CN109444298B - 一种快速挖掘并测定白酒酿造过程中腺苷甲硫氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及白酒发酵功能因子挖掘分析技术领域，尤其涉及用于白酒发酵产物，包括大曲、酒醅、酒糟中腺苷甲硫氨酸的挖掘及其含量的测定。其具体步骤为：挖掘白酒酿造过程中腺苷甲硫氨酸的存在及其表达和测定白酒酿造过程中的腺苷甲硫氨酸的含量。本发明的优点是：操作简便快速、劳动强度小、有机溶剂用量少、准确度高、定量准确等特点，适用于发掘白酒发酵过程中的健康因子及腺苷甲硫氨酸的定性及定量分析。
Description
技术领域
本发明涉及白酒发酵功能因子挖掘分析技术领域，尤其涉及用于白酒发酵产物，包括大曲、酒醅、酒糟的腺苷甲硫氨酸含量的测定。
背景技术
中国白酒（Chinese liquors）是指以粮谷为主要酿造原料，以大曲、小曲或麸曲及酒母等为糖化发酵剂，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏而制成的蒸馏酒。白酒的酿造历史悠久，在几千年的传承发展中，中国白酒形成了自己独有的固态发酵（Solid-state fermentation）方式和蒸馏工艺（Distillation），与法国的白兰地（Brandy），俄国的伏特加（Vodka）和苏格兰的威士忌（Whisky）并称为世界四大蒸馏酒。白酒酿造中微生物数量庞大，发酵组分极为复杂，目前已检测到的化学物质超过上千种，这些物质大部分来自原料或发酵过程中微生物代谢产生。酒醅是发酵过程中风味物质合成的重要来源，因此酒醅是新的风味物质的载体。
S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine, SAM）广泛存在于动植物及微生物中，是甲硫氨酸在体内的活性形式。SAM 是一种重要的生理活性物质，参与了生物体内多种生化反应，表现出广泛的和多样的治疗作用，对于关节炎、抑郁症、肝功能紊乱等均有较好的疗效，也是预防癌症、心血管疾病和抗衰老的保健药品，具有良好的临床应用前景。SAM合成酶（S-adenosylmethionine synthase, MAT）是 SAM在生物体内合成的关键限速酶。MAT在古细菌、细菌和真核生物中普遍存在。在细菌和真核生物之间，其序列较为保守。对于白酒来说，白酒中的风味物质在固态发酵过程中产生，为了提高白酒的健康品质，进一步探索新的风味物质的产生来源、形成机理、代谢途径等，进而发现新的类型的风味物质物质显得尤其必要。近年来，国内各白酒企业或高校科研院所对白酒中的风味物质不断探索发现，希望能够发现新的功能因子，目前在白酒酿造过程中发现的新风味物质，存在技术操作复杂、工作量大、设备要求高及成本昂贵等问题。同时，对于白酒中微量成份含量的测定方法的研究分析，关于固态发酵过程产物如大曲、酒醅、酒糟中化合物的定量分析方法一直是研究热点。
发明内容
基于上述问题，本发明通过转录组结合宏基因组分析、发酵产物的超声萃取、样品固相萃取富集和纯化、高效液相色谱-质谱联用进行定性、定量分析来测定酒醅、酒糟风味物质腺苷甲硫氨酸的方法，给出发现白酒中新的风味物质增加一条新的途径；也可以用于比较不同酿造工艺的发酵过程中腺苷甲硫氨酸的含量测定或者比较发酵过程中腺苷甲硫氨酸的产生水平以及变化趋势，为酿造工艺的改良以及终产品品质的改进提供基础数据支撑和相关理论依据。
一种快速挖掘并测定白酒酿造过程中腺苷甲硫氨酸的方法，具体包括以下步骤：
（1）挖掘白酒酿造过程中腺苷甲硫氨酸的存在及其表达：
1）高通量测序：对待测样品白酒发酵产物用Illumina Mi Seq PE300 (Illumina，California，USA)进行高通量测序；
2）转录组测序：对白酒发酵产物提取RNA，并用Hiseq2000对RNA进行测序；
3）基因表达分析：使用软件Cuff links对步骤2）测序后的RNA进行基因表达分析，确定白酒发酵过程中产生的对应风味物质（腺苷甲硫氨酸）的菌种；
（2）测定白酒酿造过程中的腺苷甲硫氨酸：
1）浸泡与超声提取：取5～10g白酒发酵产物（酒醅、酒糟及大曲），加入15～20ml（2倍体积）的超纯水，浸泡10～30min后，超声提取 2～3次，每次≥20min，12000rpm离心10～15min后取上清液备用；
2）固相萃取柱浓缩纯化：向oasis HLB萃取小柱加入2ml甲醇活化固相萃取柱，再加入1ml超纯水平衡萃取柱；加入步骤1）所得样品上清液，静置10min后加入2ml甲醇洗脱，再加入 1ml流动相（水（含0.1%甲酸）：甲醇=(95:5，v/v)）洗脱，并收集0.8ml处流出液；过0.22μm滤膜于液相小瓶中待LC-MS检测备用；
3）腺苷甲硫氨酸含量的测定：物质定性采用离子碎片进行分析比对，并以标准品作为对照；定量方法采用将待测物质丰度与标准品比对。
4）LC-MS检测：
a、仪器：Agilent 6520 Accurate-Mass QTOF LC-MS，ESI+离子源 (AgilentTechnologies) ；
b、色谱柱：Kromasil 100-5 C18 column; 4.6×250 mm ；
c、液相条件：柱温：25～35℃；
d、流动相 ：A相：甲醇，B相：水（含0.1%甲酸），B相：A相=(95:5，v/v)；
f、流速：0.8 mL/min
g、进样量：10μl；
5）标准曲线的建立：
a、配制标准品母液：称取1mg腺苷甲硫氨酸物标准品，用超纯水配制成1mg/ml 的标准品母液，随后梯度稀释成12.5μg/ml、25μg /ml、50μg/ml、100μg /ml、125μg/ml标品溶液放置于4℃冰箱中保存备用；
b、绘制标准曲线：以腺苷甲硫氨酸标准品特征离子峰的峰面积作为纵坐标，以腺苷甲硫氨酸标准品稀释液浓度作为横坐标绘制标准曲线；
6）腺苷甲硫氨酸含量计算：通过步骤5）标准曲线计算白酒发酵产物中腺苷甲硫氨酸含量，根据腺苷甲硫氨酸标准曲线看出，腺苷甲硫氨酸在5μg/ml - 500μg/ml的检测范围内具有良好的线性关系，线性相关系数R2大于0.999。
本发明的主要试剂与材料 ：腺苷甲硫氨酸标准品购于sigma公司。酒醅、酒糟：牛栏山酒厂提供。主要仪器包括：液相色谱质谱联用仪：美国 Agilent 6520 Accurate-MassQTOF LC/MS；固相萃取柱oasis HLB (美国，Waters公司) ；超声仪KQ-200KDB（昆山舒美）；eppendorf-5418离心机(德国)
本发明方法无需大量繁琐的实验操作，通过生物信息学方法就能预测可能存在的未发现的健康因子以及其产生菌株。前处理操作简便，且在进行固相萃取的方式有效避免了对样品的污染与损失。本发明方法准确度高、精密度较高，检测时间较短，能满足对白酒酿造过程中腺苷甲硫氨酸含量的检测要求，也可以用于比较不同酿造工艺的发酵过程中腺苷甲硫氨酸的含量测定或者比较发酵过程中腺苷甲硫氨酸的产生水平以及变化趋势，为酿造工艺的改良以及终产品品质的改进提供基础数据支撑和相关理论依据。
相比于现有技术，本发明的优点是：操作简便快速、劳动强度小、有机溶剂用量少、准确度高、定量准确等特点，适用于发掘白酒发酵过程中的健康因子及腺苷甲硫氨酸的定性及定量分析。
说明书附图
图1牛栏山酒厂中酒醅中S-腺苷甲硫氨酸合酶的转录量以及其产生相应菌株。
图2腺苷甲硫氨酸标准曲线。
具体实施方式
挖掘牛栏山白酒酿造生产中酒醅中腺苷甲硫氨酸的存在及其表达，即基因组结合转录组分析S-腺苷甲硫氨酸合酶（EC:2.5.1.6）的转录情况。白酒发酵产物用IlluminaMiSeqPE300 (Illumina，California，USA)进行高通量测序；白酒发酵产物提取RNA，并用Hiseq2000对RNA进行转录组测序；使用软件Cuff links对转录组测序后的RNA进行基因表达分析，确定白酒发酵过程中酒醅产生的对应风味物质（腺苷甲硫氨酸）的菌种。
实施例1
牛栏山白酒酿造生产中酒醅中腺苷甲硫氨酸含量测定方法。
称取10g经过基因组结合转录组分析含有腺苷甲硫氨酸的酒醅于50mL三角瓶中，加入20ml的超纯水，浸泡30min后，超声提取3次，每次20min，12000rpm离心15min后取上清液备用；向oasis HLB萃取小柱加入2ml甲醇活化固相萃取柱，再加入1ml超纯水平衡萃取柱；加入上述离心所得上清液，静置10min后加入2ml甲醇洗脱，再加入 1ml流动相（水（含0.1%甲酸）:甲醇=(95:5,v/v)）洗脱，并收集0.8ml处流出液；过0.22μm滤膜于液相小瓶中待LC-MS检测备用；按照（柱温：35℃；流动相:水（含0.1%甲酸）:甲醇=(95:5,v/v)；流速：0.8mL/min；进样量：10μl；）的LC-MS分析条件检测目标物腺苷甲硫氨酸，经液相色谱分离，采用特征选择离子监测扫描模式 (+ESI)，以碎片的丰度比定性，以腺苷甲硫氨酸标准品特征离子峰的峰面积作为纵坐标，以腺苷甲硫氨酸标准品稀释液浓度作为横坐标绘制标准曲线定量；通过标准曲线计算，牛栏山白酒酒醅中的腺苷甲硫氨酸在5μg/ml - 500μg/ml的检测范围内具有良好的线性关系，线性相关系数R2大于0.999，经过计算，牛栏山白酒酒醅中的腺苷甲硫氨酸含量为39.15μg/ml。
实施例2
牛栏山白酒酿造生产中酒糟中腺苷甲硫氨酸含量测定方法。
称取8g经过基因组结合转录组分析含有腺苷甲硫氨酸的酒糟于50mL三角瓶中，加入18ml的超纯水，浸泡20min后，超声提取2次，每次25min，12000rpm离心13min后取上清液备用；向oasis HLB萃取小柱加入2ml甲醇活化固相萃取柱，再加入1ml超纯水平衡萃取柱；加入上述离心所得上清液，静置10min后加入2ml甲醇洗脱，再加入 1ml流动相（水（含0.1%甲酸）:甲醇=(95:5,v/v)）洗脱，并收集0.8ml处流出液；过0.22μm滤膜于液相小瓶中待LC-MS检测备用；按照（柱温：30℃；流动相:水（含0.1%甲酸）:甲醇=(95:5,v/v)；流速：0.8 mL/min；进样量：10μl；）的LC-MS分析条件检测目标物腺苷甲硫氨酸，经液相色谱分离，采用特征选择离子监测扫描模式 (+ESI)，以碎片的丰度比定性，以腺苷甲硫氨酸标准品特征离子峰的峰面积作为纵坐标，以腺苷甲硫氨酸标准品稀释液浓度作为横坐标绘制标准曲线定量；通过标准曲线计算，牛栏山白酒酒醅中的腺苷甲硫氨酸在5μg/ml - 500μg/ml的检测范围内具有良好的线性关系，线性相关系数R2大于0.999，经过计算，牛栏山白酒酒醅中的腺苷甲硫氨酸含量为7.04μg/ml。
实施例3
牛栏山白酒酿造生产中大曲中腺苷甲硫氨酸含量测定方法。
称取5g经过基因组结合转录组分析含有腺苷甲硫氨酸的大曲于50mL三角瓶中，加入15ml的超纯水，浸泡10min后，超声提取2次，每次20min，12000rpm离心10min后取上清液备用；向oasis HLB萃取小柱加入2ml甲醇活化固相萃取柱，再加入1ml超纯水平衡萃取柱；加入上述离心所得上清液，静置10min后加入2ml甲醇洗脱，再加入 1ml流动相（水（含0.1%甲酸）:甲醇=(95:5,v/v)）洗脱，并收集0.8ml处流出液；过0.22μm滤膜于液相小瓶中待LC-MS检测备用；按照（柱温：25℃；流动相:水（含0.1%甲酸）:甲醇=(95:5,v/v)；流速：0.8 mL/min；进样量：10μl；）的LC-MS分析条件检测目标物腺苷甲硫氨酸，经液相色谱分离，采用特征选择离子监测扫描模式 (+ESI)，以碎片的丰度比定性，以腺苷甲硫氨酸标准品特征离子峰的峰面积作为纵坐标，以腺苷甲硫氨酸标准品稀释液浓度作为横坐标绘制标准曲线定量；通过标准曲线计算，牛栏山白酒酒醅中的腺苷甲硫氨酸在5μg/ml - 500μg/ml的检测范围内具有良好的线性关系，线性相关系数R2大于0.999，经过计算，牛栏山白酒大曲中的腺苷甲硫氨酸含量为20.13μg/ml。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的原理之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种快速挖掘并测定白酒酿造过程中腺苷甲硫氨酸的方法，具体包括以下步骤：
(1)挖掘白酒酿造过程中腺苷甲硫氨酸的存在及其表达：
1)高通量测序：对待测样品白酒发酵产物用Illumina Mi Seq PE300 Illumina，California，USA进行高通量测序；
2)转录组测序：对白酒发酵产物提取RNA，并用Hiseq2000对RNA进行测序；
3)基因表达分析：使用软件Cufflinks对步骤2)测序后的RNA进行基因表达分析，确定白酒发酵过程中产生的对应风味物质腺苷甲硫氨酸的菌种；
(2)测定白酒酿造过程中的腺苷甲硫氨酸：
1)浸泡与超声提取：取5～10g白酒发酵产物，加入15～20ml的超纯水，浸泡10～30min后，超声提取2～3次，每次≥20min，12000rpm离心10～15min后取上清液备用；
2)固相萃取柱浓缩纯化：向oasis HLB萃取小柱加入2ml甲醇活化固相萃取柱，再加入1ml超纯水平衡萃取柱；加入步骤1)所得样品上清液，静置10min后加入2ml甲醇洗脱，再加入1ml流动相洗脱，并收集0.8ml处流出液；过0.22μm滤膜于液相小瓶中待LC-MS检测备用；
3)腺苷甲硫氨酸含量的测定：物质定性采用离子碎片进行分析比对，并以标准品作为对照；定量方法采用将待测物质丰度与标准品比对；
4)LC-MS检测：
a、仪器：Agilent 6520Accura te-Mass QTOF LC-MS，ESI+离子源AgilentTechnologies；
b、色谱柱：Kromasil C18 column，4.6×250mm；
c、液相条件：柱温：25～35℃；
d、流动相：A相：甲醇，B相：含有0.1％的甲酸的水，B相与A相体积比为95:5；
f、流速：0.8mL/min
g、进样量：10μl；
5)标准曲线的建立：
a、配制标准品母液：称取1mg腺苷甲硫氨酸物标准品，用超纯水配制成1mg/ml的标准品母液，随后梯度稀释成12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、125μg/ml标品溶液放置于4℃冰箱中保存备用；
b、绘制标准曲线：以腺苷甲硫氨酸标准品特征离子峰的峰面积作为纵坐标，以腺苷甲硫氨酸标准品稀释液浓度作为横坐标绘制标准曲线；
6)腺苷甲硫氨酸含量计算：通过步骤5)标准曲线计算白酒发酵产物中腺苷甲硫氨酸含量。
2.根据权利要求1所述的一种快速挖掘并测定白酒酿造过程中腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于：步骤(1)和(2)所述的白酒发酵产物为酒醅、酒糟或大曲。
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