CN105238853A - 一种同时测定人他克莫司作用靶点基因多态性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学和医学检验技术领域，涉及一种同时测定人他克莫司作用靶点信号通路系列蛋白编码基因多态性的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法。本发明对样本进行DNA提取后，进行多重PCR扩增，单碱基延伸反应后，应用飞行时间质谱方法进行对样品进行基因分型分析。所述方法操作简便、无需序列特异性探针，可对多个样本多重检测，每个体系可实现40重反应，同时检测40个SNP位点，具有高通量，适用范围广，同时检测多至成千上万个样本，几十到成百上千个位点；无需荧光标记，仅需合成普通引物，单个分析成本低；高灵活度，分析所需样本量少，高灵敏度，检测精度高。适合临床常规基因检测，进一步为临床个体化合理用药提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术和医学检验领域，涉及他克莫司作用靶点基因多态性的测定方法，具体涉及他克莫司的作用靶点信号通路系列蛋白编码基因多态性的检测方法。
背景技术
据研究报道，他克莫司治疗窗窄，疗效存在显著个体差异，目前，临床上通常采用通过对其进行治疗药物监测(therapeuticdrugmonitoring，TDM)，即监测血药浓度，进行调整他克莫司的剂量。实践显示，传统的TDM难以从药效学的角度反映个体之间的变异，而且TDM只有在服药后方可实施，无法在服药前预测机体对药物的反应，药物的初始剂量难以确定。因此，单纯依靠TDM进行他克莫司的个体化治疗显然是不够的，临床实践中迫切需要寻找新的个体化治疗干预策略。
现有技术公开了遗传变异是导致药物效应个体间变异的最主要因素之一。通过研究遗传变异与药物反应的关系，可根据基因型制定药物的初始剂量，也可以筛选药物反应敏感或无效的特定人群，进行个体化治疗，因此，药物基因组学是个体化药物治疗发展的新台阶。至2014年8月，FDA已经批准或修订138种药物说明书，建议检测基因型，以提高药物使用的有效性和安全性(http://www.fda.gov/％20drugs/scienceresearch/researchareas/pharmacogenetics/ucm083378.htm)。
有研究公开了他克莫司在体内的作用靶点和通路，他克莫司进入T细胞后与一种免疫亲和素—FK506结合蛋白(FK506bindingprotein，FKBP)相结合，FKBP—FK506复合物专一性地结合以及抑制钙调磷酸酶(calcineurin，CaN)活性，阻断活化T细胞核转录因子(nuclearfactorofactivatedTcell，NFAT)的去磷酸化，进而抑制IL-2的基因转录，从而抑制T细胞的后续活化。研究显示，他克莫司作用信号通路的重要分子(FKBP、CaN及NFAT)的功能状态，对于他克莫司药理作用的发挥，具有至关重要的作用，他克莫司作用靶点信号通路中的FKBP、CaN及NFAT蛋白编码基因的单核苷酸多态性，影响基因功能，进而影响他克莫司与FKBP、FKBP与CaN、CaN与NFAT、以及NFAT与靶基因的相互结合，最终影响他克莫司的免疫抑制作用。
FKBP属免疫亲和素的一个亚类，其家族成员有20多个，其中最重要的是FKBP12、FKBP12.6，其编码基因分别为FKBP1A和FKBP1B；CaN以异二聚体的形式存在，由61ku的催化亚基CalcineurinA(CNA)和19ku的调节亚基CalcineurinB(CNB)组成；其中的CNA有CNAα、CNAβ和CNAγ三个亚型，其编码基因分别为PPP3CA、PPP3CB和PPP3CC；CNB有CNB1和CNB2两个亚型，其编码基因分别是PPP3R1和PPP3R2；研究显示，CNAα、CNAβ及CNB1在体内广泛表达，CNAγ和CNB2只存在于大脑和睾丸中；NFAT属于Rel蛋白家族，Rel蛋白家族包括NF-kB及NFAT，是保守的DNA结合域；NFAT有5种亚型，分别是NFATC1、NFATC2、NFATC3、NFATC4、NFAT5，其中NFATC1、NFATC2、NFATC3主要存在于T淋巴细胞等免疫细胞中，NFATC4存在于包括心脏在内的其他组织细胞中，NFAT5不同于其他4种蛋白，不受细胞内钙离子浓度的调节，主要通过激活高渗诱导的肿瘤坏死因子(TNF)基因转录，参与T细胞生长、发育的调节。研究显示，CaN-NFAT信号通路在免疫系统与非免疫系统中均发挥重要的作用，因此检测他克莫司靶点通路基因的遗传变异对预测他克莫司药物反应具有较重要的临床意义。
已知药物在体内最终效应的发挥受到多个环节的影响，其包括药动学和药效学环节，而药动学和药效学又各自受到多种酶、转运蛋白、受体、信号通路等的影响，而每种受体、蛋白等的编码基因，又存在多个SNP位点，因此，仅仅通过检测一种基因的一个SNP位点的基因型，对解释药物的个体差异，显然是远远不够的，因此，往往需要同时检测多个基因多个SNP位点，对解释药物的个体差异能提供有意义的参考依据。
目前，基因多态性的检测方法主要有DNA直接测序法和Taqman探针法等，所述DNA直接测序法是目前突变检测的金标准，但存在费时费力，成本较昂贵等缺陷，是一种低通量的检测方法，不适用于大量样本检测；所述Taqman是高度特异的定量PCR技术，其特点是适应于大样本少量SNP位点检测，是一种中等通量的SNP检测，而对于同时检测多个SNP位点，则费用较高，不适宜。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种高效、灵敏、准确的，能同时检测多个SNP位点的方法，该方法适应于大样本或小样本，进一步为协助个体化给药、保证用药安全和有效提供技术支撑。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种同时测定人他克莫司作用靶点基因多态性的方法，具体涉及一种同时测定他克莫司作用靶点通路系列蛋白编码基因多个SNP位点基因型的方法。
本发明基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-AssistedLaserDesorption/IonizationTimeofFlightMassSpectrometry，MALDI-TOFMS)方法同时测定人他克莫司作用靶点信号通路系列蛋白编码基因多态性，尤其采用MALDI-TOFMS方法同时检测他克莫司的作用靶点信号通路上FK506结合蛋白、钙调磷酸酶、活化T细胞核转录因子的编码基因多态性。该方法能高效、灵敏、准确的同时检测他克莫司作用靶点信号通路中的多个蛋白编码基因中的多个SNP位点的基因型，为解释临床他克莫司药效的个体差异提供重要依据，进一步指导他克莫司的临床个体化给药干预策略。
本发明方法中采用时间飞行质谱(MALDI-TOF)方法，首先通过PCR扩增含有SNP的基因组片段，然后通过序列特异性引物实现单碱基延伸，随后样品分析物与芯片基质共结晶后在真空管中受瞬时纳秒(10-9s)强激光激发，核酸分子因此解吸附成为单电荷离子，由于电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间获得样品分析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息。本方法适用于同时检测同一样本多个SNP位点。
更具体的，本发明的一种同时测定人他克莫司作用靶点基因多态性的方法，其特征在于，对待测样品基因组DNA提取，经PCR扩增后，SAP处理、单碱基延伸后，产物纯化，用飞行时间质谱仪进行检测，进行基因分型，
通过以下步骤：
(1)设计序列特异性引物
查找目的基因的DNA序列，针对目的基因的突变位点设计筛选合适的引物对；并根据不同的位点，组合成不同的PCR反应体系；
(2)提取外周血细胞样本的基因组DNA，利用步骤(1)筛选的引物进行基因扩增；
(3)扩增的PCR产物进行SAP处理，进行单碱基延伸反应，纯化后得样品分析物；
(4)样品分析物点样至芯片基质，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析，获得样品分析物的分子量，检出SNP位点信息，完成基因分型分析。
本发明步骤(1)中，采用DNA提取试剂盒提取人外周血细胞样本的基因组DNA，调整所述DNA浓度为10-100ng/ul；
本发明步骤(1)中的PCR反应体系通过下述步骤进行，
1)标注每孔对应的DNA样品的编号及所用反应体系和引物；
2)在反应孔中分别加入1μLDNA模板，贴膜，2000rpm/10秒离心后备用；
3)配制PCR反应液：
4)PCR反应液4ul，加入已有1uLDNA的反应孔板中，使各孔终体积为5ul；
5)将每孔装有5ul反应液的孔板短暂离心后放入PCR仪，进行“PCR”的反应程序，该PCR反应程序为：94℃15min，45个循环(94℃20sec，56℃30sec，72℃1min)，72℃3min；
6)PCR反应程序结束后，将孔板短暂离心后备用，4℃保存。
本发明步骤(3)中，SAP处理和单碱基延伸反应通过下述步骤进行，
1)配制SAP反应液：
2)PCR反应孔板，加入SAP反应液，每孔加2μL，封膜、离心；
3)将已加入SAP反应液的孔板放入PCR仪中，运行名为“SAP”的反应程序；SAP反应程序：37℃40min，85℃5min；
4)反应结束，将孔板取出短暂离心备用，可在4℃保存；
5)延伸反应
(1)配制iPlex反应试剂
(2)将iPlex反应液加入PCR反应孔板，每孔加2μL，封膜、离心；
(3)将已加入iPlex反应液的孔板放入PCR仪中，运行名为“extension”的反应程序，延伸反应条件为：94℃30sec，40个循环{94℃5sec，5个小循环(52℃5sec，80℃5sec)}，72℃3min；
(4)反应结束，将孔板取出短暂离心备用，可在4℃保存；
6)产物纯化
(1)取树脂在树脂刮板上，均匀覆盖，刮去多余的树脂，放置20min；
(2)将反应结束的孔板1000rpm离心1min，每孔加入25μL去离子水，倒置在树脂板上面，然后反置将树脂板扣在孔板上，敲击使树脂落入孔板，封膜；
(3)翻转孔板20分钟，3500rpm、5分钟离心后备用。
本发明步骤(4)中采用TYPER软件分析实验结果。
其包括步骤：
1)人全血基因组DNA提取，
用DNA提取试剂盒提取全血基因组DNA，并调整浓度为10-100ng/ul；
2)多重PCR反应
(1)查找目的基因序列，针对突变位点，设计并合成PCR引物
(2)根据已抽提样品编制384孔反应表，注明每孔对应的DNA样品的编号，所用引物。
(3)按表在384孔板各孔中分别加入1μLDNA模板，贴膜，2000rpm/10秒离心后备用。
(4)按下表配制PCR反应液：(以384个样本为例)
注：以上384孔反应液有4％过量。
(5)取一排12联管，每孔加入配置好的PCR反应液133μL，短暂离心后备用。
(6)用10ul排枪取12联管中PCR反应液4ul，加入已有1uLDNA的384孔板中，使各孔终体积为5ul。
(7)将装有5ul反应液的384孔板短暂离心后放入PCR仪，运行名为“PCR”的反应程序。PCR反应程序为：94℃15min，45个循环(94℃20sec，56℃30sec，72℃1min)，72℃3min。
(8)PCR反应程序结束后，将384孔板短暂离心后备用，可在4℃保存。
3)SAP处理
(1)配制SAP反应液
按以下表次序配制SAP反应液(以384个样本为例)
注：以上384孔反应液有4％过量。
(2)取一排12联管，将SAP反应液以每孔66μL分装，短暂离心后，用10ul排枪分装于384孔PCR反应板，每孔加2μL，封膜、离心。
(3)将已加入SAP反应液的384孔板放入PCR仪中，运行名为“SAP”的反应程序。SAP反应程序：37℃40min，85℃5min。
(4)反应结束，将384孔板取出短暂离心备用，可在4℃保存。
4)延伸反应
(1)配制iPlex反应试剂
注：以上384孔反应液有4％过量。
(2)取一排12联管，将iPlex反应液以每孔66μL分装，短暂离心后，用10uL排枪分装于384孔PCR反应板，每孔加2μL，封膜、离心。将已加入iPlex反应液的384孔板放入PCR仪中，运行名为“extension”的反应程序。延伸反应条件为：94℃30sec，40个循环{94℃5sec，5个小循环(52℃5sec，80℃5sec)}，72℃3min。
(3)反应结束，将384孔板取出短暂离心备用，可在4℃保存。
5)产物纯化
(1)取6mg树脂在384孔树脂刮板上，均匀覆盖，刮去多余的树脂，放置20min。
(2)将反应结束的384孔板1000rpm离心1min，每孔加入25μL去离子水，倒置在树脂板上面(注意固定，不能移位)，然后反置将树脂板扣在384孔板上，敲击使树脂落入384孔板，封膜。
(3)以384孔板的长轴为轴心，翻转384孔板20分钟，3500rpm、5分钟离心后备用。
6)质谱检测
(1)NanodispenserSpectroCHIP芯片点样
将检测样品从384孔反应板转移到表面覆盖基质的MassARRAYSpectroCHIP芯片。
(2)MassARRAYAnalyzerCompact质谱检测
将样品转移到SpectroCHIP芯片后，即可放入质谱仪进行检测，每个检测点只需3-5秒，全自动分析。
(3)TYPER软件分析实验结果，获得分型数据。
本发明方法操作简便、无需序列特异性探针，一张芯片可对384个样本进行多重检测，每个体系最多可实现40重反应，同时检测40个SNP位点，通量可根据客户要求进行个性化调整，高通量，适用范围广，几十到成千上万个样本，同时检测几十到成百上千个位点；无需荧光标记，仅需合成普通引物，单个分析成本低；高灵活度，一张芯片上样本和位点检测匹配可随意选择；分析所需样本量少(10ng)，高灵敏度，检测精度高，SNP检测准确率可达99.9％。适合临床常规基因检测，进一步为临床个体化合理用药提供技术支撑。
附图说明
图1：一个样本一个反应体系的基因分型图。
图2：rs12958819位点AA型分型图。
图3：rs12958819位点GA型分型图。
图4：rs12958819位点GG型分型图。
图5：rs4811187位点CC型分型图。
图6：rs4811187位点CT型分型图。
图7：rs4811187位点TT型分型图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不使用限制本人发明的范围，若未特别指明，实施例中所用技术手段为本技术领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中所用飞行质谱仪为MassARRAYCompactSystem(SEQUENOM公司)，型号PT009044。点样仪为MassArrayTMNanodispenser(SAMSUNG公司)。
实施例1同时测定人他克莫司作用靶点基因多态性
按下述步骤：
1)人全血基因组DNA提取，
用DNA提取试剂盒提取全血基因组DNA，并调整浓度为10-100ng/ul；
2)多重PCR反应
(1)查找目的基因序列，针对突变位点，设计并合成PCR引物，
(2)根据已抽提样品编制384孔反应表，注明每孔对应的DNA样品的编号，所用引物，
(3)按表在384孔板各孔中分别加入1μLDNA模板，贴膜，2000rpm/10秒离心后备用，
(4)按下表配制PCR反应液：(以384个样本为例)
注：以上384孔反应液有4％过量，
(5)取一排12联管，每孔加入配置好的PCR反应液133μL，短暂离心后备用
(6)用10ul排枪取12联管中PCR反应液4ul，加入已有1uLDNA的384孔板中，使各孔终体积为5ul，
(7)将装有5ul反应液的384孔板短暂离心后放入PCR仪，运行名为“PCR”的反应程序。PCR反应程序为：94℃15min，45个循环(94℃20sec，56℃30sec，72℃1min)，72℃3min，
(8)PCR反应程序结束后，将384孔板短暂离心后备用，可在4℃保存；
3)SAP处理
(1)配制SAP反应液
按以下表次序配制SAP反应液(以384个样本为例)
注：以上384孔反应液有4％过量。
(2)取一排12联管，将SAP反应液以每孔66μL分装，短暂离心后，用10ul排枪分装于384孔PCR反应板，每孔加2μL，封膜、离心。
(3)将已加入SAP反应液的384孔板放入PCR仪中，运行名为“SAP”的反应程序。SAP反应程序：37℃40min，85℃5min。
(4)反应结束，将384孔板取出短暂离心备用，可在4℃保存。
4)延伸反应
(1)配制iPlex反应试剂
注：以上384孔反应液有4％过量
(2)取一排12联管，将iPlex反应液以每孔66μL分装，短暂离心后，用10uL排枪分装于384孔PCR反应板，每孔加2μL，封膜、离心，将已加入iPlex反应液的384孔板放入PCR仪中，运行名为“extension”的反应程序，延伸反应条件为：94℃30sec，40个循环{94℃5sec，5个小循环(52℃5sec，80℃5sec)}，72℃3min；
(3)反应结束，将384孔板取出短暂离心备用，4℃保存；
5)产物纯化
(1)取6mg树脂在384孔树脂刮板上，均匀覆盖，刮去多余的树脂，放置20min；
(2)将反应结束的384孔板1000rpm离心1min，每孔加入25μL去离子水，倒置在树脂板上，然后反置将树脂板扣在384孔板上，敲击使树脂落入384孔板，封膜；
(3)以384孔板的长轴为轴心，翻转384孔板20分钟，3500rpm、5分钟离心后备用；
6)质谱检测
(1)NanodispenserSpectroCHIP芯片点样
将检测样品从384孔反应板转移到表面覆盖基质的MassARRAYSpectroCHIP芯片；
(2)MassARRAYAnalyzerCompact质谱检测
将样品转移到SpectroCHIP芯片后，即可放入质谱仪进行检测，每个检测点只需3-5秒，全自动分析；
(3)TYPER软件分析实验结果，获得分型数据。
检测结果表明，本发明方法操作简便、无需序列特异性探针，一张芯片可对384个样本进行多重检测，每个体系最多可实现40重反应，同时检测40个SNP位点，通量可根据客户要求进行个性化调整，高通量，适用范围广，几十到成千上万个样本，同时检测几十到成百上千个位点；无需荧光标记，仅需合成普通引物，单个分析成本低；高灵活度，一张芯片上样本和位点检测匹配可随意选择；分析所需样本量少(10ng)，高灵敏度，检测精度高，SNP检测准确率可达99.9％。
实施例2：利用时间飞行质谱技术检测10例肾移植患者FKBP1A、PPP3CB、NFATC1基因共计35个SNP位点的基因型
1、人全血基因组DNA提取
用DNA提取试剂盒提取全血基因组DNA，并调整浓度为10-100ng/ul。
2、多重PCR反应
1)查找目的基因序列，针对突变位点，设计并合成PCR引物
同时测定FKBP1A、PPP3CB、NFATC1基因中35个SNP位点，设计的引物如表1所示。
表1FKBP1A、PPP3CB、NFATC1基因中35个SNP位点的基因型检测所用引物及产生的单碱基延伸物
注：W1、W2、W3、W4分别代表4个多重PCR反应体系；
2)根据已抽提样品编制384孔反应表，注明每孔对应的DNA样品的编号，所用引物；
3)按表在384孔板各孔中分别加入1μLDNA模板，贴膜，2000rpm/10秒离心后备用；
4)按下表配制PCR反应液：
分为4个反应体系进行多重PCR，按表1所示分组；
5)取一排12联管，每孔加入配置好的PCR反应液133μL，短暂离心后备用；
6)用10ul排枪取12联管中PCR反应液4ul，加入已有1uLDNA的384孔板中，使各孔终体积为5ul；
7)将装有5ul反应液的384孔板短暂离心后放入PCR仪，运行名为“PCR”的反应程序。PCR反应程序为：94℃15min，45个循环(94℃20sec，56℃30sec，72℃1min)，72℃3min；
8)PCR反应程序结束后，将384孔板短暂离心后备用，4℃保存；
3、SAP处理
1)配制SAP反应液
2)取一排12联管，将SAP反应液以每孔66μL分装，短暂离心后，用10ul排枪分装于384孔PCR反应板，每孔加2μL，封膜、离心；
3)将已加入SAP反应液的384孔板放入PCR仪中，运行名为“SAP”的反应程序。SAP反应程序：37℃40min，85℃5min；
4)反应结束，将384孔板取出短暂离心备用，4℃保存；
4、延伸反应
1)配制iPlex反应试剂
2)取一排12联管，将iPlex反应液以每孔66μL分装，短暂离心后，用10uL排枪分装于384孔PCR反应板，每孔加2μL，封膜、离心；将已加入iPlex反应液的384孔板放入PCR仪中，运行名为“extension”的反应程序；延伸反应条件为：94℃30sec，40个循环{94℃5sec，5个小循环(52℃5sec，80℃5sec)}，72℃3min；
3)反应结束，将384孔板取出短暂离心备用，4℃保存，各位点单碱基延伸产物如表1所示；
5、产物纯化
1)取6mg树脂在384孔树脂刮板上，均匀覆盖，刮去多余的树脂，放置20min；
2)将反应结束的384孔板1000rpm离心1min，每孔加入25μL去离子水，倒置在树脂板上面，然后反置将树脂板扣在384孔板上，敲击使树脂落入384孔板，封膜；
3)以384孔板的长轴为轴心，翻转384孔板20分钟，3500rpm、5分钟离心后备用；
6、质谱检测
1)NanodispenserSpectroCHIP芯片点样
将检测样品从384孔反应板转移到表面覆盖基质的MassARRAYSpectroCHIP芯片；
2)MassARRAYAnalyzerCompact质谱检测
将样品转移到SpectroCHIP芯片后，即可放入质谱仪进行检测，每个检测点只需3-5秒，全自动分析；
3)TYPER软件分析实验结果，获得分型数据。
本实施例中，对10例肾移植患者进行了检测，FKBP1A、PPP3CB、NFATC1基因中35个SNP位点的基因型检测结果显示，与现有的直接测序方法比较，本方法能同时检测多个样本的多个SNP位点，且操作简便，效率高，基因分型准确率可达95％以上(如表2所示)。
表210例肾移植患者FKBP1A、PPP3CB、NFATC1基因中35个SNP位点的基因型检测结果
| SNP_ID | 基因 | 纯合野生型(例数) | 杂合型(例数) | 纯合突变型(例数) |
| rs1017860 | NFATC1 | CC(8) | TT(1) | TC(1) |
| rs12569942 | PPP3CB | AA(4) | AG(6) | GG(0) |
| rs12608349 | NFATC1 | CC(0) | CT(5) | TT(5) |
| rs12644 | PPP3CB | AA(2) | AG(5) | GG(3) |
| rs1294689 | FKBP1A | CC(1) | CT(1) | TT(8) |
| rs1294690 | FKBP1A | AA(1) | GG(8) | GA(1) |
| rs12958819 | NFATC1 | AA(2) | GG(6) | GA(2) |
| rs12959273 | NFATC1 | AA(1) | AG(1) | GG(8) |
| rs160189 | NFATC1 | AA(5) | AG(3) | GG(2) |
| rs177820 | NFATC1 | CC(6) | CT(2) | TT(2) |
| rs1884392 | FKBP1A | AA(7) | CC(1) | CA(2) |
| rs1951765 | FKBP1A | AA(1) | TT(7) | TA(2) |
| rs2002311 | NFATC1 | CC(1) | CT(3) | TT(6) |
| rs2036892 | NFATC1 | AA(6) | TT(1) | TA(3) |
| rs2055899 | NFATC1 | CC(0) | CT(2) | TT(8) |
| rs2060611 | NFATC1 | AA(0) | GG(7) | GA(3) |
| rs2280055 | NFATC1 | CC(6) | TT(1) | TC(3) |
| rs2581731 | NFATC1 | CC(1) | CT(7) | TT(2) |
| rs2596606 | NFATC1 | AA(4) | AG(5) | GG(1) |
| rs306871 | NFATC1 | CC(1) | CT(4) | TT(5) |
| rs3826567 | NFATC1 | CC(8) | TT(0) | TC(2) |
| rs3826572 | NFATC1 | AA(6) | GG(2) | GA(2) |
| rs3894049 | NFATC1 | CC(8) | GG(1) | GC(1) |
| rs4799055 | NFATC1 | GG(4) | GT(4) | TT(2) |
| rs6041749 | FKBP1A | CC(0) | TT(6) | TC(4) |
| rs6041861 | FKBP1A | AA(7) | GG(1) | GA(2) |
| rs6041880 | FKBP1A | AA(6) | GG(1) | GA(3) |
| rs6506775 | NFATC1 | CC(8) | CT(1) | TT(1) |
| rs68734 | NFATC1 | CC(1) | CG(5) | GG(4) |
| rs7240932 | NFATC1 | CC(0) | CT(3) | TT(7) |
| rs754093 | NFATC1 | GG(1) | GT(7) | TT(2) |
| rs754505 | NFATC1 | AA(0) | AG(0) | GG(10) |
| rs8090864 | NFATC1 | AA(3) | AG(6) | GG(1) |
| rs8091347 | NFATC1 | CC(3) | CG(6) | GG(1) |
| rs9518 | NFATC1 | CC(0) | TT(6) | TC(4) |
实施例3：用时间飞行质谱技术检测10例肾移植患者FKBP1B、PPP3R1、NFATC2基因中，共计48个SNP位点的基因型
1、人全血基因组DNA提取
用DNA提取试剂盒提取全血基因组DNA，并调整浓度为10-100ng/ul。
2、多重PCR反应
1)查找目的基因序列，针对突变位点，设计并合成PCR引物，
同时测定3种基因，48个SNP位点，设计的引物(如表3所示)；
2)根据已抽提样品编制384孔反应表，注明每孔对应的DNA样品的编号，所用引物；
3)按表在384孔板各孔中分别加入1μLDNA模板，贴膜，2000rpm/10秒离心后备用；
4)按下表配制PCR反应液：(以384个样本为例)
48个SNP位点，分为4个反应体系进行多重PCR，具体分组按表3所示；
5)取一排12联管，每孔加入配置好的PCR反应液133μL，短暂离心后备用；
6)用10ul排枪取12联管中PCR反应液4ul，加入已有1uLDNA的384孔板中，使各孔终体积为5ul；
7)将装有5ul反应液的384孔板短暂离心后放入PCR仪，运行名为“PCR”的反应程序。PCR反应程序为：94℃15min，45个循环(94℃20sec，56℃30sec，72℃1min)，72℃3min；
8)PCR反应程序结束后，将384孔板短暂离心后备用，4℃保存；
3、SAP处理
1)配制SAP反应液
2)取一排12联管，将SAP反应液以每孔66μL分装，短暂离心后，用10ul排枪分装于384孔PCR反应板，每孔加2μL，封膜、离心；
3)将已加入SAP反应液的384孔板放入PCR仪中，运行名为“SAP”的反应程序，SAP反应程序：37℃40min，85℃5min；
4)反应结束，将384孔板取出短暂离心备用，4℃保存；
4、延伸反应
1)配制iPlex反应试剂
2)取一排12联管，将iPlex反应液以每孔66μL分装，短暂离心后，用10uL排枪分装于384孔PCR反应板，每孔加2μL，封膜、离心，将已加入iPlex反应液的384孔板放入PCR仪中，运行名为“extension”的反应程序，延伸反应条件为：94℃30sec，40个循环{94℃5sec，5个小循环(52℃5sec，80℃5sec)}，72℃3min；
3)反应结束，将384孔板取出短暂离心备用，4℃保存；各位点单碱基延伸产物如表3所示；
5、产物纯化
1)取6mg树脂在384孔树脂刮板上，均匀覆盖，刮去多余的树脂，放置20min；
2)将反应结束的384孔板1000rpm离心1min，每孔加入25μL去离子水，倒置在树脂板上面(注意固定，不能移位)，然后反置将树脂板扣在384孔板上，敲击使树脂落入384孔板，封膜；
3)以384孔板的长轴为轴心，翻转384孔板20分钟，3500rpm、5分钟离心后备用；
6、质谱检测
1)NanodispenserSpectroCHIP芯片点样
将检测样品从384孔反应板转移到表面覆盖基质的MassARRAYSpectroCHIP芯片；
2)MassARRAYAnalyzerCompact质谱检测
将样品转移到SpectroCHIP芯片后，即可放入质谱仪进行检测，每个检测点只需3-5秒，全自动分析；
3)TYPER软件分析实验结果，获得分型数据。
本实施例对10例肾移植患者进行了检测，FKBP1B、PPP3R1、NFATC2基因中48个SNP位点的基因型检测，结果显示，与现有的直接测序方法比较，本方法能同时检测多个样本的多个SNP位点，且操作简便，效率高，基因分型准确率可达95％以上(如表4所示)。
表3FKBP1B、PPP3R1、NFATC2基因中48个SNP位点的基因型检测所用引物及产生的单碱基延伸物
| WELL | SNP_ID | 正向引物 | 反向引物 | 单碱基延伸引物 |
| W1 | rs10185680 | ACGTTGGATGTCTTTCCAGCACCTAGCCTC | ACGTTGGATGGGGAAAGGAGTAACAAGTGC | ggtTTGCTCACTGCAAATGT |
| W1 | rs11696516 | ACGTTGGATGAGAGATGGTGCGAGGTTTAC | ACGTTGGATGAATTCCCATATGCCAGCTCC | TGGAGAGAACAGAGAGACTAAG |
| W1 | rs12625064 | ACGTTGGATGCCATTTTACAGGTGGAAAGC | ACGTTGGATGAGCTTGCAGCCCCTTCCAGT | gcagtTGGAAAGCCTGAGTCATC |
| W1 | rs17199672 | ACGTTGGATGCCAAGGGTCCATCTTCTTTC | ACGTTGGATGTACAGGTCAGGCCAGATTCC | aTTCTTTCTTTTGCACCCTTT |
| W1 | rs2426295 | ACGTTGGATGATCCAGCTAAGGTGTGTGTC | ACGTTGGATGCGTAAGAGAGATCAAAGGTG | cctcTTTGCAAAATCATTTTTGAGA |
| W1 | rs2426300 | ACGTTGGATGACTTGGTGCAGTCATGAAGG | ACGTTGGATGGTGAGACAATGAGACTGACC | ctgcTGGAATTAGTGGCCTAAGAAGA |
| W1 | rs3787193 | ACGTTGGATGATTTCACATCACTCAGTTGC | ACGTTGGATGTCTTGTCGTTTTCTCATGGG | ggaATAGAATGGGGATTGGCGAC |
| W1 | rs4811189 | ACGTTGGATGGCCCTTCGAACCAGAAAAAC | ACGTTGGATGCCAAGGGTGTGTTTCTGATA | tttaTGATAAGATACAGTGCAGTT |
| W1 | rs6013189 | ACGTTGGATGTCTGTGCTCAGTTTCTCACC | ACGTTGGATGTCTGATCCCTCATAAGAGCC | tcgtgTCTCACCAGTAAAATTGAGAA |
| W1 | rs6021232 | ACGTTGGATGGACTACTAACAGGACATGCC | ACGTTGGATGTCCTAGATCTTTCTGGGTCG | ACTTTAAAAAATAGTAAGGTAGAAG |
| W1 | rs6021262 | ACGTTGGATGCTGTGCTGATCTCACCAACG | ACGTTGGATGTATGGGGAATGTCTCACTGG | TCACCAACGTTGTATCACC |
| W1 | rs6021266 | ACGTTGGATGAAGGCTTGCTTTGTGCCTAC | ACGTTGGATGCAGTGGTGAACTAAACAGGC | cAATGTCAGCTCCATGAA |
| W1 | rs6021276 | ACGTTGGATGAGATAAGCAGACAGATGTCC | ACGTTGGATGGCAGGGCTGGAATTGAAAAC | gaatACAGATGTCCAGAGAGA |
| W1 | rs6096426 | ACGTTGGATGACAGCTAGCGCTGATATTAG | ACGTTGGATGAAGCTGGGATTATAAGCGTG | GTGCCCAGCCAGAATAT |
| W1 | rs6096431 | ACGTTGGATGGACATGAAGATGGGAACAGC | ACGTTGGATGGTACCCAATTGGTAGATCCC | ggggaAGCAGATACTGAGGACTAATG |
| W1 | rs747063 | ACGTTGGATGCTGAGATCAAGAGTCTGAGC | ACGTTGGATGAGTAACTTTCCCGCCATGAC | taaAGGTTTACATCCTGGCA |
| W1 | rs761376 | ACGTTGGATGTCTGGTTACGACCATGCTTC | ACGTTGGATGGGGCAATCGTGTAGAGAATT | TAACTAAGGCAGAACGTGG |
| W1 | rs8123890 | ACGTTGGATGTAATGTATTGCGTGCTTGCT | ACGTTGGATGCTCATAGCGTTGCAGTGAAG | ccattTATTGCGTGCTTGCTAAATAC |
| W2 | rs11086340 | ACGTTGGATGGATGGATGGTAACATGTGGG | ACGTTGGATGGTGCGAAGGTTGAGAAATCC | TTAAGACATTGGAGTAAGAAAC |
| W2 | rs11086343 | ACGTTGGATGAGTGCCAGGCTGTGGAAACT | ACGTTGGATGCCAAAGAGTTGAGGGTTTCC | aGAAACTGCTGGAATCGGT |
| W2 | rs17199748 | ACGTTGGATGACACCCTGAAGATCTTGCTG | ACGTTGGATGGTCGATCTAAGACTTTGAGG | TGGAGGTACATGTGGTTAAG |
| W2 | rs2024581 | ACGTTGGATGCGCCCCTCATTTTATGCAAG | ACGTTGGATGGAGCGCGGTTACTTAAAATG | GAAGCTGAGAATTACCTGTGTAT |
| W2 | rs228832 | ACGTTGGATGCACAATCAGAGCAACACAGC | ACGTTGGATGTTGGGAGGTGGATTATACGG | cccatATTATACGGAACTTCTGGTCA |
| W2 | rs228835 | ACGTTGGATGGGCCAGGGTTCCCACTGAA | ACGTTGGATGAAATGTGTAACCCTTCAGGC | cCCCTTCAGGCAAAGTTCAC |
| W2 | rs3787190 | ACGTTGGATGATTTGACCTTCTGGGGCTTC | ACGTTGGATGCACACGTTCTCATTGACTCC | TCTCTCCAATTTGCTTCTT |
| W2 | rs4396773 | ACGTTGGATGCCAAAGACTGACTAGCCATC | ACGTTGGATGGCACATGATCCTTCAACTGG | tttggTGTGCTGAAATGGAAACTAT |
| W2 | rs6021183 | ACGTTGGATGAGATCACAGAACCCCGTATC | ACGTTGGATGGAGGTCTGTGCCTTAATGAG | gtgcGAGGTTGGTGTTAAAATGTCAC |
| W2 | rs6021231 | ACGTTGGATGGTGTGGTGGCTCTAATCCAA | ACGTTGGATGTCCAGATGCTGCAGAAATCC | ttttcGAAATCCCATAGTCTCTCT |
| W2 | rs6067766 | ACGTTGGATGATGAAACTACAAAGGAGGGC | ACGTTGGATGGAGTGAGGTGCTCCTTTAAG | TATGGGTAGGTCAGCATCA |
| W2 | rs6067796 | ACGTTGGATGGAAGAAAATCCAAACTGCCC | ACGTTGGATGTGTGGCTGGACTGGAGTTG | taaagCCAAACTGCCCATTGCAGCC |
| W2 | rs6123048 | ACGTTGGATGATCAGGCAGCTCTTCTACAC | ACGTTGGATGGTAGACAGACGAGTGAATCC | CTTCAATGTGGGACTCTG |
| W2 | rs761374 | ACGTTGGATGTTGAAGGGAGGAACTGTGAC | ACGTTGGATGTCCATCACTGACTCTGACCT | cgttCCTTCATGTCCCCATCT |
| W2 | rs910156 | ACGTTGGATGAGGCTCTGAATCAAGCTTCC | ACGTTGGATGTGTTCCCTAGTACAGCACCC | gctcACTACTCAGCAACATCTT |
| W3 | rs12994570 | ACGTTGGATGGAGAAGCTAAGTGGTTGTGG | ACGTTGGATGGCCTCTCAAATTACAACTAGG | TCTGTTCAGAAGCAATGA |
| W3 | rs228840 | ACGTTGGATGTTTCAACCATGGGCAGCTCG | ACGTTGGATGACCTCCTCTTTTGAACAGAC | gaaatAGAGAGAAGTCACTGTGAT |
| W3 | rs3787189 | ACGTTGGATGTTATTCCTGTTCGACGAGGG | ACGTTGGATGTTCATTGCTGACCAGCTGCC | CAGCTGCCTGACTTTAGGTA |
| W3 | rs3787197 | ACGTTGGATGATGATAGTGAGCTTAGGCAG | ACGTTGGATGGAGTGATTCATTCTCCAGCG | gggatTGAGCTTAGGCAGACTCCAAA |
| W3 | rs6021240 | ACGTTGGATGTCACGTTCTCATCAACCTCC | ACGTTGGATGAAGGGACAAGGCAGAAATTA | AGGGGTCCAGGTGAGAGATG |
| W3 | rs6123045 | ACGTTGGATGTGCTGCATTTTGACCATGGC | ACGTTGGATGCCCAAACAGTAAAGATAAAAC | ttGCACCATGCCCTTGCTAAACTAT |
| W3 | rs6126240 | ACGTTGGATGGGAGGAAGCTCACCAAGATG | ACGTTGGATGCAGCTACCACCTCTATACTC | ggaccAGCACTGGAATTCCAAG |
| W3 | rs7560138 | ACGTTGGATGCCCAGCAAACTGGAAGTTTC | ACGTTGGATGTTTGTTGAGCACCTACTTGG | agGGAAGTTTCTCGAGGAC |
| W4 | rs228851 | ACGTTGGATGATAGGACAGAGACTGACAAG | ACGTTGGATGTGTTTAGATGGCTCCTCAAG | cgcaCCCCTTTGTGCTCTGA |
| W4 | rs228852 | ACGTTGGATGTCCTGAGCTCAAGCGATCGT | ACGTTGGATGAAAAATACTGATGCCCAGCC | AGCGATCGTCCGGCCT |
| W4 | rs2426302 | ACGTTGGATGAGTGAGCCTCGTGAGAAGTG | ACGTTGGATGCCTGGCCAGTATTGAATTTT | GTATGAAAGATAACTTTTAGCAG |
| W4 | rs2426312 | ACGTTGGATGTTCCCATCAATGCGCATCTC | ACGTTGGATGGGCTTTATCAGAACAGCTTG | AGGGTAGAGAAGTGCC |
| W4 | rs4811187 | ACGTTGGATGTCAAGAGACTTCCCTGATGC | ACGTTGGATGTCACAAGTACCAACCTGTGC | ctaCCCATCCTCTCAACTTTA |
| W4 | rs6021264 | ACGTTGGATGCCACCTTGATAAAGACAGTG | ACGTTGGATGAAAGAAGGGACAGCAGTTAG | TAGAACTAACATAAGCTTCATTAA |
| W4 | rs6506775 | ACGTTGGATGTGCACTCAGCAGCACAGTGG | ACGTTGGATGCACAACGCAGAGAGAAAGAC | CGTGCGACCCCCACA |
表410例肾移植患者FKBP1B、PPP3R1、NFATC2基因中48个SNP位点的基因型检测结果
Claims (5)
1.一种同时测定人他克莫司作用靶点基因多态性的方法，其特征在于，对待测样品基因组DNA提取，经PCR扩增后，SAP处理、单碱基延伸后，产物纯化，用飞行时间质谱仪进行检测，进行基因分型，
通过以下步骤：
(1)设计序列特异性引物
查找目的基因的DNA序列，针对目的基因的突变位点设计筛选合适的引物对；并根据不同的位点，组合成不同的PCR反应体系；
(2)提取外周血细胞样本的基因组DNA，利用步骤(1)筛选的引物进行基因扩增；
(3)扩增的PCR产物进行SAP处理，进行单碱基延伸反应，纯化后得样品分析物；
(4)样品分析物点样至芯片基质，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析，获得样品分析物的分子量，检出SNP位点信息，完成基因分型分析。
2.按权利要求1所述的测定人他克莫司作用靶点基因多态性的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，
采用DNA提取试剂盒提取人外周血细胞样本的基因组DNA，调整所述DNA浓度为10-100ng/ul。
3.按权利要求1所述的测定人他克莫司作用靶点基因多态性的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的PCR反应体系通过下述步骤进行，
1)标注每孔对应的DNA样品的编号及所用反应体系和引物；
2)在反应孔中分别加入1μLDNA模板，贴膜，2000rpm/10秒离心后备用；
3)按下表配制PCR反应液：
4)PCR反应液4ul，加入已有1uLDNA的反应孔板中，使各孔终体积为5ul；
5)将每孔装有5ul反应液的孔板短暂离心后放入PCR仪，进行“PCR”的反应程序，该PCR反应程序为：94℃15min，45个循环(94℃20sec，56℃30sec，72℃1min)，72℃3min；
6)PCR反应程序结束后，将孔板短暂离心后备用，4℃保存。
4.按权利要求1所述的测定人他克莫司作用靶点基因多态性的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，SAP处理和单碱基延伸反应通过下述步骤进行，
1)按下表配制SAP反应液：
2)PCR反应孔板，加入SAP反应液，每孔加2μL，封膜、离心；
3)将已加入SAP反应液的孔板放入PCR仪中，运行名为“SAP”的反应程序；SAP反应程序：37℃40min，85℃5min；
4)反应结束，将孔板取出短暂离心备用，可在4℃保存；
5)延伸反应
(1)按下表配制iPlex反应试剂
(2)将iPlex反应液加入PCR反应孔板，每孔加2μL，封膜、离心；
(3)将已加入iPlex反应液的孔板放入PCR仪中，运行名为“extension”的反应程序，延伸反应条件为：94℃30sec，40个循环{94℃5sec，5个小循环(52℃5sec，80℃5sec)}，72℃3min；
(4)反应结束，将孔板取出短暂离心备用，4℃保存；
6)产物纯化
(1)取树脂在树脂刮板上，均匀覆盖，刮去多余的树脂，放置20min；
(2)将反应结束的孔板1000rpm离心1min，每孔加入25μL去离子水，倒置在树脂板上面，然后反置将树脂板扣在孔板上，敲击使树脂落入孔板，封膜；
(3)翻转孔板20分钟，3500rpm、5分钟离心后备用。
5.按权利要求1所述的测定人他克莫司作用靶点基因多态性的方法，其特征在于，所述步骤(4)中采用TYPER软件分析实验结果。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160113 |
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