JPH08116964A - Ｌ−アスコルビン酸含有バイオマス - Google Patents
Ｌ−アスコルビン酸含有バイオマスInfo
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- JPH08116964A JPH08116964A JP7077857A JP7785795A JPH08116964A JP H08116964 A JPH08116964 A JP H08116964A JP 7077857 A JP7077857 A JP 7077857A JP 7785795 A JP7785795 A JP 7785795A JP H08116964 A JPH08116964 A JP H08116964A
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- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 Ｌ−アスコルビン酸含有バイオマスに関す
る。 【構成】 クロレラピレノイドサ中のＬ−アスコルビン
酸含有率がその細胞の３．５乾量％よりも高い細胞を含
んで成るバイオマスに関する。
る。 【構成】 クロレラピレノイドサ中のＬ−アスコルビン
酸含有率がその細胞の３．５乾量％よりも高い細胞を含
んで成るバイオマスに関する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】Ｌ−アスコルビン酸は重要な栄養
補給物であり、そしてこれはビタミンカプセルにおい
て、並びにヒト及び他のビタミンＣ要求動物の両者のた
めの食物中の栄養補給物として広い用途を有する。Ｌ−
アスコルビン酸は、基本的に大量に製造される化学物質
であり、そしてこれは、ひじょうに価格不安定であり、
そして市場性を有するためには経済的且つ能率的な生産
を必要とする。従って、Ｌ−アスコルビン酸の能率的な
生産をもたらす、栄養物の能率的転換を提供する微生物
を用いる方法を開発することができることに実質的な興
味が持たれる。
補給物であり、そしてこれはビタミンカプセルにおい
て、並びにヒト及び他のビタミンＣ要求動物の両者のた
めの食物中の栄養補給物として広い用途を有する。Ｌ−
アスコルビン酸は、基本的に大量に製造される化学物質
であり、そしてこれは、ひじょうに価格不安定であり、
そして市場性を有するためには経済的且つ能率的な生産
を必要とする。従って、Ｌ−アスコルビン酸の能率的な
生産をもたらす、栄養物の能率的転換を提供する微生物
を用いる方法を開発することができることに実質的な興
味が持たれる。
【０００２】野生型の微生物は、少量のＬ−アスコルビ
ン酸を産生するに過ぎない。Ｌ−アスコルビン酸の実質
的に増強された製造を微生物により達成することができ
るかどうかは、予測できない。消費される栄養物に対す
る、Ｌ−アスコルビン酸の増強された製造が、Ｌ−アス
コルビン酸経路に関与する酵素の増大された発現により
可能であるかも知れない場合でも、微生物の生存及び代
謝に対するＬ−アスコルビン酸の上昇した濃度の効果は
予測できない。従って、微生物がＬ−アスコルビン酸を
産生することは知られているが、経済的に能率的な方法
を達成することができるという確実性はない。
ン酸を産生するに過ぎない。Ｌ−アスコルビン酸の実質
的に増強された製造を微生物により達成することができ
るかどうかは、予測できない。消費される栄養物に対す
る、Ｌ−アスコルビン酸の増強された製造が、Ｌ−アス
コルビン酸経路に関与する酵素の増大された発現により
可能であるかも知れない場合でも、微生物の生存及び代
謝に対するＬ−アスコルビン酸の上昇した濃度の効果は
予測できない。従って、微生物がＬ−アスコルビン酸を
産生することは知られているが、経済的に能率的な方法
を達成することができるという確実性はない。
【０００３】
【従来の技術】Loewus, F. A. は、L-Ascorbic Acid :
Metabolism, Biosynthesis, Function, The Biochemist
ry of Plants, 第３巻，Academic Press, Inc., ７７〜
９９ページ、１９８０において、Ｌ−アスコルビン酸の
源及び生合成の総説を提供する。藻類におけるアスコル
ビン酸の製造の説明を、Vaidyaなど.,Science and Cult
ure （１９７１）３７：３８３〜３８４；Subbulakshmi
など.,Nutrition Reports International （１９７６）
１４：５８１〜５９１；Aarunsonなど.,Arch Microbio
l. （１９７７）１１２：５７〜５９；Shigeokaなど.,
J. Nutr. Sci. Vitaminol. （１９７９）２５：２２９
〜３０７；Shigeokaなど., Agric. Biol. Chem. （１９
７９）４３：２０５３〜２０５８；Bayanora及び Truba
chev, Prikladnaya Biokhimiya ; Mikrobiologyia （１
９８１) １７：４００〜４０７（ＵＤＣ ５８２．２
６：５７７．１６）；及び Ciferri, Microbiological
Reviews（１９８３）４７：５５１〜５７８に見出すこ
とができる。
Metabolism, Biosynthesis, Function, The Biochemist
ry of Plants, 第３巻，Academic Press, Inc., ７７〜
９９ページ、１９８０において、Ｌ−アスコルビン酸の
源及び生合成の総説を提供する。藻類におけるアスコル
ビン酸の製造の説明を、Vaidyaなど.,Science and Cult
ure （１９７１）３７：３８３〜３８４；Subbulakshmi
など.,Nutrition Reports International （１９７６）
１４：５８１〜５９１；Aarunsonなど.,Arch Microbio
l. （１９７７）１１２：５７〜５９；Shigeokaなど.,
J. Nutr. Sci. Vitaminol. （１９７９）２５：２２９
〜３０７；Shigeokaなど., Agric. Biol. Chem. （１９
７９）４３：２０５３〜２０５８；Bayanora及び Truba
chev, Prikladnaya Biokhimiya ; Mikrobiologyia （１
９８１) １７：４００〜４０７（ＵＤＣ ５８２．２
６：５７７．１６）；及び Ciferri, Microbiological
Reviews（１９８３）４７：５５１〜５７８に見出すこ
とができる。
【０００４】
【発明の要約】クロレラ藻類を用いるＬ−アスコルビン
酸の製造のための改良方法を提供し、その方法において
は、該クロレラを初期の間、中間的な細胞密度に増殖せ
しめ、そして制限レベルで炭素源の逐次的又は連続的添
加によって増殖を続ける。炭素源の改良された利用性
が、高められた収率を伴って、Ｌ−アスコルビン酸の製
造に関して観察される。
酸の製造のための改良方法を提供し、その方法において
は、該クロレラを初期の間、中間的な細胞密度に増殖せ
しめ、そして制限レベルで炭素源の逐次的又は連続的添
加によって増殖を続ける。炭素源の改良された利用性
が、高められた収率を伴って、Ｌ−アスコルビン酸の製
造に関して観察される。
【０００５】
【特定の態様の記載】微生物細胞によるＬ−アスコルビ
ン酸の能率的な製造のための新規な方法が提供される。
その方法は、中間的な密度に細胞を増殖するために十分
である炭素源を含む発酵器中における藻類の初期増殖を
含む。炭素源を消耗した段階で、追加量の炭素源を逐次
的に又は連続的に添加し、その添加を停止するまで、予
定したレベル以下に炭素源の濃度を維持する。停止は、
微生物によるＬ−アスコルビン酸生産の実質的な消耗に
よって決定されるであろう。
ン酸の能率的な製造のための新規な方法が提供される。
その方法は、中間的な密度に細胞を増殖するために十分
である炭素源を含む発酵器中における藻類の初期増殖を
含む。炭素源を消耗した段階で、追加量の炭素源を逐次
的に又は連続的に添加し、その添加を停止するまで、予
定したレベル以下に炭素源の濃度を維持する。停止は、
微生物によるＬ−アスコルビン酸生産の実質的な消耗に
よって決定されるであろう。
【０００６】対象の微生物を、過剰生産体（Ｏｖｅｒｐ
ｒｏｄｕｃｅｒ）である株についてランダムにスクリー
ンすることができる。有望な微生物を選択し、そして物
理的又は化学的突然変異誘発物、たとえば紫外線、Ｘ
線、ニトロソ尿素、硫酸ジメチル、等を用いて突然変異
を誘発することができる。過剰生産体及び排出体の検出
をレドックス色素により有利に決定することができる。
アスコルビン酸への代謝中間体に対する類似体又はアス
コルビン酸合成の阻害剤を用いることによって、化学的
妨害の存在の中で、Ｌ−アスコルビン酸生産を維持し又
は増大することができる微生物を選択することができ
る。
ｒｏｄｕｃｅｒ）である株についてランダムにスクリー
ンすることができる。有望な微生物を選択し、そして物
理的又は化学的突然変異誘発物、たとえば紫外線、Ｘ
線、ニトロソ尿素、硫酸ジメチル、等を用いて突然変異
を誘発することができる。過剰生産体及び排出体の検出
をレドックス色素により有利に決定することができる。
アスコルビン酸への代謝中間体に対する類似体又はアス
コルビン酸合成の阻害剤を用いることによって、化学的
妨害の存在の中で、Ｌ−アスコルビン酸生産を維持し又
は増大することができる微生物を選択することができ
る。
【０００７】上の生産体の子孫を、グラム細胞当りミリ
グラムにより測定されるＬ−アスコルビン酸の改良され
た比生産性について選択する。次に、これらの子孫を個
々のクローンにさらに分離することができ、そして上の
方法にさらにゆだねることができる。選択される藻類
は、クロレラ、特にクロレラピレノイドサの株である。
Ｃ．ピレノイドサ、ＵＴＥＸ１６６３株又は他の同等の
株が特別な興味の対象である。
グラムにより測定されるＬ−アスコルビン酸の改良され
た比生産性について選択する。次に、これらの子孫を個
々のクローンにさらに分離することができ、そして上の
方法にさらにゆだねることができる。選択される藻類
は、クロレラ、特にクロレラピレノイドサの株である。
Ｃ．ピレノイドサ、ＵＴＥＸ１６６３株又は他の同等の
株が特別な興味の対象である。
【０００８】この方法を行なう場合、約０．１５〜０．
４ｇ／ｌの乾量の細胞の初期細胞密度を提供するのに十
分な量で、活発に増殖している微生物株の培養物を栄養
培地に接種する。その培地は炭素源、種々の塩及び微量
金属を含むであろう。炭素源は通常、グルコースを含む
グルコース源であろう。グルコース源は、グルコースに
転換され得る任意のサッカリド又はポリサッカリド、た
とえばスクロース、アミロースであることができる。使
用されるグルコース源の合計量は、代謝されるとすれ
ば、約６５〜９０、より普通には約７５〜８５そして好
ましくは約８０ｇ／ｌの濃度を提供するであろう。普
通、全グルコースの約１５〜３０％、普通には全グルコ
ースの約２０％〜２５％が初めに添加されるであろう。
グルコースは、通常、他の添加物と共に最初に及び発酵
の過程で添加されるであろう。グルコース源は、一般的
に制限されない増殖の期間中１５〜３０ｇ／ｌの範囲で
維持されるであろう。この量は、増殖期間中グルコース
制限を避けるのに十分であることが見出される。
４ｇ／ｌの乾量の細胞の初期細胞密度を提供するのに十
分な量で、活発に増殖している微生物株の培養物を栄養
培地に接種する。その培地は炭素源、種々の塩及び微量
金属を含むであろう。炭素源は通常、グルコースを含む
グルコース源であろう。グルコース源は、グルコースに
転換され得る任意のサッカリド又はポリサッカリド、た
とえばスクロース、アミロースであることができる。使
用されるグルコース源の合計量は、代謝されるとすれ
ば、約６５〜９０、より普通には約７５〜８５そして好
ましくは約８０ｇ／ｌの濃度を提供するであろう。普
通、全グルコースの約１５〜３０％、普通には全グルコ
ースの約２０％〜２５％が初めに添加されるであろう。
グルコースは、通常、他の添加物と共に最初に及び発酵
の過程で添加されるであろう。グルコース源は、一般的
に制限されない増殖の期間中１５〜３０ｇ／ｌの範囲で
維持されるであろう。この量は、増殖期間中グルコース
制限を避けるのに十分であることが見出される。
【０００９】所望により、いくらかの添加物が最初に発
酵器中に存在し、そしてグルコース源の添加と一緒に同
じ添加物の逐次的添加によって連続的に添加されるであ
ろう。
酵器中に存在し、そしてグルコース源の添加と一緒に同
じ添加物の逐次的添加によって連続的に添加されるであ
ろう。
【００１０】発酵器に添加される全量と比較する場合、
少しづつ添加される量のグルコースに対して異なった割
合を有するであろう添加物の中に、アルカリ金属のリン
酸塩、すなわちリン酸ナトリウム及びリン酸カリウム
が、特に二塩基性リン酸ナトリウム及び一塩基性リン酸
カリウムとして存在する。二塩基性リン酸ナトリウムの
合計量は、１ｌ当り合計約１〜２ｇ、普通１ｌ当り合計
約１〜１．５ｇ、そして好ましくは１ｌ当り合計約１．
３ｇであろう。発酵器中に初めに存在する二塩基性リン
酸ナトリウムの量は、添加される二塩基性リン酸ナトリ
ウムの全量の約３５％〜５０％、より普通には約４０％
〜４５％であろう。一塩基性リン酸カリウムの全量は、
１ｌ当り約１．５〜３ｇ、より普通には１ｌ当り約２〜
２．５ｇであろう。最初に存在する量は、一般的に、全
量の約４０％〜５０％、より普通には、全量の約４５％
〜５０％であろう。
少しづつ添加される量のグルコースに対して異なった割
合を有するであろう添加物の中に、アルカリ金属のリン
酸塩、すなわちリン酸ナトリウム及びリン酸カリウム
が、特に二塩基性リン酸ナトリウム及び一塩基性リン酸
カリウムとして存在する。二塩基性リン酸ナトリウムの
合計量は、１ｌ当り合計約１〜２ｇ、普通１ｌ当り合計
約１〜１．５ｇ、そして好ましくは１ｌ当り合計約１．
３ｇであろう。発酵器中に初めに存在する二塩基性リン
酸ナトリウムの量は、添加される二塩基性リン酸ナトリ
ウムの全量の約３５％〜５０％、より普通には約４０％
〜４５％であろう。一塩基性リン酸カリウムの全量は、
１ｌ当り約１．５〜３ｇ、より普通には１ｌ当り約２〜
２．５ｇであろう。最初に存在する量は、一般的に、全
量の約４０％〜５０％、より普通には、全量の約４５％
〜５０％であろう。
【００１１】上の添加物の他に、生物学的に許容される
キレート剤を添加する。便利には、クエン酸三ナトリウ
ムが、１ｌ当り約０．８〜１．２ｇの合計量、普通１ｌ
当り約１．０ｇの合計量で使用されるであろう。一塩基
性リン酸ナトリウムは、約０．８〜１ｇ／ｌ、好ましく
は約０．９５〜１ｇ／ｌで存在するであろう。生物学的
に許容される鉱酸は、溶液中に微量金属を保持し、そし
てまた、窒素源として普通使用されるアンモニアを中和
するために添加される。便利には、濃硫酸が、１ｌ当り
約１〜２ml、より普通には１ｌ当り約１．２〜１．５ml
の量で使用される。金属の中で、特に生理的に許容され
る塩、たとえば硫酸塩として、マグネシウムが約０．１
〜０．２ｇ／ｌ、好ましくは約０．１〜０．１５ｇ／ｌ
で存在するであろう。使用される鉄及び銅の量は限定さ
れる。なぜならば、これらの金属は、アスコルビン酸形
成を抑制するからである。鉄（第一鉄）は、初めに約５
〜７mg／ｌ、好ましくは約５．５〜６mg／ｌで存在し、
そしてその後のいづれの添加中にも含まれないであろ
う。銅は、比較的少量、一般的にグルコース１ｇ当り約
１〜５０μｇで存在するであろう。
キレート剤を添加する。便利には、クエン酸三ナトリウ
ムが、１ｌ当り約０．８〜１．２ｇの合計量、普通１ｌ
当り約１．０ｇの合計量で使用されるであろう。一塩基
性リン酸ナトリウムは、約０．８〜１ｇ／ｌ、好ましく
は約０．９５〜１ｇ／ｌで存在するであろう。生物学的
に許容される鉱酸は、溶液中に微量金属を保持し、そし
てまた、窒素源として普通使用されるアンモニアを中和
するために添加される。便利には、濃硫酸が、１ｌ当り
約１〜２ml、より普通には１ｌ当り約１．２〜１．５ml
の量で使用される。金属の中で、特に生理的に許容され
る塩、たとえば硫酸塩として、マグネシウムが約０．１
〜０．２ｇ／ｌ、好ましくは約０．１〜０．１５ｇ／ｌ
で存在するであろう。使用される鉄及び銅の量は限定さ
れる。なぜならば、これらの金属は、アスコルビン酸形
成を抑制するからである。鉄（第一鉄）は、初めに約５
〜７mg／ｌ、好ましくは約５．５〜６mg／ｌで存在し、
そしてその後のいづれの添加中にも含まれないであろ
う。銅は、比較的少量、一般的にグルコース１ｇ当り約
１〜５０μｇで存在するであろう。
【００１２】次の実験の部分に記載されるであろう微量
金属の溶液は、１ｌ当り約１０〜１５ml、より普通には
１ｌ当り約１２〜１４mlで存在するであろう。グルコー
スに基づいて、微量金属の溶液は０．１〜０．２ml／ｇ
グルコースで使用されるであろう。便利には、発酵の過
程の間に添加される溶液を調製する。この溶液は、多く
の場合、次の組成物を有するであろう。
金属の溶液は、１ｌ当り約１０〜１５ml、より普通には
１ｌ当り約１２〜１４mlで存在するであろう。グルコー
スに基づいて、微量金属の溶液は０．１〜０．２ml／ｇ
グルコースで使用されるであろう。便利には、発酵の過
程の間に添加される溶液を調製する。この溶液は、多く
の場合、次の組成物を有するであろう。
【００１３】
【表１】
【００１４】供給される窒素は無水アンモニアによって
である。これはまた、pH調節として使用される。培地中
の実際の窒素レベルは、培地の酸性度及び培地の緩衝能
によって決定される。
である。これはまた、pH調節として使用される。培地中
の実際の窒素レベルは、培地の酸性度及び培地の緩衝能
によって決定される。
【００１５】微量金属組成物は次の金属を有するであろ
う。
う。
【表２】
【００１６】微量のＨＣｌを含む蒸留水中に溶解されて
いる上の表に示された種々の化合物の適切な量を蒸留水
に添加することによって微量金属の原液を調製し、そし
てここで最終体積は１ｌであり、そして濃塩酸２０mlを
含む。蒸留水を用いて、成分の微量金属の適切な割合を
確保する。
いる上の表に示された種々の化合物の適切な量を蒸留水
に添加することによって微量金属の原液を調製し、そし
てここで最終体積は１ｌであり、そして濃塩酸２０mlを
含む。蒸留水を用いて、成分の微量金属の適切な割合を
確保する。
【００１７】多くの塩が一又は二塩基性塩として言及さ
れているけれども、これは便宜上であり、そして必要で
はないことを理解するべきである。これらの化合物は緩
衝剤として作用し、そして従って陽子化の状態の割合
は、培地のpHにより異なるであろう。
れているけれども、これは便宜上であり、そして必要で
はないことを理解するべきである。これらの化合物は緩
衝剤として作用し、そして従って陽子化の状態の割合
は、培地のpHにより異なるであろう。
【００１８】発酵を行なう場合、二塩基性リン酸ナトリ
ウム及び一塩基性リン酸ナトリウムは、発酵器中に添加
されるべき全培地の約７５％〜９０％、普通約８０％〜
９０％中に溶解されるであろう。
ウム及び一塩基性リン酸ナトリウムは、発酵器中に添加
されるべき全培地の約７５％〜９０％、普通約８０％〜
９０％中に溶解されるであろう。
【００１９】次に発酵の過程の間に少しづつ添加される
べき溶液を、適切な割合で、個々の成分を混合すること
によって調製する。グルコースは、使用されるべき水の
約７５％〜８５％、好ましくは約８０％中に溶解される
であろう。シトレート、マグネシウム及び硫酸は、使用
されるべき水の約５％〜１５％、普通約１０％を含む水
性培地中に混合され、他方、リン酸塩は、使用されるべ
き水の約５％〜１５％、より普通には約１０％中に混合
され、次に使用されるべき全量水の約５％〜１５％、よ
り普通には約８％〜１０％中の微量金属の溶液が混合さ
れる。リン酸塩の一部を含む発酵器に、第一鉄塩及び上
で調製されたグルコース−塩濃縮物の約２０％を添加す
る。その添加は、いかなる外来性微生物の導入をも避け
るために、無菌状態で行なう。次に、栄養培地を目的と
する温度、一般的に約３０℃〜４０℃の範囲、好ましく
は約３５℃にして、そして発酵器に接種物を接種し、約
０．１５〜０．４ｇ／ｌの開始細胞密度を提供する。少
量の消泡剤を発酵の進行の間に添加することができる。
べき溶液を、適切な割合で、個々の成分を混合すること
によって調製する。グルコースは、使用されるべき水の
約７５％〜８５％、好ましくは約８０％中に溶解される
であろう。シトレート、マグネシウム及び硫酸は、使用
されるべき水の約５％〜１５％、普通約１０％を含む水
性培地中に混合され、他方、リン酸塩は、使用されるべ
き水の約５％〜１５％、より普通には約１０％中に混合
され、次に使用されるべき全量水の約５％〜１５％、よ
り普通には約８％〜１０％中の微量金属の溶液が混合さ
れる。リン酸塩の一部を含む発酵器に、第一鉄塩及び上
で調製されたグルコース−塩濃縮物の約２０％を添加す
る。その添加は、いかなる外来性微生物の導入をも避け
るために、無菌状態で行なう。次に、栄養培地を目的と
する温度、一般的に約３０℃〜４０℃の範囲、好ましく
は約３５℃にして、そして発酵器に接種物を接種し、約
０．１５〜０．４ｇ／ｌの開始細胞密度を提供する。少
量の消泡剤を発酵の進行の間に添加することができる。
【００２０】発酵の第１段階において、細胞は中間的な
密度に増殖せしめられる。これは、普通、約０．１〜
０．１５／時の増殖速度により、約３５〜５０時間、よ
り普通には約４０〜４５時間を必要とするであろう。約
６．５〜８．０の範囲のpHを維持するために、そのpHを
無水アンモニアを用いることによって調節することがで
きる。普通、pH調節は活発な増殖の後解除される。攪拌
は普通、約２００〜１０００rpm で行なわれ、そして通
気は約０．２〜０．６ｌ／分で空気により行なわれるで
あろう。初期のための最終密度は、約３５〜４５ｇ／
ｌ、好ましくは約４０ｇ／ｌの細胞密度であるべきであ
る。
密度に増殖せしめられる。これは、普通、約０．１〜
０．１５／時の増殖速度により、約３５〜５０時間、よ
り普通には約４０〜４５時間を必要とするであろう。約
６．５〜８．０の範囲のpHを維持するために、そのpHを
無水アンモニアを用いることによって調節することがで
きる。普通、pH調節は活発な増殖の後解除される。攪拌
は普通、約２００〜１０００rpm で行なわれ、そして通
気は約０．２〜０．６ｌ／分で空気により行なわれるで
あろう。初期のための最終密度は、約３５〜４５ｇ／
ｌ、好ましくは約４０ｇ／ｌの細胞密度であるべきであ
る。
【００２１】グルコースの利用性を、便利な方法、たと
えばグルコースオキシダーゼ酵素試験、ＨＰＬＣ、等に
よって上清液中においてモニターする。グルコース濃度
が下がる場合、全グルコースの濃度が約３０ｇ／ｌ以下
に維持されることを確保しながら、グルコース−塩濃縮
物の溶液の約２０％のアクコートを添加することによっ
て、グルコースを補充することができる。初期相におい
て、高い細胞密度に達し、そしてグルコースが実質的に
完全に使い尽くされた場合、その後約２〜４時間、より
普通には約３時間、そのグルコースの消耗状態が維持さ
れる。次に、その後比較的等い時間間隔で約０．００５
〜０．０１５ｇグルコース／時／ｇ細胞の添加速度をも
たらすようにグルコースを添加することができる。Ｌ−
アスコルビン酸の濃度が実質的に一定に維持され又は減
少し始める時、反応を停止し、細胞及び上清液を単離
し、そしてアスコルビン酸を細胞から分離し、そして常
法に従って集める。
えばグルコースオキシダーゼ酵素試験、ＨＰＬＣ、等に
よって上清液中においてモニターする。グルコース濃度
が下がる場合、全グルコースの濃度が約３０ｇ／ｌ以下
に維持されることを確保しながら、グルコース−塩濃縮
物の溶液の約２０％のアクコートを添加することによっ
て、グルコースを補充することができる。初期相におい
て、高い細胞密度に達し、そしてグルコースが実質的に
完全に使い尽くされた場合、その後約２〜４時間、より
普通には約３時間、そのグルコースの消耗状態が維持さ
れる。次に、その後比較的等い時間間隔で約０．００５
〜０．０１５ｇグルコース／時／ｇ細胞の添加速度をも
たらすようにグルコースを添加することができる。Ｌ−
アスコルビン酸の濃度が実質的に一定に維持され又は減
少し始める時、反応を停止し、細胞及び上清液を単離
し、そしてアスコルビン酸を細胞から分離し、そして常
法に従って集める。
【００２２】本発明によれば、Ｌ−アスコルビン酸の高
い収率が、他の天然源、たとえばローズヒップス（ｒｏ
ｓｅ ｈｉｐｓ）からの収量よりもはるかに高い収量が
得られる。３．５％を越えるバイオマス物質のレベルを
達成することができ、そして４．０％及びそれよりも高
いレベルも達成し得る。Ｌ−アスコルビン酸の濃度は
１．４５ｇ／ｌを越え、そして３．３ｇ／ｌ又はそれよ
りも高くなることができる。消費される基質に基づくモ
ル収率は少なくとも約０．０１０、普通少なくとも約
０．０１３である。次の例は制限的でなく例示的に示さ
れている。
い収率が、他の天然源、たとえばローズヒップス（ｒｏ
ｓｅ ｈｉｐｓ）からの収量よりもはるかに高い収量が
得られる。３．５％を越えるバイオマス物質のレベルを
達成することができ、そして４．０％及びそれよりも高
いレベルも達成し得る。Ｌ−アスコルビン酸の濃度は
１．４５ｇ／ｌを越え、そして３．３ｇ／ｌ又はそれよ
りも高くなることができる。消費される基質に基づくモ
ル収率は少なくとも約０．０１０、普通少なくとも約
０．０１３である。次の例は制限的でなく例示的に示さ
れている。
【００２３】
【実施例】実験 １ｌの発酵器中で水０．６ｌ、二塩基性リン酸ナトリウ
ム０．２３ｇ及び一塩基性リン酸カリウム０．２７ｇを
殺菌した。次に、そのリン酸塩溶液に、蒸留水５ml中硫
酸第一鉄（七水和物）１１．２mg及び次のようにして調
製された殺菌されたグルコース−塩濃縮物２０mlを添加
した。栄養物のグループをそれぞれ殺菌し、そして冷却
後混合した。 グループ１ 水８０ml中食品銘柄の一水和物（無水基準）グルコース
５６ｇ（８０ｇ／ｌ） グループ２ 水１０ml中クエン酸三ナトリウム二水和物０．７ｇ
（１．０ｇ／ｌ）、無水硫酸マグネシウム（０．６６ｇ
／ｌ）及び硫酸１ml（１．４ml／ｌ）
ム０．２３ｇ及び一塩基性リン酸カリウム０．２７ｇを
殺菌した。次に、そのリン酸塩溶液に、蒸留水５ml中硫
酸第一鉄（七水和物）１１．２mg及び次のようにして調
製された殺菌されたグルコース−塩濃縮物２０mlを添加
した。栄養物のグループをそれぞれ殺菌し、そして冷却
後混合した。 グループ１ 水８０ml中食品銘柄の一水和物（無水基準）グルコース
５６ｇ（８０ｇ／ｌ） グループ２ 水１０ml中クエン酸三ナトリウム二水和物０．７ｇ
（１．０ｇ／ｌ）、無水硫酸マグネシウム（０．６６ｇ
／ｌ）及び硫酸１ml（１．４ml／ｌ）
【００２４】グループ３ 水１０ml中一塩基性リン酸ナトリウム０．６５ｇ（０．
９７ｇ／ｌ）、一塩基性リン酸カリウム１．３ｇ（１．
９ｇ／ｌ）及び二塩基性リン酸ナトリウム０．６８ｇ
（０．９７ｇ／ｌ） グループ４ 微量金属の溶液９．４ml
９７ｇ／ｌ）、一塩基性リン酸カリウム１．３ｇ（１．
９ｇ／ｌ）及び二塩基性リン酸ナトリウム０．６８ｇ
（０．９７ｇ／ｌ） グループ４ 微量金属の溶液９．４ml
【００２５】温度を３５℃に上昇し、攪拌を約２００rp
m で始め、そして約０．３ｇの細胞／ｌの濃度で、５０
mlのクロレラピレノイドサＵＶ １０１−１５８を添加
した。これらの細胞を１９８５年６月２７日にＡ．Ｔ．
Ｃ．Ｃ．に寄託し、そして寄託番号５３１７０を得た。
次の図表は発酵のための条件及び分析結果を記載してい
る。
m で始め、そして約０．３ｇの細胞／ｌの濃度で、５０
mlのクロレラピレノイドサＵＶ １０１−１５８を添加
した。これらの細胞を１９８５年６月２７日にＡ．Ｔ．
Ｃ．Ｃ．に寄託し、そして寄託番号５３１７０を得た。
次の図表は発酵のための条件及び分析結果を記載してい
る。
【００２６】
【表３】
【００２７】Ｌ−アスコルビン酸を測定するために使用
される方法は、Grun及びLoewus, Analytical Biochemis
try （１９８３）１３０：１９１〜１９８によって記載
されている。その方法は、７．８×３００mmの有機酸分
析カラム、ＨＰＸ−８７（Bio-Rad Laboratories, リッ
チモンド，カリフォルニア）を用いるイオン交換方法で
ある。その条件は、移動相、０．０１３Ｍの硝酸、０．
８ml／分の流速、１５００psigの圧力、ＵＶ ２４５〜
２５４nmでの検出である。
される方法は、Grun及びLoewus, Analytical Biochemis
try （１９８３）１３０：１９１〜１９８によって記載
されている。その方法は、７．８×３００mmの有機酸分
析カラム、ＨＰＸ−８７（Bio-Rad Laboratories, リッ
チモンド，カリフォルニア）を用いるイオン交換方法で
ある。その条件は、移動相、０．０１３Ｍの硝酸、０．
８ml／分の流速、１５００psigの圧力、ＵＶ ２４５〜
２５４nmでの検出である。
【００２８】上の条件により、Ｌ−アスコルビン酸及び
イソアスコルビン酸の分離が可能である。１ｌ当りの細
胞のグラム数を決定するために、次の方法を使用する。
バイオマスサンプル（５ml）を１つの秤量パンに移し、
そして上清液５mlを第２の秤量パンに移す。その上清液
を遠心分離する。そのパンを対流オーブン（１０５℃で
３時間）中で乾燥せしめる。デシケーター中で冷却した
後、パン内容物の重さを計る。１ｌ当りの細胞のグラム
数を（サンプル重量−上清液重量）×２００として決定
する。
イソアスコルビン酸の分離が可能である。１ｌ当りの細
胞のグラム数を決定するために、次の方法を使用する。
バイオマスサンプル（５ml）を１つの秤量パンに移し、
そして上清液５mlを第２の秤量パンに移す。その上清液
を遠心分離する。そのパンを対流オーブン（１０５℃で
３時間）中で乾燥せしめる。デシケーター中で冷却した
後、パン内容物の重さを計る。１ｌ当りの細胞のグラム
数を（サンプル重量−上清液重量）×２００として決定
する。
【００２９】上の結果に基づく場合、グラム細胞当りの
アスコルビン酸のグラムに基づく比生産性を、０．０４
又はそれよりも高いレベルで達成し、そして消化される
グルコースのモル当り形成されるＬ−アスコルビン酸の
モルとして定義されるモル収率は少なくとも０．０１又
はそれよりも高い。さらに、そのアスコルビン酸の濃度
を約１．５ｇ／ｌ又はそれよりも高く上昇せしめること
ができる。
アスコルビン酸のグラムに基づく比生産性を、０．０４
又はそれよりも高いレベルで達成し、そして消化される
グルコースのモル当り形成されるＬ−アスコルビン酸の
モルとして定義されるモル収率は少なくとも０．０１又
はそれよりも高い。さらに、そのアスコルビン酸の濃度
を約１．５ｇ／ｌ又はそれよりも高く上昇せしめること
ができる。
【００３０】アスコルビン酸の高められた収率を、グル
コースの能率的な使用及び発酵時間により達成すること
ができることが、上の結果から明らかである。微生物、
特にクロレラ株を発酵器中において増殖せしめることが
でき、そしてそこで、高レベルのＬ−アスコルビン酸を
安い炭素源の能率的な使用により得て、Ｌ−アスコルビ
ン酸を提供することができる。
コースの能率的な使用及び発酵時間により達成すること
ができることが、上の結果から明らかである。微生物、
特にクロレラ株を発酵器中において増殖せしめることが
でき、そしてそこで、高レベルのＬ−アスコルビン酸を
安い炭素源の能率的な使用により得て、Ｌ−アスコルビ
ン酸を提供することができる。
【００３１】前述の発明は、明確に理解するために例示
的及び例的にいくらか詳細に記載されているけれども、
特許請求の範囲内で変法及び変更を行なうことができ
る。
的及び例的にいくらか詳細に記載されているけれども、
特許請求の範囲内で変法及び変更を行なうことができ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロナルド ジェイ．ハス アメリカ合衆国，ウィスコンシン 54220, マニトウォック，サウス セブンス スト リート 1035
Claims (2)
- 【請求項１】 Ｌ−アスコルビン酸含有バイオマスであ
って、クロレラピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐ
ｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）の細胞のＬ−アスコルビン酸含
有率が前記細胞の３．５乾量％よりも高い細胞を含んで
成るバイオマス。 - 【請求項２】 前記細胞がＡ・Ｔ・Ｃ・Ｃ・寄託番号５
３１７０を有するクロレラピレノイドサの細胞である請
求項１記載のバイオマス。
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|---|---|
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| JP2690469B2 JP2690469B2 (ja) | 1997-12-10 |
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| WO1993019192A1 (en) * | 1992-03-18 | 1993-09-30 | Bio-Technical Resources | L-ascorbic acid production in microorganisms |
| AU1839795A (en) * | 1994-02-10 | 1995-08-29 | Bio-Technical Resources Lp | L-ascorbic acid production in microorganisms |
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| US20100297296A1 (en) * | 2008-10-14 | 2010-11-25 | Solazyme, Inc. | Healthier Baked Goods Containing Microalgae |
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| SG10201509035WA (en) | 2010-11-03 | 2015-12-30 | Solazyme Inc | Microbial Oils With Lowered Pour Points, Dielectric Fluids Produced Therefrom, And Related Methods |
| JP6071904B2 (ja) | 2011-02-02 | 2017-02-01 | テラヴィア ホールディングス， インコーポレイテッド | 組み換え油産生微生物から生成される用途に応じた油 |
| BR112013028621A2 (pt) | 2011-05-06 | 2016-11-29 | Solazyme Inc | "microalgas oleaginosas recombinantes, método para produzir biomassa de microalga ou um produto produzido da biomassa, e método para produzir uma composição lipídica de microalga". |
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| SG11201406711TA (en) | 2012-04-18 | 2014-11-27 | Solazyme Inc | Tailored oils |
| US10098371B2 (en) | 2013-01-28 | 2018-10-16 | Solazyme Roquette Nutritionals, LLC | Microalgal flour |
| US9249252B2 (en) | 2013-04-26 | 2016-02-02 | Solazyme, Inc. | Low polyunsaturated fatty acid oils and uses thereof |
| FR3009619B1 (fr) | 2013-08-07 | 2017-12-29 | Roquette Freres | Compositions de biomasse de microalgues riches en proteines de qualite sensorielle optimisee |
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| CN106574255A (zh) | 2014-07-10 | 2017-04-19 | 泰拉瑞亚控股公司 | 酮脂酰acp合酶基因及其用途 |
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1985
- 1985-07-01 US US06/750,828 patent/US5001059A/en not_active Expired - Fee Related
-
1986
- 1986-06-27 CA CA000512672A patent/CA1318870C/en not_active Expired - Fee Related
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- 1995-04-03 JP JP7077857A patent/JP2690469B2/ja not_active Expired - Fee Related
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