PL71341B1 - - Google Patents

Description

Sposób wytwarzania nowej aktywnej substancji przeciwrakowej Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowej aktywnej substancji przeciwrakowej.Dotyicfnczas jako czynniki przeciwrakowe opisa¬ no Mika substancji syntetycznych, wyciagi po¬ chodzenia zwierzecego i roslinnego oraz substancje uzyskane z bakterii. Te ostatnie otrzymano w spo¬ sób nastepujacy. Mikroorganizmy hodowano na pozyiwice, nastepnie wydzielano z niej substancje aktywna, która poddawano zabiegom oczyszczaja¬ cym.Srodki te jednak nie sa zadowalajace, gdyz dzialaja nie tyllko na rakowate komórki, ale takze uszkaldizaja zdrowa tkanke.Celem wynalazku jest wytworzenie takiej sub¬ stancji przeciwrakowej, która powodowalaby tylko obumieranie (nekroze) komórek rakowaltych, nie uszkadzajac komórek zdrowych.Stwierdzono, ze taka aktywna substancje o selek¬ tywnyim oddzialywaniu, tylko na komórki rakowa¬ te, wytwarza nowy szczep bakterii z gatunku La- ctabaicillus, który zdeponowano w Ministerstwie Higieny i Ubezpieczen Spolecznych, Instytucie Kontroli Leków, Sofiia, Bulgaria pod numerem La- citobacilhis Bulgaricus Tuimoronecroticans LB5J1- Lm/05.Nowa substancja przeciwrakowa wytworzona sposobem wedlug wynalazku jest calkowicie od¬ mienna swoim dzialaniem biologicznym oraz w swej naturze Chemicznej od wszystkich dotychczas znanych substancji przeciwrakowych, przy czym atakuje wylacznie komórki rakowate. 10 15 20 25 2 Nowa substancja przeciwrakowa hamuje rozwój nowotworów oraz wykazuje silne dzialanie nekro¬ tyczne na nowotwory. Zastrzyk dozyilny substancji moze doprowadzic do calkowitego zniszczenia na¬ wet duzych guzów nowotworowych oraz do calko¬ witego wyleczenia prawie polowy sposród leczonych zwierzat, podczas, gdy znane substancje przeciw¬ rakowe tyflko wówczas wplywaja hamujaco na rozwój nowotworu, gdy sa zastosowane bezposred¬ nio po zaszczepieniu nowotworu.Nowa substancja przeciwrakowa dziala pobu¬ dzajaco na zwiekszenie odpornosci organizmu.Zaobserwowano zmiany w rakowatych tkankach juz w 8 godzin po zastnzyknieciu dozylnymi sub¬ stancji przeciwrakowej. Badania mikroskopowe wykazaly, ze substancja dziala wylacznie na rako¬ wate komórki, nie dzialajac przy tym na naczynia krwionosne oraz inne normalne tkanki. Substancja pobudza szpik kostny i czynnosc hemopoezy, pod¬ czas gdy inne preparaty przeciwrakowe czynnosc te hamuja.Powyzsze fakty wykazuja, ze substancja przeciw- rakowa rózni sie znacznie od znanych substancji tego rodzaju i jej struktura chemiczna potwierdza to calkowicie.W tablicy 1 pokazano róznice dzialania substan¬ cji piTzeciwrakowych otrzymanej sposobem wedlug wynalazku oznaczonych literami C, D, E — i dwóch znanych substancji — „Endoksan" i „Mitomycyna C". 7134171 341 Tablica 1 Myisizy: zaszczepienie sarkomy 180 Selekcja sarkomy dolbnze rozwinietej w 8 dni po zaszczepieniu i podzial na jednakowe glmpy eksperymentalne Dawka dozylnie dni podawania 8 ¦ 8 9 10 11 12 13 18 A „Endokteam" (1) 0,5 mg 0,5 mg 0,5 mg 0,5 mg 0,5 mg 0,5 mg 0,5 mg B „Mitomycyna" (1) 0,010 mg 0,010 mg 0,010 mg 0,010 mg 0,010 mg 0,010 mg 0,010 mg C D D Substancja aktywna wedlug wynalazku 20 mg 20 mg 20 mg 20 mg 20 mg 2 mg 2 mg 2 mg 2 mg 2 mg 0,200 mg 0,200 mg 0,200 mg 0,200 mg 0,200 mg Wyniki w 22 dni po zaszczepieniu Wyssdrowialo Nie wyzdrowialo Niezywe Ogólem A Ilosc 1 24 0 25 % 4 96 0 100 B Ilosc 0 21 4 25 % 0 84 16 100 C Ilosc 19 4 2 25 % 76 16 8 100 D Ilosc 16 9 0 25 % 64 36 0 100 E Ilosc 12 13 0 25 % 48 52 0 100 Substancja przeoiwrafeowa nie ma wlasciwosci baktertobójczych i jest calkowicie odmienna od substancji antyibakteryjnych produkowanych przez paleczki z gatunku Lactobacilluls i opisanych przez Bagdanowa (Geuvres scienitifiques de ISUL, Insiti- tut de speciaOliization et perfetiónnement des mede- cins, 2, 1952, str. 131^139), Whenter'a Hirach'a Mattick'a (Nature 1952, 1om 168, str. 659) i James VinJcont Co. (Bacteriology, 1959, str. 477^84). Nie ma ona nic wspólnego z kwasem mlekowym, któ¬ remu V. Canrninati przypisuje dzialanie przeciw- 65 rakowe (Boli. Imst. Sierdterap. Milanese 12, 1933, str. 205—220).Nowy szczep jest utworzony przez paleczki gram dodatnie o wielkosci 5 i 7 mikronów, ulozone w grupach lub lancuchach o róznych dlugosciach w zaleznosci od pozywki. Mozna go wyodrebnic z jogurtu, w srodowisku zawierajacym agar.W kuttuiracih miekkich daje on osad miekki, pod¬ czas gdy w srodowisku zawierajacyim agar tworzy male wlókniste kolonie.Charakterystyki: morfologiczna, biologiczna, fizjo¬ logiczna, przedstawiono w tablicy 2.71341 Tablica 2 1 1 2 3 1 4 5 6 7 8 9 Obserwacje mikroskopowe Pozywka kultury Nr temp. 37T! Zelatyna utrwalona Kultura na mleku Kultura sprzyjajaca wzrostowi Kultura na roztworze glukozy w temp. 37°C Kolonie na glukozieagainze w temp. 37°C Kultura na glukozieagarze w temp. 37°C Kultura na glukozie utrwalonej w temp. 37^C Wlasciwosci fizjologiczne 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1,1 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Paleczki Ruchliwosc Enidospory Wytwarzanie zarodników Zabiarwienie gram Zdolnosc rozpuszczania Koagulacja Reakcja mleka na papierek lakmusowy Pozywka kultury Nr Zmetnienie Opadanie Postac opisana w tekscie Wzrost Wzrost Zmniejszenie azotanów Kataflaza Temperatura wizorstu Optymalna tempe¬ ratura wzorsttu Potrzebny tlen 23^-37°C 25—45°C 30—50°C 40^_60°C 25^37°C 30—40°C 32—45°C 35-h50°C Aoserobiosa Skret optyczny kwasu mlekowego Cukry Potnzebmy aminokwas Potrzebna witamina Glukoza Manrooza Sacharoza Laktoza Maltoza Skrobia Insulina Melecytoza L-aspargina L-triptofan Czynnik Bac. Bul- garicus +5-^19u — — — + — + R 11 — + + + + — + + + DC—) -j- + + + + — — — + | + | +71341 8 Jako substancje wyjsciowa stosuje sie komórki bakteryjne pochodzace od mfikatoarganSzniów ma¬ cierzystych, jak równiez komórki bakteryjne liofili¬ zowane, odtluszczone suche komórki bakteryjne, komórki bakteryjne z których uprzednio elimino¬ wano pewne ciala zbedne oraz preparaty substancji przeciwrakowej, uzyskane droga chemicznego ooczyszczania.Substancja pizeciwrafcowa otinzyimaina w sposób opisany powyzej rozpuszczalna jest w wodzie obo¬ jetnej lub alkalicznej, przy czyim straca sie przy wartosci pH nizszej od 4. Substancja ta praktycz¬ nie nie rozpuszcza sie w rozpuszczalnikach orga¬ nicznych takich, jak alkohol, aceton, octan etylowy, eter, benzen, cMoroform, eter naftowy. Nie diali¬ zuje sie w wodzie poprzez menubrane celofanowa.Substancja przeciwrakowa traci dzialanie przeciw¬ rakowe pod wplytwem podgrzewania jej do tem- peraitury 120^C w czasie 10 minut w obojetnym roztworze wodnym. Traci ona swoja aktywnosc w temperaturze otoczenia w roztworze alkalicznym.Najbardziej charakterystyczna wlasciwoscia sub¬ stancji przeciwrakowej jest jej biologiczne dziala¬ nie przeciwrakowe. Gdy zastrzyk dozylny odipo- wdedniej dawki tej substancji daje sie myszom, które maja sarkomy Krocfcera (Sarkoma 160) w pelni rozwoju w skórze lufo tez raki sródskórne ErJMha, wówczas powstaje wyraznie zaznaczona nekroza prawie wszystkich guzów nowotworowych, a w ciagu kilku dni nasitetpnych^ prawie polowa zwierzat calkowicie zostaje wyleczona.Powyzsze wlasciwosci substancji pnzeciwirakowej pozwalaja wnioskowac, ze posiada ona zlozona bu¬ dowe czajsiteczki. Rózni sie ona swymi wlasciwos¬ ciami od wszystkich znanych dotychczas srodków przeciwrakowych.Liczne analizy chemiczne substancji przeciwra- kowej wykazaly, ze ma ona zlozony sklad chemicz¬ ny oraz, ze zawiera takze kwas ryfoonukleinowy, którego wlasciwosci chemiczne i fizyczne moglyby pozwolic na okreslenie charaktteru substancji pffzeciwrakowej.Na przyklad fig. 1 przedstawia widmo ultrafio¬ letowe, a fig. 2 widmo podczerwone substancji przeoiwrakowej. Fig. 3 i 4 przedstawiaja wiidmo ultrafioletowe i podczerwone kwasu rylbonukleiino- wego, który zawiera substancje przeciwirakowa.Mozna zauwazyc, ze na fig. 3 przy stezeniu kwasu rytooniukleinowego 0,00)11% maksimum absorpcji jest przy 258 mikronach i tak samo jest dla sub¬ stancji przeciwrakowej (fig. 1).Kwas rybonukieiniowy, który wchodzi w sklad substancji przeciwa-akowej zawiera jako sól sodu: wegiel wodór azot fosfor — 33,35% — 4,43% — 13,70% — 9,80% Po hydrolizie analiza chromatograficzna weglo¬ wodanów za pomoca metody rozpuszczonego buta¬ nolu : propanofliu : wody w stosunku 1 : ii : 1, wy¬ kazuje plazme 0,35 HF, która odpowiada ryibozie.Sposób wytwarzania nowej aktywnej substancji przeciwirakowej wedlug wynalazku polega na tym, ze mikroorganizm Lactolbacilllus Buligaricus Tuimo- roneeroticans LB51—lni/65 poddaje sie hodowli 5 w warunkach beztlenowych, w temperaturze 28— 509C, w ciagu 18—24 godzin, w srodowisku odzyw¬ czym zawierajacylm przynajmniej jedna z takich substancji jak wyciag z soi, pepton, wyciag z droz¬ dzy, wyciag z kukurydzy, wyciag z miesa, glikoza, 10 maltoza, laktoza, sacharoza, dekstryna i melasa oraz sole nieorganiczne, nastepnie rozbija sie ko¬ mórki bakteryjne, po czym aktywna substancje przeciwrakowa ekstrahuje sie za pomoca wody lub fenolu i wytraca z wyciajgu. 15 Hodowla kultur i otrzymywanie substancji przeciwrakowej wytwarzanej przez bakterie La- otobaoillus Rulgairiiouls Tumoronecroticans LB51— lm/65 uzalezniona jest od rodzaju pozywki. Mozna Stosowac pozywki zawierajace rózne czynniki od- 20 zywcze. Jako zródlo azotu mozna stosowac pepto¬ ny, wyciagi z miesa, kukurydzy, soi, drozdzy itp., a jako zródlo wegla glukoze, maltoze, laktoze, sacharoze, melase itp. Jako zródlo fosforu stosuje sie hydrolizaty drozdzy, fosfaty itp. Jako substancje 25 odzywcze mozna stosowac co najmniej jeden zwia¬ zek z grupy zawierajacej azot i wegiel. Stwierdzo¬ no, ze przez dodanie malych ilosci soli nieorga¬ nicznych, takich jak fosforan sodiu i fosforan potasu, siarczan magnezu i inne, zwieksza sie 30 dzialanie przeciwrakowe.Hodowla kultur moze byc prowadzona w wa¬ runkach beztlenowych, bez doplywu powietrza, w temperaturze w granicach 45—35°C, która oka¬ zala sie najkorzystniejsza wówczas, gdy byla 35 stosowana przez okres 18—24 godzin.W czasie fermentacji wartosc pH kultury bakte¬ ryjnej spada do 3,8. W tym czasie nie jest koniecz¬ ne kontrolowanie pH.W czasie fermentacji substancja przeciwrakowa 40 gromadzi sie zwlaszcza w komórkach bakteryjnych.W przypadku, gdy wytwarza sie autoliza ko¬ mórek bakteryjinyich, dzialanie przeciwrakowe jest równoczesnie stwierdzone w kulturach plynnych.Substancja przeciwrakowa moze byc ekstrahowana 45 woda po zniszczeniu blony komórek bakteryjnych.Z chwila zakonczenia fermentacji substancja przeciwrakowa zawarta w komórkach bakteryjnych moze byc ekstrahowana i oczyszczona róznymi spo¬ sobami. 50 Oczyszczenie obejmuje co najmniej operacje ekstrakcji i operacje stracania, które moga byc stosowane same lub szereg razy w róznych kombi¬ nacjach, jak przedstawiono w nastepujacym sche¬ macie: 55 E — ekstrakcja E^P P — stracanie E — P — E E—P—E—P E —P —E —P —E —P itd. 60 Ekstrakcje substancji rakowej przeprowadza sie za pomoca co najmniej jednego z rozpuszczalników z grupy wody i fenolu. Pierwotna substancje w postaci ciala stalego uzywa sie przy wyciagu wod- 6g nym, podczas gdy dla ekstnakcji za pomoca fenolu9 mozna sie poslugiwac roztworem wodnymi sub¬ stancji pmzeciwrakiowej lub tez tkanki, które ja zawieraja.Jatko ciala stale zawierajace substancje przeciw- rakowe nalezy wymienic komórki bakteryjne w stanie naturalnym, komórM bakteryjne suche od¬ tluszczone, komórki bakteryjne wyekstrahowane uprzednio w celu usuniecia cial zbednych oraz ciala suche otrzymane jako produkty ekstrakcji i stracania, opisane pózniej.Wyciag wodny uzyskuje sie mieszajac wode oraz ciala zawierajace substancje pmzeciwrakowa. Gdy ciala te sa utworzone z komórek bakteryjnych, trzeba je rozczlonkowac za pomoca homogenizato- ra, mlyna koloidalnego, ultradzwieków lub enzy¬ mów, takich jak lizozyim, pepsyna i inne. Miesza¬ nine przefiltrowuje sie luib odwirowuje w celu usuniecia materialów nierozpuszczalnych. Wówczas wieksza czesc wlasciwosci przeciwrakowych prze¬ chodzi do wyciagu wodnego. Ekstrakcja wodna za¬ chodzi w temperaturze od 0°C do 18°C. Korzystnie jest, aby wartosc pH wiody wynosila od 4—9. War¬ tosc pH nizsza wywoluje stracanie, podczas gdy wartosc pH wyzsza czyni substancje przeciwrakowa nieaktywna. Dodanie fosforanu oraz 0,01 mola siarczanu magnezu poprawia wlasciwosci wyciagu wodnego.Proces ekstrahowania fenolem moze byc prowa¬ dzony aiUbo przez ekstrakcje cial stalych 96% fe¬ nolem lub przez dodanie równej ilosci 96% fenolu do roztworów wodnych lub do zawiesin zawieraja¬ cych substancje przeciwrakowa.W obydwu przypadkach, po energicznym wstrza¬ saniu mieszanin, odwirowuje sie je w celu oddzie¬ lenia warstwy fenolu, osadu nierozpuszczaiLnego oraz warstwy wody. Substancja przeciwrakowa przechodzi do fenolu i oddziela sie za pomoca pro¬ cesów opisanych ponizej. Ekstrakcje fenolem pro¬ wadzi sie w temipieratuirze od 4—'70°C.Proces stracania substancji przeciwrakowej pro¬ wadzi sie za pomoca dodania róznych soli, roz¬ puszczalników organicznych rozpuszczalnych w wo¬ dzie i/lub kwasów. Te procesy stracania moga byc prowadzone na wyciagach wodnych oraz na wy¬ ciagach fenolowych.Gdy proces stracania prowadzi sie za pomoca dodania róznych soli, wówczas zaleca sie zwlaszcza siarczan amonowy, chlorek amonowy, siarczan so¬ dowy, chlorek wapnia lub siarczan magnezu. G*dy stosuje sie siarczan amonowy, ilosc zalezna jest od nasycenia, jakie chce sie osiagnac, a które po¬ winno zawierac sie miedzy 0,1 i 0,8. Substancja przeciwrakowa przechodzi do osadu. Reszte soli osadu eliminuje sie za pomoca postepowania takie¬ go jak dializa, przesaczenie za pomoca „sephadeK^" lub rozpuszczenie, a nastepnie powtarza sie proces stracania przy uzyciu kwasu.Gdy stracanie prowadzi sie za pomoca rozpusz¬ czalników organicznych rozpuszczalnych w wodzie, mozna stosowac metanol, etanol, aceton itp. Ko¬ rzystne jest stosowanie od jednej do trzech obje¬ tosci rozpuszczalnika na jedna objetosc roztworu podstawowego. 341 10 W przypadku stracania za pomoca kwasów, ko¬ rzystne jest aby wartosc pH wynosila od 1,5—4.Do tego celu mozna stosowac kwasy nieorganiczne, takie jak kwas chlorowodorowy, kwas siarkowy, 5 kwas fosforowy oraz kwasy organiczne, takie jak kwas octowy, kwas szczawiowy itp.Komórki bakteryjne rozbija sie w homogeniza- torze, mlynie koloidalnym za pomoca uO/tradzwie- ków, bialka jaja, liaozymu lub enzymów proteoM- 10 tycznych takich, jak pepsyna i trypsyna.Do ekstrakcji substancji przediwrakowej mozna uzywac bialko jaja kurzego i enzymy, przy czym enzymy nie wchodza w reakcje chemiczna z sub¬ stancja czynna. Wplywaja one jedynie na usuniecie materialów zbednych i nie maja zadnego zwiazku z dzfralaniem przeciwrakowyim.Enzymy stosuje sie kolejno w róznych komflbd- nacjach w zaleznosci od celu, jaki chce sie osiag- 20 nac, korzytetnie jest stosowac nastepujaca kolejnosc: lizozyim, pepsyna, trypsyna i pepsyna.Przyklad I. LactobacMus bulgaricus var. tu- moronecroticans LB51—lm/65 zaszczepiono na po- 25 zywce w ilosci 200 ml, zawierajacej 3% wyciajgu z soi, 0,5% peptonu, 0,5% wyciagu z miesa, 0,5% wyciajgu z drozdzy, 0,5% sacharozy i 0,1% sftancza- nu magnezu. Hodowle prowadzono w temperaturze 37°C w czasie 24 godzin. Wartosc pH kultury bak- 30 teryjnej doprowadzona zostala do 6,5 nastepnie kulture odwirowano do 5000 g przez okres 30 mi¬ nut.Ciecz powierzchniowa 1 zostala zastrzyknieta do¬ zylnie w ilosci 0y5ma myszom z sarkoma 180 w 35 stadium rozwoju, zaszczepiona podlskórnie. Nie wy¬ stapila jakakolwiek nekroza guza nowotworowego u zadnej z 20 leczonych myszy. Osad 2 komórek bakteryjnych zmielono z piaskiem z kwarcu w mozdzierzu i wyeksitraihowano za pomoca 100 ml 40 wody destylowanej. Mieszanine odwirowano do 5000 g i dawke 0,5 mi cieczy powiercoohniowej 3 zastrzyknieto dozylnie myszom z sarkoma 180. Po 24 godzinach zaobserwowano obumarcie guza no¬ wotworowego u 17 sposród 20 leczonych myszy, 45 a w 10 dni pózniej 8 myszy zostalo calkowicie wyfleczonych.Przyklad II. Lactóbacillus bulgairicus var. tu- moronecroticans LB51—lm/65 zaszczepiono na po- 50 zywce w ilosci 1200 litrów mieszanki skladajajcei sie z 3% wyciagu z soi, 0,5% wyciagu z miesa, 0,5% peptonu, 2% melasy, w przeliczeniu na cu¬ kier, 0,1% siarczanu magnezu i 1200 litrów wody z rurociagu. Kulture hodowano w temperaturze 55 37°C w czasie 24 godzin. pH kultury wynosilo 6,5.Nastepnie kulture odwirowano, osad przemyto 50 objetosciami roztworu fizjologicznego i ponownie odwirowano. Otrzymano 14,200 gramów naturalnych wilgotnych komórek bakteryjnych. 60 5,000 g tych komórek bakteryjnych rozcienczono 15000 mililitrami wody i rozczlonkowano w homo- genezatorze. Itoodutot ^homogenizowany odwirowa¬ no do 5.000 g i ciecz powierzchniowa 1 oddzielono. 10 miliflitrów tej cieczy rozcienczono woda desty- 65 lowana do stezenia wynoszacego 8 mg substancji/ 11 100 mdMitrów cieczy powiea^cliniiowej 1 liofiGizo- rnefto dozylnie myszom z sarkoma Krockera roz¬ winieta. Zaznaczyla sie znaczna nekroza guza u 19 sposród 20 leczonych myszy, z których 12 zostalo w nastepstwie calkowicie wyleczonych. 100 mffiiljrów cdeozy powierzchniowej 1 liofilizo¬ wano. Analiza caheniiczna substancji zliofilizowanej wykazywala sklad nastepujacy. 9,5% kwasu nuklei¬ nowego i 70% proteiny.Przyklad III. Dodano 3000 mililitrów cieczy 1, takiej sarniej jak w przykladzie II do 6000 mili¬ litrów 90% etanolu. Ultazyimano mieszanine przez 2 godziny w temperaturze 4°C, a nastepnie odwiro¬ wano.Ciecz powierzchniowa oddzielono zas osad 3 rozpuszczono w 600 ml wody, nastepnie odwirowa¬ no w celu usuniecia zbednych pozostalosci. Roz¬ twór czysty 4 rozdzielono na trzy czesci równe dla dalszej obróbki. 200 mililiitrów roztworu 4 zakwaszono kwasem cMorowodorowymi do pH=2. Osad 5 oddzielono przez odwirowanie. Ciecz powierzchniowa 6 rów¬ niez oddzielono. Osad przemyto etanolem i aceto¬ nem i nastepnie osuszono. Otrzymano 9,4 g suchej substancji. 30 miligramów tej substancji rozpusz¬ czono w 15 mililitrach wody a nastepnie dawke 0,5 nil zastrzyknieto dozylnie myszom z sarkoma 180.Wystapila nekroza roztworu u 17 sposród '18 leczo¬ nych myszy, z których 10 calkowicie w nastepstwie wyzdrowialo. Wyniki analizy wykazaly obecnosc 13,7% kwasu nukleinowego i 74% proteiny.Przyklad IV. 200 mililiitrów roztworu 4, ta¬ kiego sarniego, jak w przykladzie III zmieszano z siarczaneni amonu do nasycenia 0,4 i umieszczo¬ no w chlodziarce na przeciag 2 godzin w tempe¬ raturze 4°C, nastepnie mieszanine odwirowano.Ciecz powierzchniowa oddzielono i osad rozcien¬ czono w 50 mililiitrach wody do pH=2, a nastepnie ponownie odwirowano. Ciecz powierzchniowa usu¬ nieto i osad rozpuszczono w wodzie, do której doda¬ wano sody, az do osiagniecia pH=7. Roztwór pod¬ dano dializie poprzez „celofan" w wodzie biezacej w czasie 18 godzin. Ciecz zdializowana odwirowa¬ no w ceflu oddzielenia malej ilosci nierozpuszozo- nej (zbednej) pozostalosci, a nastepnie liofilizowano.Otrzymano 7,4 g suchej substancji. Badanie dziala¬ nia przeoiwrakowego, przeprowadzone w ten sam sptosób, jak w przykladzie III, doprowadzilo do nekrozy nowottworu u wszystkich 20 leczonych zwierzat, z których 12 w nastepstwie calkowicie zostalo wyleczonych.Przyklad V. Do 200 mililitrów roztworu 4 takiego samego, jak w przykladzie III, dodano 2 mMilitry 20% roztworu chlorku wapnia. Osad 1 oddzielono przez odwirowanie. Ciecz powierzchnio¬ wa 2 zakwaszono kwasem chlorowodorowym do pH=2. Nowy osad oddzielono przez odwirowanie i (Siecz powierzchniowa 4 usunieto. Osad 3 rozpusz¬ czono w wodzie, do której dodawano sody az do osiagniecia pH=7. Nastepnie osad poddano liofili- zie. Otrzymano 3,2 g suchej substancji. Dawka jed- L341 12 nomiligramowa na kazda mysz doprowadzila do calkowitej nekrozy nowotworu u wszystkich leczo¬ nych myiszy. Wyniki analizy wykazaly obecnosc 14,3% kwasu niukUeinowego i 69% proteiny. 5 Osad 1 rozcienczono 50 mililj.itrami wody i do¬ dano 3 g amberlitu. Mieszanine odwirowano i ciecz powierzchniowa zliofildzowano. Otrzymano 7,4 g suldhejj sulbatanoji. Dawka 1 rniiligramowa na mysz tej substancji, wywolala gleboka nekroze nowo- 10 tworu u wszystkich 20 leczonych zwierzat, z któ¬ rych 11 zostalo calkowicie wyleczonych.Wyniki analizy wykazaly obecnosc 11,9% kwasu nulkUeinowago i 70% proteiny. 15 Przyklad VI. 1000 ml cieczy powierzchniowej 1, takiej samej, jak w przykladzie II zakwaszono kwasem chlorowodorowym do pH=2. Osad oddzie¬ lono przez odwirowanie i rozpuszczono w 100 mi¬ lilitrach wody, do której dodawano sody az do piH=7. Roztwór wmieszano z dwiema objetosciami 98% etanolu. Osad oddzielono przez odwirowanie, nastepnie przemyto etanolem i acetonem i osuszo¬ no. Obrzymano 7,2 g suchej substancji Dawka 1 miligrama na mysz wywolala nekroze nowotworu u 20 leczonych zwierzat, z których 13 zostalo cal¬ kowicie wytleazonych. Wyniki analizy tej substancji wykazaly obecnosc 10,8% kwasu nukleinowego i 74% proteiny. 30 Przyklad VII. Do 1000 mililitrów cieczy po- wierzchmiiowej, takiej saimej jak w przykladzie II, dodano siarczanu amonu do nasycenia 0,4. Osad odwirowano i rozpuszczono w wodzie. Roztwór za- n kwaszono kwasem chlorowodorowym az do pH=2. 35 Osad rozpuszczono w wodzie, zobojetniono do pH = 7, nastepnie liofilizowano. Otrzymano 8,2 g suchej substancji. Dawka 1 mg na mysz doprowadzila do nekrozy guza u 18 leczonych myszy, z których 12 w nastepsitwie zostalo wyleczonych.Wyniki analizy wykazaly 9,9% kwasu nukleino¬ wego i 77% proteiny.Przyklad VIII. Do 1O00 mililitrów cieczy po- 45 wiiarzahiniowej 1, takiej samej jak w przykladzie II, dodano 10 mililitrów 20% roztworu chlorku wap¬ nia. Osad odwirowano i rozpuszczono w 100 mili¬ litrach wody destylowanej. Do tej zawiesiny do¬ dano 3 g ambeiiiiki. Po energicznym wstrzasaniu 50 mieszanine odwirowano i ciecz powierzchniowa liofilizowano. Otrzymano 6,8 g suchej substancji.Dawka 1 mg na mysz wywolala znaczna nekroze nowotworu u kazdej z 24 leczonych myszy, z któ¬ rych 11 calkowicie w nastepstwie wyzdrowialo. 55 Wyniki analizy wykazaly Obecnosc 12% kwasu nukleinowego i 69% proteiny.Przyklad IX. 500 mililitrów cieczy powierzch¬ niowej 1, takiej samej jak w przykladzie II, zmie- 60 szano z 500 milliMitraini 90% fenolu. Mieszanine energicznie wstrzasano przez 1 godzine w tempe¬ raturze 4°C i odwirowano do 5000 g przez 30 minut.Faze wody i fenolu oddzielono.Faze wody zakwaszono kwasem cMorowodoro- 65 wym do pH=2. Osad oddzielono przez odwirowa-71341 13 nie, nastepnie przemyta etanolem i acetonem i w koncu osuszono. Otrzymano 1,8 g suchej substancji.Dawka 2 mg na mysz wywolala nekroze nowotworu tylko u 12 sposród leczonych myszy, z których je¬ dynie 5 calkowicie wyzdrowialo.Faze fenolu zmieszano z octanem sodu do 1% stezenie, po czym dodano 4 objetosci etanolu. Osad odwirowano, przemyto etanolem i acetonem, a na¬ stepnie osuszono. Otrzymano 6,4 g suchej substancji.Dawka 1 mg na mysz wywolala nekroze nowo¬ tworu u 20 leczonych zwierzat, z których 12 zosta¬ lo w nastepstwie calkowicie wyleczonych.Wyniki analizy tej substancji wykazaly obecnosc 7,9% kwasu nukleinowego i 84% proteiny.Przyklad X. 100g wilgotnych komórek bak¬ teryjnych w stanie naturalnym, takich jak w przy¬ kladzie II, zmieszano z 1000 miliildtrarmi 90% fenolu swiezo zdestylowanego. Mieszamine wstrzasano przez 1 godzine w temperaturze lO^C, nastepnie od¬ wirowano. Warstwe fenolu oddzielono. 100 mdili- litrów tej wartetwy zmieszano z 1% octanem sodo¬ wym i 4 objetosciarnd 96% etanolu. Osad otrzymano odwirowano, przemyto etanolem i acetonem, na¬ stepnie osuszono. Otrzymano 3,2 g suchej substancji.Dawka 2 mg na mysz wywolala nekroze nowotwo¬ ru u 20 leczonych myszy, z których 9 w nastepstwie calkowicie zostalo wyleczonych.Przyklad XI. 500 g wilgotnych komórek bak¬ teryjnych, takich jak w przykladzie II, rozcienczo¬ no 1000 mifliililtrami wody i dodano nastepnie 1000 milililirów 90% fenolu. Mieszanine wstrzasano przez 1 godzine w temperaturze 4°C i nastepnie odwiro¬ wywano przez 30 minut do 5000 g. Faze wody 1 i faze fenolu 2 oddzielono. Do fazy wodnej dodano 1% oobanu sodu i nastepnie 2 objetosci etanolu.Mieszanine odwirowano. Ciecz powierzchniowa 2 usunieto. Osad 4 rozpuszczono w 50 mtililitrach wo¬ dy, do której dodawano sode w celu doprowadze¬ nia do pH=7. Nastepnie roztwór zakwaszono kwasem chiloroWoidorowym do pH=2. Mieszanine odwirowano. Oiecz powierzchniowa 5 oddzielono i osad 6 rozpuszczono ponownie w 50 miliMitrach wody, do której dodawano sode, a nastepnie za¬ kwaszono kwasem cMonowodorowym az do uzyska¬ nia pH=2 i odwirowano. Ciecz powierzchniowa usunieto i osad 8 przemyto etanolem i acetonem, nastepnie rozpuszczono w 20 miliilitrach wody, do której dodawano sode w celu doprowadzenia do pH=7 i liofilizowano. Otrzymano 0,8 g suchej sub¬ stancji. Dawka ling tej substancji na mysz wy¬ wolala calkowita nekroze nowotworu u 20 leczo¬ nych myszy, z których tylko 5 w nastepstwie zo¬ stalo calkowicie wyleczonych.Faze fenolu 2 sitrajcono 4 Objeitosciami etanolu.Osaid przemyto etanolem i acetonem a nastepnie osuszono. Dawka lmg tej substancji na mysz wy¬ wolala nekroze nowotworu u 22 leczonych myszy, z których 10 calkowicie w nastepstwie zostalo wy¬ leczonych.Przyklad XII. 10 g komórek bakteryjnych liofilizowanych rozcienczono 100 ml wody. Dodano 14 25 do tego 100 mg liizozytmy. Mieszanine ciagle wstrza¬ sano przez 3 godziny w temperaturze 37°C i otrzy¬ mano calkowita homogenizacje. Mieszanie odwiro¬ wano do 10 000 g przez okres 1 godziny. Ciecz 5 powierzchniowa 1 liofilizowano. Dawka 2 mg na mysz wywolala nekroze nowotworu u 17 z 20 le¬ czonych myszy. Osad 2 ponownie rozpuszczono w wodzie zakwaszonej kwasem chlorowodorowym do pH=2 i dodano 100 mg pepsyny. Mieszanine io utrzymano przez 2 godziny w temperaturze 37°G, a nastepnie ja odwirowano. Ciecz powlerztohniowa 3 usunieto. Osad 4 rozpuszczono w wodzie zobojet¬ nionej do pH=7. Po ponownym odwirowaniu osad 5 oddzielono, podczas gdy ciecz powierzchniowa 6 is liofilizowano.W wyniku nastapila calkowita nekroza nowo¬ tworu u wszystkich leczonych myszy za pomoca zastrzykniecia dawki 1 mg. 20 Przyklad XIII. 4800g w stanie naluirailnyni, wilgoibnych komórek bakteryjnych LacAobaiciillus bulgaricuis var. tumoronecroticanB IiB51^1m/85 rozcienczono 2000 ml bialka kurzego dodajac roz¬ twór soli do uzyskania calkowitej objetosci 14000 ml. Zawiesine utrzymywana w temperatturze 37°C poddano ciaglemu wstrzasaniu przez 3 godziny, po czym mieszanine zakwaszono kwasem chlorowodo¬ rowym do pH=2.Do lOOOml mieszaniny 1 dodano Ig pepsyny mieszajac wszystko stale przez 4 godziny i utrzy¬ mujac w temperaturze 37°C. Nastepnie za pomoca sody doprowadzono do pH=7. Dodano do tego jeszcze Ig tnipsyny „Diifico". Obróbke trypsyna prowadzono przez 12 godzin w temperaturze 37°C ciagle wstrzasajac, przy czym dodawano chloro¬ form. 500 ml mieszaniny obrobionej w taki sposób, od¬ wirowano z szybkoscia 8000 abr/mdn. w czasie 30 40 minut. Osad nie calkowicie zekstrahowanych po¬ zostalosci 2 przemyto alkoholem a nastepnie osu¬ szono. Otrzymano 5g suchej substancji. Ciecz po¬ wierzchniowa 3 zmieszano z równa objetoscia alko¬ holu. Osad otrzymany odwirowano z szybkoscia 45 2700 obr/min. przez 15 minut, nastepnie rozpusz¬ czono go w niewielkiej liilosci wody zlioffiilizowanej.Otrzymano 3500 mig suchej substancji. Analiza wy¬ kazala obecnosc 62% proteiny i 13,54% kwasu nukleinowego. 50 Dawka 4 mg zafitrzyiknieta dozylnie myszom z dobrze rozwinieta sarkoma 180, wywolala glebo¬ ka nekroze nowotworu u wszystkich 10 leczonych zwiierzajt. 55 Przyklad XIV. 13 000 ml mieszaniny 1, takiej samej jak w przykladzie XIII odwirowano z szyb¬ koscia 8000 obr/min. w czasie 30 mdnut. Ciecz powierzchniowa 1 oddzielono. Osad 2 poddano trzy¬ krotnie odtluszczeniu mieszanina o równej objetosci 6o alkoholu i eteru. Po odparowaniu rozpuszczaHnika otrzymano 544 g suchej substancji 3.Przyklad XV. 10g substancji 3, takiej samej jak w przykladzie XIV, rozcienczono 100 md roz- 65 tworu soli. Po zakwaszeniu mieszaniny kwasem71341 15 cihlorowodarx)wyim do pH=2, dodano 100 mig pepsy¬ ny. Mieszanine utrzymano w temperaturze 37°C przez 4 godzimy, ciagle ja wstrzasajac. Nastepnie mieszaninie odwirowano z szylbkoscia 2700 obr/niin. przez 15 miinut. Giecz powierzchniowa 1 oddzielo¬ no. Osad 2 rozpuszczono w wyjsciowej objetosci roztworu soli, nastepnie zobojetniono do pH=7, po czym odwirowano z szylbkoscia 8000 obr/niin. pnzez 30 minut. Osad 3 niewyekislTahowanych pozostalosci przemyto alkoholem i nastepnie osuszano. Otrzy¬ mano 3900 mig suchej substancji, której analiza wy¬ kazala obecnosc 88% proteiny i 10,09% kwasu nuk¬ leinowego.Dawka 2 mig wstrzyknieta dozylnie myszom z sar¬ koma 180 dobrze rozwinieta, wywolala gleboka nekroze nowotworów u 17 z 20 leczonych myszy.W dziesiec dni pózniej 9 zwierzat zostalo komplet¬ nie wyleczonych.Przyklad XVI. 10g substancji 3, takiej samej jak w przykladzie XIV, rozcienczono 100 ml roztwo¬ ru soli, skorygowano pH do 7 i dodano 100 mg tripsyny „Difco". Mieszanine poddano w tempera¬ turze 37^C energicznemu wstrzasaniu w czasie 4 godizin, nastepnie odwirowano ja z szybkoscia 2700 oibr/irnin. w czasie 15 minut. Osald 1 zawiera¬ jacy pozostalosci niewyekstrahowane przemyto al¬ koholem i nastepnie osuszono. Otrzymano 2550 mg suchej substancji.Ciecz powierzchniowa 2 zmieszano z równa ilos¬ cia alkoholu. W wyniku otrzymano obfity osald.Ciecz powierzchniowa 3 oddzielono po odwirowa¬ niu i osald 4 rozpuszczono w wodzie i nastepnie zliofiUilzowano. Otrzymano 2800 mg suchej sulbstan- cji, której analiza wykazala obeonosc 92% proteiny i 7% kwasu nukleinowego.Dawki 4 mg zastrzykniete dozylnie myszom z sarkoma 180 dobrze rozwinieta, spowodowaly gleboka nekroze nowotworów u 18 z 20 leczonych zwierzat. Dziesiec dni pózniej, 10 zwierzat calko¬ wicie wyzdrowialo.Przyklad XVII. 10g substancji 3, takiej samej jak w przykladzie XIV, rozcienczono 10 miMlitrami roztworu soli. Mieszanine zakwaszono az do pH=2 za pomoca kwasu chlorowodorowego i dodano do tego 100 mig pepsyny. Po 4 gdzinnej obróbce w temperaturze 37*C, mieszanine zobojetniono do pH=7 dodajac do niej 100 mig tripsyny „Difco".Mieszanine uitrzymano ponownie w temperaturze 37°C przez okres 4 godzin i odwirowano z szybkos¬ cia 8000 obr/min. przez 30 minut. Osad zawiera¬ jacy pozostalosci niewyekstrahowane 1 przemyto alkoholem i wysuszono. Otrzymano 1350 mg suchej substancji.Ciecz powierzchniowa 2 zmieszano z równa ob¬ jetoscia alkoholu i odwirowano. Giecz powierzch¬ niowa 3 oddzielono. Po rozpuszczeniu w malej ilosci wody osad liofilizowano. Otrzymano 2200mg suchej substancji, której analiza wykazala obecnosc 68% proteiny i 8,84% kwasu nukleinowego. 2 mg dawka zasitrzylknieta dozylnie myszom z dobrze rozwinieta sarkoma 180, wywolala glebo¬ ka nekroze nowofoworu u kazdego z 20 leczonych 16 15 20 30 zwierzat, a w 10 dni pózniej 8 zwierzat zostalo wyleczonych.Przyklad XVIII. 1500mg frakcji 4, takiej 5 samej jak w przykladzie XV, rozpuszczono w 45 ml roztworu soli, dodajac do tego 15 mg rekrystaflizo- wanej trypsyny. Mieszanine utrzymano w tempe¬ raturze 37X! ciagle ja wstrzasajac, przy czym okresowo korygowano pH do wairtosci wynoszacej 10 7. Po obróbce trwajacej 20 godzin, niieszanine od¬ wirowano. Osad 1 zawierajacy mewyekstrahowane ciala oddzielono. Do cieczy powierzchniowej 2 do¬ dano chlorku sodu az do 12% stezenia. "W wyniku nastapilo osadzenie sie osadu, który zostal odwiro¬ wany z szylbkoscia 2700 obr/min. w czasie 30 minut, nastepnie osad 3 rozpuszczono w wodzie i liofilizowano. Otrzymano 400 mg suchej substan¬ cji, której analiza wykazala obecnosc 11% proteiny i 0,5% kwasu nukleinowego.Nawet \ 8 mg dawka na mysz tej substancji za- strzyknieta dozylnie, nie wywolala zadnej zmiany nowotworów u 20 leczonych zwierzat.Dodano 1/2 objetosci alkoholu do cieczy po¬ wierzchniowej 4. Osad otrzymany oddzielono za pomoca odwirowania, nastepnie rozpuszczono w niewielkiej ilosci wody i liofilizowano. Otrzymano 120 mg suchej substancji 5, której analiza wykaza¬ la obecnosc 21% proteiny i 7,3% kwasu nukleino¬ wego. 4img dawka zastrzykmiejta dozylnie myszom z dobrze rozwinieta sarkoma 180 wywolala gleboka nekroze nowotworu u 18 z 20 leczonych zwierzat, a w 10 dni pózniej 8 zwierzat zostalo calkowicie wyleczonych.Przyklad XIX. 5g liofilizowanych komórek bakteryjnych Ladxbacilllus bulgaricus var. tumoro- necroticans LB51—lm/65 rozcienczono 50 ml roz- 40 tworu soli, którego pH wynosil 7. Do mieszaniny dodano 50 mg lizozymu. Obróbke lizozymem pro¬ wadzono w temperaturze 37°C wstrzasajac przez okres 2 godzin. Mieszanine zakwaszono kwasem chlorowodorowyim do pH=2 i dodano do niej 50 mg 45 pepsyny. Po 4 godzinnej obróbce w temperaturze 37^C, mieszanine odwirowano z szybkoscia 2700 obr/min. w czasie 30 minut. Ciecz powierzchniowa oddzielono.Osad 2 rozpuszczano w roztworze soli o pH=7 so i dodano do tego 50 mg tnipsyny „Difco". Po 4 godzinnej obróbce w temperaturze 37°C stale •wstrzasajac, mieszanine odwirowano z szybkoscia 27O0 obr/min. przez 30 minut. Osad niewyekstra- howanych pozostalosci 3 przemyto alkoholem i wy- 55 suszono. Otrzymano 640 mg suchej substancji.Ciecz powierzchniowa 4 zmieszano z równa ob¬ jetoscia alkoholu. Po odwirowaniu mieszaniny osad 5 rozpuszczano w malej ilosci wody i dializowano poprzez blone „celofanowa" w wodzie biezacej 60 i nastepnie liofiMzowiano. Otrzymano 500 mg suchej substancji, której analiza wykazala obecnosc 37% proteiny i 11,36% kwasu nukleinowego.Ciecz powierzchniowa 6 zmieszano z równa ilos¬ cia alkoholu i odwirowano. Osad 7 rozpuszczono 65 w niewielkiej ilosci wody i poddano dializie w17 wodzie biezacej przez okres 24 godzin, a nastepnie liaffiMaowano. Otrzymano 80 mig suchej substancji, kftórej analiza wykazala obecnosc 29% proteiny i 41,24% kwasu nukleinowego.Osady 5 i 7 wykazaly, przy 4 mg dawce, silne dzialanie nekrotyczne nowotworu u 20 leczonych mytszy. PL PL PL PL PL

Claims (7)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowej aktywnej substan¬ cji przecijwrakowej, polegajacy na hodowli mikro- arganiizmiu w pozywce i nastepnym wydzieleniu i oczyszczeniu substancji, znamienny tym, ze mik¬ roorganizm LactobacMus BuHgaricus Tumoronec- roDicans LD51—llim/65 hoduje sie w warunkach beztlenowych, w temperaturze w granicach 28— 50°C, w ciagu 18—24 godzin, w srodowisku odzyw¬ czym zawierajacym przynajmniej jedna z suibsltan- cji takich, jak wyciag z soi, pepton, wyciag z droz¬ dzy, wyciag z kukurydzy, wyciag z miesa, glikoza, maltoza, laktoza, sacharoza, dekstryna czy melasa oraz sole nieorganiczne, nastepnie rozbija sie ko- 341 18 morki bakteryjne a substancje przeedwrakowa ekstrahuje za pomoca wody lub fenolu i wytraca z wyciagu.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 5 hodowle prowadzi sie w srodowisku odzywczym zawierajacym organiczne i nieorganiczne fosforany oraz siarczan magnezu.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wyekstrahowana substancje przeciwrakowa wytra- io ca sie przez dodanie do wyfciajgu przynajmniej jed¬ nej z suibstanicji takich jak rozpuszczalne w wodzie rozpuszczalniki organiczne, sole i kwasy. 4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze do rozpuszczalnika dodaje sie kwas az do uzyska- 15 nia wartosci pH=,l,5—

4.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze komórki bakteryjne rozbija slie w homogenizaltOTBe, mlynie koloidalnym za pomoca ultradzwieków, bialka jaja, lizozyimiu lub enzymów proteolitycz- 20 nydh takich, jak pepteyina i tripsyna.

6. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze enzymy stosuje sie w nastepujacej kolejnosci: lizozym, pepsyna, trypsyna i peplsyna.KI. 30h,6 71341 MKP C12d 13/00 36 34 32 30-1 28-1 26 2^ 22 20- 18 16 14H 12 8-

7. - 6- 5H O CM r' i—i ° ? ~ II II Q I ' O. Fig. 1 Fig. 2KI. 30h,6 71341 MKP C12d 13/00 Fiq3 Fiq4 czytelnia] Urzedu Pot*nlo«ego PL PL PL PL PL