CN103265595B - 一种酿酒酵母发酵液中提取s-腺苷甲硫氨酸的方法 - Google Patents

一种酿酒酵母发酵液中提取s-腺苷甲硫氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及了一种从发酵液中提取分离S-腺苷甲硫氨酸的工艺，属于生物工程领域。通过发酵液的过滤、超声破碎、阳离子交换树脂吸附、洗脱、重结晶及真空干燥技术得到S-腺苷甲硫氨酸。本发明是一种易于操作、成本低、安全可靠的分离方法。

Description

一种酿酒酵母发酵液中提取S-腺苷甲硫氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种从发酵液中提纯S-腺苷甲硫氨酸的工艺，属于生物工程领域，具体涉及生物制药，发酵产物的提取，分离的方法，特别涉及一种从酿酒酵母发酵液中提取S-腺苷甲硫氨酸的方法。
技术背景
S-腺苷甲硫氨酸简称SAM或AdoMet，是甲硫氨酸的活性形式。SAM在室温中性或碱性环境中，只要稍微吸湿就会导致快速失活，SAM与一些大分子的阴离子结合成盐，可以提高空间位阻，增加SAM的稳定性，尤其是与水溶性电解质，如磷酸盐、聚乙烯磺酸硫酸盐、聚乙烯磺酸磷酸盐、聚苯乙烯磺酸盐等结合后所形成盐有比较好的稳定性。
SAM是生物体内重要的中间代谢物质，参与多种生化反应，主要为体内激素、神经递质、核酸、蛋白质、和磷脂的生物合成、代谢以及抗氧化剂的形成，与体内各种解毒过程关系密切，其中最重要的生理作用是转甲基作用、转丙氨基作用、转硫作用。SAM是维护细胞膜正常功能、人体正常代谢和将抗不可缺少的重要生命物质。
目前，全球每年用在治疗肝病和帕金森氏等病的SAM大约需要450～500吨左右。随着生活节奏的加快和工作压力的增加，抑郁症患者和关节炎患者也明显增多，SAM在国内的市场也非常广阔。据估算，我国SAM的年用量应在90～100吨左右。而目前对SAM的大部分研究主要集中在SAM的发酵及检测方面，很少有SAM分离的报导。因此，本领域迫切需要提供一种易于操作、成本低，安全，可靠的分离方法。
发明内容
本发明的目的是为了改进现有技术的不足而提供了一种从酿酒酵母发酵液中提取S-腺苷甲硫氨酸的方法，该方法操作方便、工艺简单、降低成本、效率高。
本发明的技术方案如下：一种从酿酒酵母发酵液中提取S-腺苷甲硫氨酸的方法，其具体步骤如下：
（1）取酿酒酵母发酵液，在发酵液中加入助滤剂，用酸调节体系pH，搅拌，将发酵液过滤，分别收集滤液和菌体；
（2）将步骤（1）所得的菌体加入容器中，加入提取剂，控制温度，搅拌，将搅拌后的菌体悬浮液用超声破碎提取，得提取液；
（3）将步骤（2）中所得提取液，离心、过滤，收集滤液；
（4）将步骤（3）中收集的滤液和步骤（1）中收集的滤液合并，用有机溶剂萃取，得萃取液；
（5）将步骤（4）中所得萃取液，先经微滤膜过滤后，再用超滤膜过滤，超滤滤液旋蒸浓缩，得浓缩液；
（6）将步骤（5）所得浓缩液转移到装有阳离子交换树脂的床层上进行吸附，用洗脱剂梯度洗脱，每5～10min收集一次洗脱液，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计没有检出峰为止，合并范围波长有检出峰部分的洗脱液，旋蒸浓缩，得浓缩液；
（7）向步骤（6）中所得浓缩液中加入逆溶剂，直至晶体不再析出，过滤，得到重结晶晶体；
（8）将步骤（7）中所得晶体冻干，得粉末。
优选步骤（1）中所述助滤剂为硅藻土或珍珠岩；助滤剂与发酵液质量体积比为1%～1.5%g/mL；所述的酸为HCl或H2SO4溶液，其摩尔浓度为2～5mol/L，调节体系pH范围为4～6；所述搅拌时间为15～30min。
优选步骤（2）中所述的提取剂为高氯酸、甲醇、乙醇或氯仿；菌体与提取剂质量体积比为1：10～15g/mL。优选步骤（2）中所述控制温度为1～8℃，搅拌速度为150～300r/min，搅拌时间为10～20min；超声提取中超声频率为25～50KHz；功率为100～200W；超声提取时间为10～30min。
优选步骤（3）中离心转速为8000～10000rpm/min，离心时间为10～30min。优选步骤（4）中的有机溶剂和步骤（6）中的洗脱剂均为甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿。
优选步骤（5）中所述的微孔滤膜孔径为0.22～0.6μm，材质为聚四氟乙烯、聚醚砜或混合纤维树脂；所述的超滤膜的孔径为0.004～0.01μm，材质为聚酰胺、聚醚砜或聚碳酸酯。
优选步骤（5）中所述浓缩液的体积为超滤后滤液体积的1/100～1/150。
优选步骤（6）中所述的阳离子交换树脂树脂的种类为D113、742、D151或D152型弱酸性阳离子交换树脂的一种；离子柱径/高比：1：27～30，洗脱剂流速为5～15mL/min；所述紫外分光光度计范围波长为240～270nm；所述浓缩液体积为洗脱液体积的1/50～1/100。
优选步骤（7）中所述逆溶剂为正己烷或石油醚。
有益效果：
（1）本发明通过对发酵液进行过滤、超声破碎、阳离子交换树脂吸附、洗脱、重结晶等技术，获得了纯度高达98％以上的S-腺苷甲硫氨酸产品，产率在85%以上。
（2）本发明通过对发酵液进行过滤、超声破碎、阳离子交换树脂吸附、洗脱、重结晶等技术，生产成本低、消耗低、污染少等，且流程简单，易于操作，易于工业化生产。
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
（1）取酿酒酵母发酵液，发酵液中加入硅藻土，硅藻土与发酵液质量体积比为1.0%g/mL，用摩尔浓度为2.0mol/L的H2SO4溶液调节混合溶液pH至4，将混合溶液搅拌20min，过滤，分别收集滤液和菌体。
（2）将步骤（1）所得的菌体加入小烧杯中，加入高氯酸，菌体与高氯酸质量体积比为1：15g/mL，1℃、150rpm/min搅拌20min，悬浮液用超声破碎提取30min，超声频率为25KHz，功率为100W。
（3）将步骤（2）中所得超声提取液8000rpm/min离心30min后过滤，滤液和步骤（1）中滤液合并，加入二氯甲烷进行萃取，得萃取液。
（4）将步骤（3）中所得萃取液经0.22μm的聚四氟乙烯微滤膜过滤，所得滤液再用0.01μm的聚醚砜超滤膜过滤，收集超滤滤液旋蒸浓缩，浓缩液为原滤液的1/100。
（5）将步骤（4）中滤液真空抽虑浓缩，浓缩液移到装有D113型弱酸型阳离子交换树脂的床层上进行吸附，柱床径高比为1：27，并用乙酸乙酯溶液以5mL/min的速率进行洗脱，用部分收集器收集洗脱液，每10min收集一次，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计检测，直至在240nm范围内没有检出峰,合并有洗脱峰部分洗脱液，将洗脱液旋蒸浓缩，浓缩至原洗脱液的1/100
（6）向步骤（6）所得浓缩液中缓慢加入石油醚，静置8h，得到重结晶晶体；
（7）将步骤（7）中的晶体冷冻干燥得粉末，经HPLC检测，得到S-腺苷甲硫氨酸粉末，产率87%，纯度98.2%。
实施例2
（1）取酿酒酵母发酵液，发酵液中加入硅藻土，硅藻土与发酵液质量体积比为1.5%g/mL，用摩尔浓度为3.0mol/L的HCl溶液调节混合溶液pH至5，将混合溶液搅拌30min，过滤，分别收集滤液和菌体。
（2）将步骤（1）所得的菌体加入小烧杯中，加入甲醇，菌体与甲醇质量体积比为1：10g/mL，8℃、300rpm/min搅拌10min，悬浮液用超声破碎提取10min，超声频率为40KHz，功率为200W。
（3）将步骤（2）中所得超声提取液9000rpm/min离心24min后过滤，滤液和步骤（1）中滤液合并，加入乙酸乙酯进行萃取，得萃取液。
（4）将步骤（3）中所得萃取液经0.42μm的聚醚砜微滤膜过滤，所得滤液再用0.008μm的聚酰胺超滤膜过滤，收集超滤滤液旋蒸浓缩，浓缩液为原滤液的1/125；
（5）将步骤（4）中滤液真空抽虑浓缩，浓缩液移到装有D151型弱酸型阳离子交换树脂的床层上进行吸附，柱床径高比为1：30，并用二氯甲烷溶液以10mL/min的速率进行洗脱，用部分收集器收集洗脱液，每7min收集一次，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计检测，直至在270nm范围内没有检出峰，合并有洗脱峰部分洗脱液，将洗脱液进行旋蒸浓缩，浓缩至原洗脱液的1/80；
（6）向步骤（6）所得浓缩液中缓慢加入正己烷，静置8h，得到重结晶晶体；
（7）将步骤（7）中的晶体冷冻干燥得粉末，经HPLC检测，得到S-腺苷甲硫氨酸粉末，产率85%，纯度98.5%。
实施例3
（1）取酿酒酵母发酵液，发酵液中加入硅藻土，硅藻土与发酵液质量体积比为1.2%g/mL，用摩尔浓度为4.0mol/L的HCl溶液调节混合溶液pH至6，将混合溶液搅拌15min，过滤，分别收集滤液和菌体。
（2）将步骤（1）所得的菌体加入小烧杯中，加入乙醇，菌体与乙醇质量体积比为1：12g/mL，4℃、200rpm/min搅拌15min，悬浮液用超声破碎提取20min，超声频率为50KHz，功率为160W。
（3）将步骤（2）中所得超声提取液10000rpm/min离心10min后过滤，滤液和步骤（1）中滤液合并，加入氯仿进行萃取，得萃取液。
（4）将步骤（3）中所得萃取液经0.6μm的混合纤维树脂微滤膜过滤，所得滤液再用0.004μm的聚碳酸酯超滤膜过滤，收集超滤滤液旋蒸浓缩，浓缩液为原滤液的1/150；
（5）将步骤（4）中滤液真空抽虑浓缩，浓缩液移到装有D152型弱酸型阳离子交换树脂的床层上进行吸附，柱床径高比为1：28，并用氯仿溶液以15mL/min的速率进行洗脱，用部分收集器收集洗脱液，每5min收集一次，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计检测，直至在260nm范围内没有检出峰，合并有洗脱洗脱液，将洗脱液进行旋蒸浓缩，浓缩至原洗脱液的1/50；
（6）向步骤（6）所得浓缩液中缓慢加入正己烷，静置8h，得到重结晶晶体；
（7）将步骤（7）中的晶体冷冻干燥得粉末，经HPLC检测，得到S-腺苷甲硫氨酸粉末，产率88%，纯度99.1%。

Claims (9)

1.一种从酿酒酵母发酵液中提取S-腺苷甲硫氨酸的方法，其具体步骤如下：
(1)取酿酒酵母发酵液，在发酵液中加入助滤剂，用酸调节体系pH为4～6，搅拌，将发酵液过滤，分别收集滤液和菌体；
(2)将步骤(1)所得的菌体加入容器中，加入提取剂，控制温度，搅拌，将搅拌后的菌体悬浮液用超声破碎提取，得提取液；其中所述控制温度为1～8℃，搅拌速度为150～300r/min，搅拌时间为10～20min；超声提取中超声频率为25～50KHz；功率为100～200W；超声提取时间为10～30min；
(3)将步骤(2)中所得提取液，离心、过滤，收集滤液；
(4)将步骤(3)中收集的滤液和步骤(1)中收集的滤液合并，用有机溶剂萃取，得萃取液；
(5)将步骤(4)中所得萃取液，先经微滤膜过滤后，再用超滤膜过滤，超滤滤液旋蒸浓缩，得浓缩液；
(6)将步骤(5)所得浓缩液转移到装有阳离子交换树脂的床层上进行吸附，用洗脱剂梯度洗脱，每5～10min收集一次洗脱液，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计没有检出峰为止，合并范围波长有检出峰部分的洗脱液，旋蒸浓缩，得浓缩液；
(7)向步骤(6)中所得浓缩液中加入逆溶剂，直至晶体不再析出，过滤，得到重结晶晶体；
(8)将步骤(7)中所得晶体冻干，得粉末。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述助滤剂为硅藻土或珍珠岩；助滤剂与发酵液质量体积比为1％～1.5％g/mL；所述的酸为HCl或H2SO4溶液，其摩尔浓度为2～5mol/L；所述搅拌时间为15～30min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的提取剂为高氯酸、甲醇、乙醇或氯仿；菌体与提取剂质量体积比为1：10～15g/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中离心转速为8000～10000rpm/min，离心时间为10～30min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中的有机溶剂和步骤(6)中的洗脱剂均为甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的微孔滤膜孔径为0.22～0.6μm，材质为聚四氟乙烯、聚醚砜或混合纤维树脂；所述的超滤膜的孔径为0.004～0.01μm，材质为聚酰胺、聚醚砜或聚碳酸酯。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所述浓缩液的体积为超滤后滤液体积的1/100～1/150。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(6)中所述的阳离子交换树脂树脂的种类为D113、742、D151或D152型弱酸性阳离子交换树脂的一种；离子柱径/高比：1：27～30，洗脱剂流速为5～15mL/min；所述紫外分光光度计范围波长为240～270nm；所述浓缩液体积为洗脱液体积的1/50～1/100。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(7)中所述逆溶剂为正己烷或石油醚。
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