JPS6312290A - アラキドン酸含有脂質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアラキドン酸含有脂質の製造方法に関し、更に
詳細にはモルテイエレラ属に属する特定の菌種を培養し
て、アラキドン酸含量の高い脂質を製造する方法に関す
る。

〔従来の技術〕

アラキドン酸は、子宮筋収縮・弛緩作用、血管拡張、血
圧降下作用等、強力かつ多彩な生理活性を有するプロス
タグランディン、トロンボキサン、プロスタサイクリン
、ロイコトリエン等の前駆物質といわれ、近年特に注目
されている。アラキドン酸は動物界に広く分布しており
、従来、動物副腎線や肝臓から抽出した脂質から分離さ
れている。

しかしこれらの脂質中のアラキドン酸含有量は一般に５
゛％以下であり、乾燥細胞重量当りの収率は０．２％以
下にすぎないこと、原材料の大量入手が困デ「であるこ
となどから、この抽出法はアラキドン酸の有用な製造法
とはいい難い。

一方、アラキドン酸生産能を有する種々の微生物を培養
してアラキドン酸を得る方法が提案されている。たとえ
ば特開昭５２−６４４８２号公報、同５２−６４４８３
号公報、同５２−６４４８４号公報には、ペニシリウム
属、タラトスボリウム属、ムコール属、フザリウム属、
ホルモプント゛ラム属、アスペルギルス属、またはロー
ドトルラ属に属するアラキドン酸生産能を有する微生物
を炭化水素、炭水化物等を炭素源とする培地で培養し、
培養物からアラキドン酸を採取する方法が記載されてい
る。しかしこの方法により得られる脂質中のアラキドン
酸含有量は７．５％以下であり、乾燥菌体当りの収率も
１％に満たない。

また接合菌類はえかび目の糸状菌であるエントモフトラ
属、デラクロイキシア属、コニディオボルス属、フィテ
ィウム属およびフィトフトラ属に属する菌にアラキドン
酸を生産する菌があり、エントモフトラ属のＥ、エクシ
ティアリスでは脂質中の全脂肪酸の２７．１％、Ｅ、イ
ブノビリスでは１９．１％、Ｅ、サクステリアナでは１
８．８％をアラキドン酸が占めていると報告されている
（Ｄ。

ティレル（Ｄ、Ｔｙｒｒｅｌｌ　）、カナディアン・ジ
ャーナル・オブ・マイクロバイオロジー（Ｃａｎ、　Ｊ
。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　）、Ｖｏｌ、１３　（１９６７
）　、７５５−７６０〕。さらにモルティエレラ、レニ
スボラがアラキドン酸を生産すること、菌糸の脂質生産
量は４．８％、脂質中のアラキドン酸含有量は２６．７
％であること（Ｒ，Ｈ，ハスキンス（Ｈａｓｋｉｎｓ　
）　ら、Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　Ｖ
ｏｌ、　１０　（１９６４）、１８７〜１９５）、およ
び、紅藻類ポルフィリゾイウム・タルエンタムがアラキ
ドン酸を生産すること、その収率は、乾燥細胞重量当り
１％以下であること（Ｔ、Ｊ、アヘルン（Ａｈｅｒｎ　
）ら、バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニア
リング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　）、Ｖｏｌ。

ＸＸＶ、１０５７−１０７０　　（１９８３））　　も
、報告されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしこれら微生物の乾燥菌体重量当りのアラキドン酸
含量、および得られる脂質中のアラキドン酸含量はいず
れも十分に高いものとはいえなかった。したがって本発
明の目的は、乾燥菌体重量当りのアラキドン酸含量、お
よびこの菌体から抽出される脂質中のアラキドン酸含量
が高く、アラキドン酸の分離精製が容易で、高純度のア
ラキドン酸を高収率で得ることができる方法を提供する
ことである。

〔問題を解決するための手段〕

本発明者は、モルティエレラ属に属する菌種についてそ
のアラキドン酸生産能を研究したところ、特定の菌種の
微生物がアラキドン酸含量の高い脂質を生産することを
見出し本発明を完成するに至った。

本発明は、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　
）属のモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌ
ｌａａｌｐｉｎａ　）、モルティエレラ・バイニエリ（
Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｂａｉｎｉｅｒｉ　）、モル
ティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｅ
ｌｏｎｇａｔａ　）、モルティエレラ・エクシグア（Ｍ
ｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｅｘｉｇｕａ　）、モルティエ
レラ・ミヌティソシマ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｍｉｎ
ｕｔｉｓｓｉｍａ　）　、モルテイエレラ・ヴァーティ
シラタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｖｅｒｔｉｃｉｌｌ
ａｔａ　）、モルティエレラ・ハイグロフィラ（Ｍｏｒ
ｔｉｅｒｅｌｌａ　ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）、またはモ
ルティエレラ・ポリセフアラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ
ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌａ　）種のいずれかに属する菌株
を培養することによりアラキドン酸を含む脂質を生産す
ることを特徴とするアラキドン酸含有脂質の製造方法で
ある。

本発明に有利に使用される菌の具体例としては、モルテ
ィエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉ
ｎａ　）　ＩＦＯ８５６８、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴ
ＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ４２４３０ モルティエレラ・バイニエリ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ
ｂａｉｎｉｅｒｉ　）　　　　ＩＦＯ８５６９モルティ
エレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｅｌｏｎ
ｇａｔａ　）　　　　ＩＦＯ８５７０モルティエレラ・
エクシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｅｘｉｇｕａ　）
　　　　　ＩＦＯ８５７１モルティエレラ・ミヌティッ
シマ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ
　）　　ＩＦＯ８５７３モルティエレラ・ヴァーティシ
ラタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔ
ａ　）　　ＩＦＯ８５７５モルティエレラ・ハイグロフ
ィラ（λＩｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ
）　　　ＩＦＯ５９４１モルティエレラ・ポリセフアラ
（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｐｏｌｙｃｅｐｈａｌａ　）
　　ＩＦＯ６３３５等があげられる。これらの菌は大阪
市の財団法人醗酵研究所（ＩＦＯ）及び米国アメリカン
・タイプ・カルチャーφコレクション（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、
　ＡＴＣＣ）の菌株目録に記載されている糸状菌である
。

上記の糸状菌の培養は固液の培地を用いて、静置培養、
振盪培養、通気攪拌培養などにより行われる。好ましい
培地としては、ジャガイモ、サトイモ、サツマイモ、キ
ャラサバ、タロイモ、キクイモなどのイモ浸出液、麦芽
エキス、ペプトン、酵母エキス、コーン・ステイープ・
リカー、カザミノ酸などに炭水化物などを加えまたは加
えずに調製した培地、とくに好ましくは、ジャガイモ浸
出液と炭水化物の混合物あるいは麦芽エキスがあげられ
る。

イモ浸出液を調製するには、約１　ｃｍ角に切ったイモ
を１１の水に３００ｇから２０００ｇ、好ましくは、４
００ｇから１０００ｇ加えて約２０分煮沸後、布で濾し
、蒸留水を用いて１１の浸出液を作る。炭水化物は０−
２０％好ましくは、２−１０％、浸出液の滅菌前あるい
は別途滅菌したものを浸出液滅菌後に添加する。炭水化
物としては例えばグルコース、フラクトース、サッカロ
ース、糖密、木材糖化液、デンプン氷解物などがあげら
れる。微量添加成分として、２価の金属、例えばＣａｅ
４あるいはＭｇ”があげられる。Ｃａ　”の添加量は０
．０２−２ｇ１Ｃ１又はｋｇ培地）、好ましくは、０．
０５−１ｇ／（Ｊ又はｋｇ培地）がよく、Ｍｇ”の添加
量は０．０１−５ｇ／（Ａ又はｋｇ培地）、好ましくは
、０．０２−２ｇ／（１又はｋｇ培地）がよい。

窒素源としてアンモニア、アンモニウム塩、グルタミン
酸、アスパラギン酸、尿素などを適宜組合せ、これに必
要に応じてカリウム、ナトリウム、鉄、亜鉛、銅、マン
ガンなどの無機塩と、微量要素、その他の栄養源を添加
して用いることもできる。

培養の初発ｐＨは、４．０〜７．０が適当であり、培養
温度は、１０〜３３℃好ましくは、２０〜３０℃で２〜
２０日間培養される。

このような好気条件での培養により当該糸状菌は培養さ
れ、生産される脂質は、大力、菌体内に含まれるので培
養物より菌体を分離し、機械的または物理的に摩砕後、
溶剤、超臨界二酸化炭素などにより抽出し、アラキドン
酸含有量の高い脂質を得る。

得られた脂質は常法の加水分解、エステル化、またはエ
ステル交換後、アラキドン酸の含有率を評価できる。ま
た、脂質中のアラキドン酸含量が高いために従来法に比
較して飛躍的に容易かつ経済的に溶剤やクロマトグラフ
ィー分画、尿素付加分離法等により目的のアラキドン酸
あるいはアラキドン酸エステルの精製を行うことができ
る。アラキドン酸あるいはアラキドン酸エステルの収率
は、乾燥菌体当り、最高２８．７％であり、従来の約２
０〜３０倍の生産性を実現できることになる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、アラキドン酸含有量の高い脂質を得る
ことができ、従来法の約３０倍の収率でアラキドン酸を
生産することができる。このように脂質中のアラキドン
酸含量が極めて高いので、アラキドン酸の精製を非常に
容易かつ短時間に行うことができ、高純度のアラキドン
酸を大量かつ安価に供給することができる。したがって
これを原料として、種々の薬理活性が利用かつ期待され
ているプロスタグランディン、トロンボキサン、プロス
タサイクリン、ロイコトリエン等を従来より安価に合成
することができる。

〔実施例〕

以下実施例により本発明を更に具体的に説明する。

ス財ＬＬＬ ２００ｇのジャガイモからの浸出）夜とグルコース２０
ｇに蒸留水を加えて１０００ｍ／とじた培養液をｐＨ５
，６に調整した。その２００ｍｌを５００ｍ１の坂ロフ
ラスコに入れた培地にモルティエラ・アルピナ（ＩＦ０
８５６８）、モルティエレラ・エロンガタ（ＩＦ○８５
７０）を個別に白金耳量接種し、２５℃で６日間振盪培
養した。

得られた菌体は直ちに６０００ｒｐｍで遠心分離して集
菌し、濾紙でできるかぎり水分をとり除いたのち秤量し
た。ついでその一部は、乾燥重量を求めるために用い、
また残りは、乳鉢内でクロロホルム／メタノール（２：
ＩＶ／Ｖ）と共にすりつぶし、引き続きクロロホルム／
メタノール（２：ＩＶ／Ｖ）で総脂質を抽出した。得ら
れた脂質は、ナトリウムメトキサイドを用いてメチルエ
ステル化後、その脂肪酸組成をクロマトグラフ分析して
アラキドン酸の含有率を求めた。結果を表１に示す。

ハスキンスらは、前述のごとくモルティエレラ・レニス
ポラから乾燥菌体重量当り４．８％の脂質を得、その脂
質中のアラキドン酸含量が２６．７％であったことを報
告しているが、これを乾燥菌体重量当りのアラキドン酸
含量に換算すると１．２８％（−２６，７％×４．８％
）になる。これに対して本発明によると、それに対応す
る表１中の数値は、アルピナは１０，９％、エロンガタ
は６．２％であり、それぞれハスキンス法の約８倍と５
倍を示し、本発明の生産効率が優れていることがわかる
。

大旗±１ ４００ｇのジャガイモからの浸出液にグルコース４０ｇ
と寒天４０ｇを加え蒸留水で２０００ｍ１とした培養液
（ｐＨ５，６）をオートクレーブにかけ直径８０龍の滅
菌シャーレ１００個に分注して寒天培地を調整した。５
０個ずつのシャーレにモルティエレラ・アルピナ（ＩＦ
０８５６８）とモルティエレラ・エロンガタ（Ｉ　ＦＯ
８５７０）を個別に白金耳量接種し、２５℃で１０日間
培養した。培養後、培地上の白線状の菌糸をスパチュラ
で集め、実施例１と同様の処理を行って表２の結果を得
た。

上記の２株と同様にモルティエレラ・アルピナ（ＡＴＣ
Ｃ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１゜ＡＴＣＣ４２４３
０）　、モルティエレラ・バイニエリ　（ＴＰＯ８５６
９）　、モルティエレラ・エクシグア（ＩＦＯ８５７１
）、モルティエレラ・ミヌティソシマ（ＩＦＯ８５７３
）、モルティエレラ・ヴァーティシラタ（ＩＦＯ８５７
５）、モルティエレラ・ハイグロフィラ（Ｉ　ＦＯ５９
４１）、モルティエレラ・ポリセフアラ（ＩＦＯ６３３
５）についても培養を行い、その抽出脂質から得たメチ
ルエステルの分析結果を表２にあわせて示す。

乾燥菌体重量当りのアラキドン酸メチルの含有率は、ハ
スキンス法（１，２８％）と比較して特にアルピナは２
２倍、他の従来生産法と比較すると２９倍となり、著し
い生産効率の向上が期待できる。

実施例３ 日永製薬社製麦芽寒天培地４５ｇを蒸留水１０００ｍｊ
！に加えオートクレーブで１２１’Ｃ１ｓ分間滅菌後、
直径８０ｎの滅菌シャーレ５０個に分注して寒天培地を
調整した。１０個ずつのシャーレにモルティエレラ・ア
ルピナ（ＩＦ０８５６８）、モルティエレラ・バイニエ
リ　（ＩＦＯ８５６９）、モルティエレラ・エロンガタ
（ＩＦＯ８５７０）、モルティエレラ・ミヌティッシマ
（ＩＦＯ８５７３）　、モルティエレラ・ヴァーティシ
ラタ（ＩＦＯ８５７５）、を個々に白金耳量接種し、２
５℃で１０日間培養した。培養後、培地上の白色の菌体
をスパチュラで集め、実施例１と同様の処理を行って表
３の結果を得た。

上記の５株と同様にモルティエレラ・アルピナＡＴＣＣ
１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ４２４３０
についても培養を行い、その抽出脂質から得たメチルエ
ステルの分析結果を表３にあわせて示す。

ス新ｌ町工 白水製薬社製サブロー寒天培地３２．５　ｇを蒸留水５
００ｍｌに加え、オートクレーブで１２１℃、１５分間
滅菌後、直径８０鰭の滅菌シャーレ２５個に分注して寒
天培地を調整した。この培地にモルティエレラ・アルピ
ナＡＴＣＣ４２４３０を白金耳量接種し、２５°Ｃで１
０日間培養した。培養後、培地上の白色の菌糸をスパチ
ュラで集め、実施例１と同様の処理を行って表４の結果
を得た。

実施例５ ジャガイモ１００ｇ、３００ｇ、５００ｇからの浸出液
のそれぞれにグルコース３０ｇと蒸留水を加え、各５０
０ｍＡとした培養液をＬ字管に２５０ｒｒ＋ｊｌ！ずつ
分注滅菌後、モルティエレラ・アルピナ（ＩＦ０８５６
８）を植菌し、２５℃下、２０日間振盪培養した。得ら
れた菌体は遠心分離により集菌洗浄後、乾燥し、乳鉢内
でクロロホルム／メタノール（２：ＩＶ／Ｖ）と共にす
りつぶし、引き続きクロロホルム／メタノール（２：　
Ｉ　Ｖ／Ｖ）で総脂質を抽出した。得られた脂質は、ナ
）　ＩＪウムメトキサイドを用いてメチルエステル化後
、その脂肪酸組成をクロマトグラフ分析してアラキドン
酸の含有率を求め、表５の結果を得た。

ジャガイモの使用量が多くなるにしたがってアラキドン
酸の収率も向上することがわかる。

実施例６ ジャガイモ６００ｇからの浸出液にグルコース６０ｇを
加え１．蒸留水で１１とした培養液を４本のＬ字管に２
５　Ｑｍｆずつ分注滅菌した。同時に、ＣａＣ１ｚ　’
　２Ｈｚ０　１８５１１ｇ、ＭｇＣ１ｚ’６Ｈ２０１０
０■及び５１５■をそれぞれ１ｍｌの水に溶かしたもの
も滅菌し、個々に３本のＬ字管に加えり１ｋ、モルテイ
エレラ・アルピナ（ＩＦ０８５６８）を植菌し、２５℃
下２０日間振盪培養した。得られた菌体は遠心分離によ
り集菌洗浄後、乾燥し、実施例５と同様の処理を行って
表６の結果を得た。

Ｃａ−とＭｇ″−″は明らかに培地当りのアラキドン酸
メチルの収率を向上させるが、乾燥菌体重量当りのアラ
キドン酸メチルの含有率はほぼ一定であった。

アラキドン酸精取のため、モルティエレラ・アルピナの
総脂質をエステル化して得られたメチルエステル５０■
を逆相系薄層板ＲＰ−１８Ｆ（メルク社製）上でメタノ
ール／アセトニトリル（ｌ：　Ｉ　　Ｖ／Ｖ　）を用い
て展開し、Ｒｆ値０．４１のハンドをかきとって回収し
たところ、純度９５．９％（４，１％はＴ−リルン酸メ
チル）のアラキドン酸メチルが３５■得られた。

〈アラキドン酸メチルの同定〉 本発明により得られたモルティエレラ属の菌体より単離
したアラキドン酸メチル（メチルエイコサ−５，８，１
１，１４−テトラエノエイト　分子量３１８．５）は以
下の５項目の分析により同定を行った。

ｉ）元素分析：　純度９５．９％のアラキドン酸メチル
（４，１％はγ−リルン酸メチル）の分析結果は、炭素
が７９．３４％、水素が１１．２１％であった。計算値
はそれぞれ７９．１５％と１０、７７％であり、よい一
致をみた。

ｉｉ）ガスクロマトグラフ分析：　　ＤＥＧ３１５％（
カラム温度１９０℃）、５Ｅ−３０（カラム温度１７０
℃）、０Ｖ−１０１（カラム温度１７０℃）の３種のカ
ラムを用いて標準のアラキドン酸メチルの保持時間と比
較したところ、非常によく一致した。

ｉｉｉ　）ガス・マス分析：　　ＤＥＧＳＩＯ％（カラ
ム温度２００°Ｃ）を通過させ、該当するピークをイオ
ン化電圧７０ｅＶでイオン化して得たマスフラグメント
パターンを標準のアラキドン酸メチルのマスフラグメン
トパターンと比較したところ、両者は酷似しており、親
ピークは３１８に現れた。但し、ｍ／ｅ　２００以上の
フラグメントシグナルは、ｍ／ｅ０２００の範囲の感度
の５倍にして測定した。

１ｖ）Ｈ−核磁気共鳴スベクトル分析：　標準のアラキ
ドン酸メチルのスペクトルと酷似し、δ値３、６　ｐｐ
ｍ付近のメチルエステルのプロトン強度を基準として計
算すると二重結合様に直接結合するプロトン（５，０〜
５．７ｐｐｍ）は８個、二重結合にはさまれたメチレン
のプロトン（２，６〜３．３ｐｐｍ）は６個存在するこ
とがわかり、メチルテトラエノエイトの構造を支持した
。

■）Ｃ１０−核磁気共鳴スベクトル分析：　δ値１５〜
３５ｐｐｍのメチレンの炭素に由来するシグナル、５ｏ
ｐｐｍ付近のメチルエステルの炭素に由来するシグナル
、１３０ｐｐｍ付近の二重結合様を形成する炭素による
シグナルの各々のパターンが標準アラキドン酸メチルの
それと酷似し、当該物質がアラキドン酸メチルの二重結
合に関する位置異性体でないことを確認した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. モルティエレラ属のアルピナ、バイニエリ、エロンガタ
   、エクシグア、ミヌティッシマ、ヴァーティシラタ、ハ
   イグロフィラまたはポリセファラ種のいずれかに属する
   菌株を培養することによりアラキドン酸を含む脂質を生
   産することを特徴とするアラキドン酸含有脂質の製造方
   法。