetalle, wie z.B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dgl., brauchen dem Permentationsmedxum nicht zugesetzt zu werden, da als Bestandteile des Mediums Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile verwendet werden.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung kann bei jeder Temperatur bewirkt werden, die für ein befriedigendes

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Wachstum des Mikroorganismus förderlich ist, z.B. bei etwa 18 bis ¹JO⁰C und vorzugsweise bei etwa 20 bis 32°C. Gewöhnlich wird eine optimale Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung in etwa 2 bis 10 Tagen erreicht. Normalerweise bleibt das Medium während der Fermentation schwach sauer (bei einem pH-Wert von 5,5 bis 7,0). Der endgültige pH-Wert hängt teilweise von etwa vorhandenen Puffersubstanzen und teilweise von dem ursprünglichen pH-Wert des Kulturmediums ab, der vorzugsweise vor der Sterilisation auf etwa 7*0 eingestellt wird.

Wenn das Wachstum in großen Kesseln und Tanks durchgeführt wird, wird zur Beimpfung vorzugsweise die vegetative Form und nicht die Sporenform des Mikroorganismus verwendet, um eine deutliche Verzögerung in der Produktion der neuen Verbindung und die damit verbundene unwirksame Anwendung der Vorrichtung zu vermeiden. Daher ist es erwünscht, in einer Nährbrühenkultur durch Beimpfung dieser Brühenkultur mit einem aliquoten Teil einer Boden- oder Schrägkultur ein vegetatives Impfmaterial herzustellen. Wenn auf diese Weise ein junges, wirksames vegetatives Impfmaterial erhalten wurde, wird es aseptisch auf große Kessel oder Tanks übertragen. Das Medium, in dem das vegetative Impfmaterial hergestellt wird, kann die gleiche oder eine andere Zusammensetzung wie das zur Produktion der neuen Verbindung verwendete Medium haben, vorausgesetzt, daß ein gutes Wachstum des Mikroorganismus erreicht wird.

Das neue Antibiotikum U-43 795 gemäß vorliegender Erfindung ist eine amphotere Verbindung. Es ist löslich in Wasser und wenig löslich in Methanol.

Zur Isolierung und Reinigung von U-43 795 können verschiedene Verfahren angewendet werden, z.B. Absorptionsverfahren

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mit anschließender Eluierung mit einem geeigneten Lösungsmittel, Säulenchromatographie, Verteilungschromatographie und Kristallisation aus Lösungsmitteln.

In einem bevorzugten Gewinnungsverfahren werden U-43 795 und das gleichzeitig hergestellte AT-125 aus ihrem Kulturmedium durch Filtration durch ein Diatomit mittlerer Porosität, z.B. FW 40 von der Eagle Picher, gewonnen. Andere geeignete Diatomite sind im Handel unter den Handelsbezeichnungen Super CeI (Johns Manville's fine diatomite), Dicalite 4200 (Great Lakes) und Miraflo 40 (Eagle Picher) erhältlich.

Die klare Flüssigkeit wird durch eine chromatographische Säule geleitet, die mit einem Styrolsulfonsäureharz oder einem ähnlichen Sulfonsäureharz gefüllt ist. Ein bevorzugtes Sulfonsäureharz ist Dowex 50 in der sauren Form (hydrogen form), das vorzugsweise stark vernetzt sein sollte, z.B. Dowex 50 χ 16. Andere geeignete Harze si^d im Handel unter den Handelsbezeichnungen Amberlite IR-120, Nalcite HCR, Chempro C-20, Permutit Q und Zeokarb 225 erhältlich. Nach ausreichendem Waschen der Säule wird das Antibiotikum mit einer Base eluiert, wobei NH^OH bevorzugt wird. Die aus der vorstehenden chromatographischen Säule erhaltenen antibiotisch wirksamen Eluate werden gesammelt und konzentriert.

In einem bevorzugten Reinigungsverfahren wird das erhaltene, vorstehend beschriebenen wäßrige Konzentrat bei einem neutralen pH-Wert (6,2 bis 7,8) durch eine Säule geleitet, die ein schwach basisches Styrol-Polyaminharz oder ähnliches Polyaminharz enthält. Ein bevorzugtes Polyaminharz ist Amberlite IR 45 (0H~). Andere verwendbare Harze sind Amberlite IR 4B, Nalcite WBR, DeAcidite E und Duolite A.2.

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Die Säule wird mit entionisiertem Wasser, 50 %igem wäßrigen Methylalkohol und 90 JEigem wäßrigen Methylalkohol gewaschen und dann mit Essigsäure in 90 % Methylalkohol eluiert. Die wirksamen Eluatfraktionen werden gesammelt und anschließend unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei ein Rückstand erhalten wird. Methylalkohol kann durch Wasser ersetzt werden.

Der vorstehend erhaltene Rückstand, der sowohl U-43 als auch AT-125 enthält, wird anschließend einer chromatographischen Trennung unter Verwendung von Silikagel (Nummer 7734 von E. Merck Darmstadt) und einem Gemisch aus Methyläthy!keton, Aceton und Wasser im Verhältnis von 65:20:15 als Lösungsmittelsystem unterworfen. Dieses Verfahren ergibt relativ reine Präparate von U-43 795 und AT-125.

Der Titer für AT-125 in der Flüssigkeit kann während der verschiedenen Stufen der Gewinnungsverfahren mit Hilfe eines Plattenversuchs unter Verwendung von Bacillus subtilis überwacht werden, wobei Bacillus subtilis in einem synthetischen Medium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet wird:

1,7 g 2,0 g 1,0 g 0,1 g 2,0 g 15,0 g

destilliertes Wasser 1 1

Metallionen-Vorratslösung 1 ml

Bacto Agar von der Difco Laboratories, Detroit, Michigan

Metallionen-Vorratslösung der folgenden Zusammensetzung:

Na₂HPO₄ . *TtiTT T3/^**	7H₂O
MgSO₄
Glucose
Bacto Agar	X

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- iff -

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NaMoO^ · 2H₂O 200 Mg/ml

CoCl₂ 100 Mg/ml

100 Mg/ml

MnSO^ 2 mg/ml

CaCl₂ 25 mg/ml

FeCl₂ · 4H₂O 5 mg/ml

ZnCl₂ x 5 mg/ml

^xZnCl₂ muß unter Verwendung von einem Tropfen 0,1 η HCl pro 10 ml Wasser getrennt gelöst werden. Die Vorratslösung wird erhitzt, um alle Verbindungen in Lösung zu bringen, anschließend 24 Stunden lang stehengelassen und steril filtriert.

Dieses Medium wird mit einer Sporensuspension von B. subtilis (1,5 x 10 Zellen/ml) in einem Verhältnis von 0,5 ml pro Liter beimpft. Die Flüssigkeitsproben werden auf Filtrierpapiere mit einem Durchmesser von 12,5 mm aufgebracht (0,08 ml pro Rundfilter), das Versuchssystem wird über Nacht bei 37 C inkubiert und die Hemmzonen werden gemessen. Die Potenz der Probe wird mit Hilfe der üblichen Standardkurve auf den Durchmesser der Hemmzone bezogen.

Dieses Medium kann nach dem Besäen mit B. subtilis auch zur Feststellung von Antibiotikum AT-125 verwendet werden. Das Antibiotikum U-43 795 kann durch Bioautographie in verhältnismäßig reinen Proben, d.h. Proben, die frei von Antibiotikum AT-125 sind, festgestellt werden. Bei diesem Verfahren werden Papierdiagramme mit der oberen Phase eines Lösungsmittelgemisches von 1-Butanol, Methanol, Benzol und Wasser im Verhältnis 2:1:1:1 entwickelt. Nach der Entwicklung werden die Blätter getrocknet, und die Papierdiagramme werden dann auf transparente Papierdiagramm-Einsätze gelegt,

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die das besäte Medium enthalten, und nach etwa 20 Minuten entnommen. Die Einsätze werden wie vorstehend beschrieben über Nacht inkubiert, und die Hemmzonen werden beobachtet.

Da das Antibiotikum U-43 795 eine amphotere Verbindung ist, bildet es Salze mit Säuren, Alkalimetallen (einschließlich Ammoniak), Erdalkalimetallen (einschließlich Magnesium und Aluminium) und Aminen. Metallsalze können hergestellt werden, indem man das Antibiotikum U-43 795 in Wasser löst, und die Lösung mit einer verdünnten Metallbase versetzt, bis der pH-Wert der Lösung 7 bis 8 beträgt. Zu den Metallsalzen von U-43 795 gehören die Natrium-, Kalium- und Kalziumsalze. Auch die Aminsalze einschließlich der Salze mit organischen Basen, wie primäre, sekundäre und tertiäre, Mono-, Di- und Polyamine, können unter Anwendung der vorstehenden oder anderer üblicherweise angewandter Methoden gebildet werden. Weiterhin können Ammoniumsalze nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Andere Salze werden mit therapeutisch wirksamen Basen erhalten, die den Salzen eine zusätzliche therapeutische Wirkung verleihen. Derartige Basen sind z.B. die Purinbasen, wie z.B. Theophyllin, Theobromin, Caffein oder Derivate solcher Purinbasen; Antihistaminbasen, die in der Lage sind, Salze mit schwachen Säuren zu bilden; Pyridinverbindungen, wie z.B. Nicotinsäureamid, Isonicotinsäurehydrazid und dgl.; Phenylalkylamine, wie z.B. Adrenalin, Ephedrin und dgl.; Cholin und andere Basen.

Säureanlagerungssalze können durch Neutralisation von U-43 795 mit der geeigneten Säure auf einen pH-Wert unterhalb etwa 7,0, vorzugsweise auf einen pH-Wert von etwa 2 bis 6, hergestellt werden. Geeignete Säuren für diesen Zweck sind z.B. Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, SuIfamin-

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säure, Bromwasserstoffsäure und dgl. Die Salze von U-43 mit Säuren und Basen können für die gleichen biologischen Zwecke wie die Stammverbindung verwendet werden.

Das Antibiotikum 11-43 795 ist wirksam gegenüber Bacillus subtilis und kann bei der Lagerung von Erdölprodukten zur Bekämpfung dieses Mikroorganismus verwendet werden, der für die Lagerung von Erdölprodukten einen bekannten Schlamm- und Korrosionsbildner darstellt. Weiterhin kann das Antibiotikum U-43 795 aufgrund seiner Wirksamkeit gegenüber Bacillus subtilis verwendet werden, um den Geruch von Fisch oder Pischkörben, der durch diesen Organismus verursacht wird, zu verhindern oder soweit wie möglich zu vermindern. U-43 795 kann weiterhin verwendet werden, um Laboratoriumstische und -einrichtungen in einem bakteriologischen Laboratorium, die mit Bacillus subtilis und/oder Sarcina lutea verunreinigt sind, zu reinigen.

Ferner ist U-43 795 wirksam gegenüber Klüseleukämie L1210 in Laboratoriumsmäusen und kann daher zur Behandlung dieser Mäuse verwendet werden.

DasjAntibiotikum U-43 795 kann unter üblichen Acylierungsbedingungen mit einem geeigneten Säurehalogenid oder -anhydrid oder einem Sulfonylhalogenid zu dem entsprechenden Bis-acylderivat acyliert werden, worin der 4-Hydroxyl- und der CC-Amino-Wasserstoff acyliert sind. Die Acylierung wird in Gegenwart eines schwachen säurebindenden Mittels durchgeführt.

Zu den geeigneten säurebindenden Mitteln gehören Amine, wie z.B. Pyridin, Chinolin und Isochinolin, sowie Puffersalze, wie z.B. Natriumacetat. Die bevorzugte Base ist

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Pyridin. Zu den Carbonsäuren, die für die Acylierung geeignet sind, gehören (a) gesättigte oder ungesättigte, geradkettige oder verzweigtkettige aliphatische Carbonsäuren, z.B. Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Isobuttersäure, Terbutylessigsäure, Valeriansäure, Isovaleriansäure, Capronsäure, Caprylsäure, Decansäure, Dodecansäure, Laurinsäure, Tridecansäure, Myristinsäure, Pentadecansäure, Palmitinsäure, Margarinsäure, Stearinsäure, Acrylsäure, Crotonsäure, Undecylensäure, ölsäure, Hexinsäure, Heptinsäure, Octinsäure und dgl.; (b) gesättigte oder ungesättigte alicyclische Carbonsäure, wie z.B. Cyelobutancarbonsäure, Cyclopentancarbonsäure, Cyclopentencarbonsäure, Methylcyclopentencarbonsäure, Cyclohexancarbonsäure, Dimethylcyclohexancarbonsäure, Dipropylcyclohexancarbonsäure und dgl.; (c) gesättigte oder ungesättigte alicyclische aliphatische Carbonsäuren,wie z.B. Cyclopentanessigsäure, Cyclopentanpropionsäure_; Cyclohexanessigsäure, Cyclohexanbuttersäure, Methylcyclohexanessigsäure und dgl.; (d) aromatische Carbonsäuren, wie z.B. Benzoesäure, Toluylsäure, Naphthoesäure, Äthy!benzoesäure, Isobuty!benzoesäure, Methylbutylbenzoesäure und dgl.; und (e) aromatische aliphatische Carbonsäuren, wie z.B. Phenylessigsäure, Phenylpropionsäure, Phenylvaleriansäure, Zimtsäure, Pheny!propiolsäure und Naphthylessigsäure und dgl. Zu weiterhin geeigneten Halogen-, Nitro-, Hydroxy-, Amino-, Cyano-, Thiocyano-.und Niederalkoxykohlenwasserstoffcarbonsäuren gehören solche Kohlenwasserstoffcarbonsäuren der vorstehenden Arten, die durch einen oder mehrere der folgenden Substituenten substituiert sind: Halogenatome, Nitro-, Hydroxy-, Amino-, Cyano- oder Thiocyanogruppen oder niedere Alkoxygruppen, vorzugsweise niedere Alkoxygruppen mit nicht mehr als 6 Kohlenstoffatomen, z.B. Methoxy-, Ä'thoxy-, Propoxy-, Butoxy-, Amyloxy- und Hexyloxygruppen und deren isomere

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Formen. Beispiele für derartige substituierte Kohlenwasserstoff carbonsäuren sind: Mono-, Di- und Trichloressigsäure; QC- und ß-Chlorpropionsäure; OC- und y-Brombuttersäure, Ot- und δ-Jodvaleriansäure; Mevalonsäure; 2- und 4-Chlorcyclohexancarbonsäure; Shikiminsäure; 2-Nitro-l-methylcyclobutancarbonsäure; 1,2,3,4, SjS-Hexachlorcyclohexancarbonsäure; 3-Brom-2-methylcyclohexancarbonsäure; 4- und 5-Brom-2-methylcyclohexancarbonsäure; 5- und 6-Brom-2-methylcyclohexancarbonsäure; 2,3-Dibrom-2-methylcyclohexancarbonsäure; 2,5-Dibrom-2-methylcyclohexancarbonsäure; 4,5-Dibrom-2-methylcyclohexancarbonsäure; 5,6-Dibrom-2-methylcyclohexancarbonsäure; 3-Brom-3-methylcyclohexancarbonsäure; 6-Brom-3-methylcyclohexancarbonsäure; l,6-Dibrom-3-methylcyclohexancarbonsäure; 2-Brom-4-methylcyclohexancarbonsäure; 1,2-Dibrom-4-methylcyclohexancarbonsäure; 3~Brom-2,2,3-trimethylcyclopentancarbonsäure; l-Brom-3_s5-dimethylcyclohexancarbonsäure; Homogentisinsäure, o-, m- und p-Chlorbenzoesäure; Anissäure, Salicylsäure; p-Hydroxybenzoesäure; ß-Resorcylsäure; Gallussäure; Veratrumsäure; Trimethoxybenzoesäure; Trimethoxyzimtsäure; 4,4'-Dichlorbenzilsäure; o-, m- und p-Nitrobenzoesäure; Cyanoessigsäure; 3,^- und 3,5-Dinitrobenzoesäure; 2,4,6-Trinitrobenzoesäure; Thiocyanoessigsäure; Cyanopropionsäure; Milchsäure; Äthoxyameisensäure (Äthylhydrogencarbonat) und dgl.

Die Acylierung wird vorteilhaft so durchgeführt, daß man eine Lösung von U-43 795 in einem Säureanhydrid mit einer geringen Menge der Base behandelt und das erhaltene Gemisch gegebenenfalls für eine kurze Zeit auf etwa 100°C erhitzt, um die Umsetzung zu vervollständigen. Das Reaktionsgemisch kann mit Wasser versetzt werden, um das Acylierungsmittel zu hydrolysieren, und das gewünschte Produkt kann nach üblichen Verfahren isoliert werden. Weiterhin können die Bis-acylderivate

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nach üblichen Veresterungsverfahren, wie sie z.B. von Smuszkovicz in J. Org. Chem., Band 29 (196H)₃ S. 843 beschrieben sind, in das entsprechende veresterte Bis-acylderivat umgewandelt werden. Die vorstehende Reaktionsfolge kann wie folgt erläutert werden:

"Bis-acyl"-derivate

.0H

CO₂

NH;

übliche Acylierungsbedingungen mit einem entsprechenden Säurehalogenid oder -anhydrid oder einem Sulfonylhalogenid

NH-A

A = Acylrest einer

Kohlenwasserstoffcarbonsäure mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen oder einer durch HaIo-CO₂H genatome, Nitro-, Hydroxy-, Amino-, Cyano-, Thiocyano- oder niedere Alkoxygruppen substituierten Kohlenwasserstoffcarbonsäure mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen oder der Rest -SO₂R, worin R = CH₃ oder

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Umwandlung in gemischtes Anhydrid mit EtO-CO-Cl oder in Säurechlorid J. übliche mit anschließender Umsetzung mit \ ■Veresterungsgeeigneten Alkoholen oder Aminen / bedingungen

H-N-A

A wie vorstehend

H ι worin R^f eine Alkylgruppe mit

B = -N-R¹ I 1 bis 20 Kohlenstoffatomen ein-

\ schließlich isomerer Formen

= -0-R¹ J bedeutet

Beispiele für Alkylgruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen einschließlich ihrer isomeren Formen, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, sind die Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl-, Decyl-, Undecyl-, Dodecyl-, Tridecyl-, Tetradecyl-, Pentadecyl-, Hexadecyl-, Heptadecyl-r, Octadecyl-, Nonadecyl- und die Eicosylgruppe sowie deren isomere Formen.

Weiterhin kann das Antibiotikum U-*I3 795 nach üblichen Verfahren /vgl. R.A. Boissonnas, Advances in Organic Chem., Bd. 3 (1963), S. 159.7 in Aminoacyl-Stickstoff-Derivate umgewandelt werden, indem man zuerst den Aminostickstoff mit einer geeigneten Schutzgruppe, z.B. Carbobenzyloxy (Cbz)-chlorid oder Carboathoxyphthalxmid umsetzt, oder indem man selektive Acylierungsbedingungen mit Acylanhydriden anwendet. Die erhaltene Verbindung kann anschließend unter Anwendung üblicher Veresterungsverfahren verestert werden, worauf die Schutzgruppe für den Aminostickstoff durch Hydrolyse entfernt wird. Die vorstehende Reaktionsfolge kann

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wie folgt erläutert werden:

"Monoacyl"-Stickstoffderivate

+NH₃

Carbobenzyloxychlorid oder Carboäthoxyphthalimid oder £ selektive Acylierungsbedingungen ) mit Acylanhydriden

wäßrige Grundlage

ND

Il

O₂H

Il ι D=H, -C-O-CH₂-<J> oder

oder Acylrest einer Kohlenwasserstoffcarbonsäure mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen oder einer durch Halogenatome, Nitro-, Hydroxy-, Amino-, Cyano-, Thiocyano- und niedere Alkoxygruppen substituierten Kohlenwasserstoffcarbonsäure mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen.

übliche Veresterungsverfahren (+ Amidbildung)

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übliche Cl Entfernung V-von Cbz- " 1 oder Phthal-N^ imido-Schutzgruppen

NH₂

B =

-NR

-OR

worin R = eine Alkylgruppe mit 1 bis Kohlenstoffatomen einschließlich der isomeren Formen bedeutet.

D wie vorstehend

Weiterhin kann das Antibiotikum U-43 795 in Monoacyl-Sauerstoff-Derivate umgewandelt werden, indem man zuerst den Aminostickstoff wie vorstehend erläutert schützt und dann die Schutzgruppe wie ebenfalls vorstehend erläutert unter üblichen Acylierungsbedingungen acyliert. Die Schutzgruppe an der Aminogruppe kann dann entfernt werden, oder das geschützte Acylat kann unter Anwendung üblicher Veresterungsbedingungen wie vorstehend erläutert verestert xferden, wobei das veresterte Aminoacyl-Sauerstoff-Derivat erhalten wird. Die vorstehende Reaktionsfolge kann wie folgt erläutert werden:

"Monoacyl"-Sauerstoff-Derivate

.CO₂H

übliche. Acylierungsbedingungen

Cbz- oder Phthalimido-Derivate oder andere, leicht entfernbare Schutzgruppe am Stickstoff

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Cl

.CO₂H übliche Entfernung der S c Hut J?- _ gruppe am Aminostickstoff

OA

co:

!übliche Veresterungsjverfahren (+ Amidbildung)

+NH₃

übliche

.0A

C-B Entfernung

der Schutzgruppe- am "^O Aminostickstoff

NH₂

Die Acyl- und Estergruppen sind die gleichen, wie sie vorstehend für die Bis-acylderivate von U-^3 795 angegeben wurden.

Die vorstehenden Derivate von U-43 795 können für die gleichen Zwecke angewendet werden, wie sie bereits vorstehend für U-43 795 aufgeführt wurden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Alle Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht und alle Anteile von Lösungsmittelgemischen beziehen sich auf das Volumen, wenn nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1

A. Fermentation

Eine Vorratsbodenprobe von Streptomyces sviceus, NRRL 5*139, wurde zum Beimpfen von 500 ml Erlenmeyer-Impfkolben ver-

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wendet, die jeweils 100 ml eines sterilen Mediums enthielten, das aus den folgenden Bestandteilen bestand:

Dextrose 25 g/l

Pharmamedia ^x 25 g/l

Leitungswasser auf 1 1

^x Produkt der Trader's Oil Mill Company, Port Worth, Texas.

Der pH-Wert des Mediums betrug vor der Sterilisation 7_S2. Das Impfmaterial wurde 2 Tage bei 28°C auf einer mit 250 UpM laufenden umlaufenden Sehüttelniaschine nach Gump gezüchtet. Das auf diese Weise hergestellte Impfmaterial wurde zum Impfen von 500 ml Erlenmejrer-Fermentationskolben verwendet, die jeweils 100 ml eines sterilen Fermentationsmediums enthielten, das aus den folgenden Bestandteilen bestand:

NH^Cl 5 g/l

Cerelose 2 g/l

Maisstärke 10 g/l

gewaschene Hefe 2,5 g/l

Sojabohnenmehl, fettextrahiert, fein gemahlen
(KaySoy) 20 g/l

Schmalzöl 1 ml

Leitungswasser auf 1 1

Der pH-Wert der Vorsterilisation wurde mit H η NaOH auf 7j2 eingestellt, Die Fermentationskolben wurden In einer Menge von 5 ml Impfmaterial, pro ICO ml Fermentatlonsraedium beimpft. Die FernentatIonskolb-sn wurden 2 bis 3 Tage bei einer Temperatur von 32°C auf einer mit 250 UpM laufenden umlaufenden Schüttelmaschine nach Gump gezüchtet.

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B. Gewinnung

Die gesamte Flüssigkeit (250 1) aus einer vorstehend beschriebenen Fermentation von AT-125 und U-43 795 wurde durch ein Diatomit mittlerer Porosität filtriert. Die erhaltene klare Flüssigkeit wurde bei einem pH-Wert von 7 bis 8 in einer chromatographxschen Säule durch 25 1 frisch regeneriertes Dowex 50 χ 16 (H ) geleitet. Die Säule wurde mit 50 1 entionisiertem Wasser gewaschen und anschließend mit 120 1 1 η NHuOH eluiert, wobei 6 1 Fraktionen gesammelt wurden. Die wirksamsten Fraktionen (Hemmzonen >50 mm) wurden bestimmt, Indem man darin eingetauchte und an der Luft getrocknete Filtrierpapiere auf einen Einsatz von Bacillus subtilis (gezüchtet In dem vorstehend beschriebenen synthetischen Medium) aufbrachte. Die wirksamen Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck konzentriert, um überschüssiges NH₁-OH zu entfernen.

C. Reinigung

(1) Säulenchromatographie mit einem schwachbasischen Polyaminharz vom Typ Styrol-Polyamin.

Das wie vorstehend beschrieben hergestellte, wirksame wäßrige konzentrierte Dowex 50-Eluat wurde bei einem pH-Wert von 7 bis 7,5 durch eine Säule geleitet, die 4 1 Amberlite IR 45 (OH") enthielt. Die Säule wurde mit 8 1 entionisiertem Wasser, 4 1 50 Jtigem wäßrigen Methylalkohol und 8 1 90 Jigem wäßrigen Methylalkohol gewaschen und anschließend mit 0,5 η Essigsäure in 90 jSigem Methylalkohol eluiert, wobei 2 1 Fraktionen gesammelt wurden. Die wirksamsten Fraktionen (bestimmt durch den Versuch mit Bacillus subtilis) wurden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. ,

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(2) Silikagel-Chromatographie

Das folgende Verfahren wurde unter Verwendung von Silikagel 60 (Nr. 7734 von E. Merck Darmstadt) mit den vorstehend erhaltenen Rückständen der IR 45 (OH~)-Säule durchgeführt. Wirksame Frakitonen (mit einem Gehalt von 6,55 g, 934 BU/mg oder 5j84 % AT-125) aus der vorstehend beschriebenen Säule IR 45 wurden zur Trockene eingedampft, und die Essigsäure wurde mit Wasser ausgetrieben. Der erhaltene Rückstand wurde in 328 ml Wasser suspendiert und auf 33 g Silikagel eingedampft. Der Kolben wurde mit 5 g frischem Silikagel gespült. Das homogene Pulver wurde über einer Säule mit Silikagel chromatographiert, wobei das Silikagel durch Aufschlämmen von 600 g Silikagel in einem Gemisch aus Methyläthylketon, Aceton und Wasser im Verhältnis 65:20:15 hergestellt worden war. Die Säule wurde mit 7200 ml dieses Lösungsmittelgemisches eluiert, wobei zuerst 1200 ml gesammelt (Nr. 0) und dann 500 ml Fraktionen (Nr. 1 bis Nr. 12) aufgefangen wurden. Die Ergebnisse waren die folgenden:

	BSS-Zone²	5XTüpfel auf	DC³
Nr.	(1-1O)¹	Silikagelplatte Ninhydrin-Bestimmung
0	0
1	0	keine Zone
2	23H	keine Zone	U-43 795
3	29	stark	U-43 795
4	30	stark	U-43 795 + AT-125
5	57	mäßig	AT-125
6	70	mäßig	AT-125
7	70	mäßig/schwach	AT-125
8	60	schwach
9	55	schwach
10	47	schwach
11	32	schwach
12	0

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1 bis 10 Verdünnungen der Fraktionen wurden getüpfelt.

BSS-Zone ist die Heinmzone (in mm) in einem vorstehend beschriebenen Plattenversuch mit B. subtilis.

Dünnschichtchromatographie mit einem Gemisch aus Methyläthylketon, Aceton und Wasser im Verhältnis 65:20:15 auf einer Silikagelplatte. Ninhydrin-Bestimmung.

Die Fraktionen 3 und 4 wurden gesammelt und unter vermindertem Druck bei 40°C eingedampft; der Rückstand wurde mit Methylalkohol zerrieben, wobei 1,37 g praktisch reines U-43 795 erhalten wurden. Umkristallisation aus wäßrigem Methylalkohol ergab das analytisch reine U-¹J3 795 in Form seines kristallinen Hydrates. Das Hydratwasser konnte durch Trocknen entfernt werden.

In ähnlicher Weise ergab die Kristallisation der Fraktionen 6 bis 8 0,37 g praktisch reines AT-125, das nach Umkristallisation aus wäßrigem Methylalkohol analytisch reines AT-125 ergab.

^Hydrat
Die Salze vom U-43 795iließen sich wie vorstehend für das nichthydratisierte ü-43 795 beschrieben herstellen. Das U-¹13 795-Hydrat und seine Salze können für die gleichen Zwecke wie vorstehend für das nichthydratisierte U-43 795 angegeben verwendet werden.

Unter einer Bioeinheit der Wirksamkeit (BU) wird die Menge an Antibiotikum verstanden, die erforderlich ist, um aus einem mit 0,08 ml seiner Lösung behandeltem Filtrierpapier von 1,27 cm Durchmesser eine Hemmzone von 20 mm zu erhalten. Der Plattenversuch entspricht der vorstehenden Beschreibung.

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Die hier beschriebene Erfindung wurde unter den Verträgen PH43-NC1-6Ö-1O23 und NIH-NCl-C-73-3707 mit dem National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethseda, Maryland 20014 gemacht.

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Claims

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Patentansprüche

Antibiotikum U-43 795 mit der Strukturformel Cl

K₂ ^CH — CH- COä

+NH₃

dessen Hydrat und die Salze dieser Verbindungen.
2. Säureadditionssalze von Antibiotikum U—43 795-
3. Kationische Salze von Antibiotikum U-^3 795.
H. Zwitterionische Form von Antibiotikum U-^3 795.
5« Hydrat des Antibiotikum U-43 795 mit der Strukturformel:

\ H

^V3 4COH 'H₂O

ι sch— CH-CO₂

+NH

und seine Salze.
6. Säureadditionssalze des Hydrats von Antibiotikum U-43 795·
7. Kationische Salze des Hydrates von Antibiotikum U-43 795.

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8. Zwitterionische Form des Hydrates von Antibiotikum U-43 795.
9. Derivate von Antibiotikum U-43 795 mit der Formel

HA

worin A einen Acylrest einer Kohlenwasserstoffcarbonsäure mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen oder einer durch Halogenatome oder Nitro-, Hydroxy-, Amino-, Cyano-, Tniocyano- oder niedere Alkoxygruppen substituierten Kohlenwasserstoffcarbonsäure mit 2 bis l8 Kohlenstoffatomen oder die Gruppe -SOpR bedeutet, in der R einen Methylrest oder den Rest CH,-v^_y darstellt; und worin B ein Wasserstoffatom oder einen Rest der Formel __N_r>t oder -OR¹ darstellt, worin R¹ eine Alkylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder isomere Formen davon bedeutet.
10. Derivate von Antibiotikum U-43 795 mit der Formel:

Cl.

Y— ^H

COH
CH-C —

CO₂B NHA

worin A und B die in Anspruch 9 angegebene Bedeutung haben.

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11. Derivate von Antibiotikum U-¹J3 795 mit der Formel

worin A und B die in Anspruch 9 angegebene Bedeutung haben.
12. Verfahren zur Herstellung und Isolierung von Antibiotikum U-¹J 3 795, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces sviceus auf übliche Weise züchtet und sodann zwecks Isolierung aus der Fermentationsflüssigkeit und Abtrennung von dem gleichzeitig gebildeten Antibiotikum AT-125 (a) die Fermentationsflüssigkeit filtriert; (b) die filtrierte Flüssigkeit an einem Ionenaustauscherharz absorbiert; (c) das Ionenaustauscherharz eluiert und die Eluate des Ionenaustausches auffängt; (d) die Eluate des Ionenaustausches unter Verwendung eines schwach basischen Polyaminharzes vom Typ Styrol-Polyamin chromatographiert und die gegenüber Bacillus subtilis wirksamen Fraktionen isoliert; (e) die gegenüber Bacillus subtilis wirksamen Fraktionen einer Silikagel-Chromatographie unterwirft und (f) aus der SiIikagel-Chromatographie relativ reine Präparate von U-*13 795 und Antibiotikum AT-125 isoliert.

Für: The Upjohn Company

Kalamazoo, Mich., V.St.A.

Dr.H.phr.Beil Rechtsanwalt

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