IT8319490A1 - Cellule microbiche contenenti S-adenosil metionina in concentrazione elevata e procedimento per la produzione di S-adenosil metionina - Google Patents

Cellule microbiche contenenti S-adenosil metionina in concentrazione elevata e procedimento per la produzione di S-adenosil metionina Download PDF

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Description

DOCUMENTAZIONE
RILEGATA
D E S C R I Z I O N E
dell 'invenzione industriale dal titolo:
"Cellule microbiche contenenti S-adenosil metionina in concentrazione elevata e procedimento per la produzione di S-adenosil metionina".
RIASSUNTO
Si descrive un procedimento per produrre S--adenosil metionina che consiste nel sottoporre a coltura un microrganismo in grado di produrre S-ade nosil metionina, nel separare le cellule microbiche e nellOttenere S-adenosil metionina in forma stabile.
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda cellule microbiche contenenti S-adenosil metionina in<- >una concentrazione elevata e sostanze simili ad adenina e so-stanze reattive con la ninidrina soltanto in basse concentrazioni e riguarda un procedimento per produr-re S-adenosil metionina per mezzo del quale si pu? ottenere S-adenosil metionina dotata di un elevato grado di purezza da tali cellule microbiche con buona efficienza mediante un?operazione semplice.
E' noto che la S-adenosil metionina (qui di seguito abbreviata SAM) ? una sostanza dotata di effetto terapeutico nei confronti d? "jecur adipsum", lipemia, arteriosclerosi, ecc., e recentemente si ? desiderato produrre questa sostanza in grandi quantit?.
Un procedimento industriale per produrre SAM proposto fino ad ora consiste nel sottoporre a coltura un lievito del genere Saccharomyces in un mezzo di coltura liquido contenente metionina, nell<1>estrar-re SAM accumulata nelle cellule microbiche e nel purificarla (per esempio, J. Biol. Chem., 229, 1037 (1957)]. Tuttavia, in questo procedimento la quantit? di SAM accumulata nelle cellule ? circa 3% al massimo e l'estratto ottenuto dalle cellule microbiche ? molto difficile da purificare poich? esso contiene notevoli quantit? di sostanze derivate da adenina oppure sostanze reattive con ninidrina che sono difficili da separare da SAM. In particolare ? difficile sepa-rare adenina, S-adenosil omocisteina e.metiltioade nosina. In un tentativo per eliminare questo inconve-niente, sono stati proposti alcuni metodi per la purificazione della SAM (per esempio pubblicazioni dei brevetti giapponesi N, 13680/1971, 21079/1974 e 20998/1978, e pubblicazione del brevetto pubblicato giapponese N? 145299/1981), per? si ? dimostrato che tali m?todi non sono sufficienti per ottenere SAM con un elevato grado di purezza in modo economico con un elevato rapporto di ricupero?
E1 noto inoltre un metodo che consiste nel sottoporre; a coltura un lievito che appartiene ai generi Candida, Pichia, Hansenula, Rhodotorula, ecc., in modo da formare e accumulare SAM nelle cellule oppure nel brodo di coltura (per esempio pubblicazione del brevetto giapponese N? 17118/i977)* Anche injtale procedimento la purificazione della SAM nelle cellule microbiche ? difficile e il ricupero della SAM dal mezzo di coltura ? pi? difficile poich? il mezzo di coltura oltre a SAM contiene diversi rnetaboliti oppure il prodotto di decomposizione della SAM.
Inoltre, poich? la SAM ? una sostanza molto instabile, spesso la pratica ? quella di trasportare cellule microbiche contenenti SAM in un posto lontano. In questo caso, il basso contenuto di SAM ? economicamente svantaggioso. .
Allo scopo di rimediare ai suddetti inconvenienti delle tecniche precedenti, gli inventori della presente invenzione hanno studiato assiduamente un procedimento industriale per la fabbricazione di SAM mediante una tecnica di fermentazione. Questo lavoro ha portato alla fine alla scoperta che quando il contenuto di SAM nelle cellule microbiche viene aumentato al disopra di un certo liv?llo non realizzabile dalle tecniche precedenti, le quantit? di impurezze che sono presenti nelle cellule microbiche e che sono difficili da separare dal SAM diventano molto piccole rispetto a SAM, e tali cellule microbiche sono molto facili da purificare e si pu? produrre in modo economico SAM dotata di un elevato grado di purezza con un elevato rapporto di ricupero.
In un aspetto, la presente invenzione realizza cos? una cellula microbica avente accumulato in essa almeno 10% in peso, riferito al peso della cellula secca, di SAM, detta cellula venendo ottenuta sottoponendo a coltura un microrganismo avente la capacit? di produrre SAM in un mezzo di coltura liquido contenente metionina.
In un altro aspetto, la presente invenzione realizza un procedimento per produrre SAM, che consiste nel sottoporre a qoltura un microrganismo avente la capacit? di produrre SAM in un mezzo di coltura liquido contenente metionina in modo da accumulare almeno 10% in peso, riferito al peso della cellula secca, di SAM nelle cellule microbiche, nel separare le cellule microbiche dal mezzo di coltura e ottenere quindi SAM in forma stabile dalle cellule microbiche.
Il microrganismo usato nella presente invenzione pu? essere qualsiasi microrganismo che ha la capacit? di produrre SAM e che pu? consentire un accumulo di almeno il 10% in peso, riferito alle cellule secche, di SAM nelle cellule microbiche in un mezzo liquido contenente metionina. si preferiscono lieviti del genere Saccharomyces'e si preferiscono in particolare lieviti di Saccharomyces cerevisiae. Esempi specifici comprendono Saccharomyces cerevisiae IFO 2342, saccharomyces cerevisiae IFO 2343, Saccharomyces cerevisiae IFO 2345, Saccharomyces
cerevisiae IFO 2346, Saccharomyces cerevisiae IFO 2347, e Yeast of Sake Kyokai N? 9. Si possono impiegare anche mutanti naturali e artificiali di questi ceppi che hanno le propriet? di cui sopra.
La cellula microbica secondo la presente invenzione contiene SAM in una quantit? di .almeno 10% in peso, preferibilmente di almeno-12% in peso, riferito al peso della cellula secca.
La cellula microbica della presente invenzione non ? particolarmente limitata per quel che riguarda un procedimento per.la sua produzione e.di solito vie- * ne prodotta sottoponendo a coltura il microrganismo in condizioni aerobiche in un mezzo di coltura liquido contenente metionina, sorgenti, di carbonio, sorgenti di azoto, sali inorganici e quantit? molto piccole di sostanze organiche nutrienti*
L? metionina viene aggiunta di solito in una proporzione di almeno 0,2 g/dl al mezzo di coltura* La metionina pu? venire aggiunta in una sola volta ' . oppure pu? venire aggiunta successivamente in por-zioni suddivise. Tuttavia, se si realizza il primo procedimento, quando la quantit? di metionina aggiunta ? grande, la quantit? di SAM accumulata nella cellul a microbica tende a diminuire. In tale caso ? pi? adatto l 'impiego del secondo procedimento.
Esempi delle sorgenti di carbonio sono zuccheri come glucosio, saccarosio e fruttosio, alcoli come etanolo e glicerolo, idrolizzato di amido, melasse, siero di soia, liquido di scarto di succhi di frutta, liquidi di scarto della lavorazione del pesce, liquido di scarto di ; fermentazioni, e liquido esaurito della pasta di legno. Sorgenti di azoto preferite comprendono urea, trimetilendiammina, tetrametilendiammina, spernjina, spermidina e 3-ammino-i ,.2 ,4--triazolo.
Si possono usare sali inorganici normali come ? necessario? Esempi comprendono fosfati come per esempio fosfato di potassio, fosfato di sodio, fosfato di calcio e fosfato di litio; sali di potassio come cloruro di potassio; sali di sodio come cloruro di sodio e carbonato di sodio; sali di magnesio come solfato di magnesio e cloruro di magnesio; sali di manganese come solfato di manganese e cloruro di manganese; sali di ferro come solfato di ferro e cloruro di ferro; sali di zinco; sali di rame; e sali di cobalto.
Esempi di sostanze organiche nutrienti che possono venire usate, a seconda della necessit?, comprendono vitamine, ammino acidi, estratto di lievito, estratto di carne, estratto di malto, liquido di macerazione del mais, "Casamino acid", farina di soia, idrolizzato di soia, peptone, triptone e un prodotto di decomposizione della caseina.
Preferibilmente, la coltura viene effettuata in condizioni aerobiche. Di solito, effettuando la coltura ad una'temperatura di 15 - 45?C, preferibilmente 20 - 35?C per un periodo di tempo compreso tra 2 e 10 giorni regolando il pH del mezzo di coltura ad un valore compreso tra 3 e 8,preferibilmente compreso tra 3,5 e 7? nelle cellule microbiche si forma e si accumula SAM
Secondo il procedimento della presente invenzione, le cellule microbiche vengono separate dal mezzo di coltura dopo la coltura e quindi SAM viene ^estratta dalle cellule microbiche e viene purificata. In queste fasi si possono adottare metodi di per s? noti. Per esempio, si pu? applicare una separazione mediante centrifugazione oppure una filtrazione per separare le cellule microbiche dal mezzo di coltura. Per ottenere SAM dalle cellule microbiche, ? possibile estrarre SAM dalle cellule impiegando un agente di estrazione come acido perclorico, acido cloridrico, acido solforico, acido formico, acido acetico, esteri costituiti da formiati, esteri costituiti da acetati oppure etanolo e purificare SAM nell?estratto in modo usuale. Non vi ? alcuna particolare limitazione per quel che riguarda il procedimento di purificazione della SAM. Per esempio, si pu? adottare da solo oppure in combinazione, un procedimento eromatografico impiegando carbone attivato, resine scambi atrici di cationi fortemente acide, resine scambiatrici di cationi debolmente acide oppure resine di chelati; un procedimento che consiste nel far precipitare SAM con "reinecke salt", con acido picrico, acido fosfotungstico, acido picrolonico ecc., e un procedimento che consiste nel far precipitare SAM impiegando un solvente organico come acetone oppure etanolo. Allo scopo di ottenere SAM in forma stabigenerale
lizzata, la pratica ? quella di aggiungere un acido come per esempio acido solforico, acido p-toluensolfonico oppure acido solfosalicilico e separare la SAM sotto forma di un sale oppure di un sale doppio.
Le cellule microbiche della presente invenzione sono adatte per il trasporto di SAM non stabile poi-, ch? esse contengono SAM in elevate concentrazioni.
Inoltre, poich? queste c?llule microbiche contengono soltanto basse concentrazioni di impurezze difficili da separare dal SAM, ? facile purificare la SAM e di conseguenza si pu? ricuperare SAM dotata di un elevato grado di purezza con un buon rendimento.
Gli esempi che seguono illustrano la presente invenzione in modo pi? specifico.
Esempio ?
Una ansata di ciascuno dei ceppi di microrgani^ smi indicati nella Tabella 1 che sono stati fatti crescere per 2 giorni in un mezzo di coltura costituito da agar inclinato (pH 6,0) costituito da
5 g/dl di glucosio, 0,5 c/dl di polipeptone, 0,4 g/dl 'di KH PO , 0,4 g/dl di K HPO , 0,02 g/dl di
^ ? ^ ?
MgSO^.7H^0, 0,2 g/dl di estratto di lievito e 2 g/dl di agar ? stata inoculata in 10 mi di un mezzo di coltura sterilizzato con calore regolato a pH 6 ,0 e costituito da 10- c/dl di saccarosio, 1 g/dl di estratto di lievito, 0,4 g/dl di KH^PO^ , 0,0i g/dl di MgSO , 7H 0, 1 ,0 g/dl di L-metionina, 0, 25 mg/ di di 4 2
ZnS04?7H20 e 1 ,25 mg/ di di MnS04.4-6H20, e si ? effettuata 1 ' incubazione sotto sbattimento a 28?c per 4 giorni?
Le cellule microbiche sono state raccolte mediante separazione con centrifugazione, sono state lavate con soluzione salina fisiologica, sono state in
poste in sospensione /acido perclorico 1,5 N e sono state sottoposte a sbattimento a temperatura ambiente per 1 ora in modo da estrarre la SAM? L'estratto ? stato sottoposto a cromatografia su carta e a cromatografia in fase liquida ad elevata prestazione per determinare il contenuto in SAM, in adenina (abbreviato Ad), in S-adenosil omocisteina (abbreviato SAH) e in metiltioadenosina (abbreviato MTA) . I risultati vengono mostrati nella Tabella 1.
Tabella 1
Quantit? di
SAM riferito Quantit? Quanti- Quantit? Prova Ceppo di microorga-? alle cellula di Ad
N t?s? di MTA nismo secche (%
peso) <*) <*) (*) 1-1 IFO 2342 14^8 2r5 x IO"3 0,06 0,03 1-2 IFO 2343 12,9 3.8 x IO"3 0,13 0,08 lltoCoorn
<y
Sii 1-3 IFO 2345 13 6.2 x IO"3
o 1.0
I 0,09 0,04 ?H
SI
? 1-4 IFO 2346 ' 19?! 1.9 x IO"3 0,06 0,02 ? 1-5 IFO 2347 16,7 8.3 x IO"3 0,06 0,03 H (h(SShcarmycesacoesycaccarom
1-6 Li)ii)iiaeecerevsecevsaervito di-Salee
Kyokai N.o. 9 18,5 2,7 x IO"3 0,06 0,07
1-7 IFO 0259 V 9,6 x IO"2 1,6 0,54 1-8 IFO 1346 4.0 5.3 x IO"2 V. 0,33 1-9 IAM 4175 V 8.8 x IO"2 315 0,69 1-10 IAM 4274 5,3 5T9xlO-2 M 0,90 1-11 IFO 2003 5.1 4.9 x IO-2 W 0,34 1-12 IFO 2363 2?1 7.3 x IO"2 li1 0,47 (*): I valori relativi sono stati calcolati riferendosi alla quantit? di SAM.-come 100.
I risultati riportati nella Tabella 1 mostrano che quando il contenuto di SAM riferito alle cellule 'secche/superiore al 12%, il contenuto di impurezze difficili da separare dal SAM ? piccolo.
Esempio 2
Si sono preparate cellule microbiche aventi differenti contenuti di SAM riferito al peso delle cellule secche sottoponendo a coltura Saceharomyces cerevisiae IFO 2346 nel medesimo mezzo di coltura descritto nell?Esempio 1 tranne che il tempo di incubazione, il pH del mezzo di coltura e la temperatura di incubazione sono stati cambiati. Le cellule microbiche ottenute sono state estratte ed analizzate adottando i medesimi metodi descritti nell'Esempio 1. I risultati sono mostrati nella Tabella 2.
ll Ctonoor
Tabella 2
Contenuto di SAM
Quantit? Quantit? Quantit? Prova N? riferito alle cel di Ad di SAH di MTA lule secche- (%
in peso) (*) (*) (*)
2-1 ' 19 ,9 1.8 x 10"3 0,06 0,01 2-2 19,1 1 .9 x 10"3 0,06 0,02 2-3 .16,3 3.1 x 10"3 0,08 0,04 2-4 15,1 6 .2 x 10-3 0,28 0,04 2-5 12,0 9.3 x 10?3 0,30. 0,07
g 2-6 6,2 4,9 x 10 2 9,9 0,33 -2 *
? ' 2-7 3,5 5,4 x 10 1,4 0,33 d
^ 2-8 1 , 8 9,6 x 10?2 1,7 0,37 H .
(*) I valori relativi sono stati calcol ati' prendendo la quantit? di SAM come 100.
Esempio 3
Una ansata di ciascuno dei ceppi di microrganismi indicati nella Tabella 3 ? stata inoculata in 10 mi di un mezzo di coltura sterilizzato a caldo regolato a pH 6,0 e costituito da 5 g/dl di glucosio, 0,5 g/dl di polipeptone, 0,4 g/dl di KH^PO , 0,4 g/dl di K2HP0?4 , 0,02 g/dl di MgS04.7H20 e 0,2 g/dl di estratto di lievito^ si ? effettuata l'incubazione sotto sbattimento a 28?C per 24 ore.
Un litro di un mezzo di coltura regolato a pH 6,0 e costituito da 10 g/dl di saccarosio, 1 c/ di di estratto di lievito, 0,4 g/dl di ??^??^ , 0 , 01 g/dl di MgSO . 7H 0 , 1 , 5 g/dl di urea ( sterilizzata separatamente) , 0 , 75 g/dl di L-metionina, 0, 02 g/dl di Cad2.2H20, 0, 25 mg/dl di ZnSO^i^O , 0 , 25 mg/dl di FeS0^. 7H20, 125 mg/dl di MnS0^.4-6H20 , 2 y.g/ ?i di GUS04. 5H20 , 2 jmg/dl di H3B03 , 0 , 2 jig/dl di COC12 *6H20 e 1 jic/dl di KI ? stato introdotto in un fermentatore da 2 litri ed ? stato sterilizzato. Quindi , 5 mi del brodo di coltura seminato preparato come indicato sopra sono stati inoculati nel mezzo di coltura e si ? effettuata 1 * incubazione a 28?C per 72 ore con aerazione ed agitazione.
Dopo 1 ' incubazione, le cellule microbiche sono state raccolt? separandole mediante centrifugazione, sono state, lavate una volta con soluzione salina fisiologica, sono state ? poste in sospensione in 100 mi di acido perclorico- 1 , 5N e sono stata sottoposte, a sbattimento a temperatura ambiente per i ora. L a so-%
spensione ? stata centrifugata p?r separare le cellule microbiche e il liquido ottenuto ? stato regolato a pH 4,5 aggiungendo bicarbonato di potassio. Il precipitato ottenuto di perclorato di potassio ? stato separato mediante centrifugazione ottenendo un estratto contenente SAM . La quantit? di SAM nell'e-stratto ? stata determinata e la quantit? di SAM riferita alle cellule secche viene indicata nella Tabella 3.
L ' estratto in una quantit? di 0, 2 g calcolato come SAM ? stato fatto passare attraverso ad una colonna 'riempita con 50 mi di Amberlite IRC-50 (forma H+ ) , : una resina se ambi atr ice di cationi debolmente ?cida, in modo da provocare l ' adsorbimento di SAM. Acido acetico 0.005N ? stato fatto passare attraverso alla colonna per lavarla fino a che il fattore di absorbimento in corrispondenza di 260 nm dell ' eluato ? diventato inferiore a 0, 1. Si sono allontanate cos? le impurezze. La quantit? di acido acetico' 0, Q05N richiesta in questo momento viene indicata nell a Tabella 3. Attraverso la colonna si ? quindi fatto passare acido solforico 0, 1N e si ? eluita SAM fino a che il fattore di absorbimento in corrispondenza di 260 nm dell ' eluato ? diventato inferiore a 0 , 05. L ' eluato ? stato trattato con la resina Amberlite IRA 900 (forma OH-) in modo da regolare il suo pH a 3,0, e quindi l ' eluato ? stato liofilizzato ottenendo solfato di SAM. Il rapporto di ricupero della SAM viene mostrato nella Tabella 3. Il i
grado di purezza della SAM ? stato misurato mediante cromatografia in strato sottile di cellulosa, mediante cromatografia su carta e mediante cromatografia in fase liquida ad elevata prestazione e viene mostrato nella Tabella 3
Tabella 3
Clltonroo
Quantit? di aci-Quantit? di Rapporto Reazione alli do acetico 0,0051 Grado d ninidrina di SAM riferi I di ricupurezza
richiesta per al- pero di sostanze di-Ce(Sh(Shaccaromvcesaccaromvcseppo di microrgata alle cel-Pro1va N? verse da SAM i)i)licerevsaecerevsae nismo lontanare le im- di SAM
lule secche SAM (2)
(% in peso) pureae(ml) ( % ) <*1) (*2)
o)
c
0 3-1 IFO 2343 12,1 980 ,94 95 tracce;(+)
a
V 3-2 IFO 2346 18,8 770 96 . 96 II
>
Mc 3-3 IFO 2347 16,7 890 94 95 II
3-4 IFO 1346 3;1 1910 86 84 +
3-5 IAM 4274 . 4,? .1760 86 83 +
3-6 IFO 2363 2J1 2440 81 : 86 +

Claims (6)

RIVENDICAZIONI
1. Cellula microbica contenente almeno 10% in peso, riferito alla cellula secca, di S-adenosil met ionina
2. Cellura microbica secondo la rivendicazione 1 che ? una cellula di un lievito del genere Saccharo myces.
3 Cellula microbica secondo la rivendicazione 1 che ? una cellula di un lievito che appartiene a Saccharomyces cerevisiae.
4. Procedimento per produrre S-adenosil metionina, che consiste nel sottoporre a coltura un microorganismo avente la capacit? di produrre S-adenosil metionina in un mezzo di coltura liquido contenente metionina in modo da accumulare almeno id? in peso, riferito alle cellule microbiche secche / di S-adenosil metionina nelle cellule microbiche, separare le cellule microbiche dal mezzo di coltura e ottenere quindi S-adenosil metionina in una forma stabile dalle cel-lule microbiche.
5. Procedimento secondo la rivendicazione 4 in cui il microrganismo ? un lievito del genere Saccharomyces.
6. Procedimento secondo la rivendicazione 4 in cui il microrganismo ? un lievito che appartiene a Saccharomyces cerevisiae.
2. Rivendicazione:
procedimento per produrre s-adenosil metionina, che consiste nel sottoporre a coltura un microorganismo avente la capacit? di produrre S-adenosil metionina in un mezzo di coltura liquido contenente metionina in modo da accumulare almeno 10% in peso, riferito alle cellule microbiche , . secche , di S-adenosil metionina nelle cellule microbiche, separare le cellule microbiche dal mezzo di coltura e ottenere quindi S-adenosil metionina in una forma stabile dalle cel-?
lule microbiche.
3. Descrizione Dettagliata della invenzione:
La presente invenzione riguarda un procedimento per produrre S-adenosil metionina mediante un metodo di fermentazione e pi? specificamente riguarda un.procedimento per mezzo del ;quale si produce in modo economico s-adenosil.metionina dotata di un elevato grado di purezza sottoponendo a coltura un microorganismo on un mezzo di coltura liquido contenente metionina.
E' noto che la S-adenosil metionina (qui di seguito abbreviata SAM) ? una sostanza fisiologicamente attiva importante che partecipa nel metabXismo in
vivo di grassi, proteine, zuccheri, ecc. Recentemente, si ? scoperto che SAM ? dotata di effetto terapeutico nei confronti di "jecur adipsum", lipemia, arteriosclerosi, sviluppo di psicosi, visioni, neurosi, sensazione di dolore in nevrosi di artropatie degenerative, insonnia ecc. e recentemente si ? desiderato produrre questa sostanza in grandi quantit?.
Come procedilento industriale per produrre
SAM, si ? proposto fino ad ora un procedimento che consiste nel sottoporre a -coltura un lievito del genere Saccharomyces in un mezzo di coltura liquido contenente metionina, nell'estrarre SAM accumulata nelle cellule microbiche e nel purificarla [per esempio, J. Biol. Chem., 229, 1037 (1957)]. Tuttavia, con questo procedimento la quantit? di SAM accumulata nelle cellule microbiche ? circa 3% al massimo e l?estratto ottenuto dalle cellule microbiche ? molto difficile da purificare poich? esso contiene notevoli quantit? di sostanze derivate da adenina oppure sostanze reattive con ninidrina che sono difficili da separare da SAM. In particolare ? difficile separare adenina, S-adenosil omocisteina e metiftLoadesosina . In un tentativo per eliminar questo invonveniente, sono stati proposti alcuni metodi per la purificazione della SAM (per esempio pubblicazioni dei brevetti giapponesi N.113680/1971, 21079/1974 e 20998/1978, e pubblicazione dei brevetto pubblicato giapponese No, 145299/1981), per? si ? dimostrato che tali metodi non sono sufficienti per ottenere SAM con un elevato grado di purezza in modo economico con un elevato rapporto di ricupero,
E1 noto inoltre un metodo che consiste nel sottoporre a coltura lieviti che appartengono ai generi Candidar pichia, Hansenula, Rhodotorula, ecc., in
modo da formare e accumulare SAM nelle cellule microbiche oppure nel brodo di coltura (per esempio pubblicazione del brevetto giapponese No. 17118/1977). Anche in tale procedimento per? la purificazione della SAM nelle cellule microbiche ? difficile e il ricupero della SAM dal mezzo di coltura ? pi? difficile poich? il mezzo di coltura oltre a SAM contiene diversi metaboliti oppure il prodotto di decomposizione
della SAM
Gli inventori della presente invenzione hanno studiato assiduamente un procedimento industriale per la fabbricazione di SAM mediante una tecnica di fermentazione ed hanno scoperto che quando il contenuto di SAM nelle cellule microbiche viene aumentato di SAM nelle cellule microbiche viene aumentato al disopra di un certo livello non realizzabile dalle tecniche precedenti, le quantit? di impurezze che sono presenti nelle cellule microbiche e che sono difficili da separare dal SAM nelle-cellule microbiche viene aumentato al disopra di un certo livello non realizzabile dalle tecniche precedenti, le zuantit? di impurezze che sono presenti nelle cellule microbiche e che sono difficili da separare dal SAM diventano molto piccole rispetto a SAM, e tali cellule microbiche sono molto facili da purificare e si pu? produrre in modo economico SAM dotata di un elevato grado di purezza con un elevato rapporto di ricupero.
Questa scoperta ha portato al perfezionamento della presente invenzione.
In tal modo, la presente invenzione
realizza un procedimento per produrre SAM, che consiste nel sottoporre a coltura un microorganismo avente la capacit? di produrre SAM in un mezzo di coltura liquido contenente metionina in modo da accumulane almeno 10% in peso, riferito al peso della cellula secca, di SAM nelle cellule microbiche, nel separare le cellule microbiche dal mezzo di coltura e ottenere quindi SAM in forma stabile dalle cellule microbiche.
I microorganismi usati nella presente invenzione possono essere qualsiasi microorganismo che ha la capacit? di produrre SAM e che pu? consentire un accumulo di almeno il 10% in peso, riferito alle cellule secche, di SAM nelle cellule microbiche, si preferiscono lieviti del genere Saccharomyces? Esempi specifici comprendono Saccharomyces cerevisiae IFO 2342, Saccharomyces cerevisiae IFO 2343, Saccharomyces cerevisiae IFO 2345, Saccharomyces
cerevisiae IFO 2346, Saccharomvces cerevisiae IFO 2347, e Yeast of Sake Kyokai N? 9. Si possono impiegare anche mutanti naturali e artificiali di questi ceppi che hanno le propriet? di cui sopra.
Nella presente invenzione, un requisito essenziale ? quello di coltivare microorganismi sino a
che non si raggiunge il contenuto di SAM in ima quantit? di almeno 10% in peso, preferibilmente di almeno 12% in peso.
In questo caso dove il contenuto di SAM ? inferiore al 10% in peso, contenuti di sostanze simili ad adenina oppure sostanzialmente con la ninidrina sono relativamente elevati e ci? rende impossibile eseguire in modo efficace la purificazione di SAM.
Sebbene le condizioni di coltura per regolare il contenuto di SAM non ? particolarmente limitata, si preferisce condurre la coltura in condizioni aerobiche in un mezzo di coltura liquido contenente metionina, sorgenti di carbonio, sorgenti di azoto, sali inorganici e quantit? molto piccole di sostanza organiche nutrienti.
Ma metionina viene aggiunta di solito in una proporzione di almeno 0,2 g/dl. La metionina pu? venire aggiunta sia con un metodo in cui si aggiunge tutta la quantit? in una sola volta sia.con un metodo in cui pu? venire aggiunta successivamente in porzioni suddivise. Tuttavia, se si realizza il primo procedimento, quando la quantit? di metionina aggiunta ? grande, la quantit? di SAM accumulata nelle cellule microbiche rende a diminuire. In tale caso ? pi? adatto l?impiego del secondo procedimento.
Esempi delle sorgenti di carbonio includono zuccheri come glucosio, saccarosio, fruttosio ecc, alcoli come etanolo, glicerolo ecc.; idrolizzato di amido, mealsse, siero di soia, liquido di scarto di succhi di frutta, liquidi di scarto della lavora? zione del pesce', liquido di scarto di fermentazioni, liquido esaurito della pasta di legno ecc.; sorgenti di azoto preferite comprendono urea, succinato di ammonio, citrato di ammonio, lattato di ammonio, ecc.
Come sali inorganici normali che si possono usa- . re in modo appropriato come ? necessario vi sono sali inorganici normali, ad esempio fosfati come per esempio fosfato di potassio, fosfato di sodio, fosfato di calcio, fosfato di litio ecc.; sali di potassio come cloruro di potassio ecc.; sali di sodio come cloruro di sodio, carbonato di sodio ecc.; sali di magnesio come solfato di magnesio, cloruro di magnesio ecc.; sali di manganese come solfato di manganese, cloruro di manganese ecc.; sali di ferro come solfato di ferro e cloruro di ferro; sali di zinco; sali di rame; sali di cobalto ecc..
Esempi di quantit? in traccia di sostanze organiche nutrienti che possono venire usate a seconda della necessit?, comprendono vitamine, ammino acidi, estratto di lievito; contenenti queste sostanze, estratto di carne, estratto di malto, liquido di macerazione del masi, "Casamino acid", farina di soia, idrolizzato di sodio, peptone, un prodotto di decomposizione della caseina, ecc.
preferibilmente, la coltura viene effettuata in condizioni aerobiche. Di solito, effettuando la coltura ad una temperatura di 15-45?C, preferibilmente 20 ? 35?c per un periodo di tempo compreso tra 2 e 10 giorni regolando il pH del mezzo di coltura
ad un valore compreso tra 3 e 8, preferibilmente compreso tra 3,5 e 7, nelle cellule microbiche si forma e si accumula SAM.
Nella presente invenzione, le cellule microbiche vengono separate dal mezzo di coltura dopo la coltura e quindi SAM viene estratta dalle cllule microbiche e viene purificata. Non vengono limitati i metodi impiegati in questi procedimenti in particolare e si possono adottare metodi di per s? noti. Per esempio, si pu? applicare una separazione mediante centrifugazione, una filtrazione ecc. per separare le cellule microbiche dal mezzo di coltura. Per ottenere SAM stabilizzata di elevata purezza dalle cllule microbiche, ? possibile estrarre SAM delle cellule impiegando un agente di estrazione come acido perclorico, acido cloridrico, acido solforico, acido formico, acido acetico, esteri costituiti da formi?ti, esteri costituiti da acetati oppure etanolo e purificare SAM nell?estratto in modo usuale. Non vi ? alcuna particolare limitazione per quel che riguarda il procedimento di purificazione della SAM. Esempi di detto procedimento cromatografico impiegando ad esempio carbone attivato, resine scambiatrici di cationi fortemente acide, resine, scambiatrici di cati?oni debolmente acide oppure resine di chelati; un procedimento che consiste nel far precipitare SAM con "reinecke", con acido picrico, acido fosfotungstico, acido picrolonico ecc., e un procedimento che consiste nel far precipitare SAM impiegando un solvente organico come acetone, etanolo ecc. e cos? via. si pu? effettuare la purificazione combinando questi metodi in modo appropriato, se richiesto. Allo scopo di ottenere SAM in forma stabilizzata, la pratica generale ? quella di aggiungere un acido come per esempio acido solforico, acido
p-toluensolfonico oppure acido solfosalicilico e separare la SAM sotto forma di un sale oppure di
un sale doppio.
Gli esempi che"seguono illustrano la presente invenzione in modo pi? specifico.
Esempio 1
Una ansata di Saccharomyces cerevisiae IFO_ ? 2346 che sono stati fatti crescere per 2 giorni in un mezzo di coltura costituito da agar inclinata (pH 6,0) costituito da _ _ _ _ l '?___ 5 g/dl di glucosio, 0, 5 g/dl di polipeptone, 0,4 g/dl di KH2P04 , 0,4 g/dl di K2HP04 , 0,02 g/dl di MgS04.7H20, 0, 2 g/dl di estratto di lievito e 2 g/dl di agar ?. stata inoculata in 10 mi di un mezzo di coltura sterilizzato con calore regolato a pH 6 ,0 e costituito da 10 g/dl di saccarosio, 1 g/dl di estratto di lievito, 0,4 g/dl di ??^??^ , 0,01 g/dl di MgSO^.yH^O, 1 ,0 g/dl di L-metionina, 0, 25 me/ di di ZnSO *7H_0 e 1 , 25 mg/dl di MnSO ?4-6H 0, e si ? effettuata l ? incubazione sotto sbattimento a 28?C per 4 giorni.
Le cellule microbiche sono state raccolte mediante separazione con centrifugazione, sono state lavate con soluzione salina fisiologica, sono state in
poste in sospensione /acido perclorico 1,5 N e sono state sottoposte a sbattimento a temperatura ambiente per 1 ora in modo da estrarre la SAM, 1 ' estratto ? stato sottoposto a cromatografia su carta e a cromatografia in fase liquida ad elevata prestazione per determinare il contenuto in SAM, in adenina (abbreviato Ad), in S-adenosil omocisteina (abbreviato SAH) e in metiltioadenosina (abbreviato MTA), I risultati vengono mostrati nella Tabella 1
Tab -elyla-1
Quantit? di Quanti- Quantit? SAM riferito Quantit?
Prova .Ceppo di microorga alle cellule di Ad
N? t?s? di MTA nismo secche (% in<
peso) (*) (*) (*) lltCoroon
1-1 IFO 2342 14;8 2r5 x IO-3 0,06 0,03
1-2 IFO 2343 12,9 ... 3.8 x IO"3 0,13 0,08ro
STi 1-3 IFO 2345 13.0 G^2 x IO"3 0,09 o0,04 2 (hS 1
(hSrmycesaacco
tsi' ycesaccarom
c 1-4 )ii)iiaecerevsecerevsa IFO 2346 19,1. 1.9 x1?"3 0,06 0,02 >"
?? 1-5 IFO 2347 16,7 8,3x 10?3 -0,06 0;03 H
1-6 Llevito di-?:Sake
Kyokai No. 9 2,7X10"3 0,06
1-7 IFO 0259 3,i 9,6 x IO"2 0,54
1-8 IFO 1346 4,0 5,3 x IO"2 M4 0,33 1-9 IAM 4175 b8 8.8 x IO"2 315 0,69 1-10 IAM 4274 OD 5f9xl0-2
5>3 . M 0,90 1-11 IFO 2003 V 4.9 x IO-2 V 0,34 1-12 IFO 2363 7,3 x IO'2 h1 0,47
(*): I valori relativi sono stati calcolati riferendosi alla quantit? di SAM/come 100,
I ri.sult^ti riportati nella Tabella 1 mostrano che quando il contenuto di SAM riferito alle cellule secche./superiore al '12?, il contenuto di impurezze difficili da separare dal SAM ? piccolo.
Esempio 2
Si sono preparate cellule microbiche aventi differenti contenuti di SAM riferito al peso delle cellule secche sottoponendo a coltura Saccharomyces cerevisiae IFO 2346 nel medesimo mezzo di coltura descritto nell'Esempio 1 tranne che il tempo di incubazione, il pH del mezzo di coltura e la temperatura di incubazione sono stati cambiati. Le cellule microbiche ottenute sono state estratte ed analizzate adottando i medesimi metodi descritti nell'Esempio 1.1 risultati sono mostrati nella Tabella 2.
Tabella 2
Contenuto di SAM
Quantit? Quantit? Quantit? Prova N? riferito alle celdi Ad di SAH di MTA lule secche (%
in peso) (*) (*) (*)
2-1 19,9 1 .8 x 10~3 0,06 0,01 2-2 19,1 1 .9 x 10~3 0,06 0,02 2-3 16,3 3.1 x 10~3 0,08 0,04 2-4 15,1 6.2 x 10~3 0,28 0,04 2-5 12,0 9.3 x 10?3 0,30 0,07
g 2-6 6,2 4,9 x 10 2 9,9 0,33 -2
? 2-7 3,5 5,4 x 10 1,4 0,33 <o
g 2-8 1,8 9,6 x 10~2 1,7 0,37 H
(*) I valori relativi sono stati calcolati prendendo la quantit? di SAM come 100.
Esempio 3
Una ansata di ciascuno dei ceppi di microrganismi indicati nella Tabella 3 ? stata inoculata in 10 mi di un mezzo di coltura sterilizzato a caldo regolato a pH 6,0 e costituito da 5 g/dl di glucosio, 0,5 g/dl di polipeptone, 0,4 c/dl di KH PO , 0,4 c/dl di K2HP04 , 0,02 g/dl di MgSO^HgO e 0,2 g/dl di estratto di lievito^, si ? effettuata 1 1 incubazione sotto sbattimento a 28?C per 24 ore.
Un litro di un mezzo di coltura regolato a pH 6,0 e costituito da 10 g/dl di saccarosio, 1 g/ di di estratto di lievito, 0,4 g/dl di ??^??^ , 0,01 g/ di di MgS0^.7H20 , 1 , 5 g/dl di urea (sterilizzata separatamente) , 0,75 g/dl di L-metionina, 0,02 g/dl di CaCl2.2H20, 0, 25 mg/dl di ZnSO^i^O , 0,25 mg/dl di- FeSO ? 7?20, 125 mg/dl di MnS04.4-6H20, 2 jig/dl di QUS04.5H20 , 2 j^g/dl di H3B03 , 0, 2 Jig/dl di CoCl2?6H20 e 1 jig/dl di KI ? stato introdotto in un fermentatore da 2 litri ed ? stato sterilizzato. Quindi, 5 mi del brodo di coltura seminato preparato come indicato sopra sono stati inoculati nel mezzo di coltura e si ? effettuata l ' incubazione a 28?C per 72 ore con aerazione ed agitazione.
Dopo l ' incubazione, le cellule microbiche sono state raccolte separandole mediante centrifugazione, sono state lavate una volta con soluzione salina fisiologica, sono state poste in sospensione in 100 mi di acido perclorico 1 ,5N e sono state, sottopcste- a per estrarre SAM. sbattimento a temperatura ambiente per 1 ora^/La sospensione ? stata centrifugata per separare le cellule microbiche e il liquido ottenuto ? stato regolato a pH 4>5 aggiungendo bicarbonato di potassio. Il precipitato ottenuto di perclorato di potassio ? stato separato mediante centrifugazione ottenendo un estratto contenente SAM . La quantit? di SAM nell'estratto ? stata determinata e la quantit? di SAM riferita alle cellule secche viene indicata nella Tabell a 3 ?
L ' estratto in una quantit? di 0, 2 g calcolato come SAM ? stato fatto passare attraverso ad una colonna riempita con 50 mi di Amberlite IRC-50 ( forma H+ ) , una resina scambiatrice di cationi debolmente acida, in modo da provocare l ' adsorbimento di SAM, Acido acetico 0 ,005N ? stato fatto passare attraverso alla colonna per lavarla fino a che il fattore di absorbimento in corrispondenza di 260 nm dell 'eluato ? diventato inferiore a 0 , 1 . si sono allontanate cos? le impurezze. La quantit? di acido acetico 0, Q05N richiesta in questo momento viene indicata nella Tabella 3# Attraverso la colonna si ? quindi fatto passare acido solforico 0, 1N e si ? eluita SAM fino a che il fattore di absorbimento in corrispondenza di 260 nm dell 'eluato ? diventato inferiore a 0 ,05. L ' eluato ? stato trattato con la resina Amberlite IRA 900 (forma 0H~) in modo da regolare il suo pH a 3 ,0, e quindi ? ' eluato ? stato liofilizzato ottenendo solfato di SAM. Il rapporto di ricupero della SAM viene mostrato nella Tabella 3. Il grado di purezza della SAM ? stato misurato mediante cromatografia in strato sottile di cellulosa, mediante cromatografia su carta e mediante cromatografia in fase liquida ad elevata prestazione e viene mostrato nella Tabella 3
Cltlonroo Tabella 3
((ShShaccaromycesaccacromyes Quantit? di aci Rapporto Reazione all* |))iiiicerevsa Quantit? di
ceerevsae do acetico 0,0051 Grado d i SAM riferi I di ricu- ninidrina.d sostanze dirichiesta per al- pero di purezza
Ceppo di microrga ta alle cel di SAM verse da SAM Prova N? nismo lule secche lontanare le im- SAM (?)
(% in peso) purezetml) (?> (*1) (*2)
QJ
c
0 3-1 IFO 2343 12,1 980 ,94 95 tracce
? v{?+) ri
G
<u 3-2 IFO 2346 18,8 770 96 96 II
>
t-cc 3-3 IFO 2347 I
16j7 890 94 95 I
3-4 IFO 1346 3,1 1910 86 84 +
3-5 IAM 4274 4,? 1760 86 83 +
3-6 IFO 2363 V 2440 81 86 + (*):'Grado si purezza di SAM
Dopo sviluppo mediante cromatografia su carta a due dimensioni, si ? pessa in evidenza una macchia attribuita alla SAM. Quindi una porzione corrispondente alla macchia,di SAM ? stata tagliata via e la SAM ? stata estratta con acido cloridrico 0,1N dalla porzione tagliata. Il grado di purezza del SAM ? stato calcolato dal coefficiente di estinzione molecolare (15400) di SAM a 260 nm.
(*2): Reazione alla ninidrina di sostanze diverse dalla SAM
Dopo sviluppo mediante cromatografia in strato sottile di cellulosa a due dimensioni, si ? detei?-minata la presenza di macchie attribuite a sostanze diverse dalla SAM messe in evidenza mediante reazione colorata della ninidrina.
Dalla Tabella 3 si vede che nella presente invenzione, la quantit? di eluato richiesta per separate le -impurezze pu? essere piccola e il rapporto di ricupero della SAM e il grado di purezza della SAM sono molto buoni.
D E S C R I Z I O N E
1, Titolo della invenzione:
"Cellule microbiche contenenti s-adenosil metionina in elevata concentrazione"
2 Rivendicazione
Cellula microbica contenente almeno 10% in peso, riferito alla cellula secca, di S-adenosil metionina.
3. Descrizione dettagliata della Invenzione
La presente invenzione riguarda cellule microbiche contenenti S-adenosil metionina in una concentrazione ^levata e pi? specificamente riguarda cellule microbiche contenenti sostanze simili ad adenina e sostanze reattive con la ninidrina soltanto in basse concentrazioni ed in grado di ottenere s-adenosil metionina dotata di un elevato grado di purezza
con .buona efficienza mediante un*operazione semplice.
E* noto che la S-adenosil metionina (qui di seguito abbreviata SAM) ? una sostanza dotata di effetto terapeutico nei confronti di "jecur adipsum", lipemia, arteriosclerosi, ecc.; e recentemente si ? desiderato pordurre questa sostanza in grandi quantit?.
Per produrre SAM si ? proposto fino ad ora solo un metodo di fermentazione con microorganismi [per esempio, J. Biol. Chem;:, 229, 10371957)] e pubblicazione di Brevetto Giapponese No. 17118/77), Tuttavia, in questi procedimenti la quantit? di SAM accumulata nelle cellule microbiche ? bassa sostanze derivate da adenina oppure sostanze reattive con ninidrina, che sono difficili da separare da SAM sono contenute in grandi quantit?, in modo che SAM di purezza elevata possa essere d?fficolmente isolata tramite un semplice procedimento.
poich? la SAM ? una sostanza molto instabile, spesso la pratica ? quella di trasportare cellule microbiche contenenti SAM in un posto lontano. In questo caso, il basso contenuto di SAM ? economicamente svantaggioso.
Allo scopo di rimediare ai suddetti inconvenienti delle tecniche precedenti, gli inventori della presente invenzione hanno studiato assiduamente e di conseguenza hanno scoperto che quando il contenuto di SAM nelle cellule microbiche viene aumentato al disopra d di un certo livello, le quantit? di impurezze che sono presenti nelle cellule microbiche e che sono difficili da separare dal SAM diventano molto piccole rispetto a SAM, e come risultato si pu? produrre in modo economico SAM dotata di un elevato grado di purezza con un elevato rapporto di ricupero.
In tal modo, la presente invenzione realizza cellule microbiche aventi accumulato in esse almeno 10% in peso, riferito al peso della cellula secca, di SAM, preferibilmente 12% in peso.
I microorganismi usati nella presente invenzione possono essere qualsiasi microorganismo che ha la capacit? di produrre SAM e che pu? consentire un accumulo di almeno il 10% in peso, rifierto alle cellule secche, di SAM nelle cellule microbiche. Si preferiscono lieviti del genere Saccharomyces.
specifici comprendono Saccharomyces cerevisiae IFO 2342, Saccharomyces cerevisiae IFO 2343, Saccharomyces cerevisiae IFO 2345, Saccharomyces
cerevisi ae IFO 2346, Saccharomyces cerevisiae IFO 2347, e Yeast of Salce Kyokai N? 9? Si possono impiegare anche mutanti naturali e artificiali di questa cellule microbich? che hanno le propriet? di cui sopra.
Le cellule microbiche secondo la presente invenzione contengono SAM in una quantit? di almeno 10% in peso, preferibilmente di almeno 12% in peso, riferito al peso delle cellule secche.
Non ? particolarmente limitato un procedimento per la produzione di cellule microbiche ? Di solito viene effettuata la coltura in condizioni aerobiche in un mezzo di coltura liquido contenente metionina, sorgenti di carbonio, sorgenti di azoto, sali inorganici e quantit? molto piccole di sostanze organiche nutrienti.
La metionina viene aggiunta di solito in una proporzione di almenofc,2 g/dl. La metionina pu? venire aggiunta sia mediante un metodo din cui ci aggiunge tutta la quanti? in una sola volta sia mediante un metodo in cui pu? venire aggiunta successivamente in porzioni suddivise. Tuttavia, se si realizza il primo?procedimento, quando la quantit? di metionina aggiunta ? grande, la quantit? di SAM accumulata nelle cen ile microbiche tende a diminuire, in tale caso ? pi? adatto l?impiego del secondo procedimento.
Esempi delle sorgenti di carbonio sono zuccheri come glucosio, saccarosio, fruttosio ecc.; alcoli come etanolo e glicerolo, idrolizzato di amido, melasse, siero di soia, liquido di scarto di succhi di frutta,liquidi di scarto della lavorazione del pesce, liquido di scarto di fermentazioni, liquido esaurito della pasta di legno ecc.-Sorgenti di azoto preferite, comprendono urea, succinato di ammonio, citrato di ammonio, lattato di ammonio e simile.
Si possono usare in modo appropriato sali inorganici normali come sali inorganici, ? necessario, per esempio fosfati come per esempio fosfato di potassio, fosfato di sodio, fosfato di calcio, fosfato di litio ecco ; sali di potassio come cloruro di potassio ecc.; sali di sodio come cloruro di sodio, carbonato di sodio ecc-i; sali di magnesio come solfato di magnesio, cloruro di magnesio; ecc.; sali di manganese come solfato di manganese, cloruro di manganese ecc.; sali di ferro come solfato di ferro, cloruro di ferro ecc.; sali di zinco; sali di rame; e sali di cobalto e simile;
Esempi di quantit? in tracce di sostanze organiche nutrienti che possono venire usate a seconda della necessit?, comprendono vitamine, animino acidi, estratto di lievito, estratto di carne, estratto di malto, liquido di macerazione del masia, "Casamino acid", farina di soia, idrolizzato di soia, peptone, triptone, un prodotto di decomposizione della caseina, ecc.
preferibilmente, la coltura viene effettuata in condizioni aerobiche. Di solito, effettuando la coltura ad una temperatura di 15-45?C, preferibilmente 20- 35?C per un periodo di tempo compreso tra 2 e 10 giorni regolando il pH del mezzo di coltura ad un valore compreso tra 3 e 8, preferibilmente compreso tra 3,5 e 7, nelle cellule microbiche si forma e si accumula SAM.':
Non ? limitato in particolare un metodo per ottenere SAM dalle cellule microbiche risultanti e viene di solito effettuato con un metodo di per s? noto.
Cio? dopo la rseparazione delle cellule microbiche dal mezzo di coltura, si estrae SAM dalle cellule microbichen e si isola quindi SAM nell?estratto per produrre un prodotto finale.
In questo caso, lo scopo di recuperare SAM in forma stabilizzata, la pratica generale ? quella di aggiungere un acido come per esempio acido solforico, acido p-toluen-solfonico oppure acido solfosalicillco e s?par? la SAM sotto forma di un sale oppure di un scile doppio.
La presente invenzione ? adatta per il traporto di SAM non stabile poich? SAM ? contenuta in elevate concentrazioni, nelle cellule microbiche, e poich? sono contenute soltanto basse concentrazioni di impurezze difficili da s?par? dal SAM, ? facile purificare la SAM e di conseguenza si pu? ricuperare SAM dotata di un elevato grado di purezza con un buon rendimento.
Gli esempi che segiono illustrano la presente invenzione in modo pi? specifico.
Esempio 1
Una ansata di Saccharomyces cerevisiae IFO 2346 che sono stati fatti crescere per 2 giorni in un mezzo di coltura costituito da agar inclinato (pH 6,0) costituito da 5 gd/dl di glucosio, 0,5 g/dl di polipeptone, 0,4 g/dl di KU PO , 0,4 g/dl di K HPO , 0,02/gl di MgS0^.7H20, 0,2 g/dl di estratto di lievito e 2 g/dl di agar ?t stata inoculata in 10 mi di un mezzo di coltura sterilizzato con calore regolato a pH 6 ,0 e costituito da 10 g/dl di saccarosio, 1 c/dl di estratto di lievito, 0,4 g/dl di KH PO , 0,01 g/dl di.
MgS0^.7H20, i ,0 g/dl di L-metionina, 0,25 mg/ di di ZnSO ?7??0 e 1 , 25 mg/ di di MnSO .4-6H 0 , e si ? effettuata l? incubazione sotto sbattimento a 28?C per 4 giorni.
Le cellule microbiche sono state raccolte mediante separazione con centrifugazione, sono state lavate con soluzione salina fisiologica, sono state in
poste in sospensione /acido perclorico 1,5 N e sono state sottoposte a sbattimento a temperatura ambiente per 1 ora in modo da estrarre la SAM. L?estratto ? stato sottoposto a cromatografia su carta e a cromatografia in fase liquida ad elevata prestazione per determinare il contenuto in SAM, in adenina (abbreviato Ad), in S-adenosil omocisteina (abbreviato SAH) e in metiltioadenosina (abbreviato MTA). I risultati vengono mostrati nella Tabella 1.
Tabella 1
Quantit? di uantit? SAI"!riferito Quantit? Quanti- Q Prova .Ceppo di microorga alle cellule di Ad t?s? di MTA N? nismo secche (^ ??^ (*) (*) (*) jiIonenenzllvCtooorn
1-1 IFO 2342 14^8 2r5 x IO"3 0,06 0,03 1-2 IFO 2343 12,9 3.8 x IO"3 0,13 0,08 1-3 IFO 2345 13.0 6.2 x IO"3 0,09 0,04 (hScscaromveac 1
1-4 1)ii)iiaecerevsaecervse IFO 2346 19.1 1.9x IO-3 0;06 0,02 1-5 IFO 2347 16,7 8.3x IO-3 0,06 0,03
1-6 Lievito di?-Sake
Kyokai No. 9 18,5 2,7x IO"3 0,06
1-7 IFO 0259 / 3,1 9,6 x IO-2 M 0,54 1-8 ?
0) IFO 1346 ' V 5.3 x IO"2
u V 0,33 1-9 E IAM 4175 8.3 x IO"2 3,5 0,69 0
u b8
1-10 fO
& IAM 4274 5,3 5,9 x IO"2
? M 0,90 1-11 um IFO 2003 4,9 x IO"2 0,34 io ?l1 il7 1-12 IFO 2363 2,1 7.3x IO"2 V 0,47 (*): I valori relativi sono stati calcolati riferendosi alla quantit? di SAM.-come 100.
I risultati riportati nella Tabella 1 mostrano che quando il contenuto di SAM riferito alle cellule e.
secche,/superiore al 12?, il contenuto di impurezze difficili da separare dal SAM ? piccolo.
Esempio 2
Si sono preparate cellule microbiche aventi differenti contenuti di SAM riferito al peso delle cellule secche sottoponendo a coltura Saccharomyces cerevisiae IFO 2346 nel medesimo mezzo di coltura descritto nell'Esempio 1 tranne che il tempo di inrcubazione, il pH del mezzo di coltura eia temperatura di incubazione sono stati cambiati. Le cellule microbiche ottenute sono state estratte ed analizzate adottando i medesimi metodi descritti nell'Esempio 1. I risultati sono mostrati nella Tabella 2.
? - ?Tabella 2
Contenuto di SAM
Quantit? Quantit? Quantit? Prova N? riferito alle cel di Ad di SAH di MTA lule secche {%
in peso) (*) (*) (*)
2-1 19,9 1.8 x 10?3 0,06 0,01 2-2 19,1 1.9 x 10-3 0,06 0,02 2-3 16,3 3.1 x ~1CT3 0,08 0,04 2-4 15,1 6.2 x 10?3 0,28 0,04
^ -3
2-5 12,0 9.3 x 10 0,30 0,07
| 2-6 6,2 4,9 x 10~2 9,9 0,33 ? 2-7 3,5 5,4 x.10?2 1,4 0,33 <U _2
? 2-8 1,8 9,6 x 10 1,7 0,37 H
ivi sono stati calcolati prendendo SAM come 100.
i ciascuno dei ceppi di microrgala Tabella 3 ? stata inoculata in di coltura sterilizzato a caldo e costituito da 5 g/dl di glucosio, ptone, 0,4 g/dl di ??^??^ , 0,4 g/dl /dl di MgSO -7H_0 e 0,2 g/dl di o^, si ? effettuata l'incubazione a 28?C per 24 ore
un mezzo di coltura regolato a pH a io g/dl di saccarosio, 1 g/ di di estratto *di lievito, 0,4 g/dl di ??^??^ , 0 ,01 g/dl di MgSO^. 7H20 , i,5 g/dl di urea (sterilizzata separatamente) , 0, 75 g/dl di L-metionina, 0,02 g/dl di CaCl2.2H 0, 0,25 me/ di di ZnSO^ ^HgO , 0, 25 mg/ di di FeSO, 7H20, 125 mg/ di di MnS04.4~6H20, 2 yg/dl
4
di CUS04.5H20, 2 g/dl di H3B03 , 0 , 2 pc/dl di COC12 ?6H20 e 1 jig/dl di KI ? stato introdotto in un fermentatore da 2 litri ed ? stato sterilizzato. Quindi, 5 mi del brodo di coltura seminato preparato come indicato sopra sono stati inoculati nel mezze di coltura e si ? effettuata l ' incubazione a 28?C per 72 ore con aerazione ed agitazione.
Dopo l ' incubazione, le cellule microbiche sono state raccolte separandole mediante centrifugazione, sono state lavate una volta con soluzione salina fisiologica, sono state ? poste in sospensione in 100 J?LL di acido perclorico 1 , 5N e sono state, sottoposte a sbattimento a temperatura ambiente per 1 ora. La sospensione ? stata centrifugata per separare le cellule microbiche e il liquido ottenuto ? stato regolato a pH 4,5 aggiungendo bicarbonato di potassio. Il precipitato ottenuto di perclorato di potassio ? stato separato mediante centrifugazione ottenendo un estratto contenente SAM . La quantit? di. SAM nell'estratto ? stata determinata e la quantit? di SAM riferita alle cellule secche viene indicata nella Tabella 3*
L ' estratto in una quantit? di 0,2 g calcolato come SAM ? stato fatto passare attraverso ad una colonna riempita con 50 mi di Amberlite IRC-50 (forma H<+ >) , una resina scambiatrice di cationi debolmente acida, in modo da provocare l ' adsorbimento di SAM. Acido acetico 0.005N ? stato fatto passare attraverso all a colonna per lavarla fino a che il fattore di absorbimento in corrispondenza di 260 nm dell 'eluato ? diventato inferiore a 0 , 1 , si sono allontanate cos? le impurezze. La quantit? di acido acetico 0, Q05N richiesta in questo momento viene indicata nella Tabella 3. Attraverso la colonna si ? quindi fatto, passare acido solforico 0, 1N e si ? eluita SAM fino a che il fattore di absorbimento in corrispondenza di 260 nm dell 'eluato ? diventato inferiore a 0,05. L 'eluato ? stato trattato con la resina Amberlite IRA 900 (forma OH-) in modo da regolare il suo pH a 3,0, e quindi l ' eluato ? stato liofilizzato ottenendo solfato di SAM. Il rapporto di ricupero della SAM viene mostrato nella Tabella 3. Il grado di purezza della SAM ? stato misurato mediante cromatografia in strato sottile di cellulosa, mediante cromatografia su. carta e mediante cromatografia in fase liquida ad elevata prestazione e viene mostrato nella Tabella 3
lCltorono Tabella 3
(Sh(Shaccarcesomyaccaromyces Quantit? di Quantit? di aciRapporto Reazione alli ||))iiiicerevsacseerevae do acetico 0,0051 Grado dininidrina di I di ricu-SAM riferi purezza sostanze dirichiesta per al- pero di
Ceppo di microrga ta alle cel di SAM verse da SAM Prova Ne nismo lontanare le im SAM
lule secche (% )
(% in peso) purese{mi) (?> (*1) (*2)
ac)
o 3-1 IFO 2343
? 12;1 980 94 95 tracce (+) c:
1) 3-2 IFO 2346 18^8 770 96 96 II
>
Mc 3-3 IFO 2347 16;7 890 94 95 II
3-4 IFO 1346 3,1 1910 86 84 +
3-5 IAM 4274 4,0 1760 86 83 +
3-6 IFO 2363 2;1 2440 81 86 +
*
Dopo sviluppo mediante cromatografia su carta a due dimensioni, si ? messa in evidenza una macchia attribuita alla SAM. Quindi una porzione corrispondente alla macchia di SAM ? stata tagliata via e la SAM ? stata estratta con acido cloridrico 0,1N dalla porzione tagliata. Il grado di purezza del SAM ? stato calcolato dal coefficiente di estinzione mole-, colare (15400) di SAM a 260 nm.
(*2): Reazione alla ninidrina di sostanze diver se dalla SAM
Dopo sviluppo mediante cromatografia in strato sottile di cellulosa a due dimensioni, si ? determinata la presenza di macchine attribuite a sostanze diverse dalla SAM messe in evidenza mediante reazione colorata della ninidrina.
Dalla Tabella 3 si vede che nella presente invenzione, la quantit? di eluato richiesta per sepaprare le impurezze pu? essere piccola e il rapporto di ricupero della SAM e il grado i purezza della SAM sono molto buoni.
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