JPS6229994A - 微生物によるｌ−アスコルビン酸の製造法 - Google Patents
微生物によるｌ−アスコルビン酸の製造法Info
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- JPS6229994A JPS6229994A JP61151845A JP15184586A JPS6229994A JP S6229994 A JPS6229994 A JP S6229994A JP 61151845 A JP61151845 A JP 61151845A JP 15184586 A JP15184586 A JP 15184586A JP S6229994 A JPS6229994 A JP S6229994A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
Ｌ−アスコルビン酸は重要な栄養補給物であり、ソシて
これはビタミンカプセルにおいて、並びにヒト及び他の
ビタミンＣ要求動物の両者のだめの食物中の栄養補給物
として広い用途を有する。
これはビタミンカプセルにおいて、並びにヒト及び他の
ビタミンＣ要求動物の両者のだめの食物中の栄養補給物
として広い用途を有する。
Ｌ−アスコルビン酸は、基本的に大量に製造される化学
物質であり、そしてこれは、ひじように価格不安定であ
り、そして市場性を有するためにｒＪ経済的且つ能率的
な生産を必要とする。従って、Ｌ−アスコルビン酸の能
率的な生産をもたらす、栄養物の能率的転換を提供する
微生物を用いる方法を開発することができることに実質
的な興味持たれる。
物質であり、そしてこれは、ひじように価格不安定であ
り、そして市場性を有するためにｒＪ経済的且つ能率的
な生産を必要とする。従って、Ｌ−アスコルビン酸の能
率的な生産をもたらす、栄養物の能率的転換を提供する
微生物を用いる方法を開発することができることに実質
的な興味持たれる。
野生型の微生物は、少量のＬ−アスコルビン酸を産生ず
るに過ぎない。Ｌ−アスコルビン酸の実質的に増強され
た製造を微生物により達成することができるかどうかは
、予測できない。消費される栄養物に対する、Ｌ−アス
コルビン酸の増強された製造が、Ｌ−アスコルビン酸経
路に関与する酵素の増大された発現により可能であるか
も知れない場合でも、微生物の生存及び代謝に対するＬ
−アスコルビン酸の上昇した濃度の効果は予測できない
。従って、微生物がＬ−アスコルビン酸を産生ずること
は知られているが、経済的に能率的な方法を達成するこ
とができるという確実性はない。
るに過ぎない。Ｌ−アスコルビン酸の実質的に増強され
た製造を微生物により達成することができるかどうかは
、予測できない。消費される栄養物に対する、Ｌ−アス
コルビン酸の増強された製造が、Ｌ−アスコルビン酸経
路に関与する酵素の増大された発現により可能であるか
も知れない場合でも、微生物の生存及び代謝に対するＬ
−アスコルビン酸の上昇した濃度の効果は予測できない
。従って、微生物がＬ−アスコルビン酸を産生ずること
は知られているが、経済的に能率的な方法を達成するこ
とができるという確実性はない。
Ｌｏｅｗｕｓ 、Ｆ 、Ａ・は、 Ｌ −Ａｓｃｏｒｂ
ｉｃ Ａｃ１ｄ ：Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、 Ｂｉｏｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ＋Ｆｕｎｃｔｉｏｎ＋ＴｈｅＢｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐ］ａｎｔ、ｓ−第３巻＋
ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅａｓ＋Ｉｎｃ、 ７７〜９９ペ
ージ、１９８０において、Ｌ−アスコルビン酸の源及び
生合成の総説を提供する。藻類におけるアスコルビン酸
の製造の説明を、Ｖａ Ｉ ｄｙａなど、 ＋ ５ｃｉ
ｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｕ１ｔｕｒｅ（１９７１） ３７
： ３８３〜３８４ ；Ｓｕｂｂｕｌａｋｓｈｍｌな
ど、、Ｎｕｔｒｉｔｌｏｎ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ（１９７ｆｉ ）１４： ５８１〜
５９１ ；Ａａｒｕｎｇｏｎなど、、Ａｒｃｈ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ、 （１９７７） １１２ ：５７〜５９
； Ｓｈｉｇｅｏｋａなど。＋Ｊ、Ｎｕｔｒ 、Ｓｅ
ｔ 。
ｉｃ Ａｃ１ｄ ：Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、 Ｂｉｏｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ＋Ｆｕｎｃｔｉｏｎ＋ＴｈｅＢｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐ］ａｎｔ、ｓ−第３巻＋
ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅａｓ＋Ｉｎｃ、 ７７〜９９ペ
ージ、１９８０において、Ｌ−アスコルビン酸の源及び
生合成の総説を提供する。藻類におけるアスコルビン酸
の製造の説明を、Ｖａ Ｉ ｄｙａなど、 ＋ ５ｃｉ
ｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｕ１ｔｕｒｅ（１９７１） ３７
： ３８３〜３８４ ；Ｓｕｂｂｕｌａｋｓｈｍｌな
ど、、Ｎｕｔｒｉｔｌｏｎ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ（１９７ｆｉ ）１４： ５８１〜
５９１ ；Ａａｒｕｎｇｏｎなど、、Ａｒｃｈ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ、 （１９７７） １１２ ：５７〜５９
； Ｓｈｉｇｅｏｋａなど。＋Ｊ、Ｎｕｔｒ 、Ｓｅ
ｔ 。
Ｓｈｉｇｅｏｋａなど、、Ａｇｒｉｃ、’Ｂｉｏ１．Ｃ
ｈｅｍ、（１９７９）４３：２０５３〜２０５８；Ｂａ
ｙａｎｏｒａ及びＴｒｕｂａｃｈｅｖ＋Ｐｒ１ｋｌａｄ
ｎａｙａ Ｂｉｏｋｈｉｍｌｙａ；Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙｉａ（１９８１） １７ ： ４００〜４０７
（ＵＤＣ５８２、２６： ５７７ 、１６ ） ；及び
Ｃ１ｆｅｒｒｌ、Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒ
ｅｖｉｅｗｓ（１９８３）４７：５５１〜５７８に見出
すことができる。
ｈｅｍ、（１９７９）４３：２０５３〜２０５８；Ｂａ
ｙａｎｏｒａ及びＴｒｕｂａｃｈｅｖ＋Ｐｒ１ｋｌａｄ
ｎａｙａ Ｂｉｏｋｈｉｍｌｙａ；Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙｉａ（１９８１） １７ ： ４００〜４０７
（ＵＤＣ５８２、２６： ５７７ 、１６ ） ；及び
Ｃ１ｆｅｒｒｌ、Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒ
ｅｖｉｅｗｓ（１９８３）４７：５５１〜５７８に見出
すことができる。
クロレラ藻類を用いるＬ−アスコルビン酸の製造のだめ
の改良方法を提供し、その方法においては、該クロレラ
を初期の間、中間的な細胞密度に増殖せしめ、そして制
限レベルで炭素源の逐次的又は連続的添加によって増殖
を続ける。炭素源の改良された利用性が、高められた収
率を伴って、Ｌ−アスコルビン酸の製造に関して観察さ
れる。
の改良方法を提供し、その方法においては、該クロレラ
を初期の間、中間的な細胞密度に増殖せしめ、そして制
限レベルで炭素源の逐次的又は連続的添加によって増殖
を続ける。炭素源の改良された利用性が、高められた収
率を伴って、Ｌ−アスコルビン酸の製造に関して観察さ
れる。
微生物細胞によるＬ−アスコルビン酸の能率的ｆｘＭ造
のための新規な方法が提供される。その方法は、中間的
な密度に細胞を増殖するために十分である炭素源を含む
発酵器中における藻類の初期増殖を含む。炭素源を消耗
した段階で、追加址の炭素源を逐次的に又は連続的に添
加し、その添加を停止する寸で、予定したレベル以下に
炭素源の濃度を維持する。停止は、微生物によるＬ−ア
スコルビン酸生産の実質的な消耗によって決定されるで
あろう。
のための新規な方法が提供される。その方法は、中間的
な密度に細胞を増殖するために十分である炭素源を含む
発酵器中における藻類の初期増殖を含む。炭素源を消耗
した段階で、追加址の炭素源を逐次的に又は連続的に添
加し、その添加を停止する寸で、予定したレベル以下に
炭素源の濃度を維持する。停止は、微生物によるＬ−ア
スコルビン酸生産の実質的な消耗によって決定されるで
あろう。
対象の微生物を、過剰生産体（Ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｅ
ｒ）である株についてランダムにスクリーンすることが
できる。有望な微生物を選択し、そして物理的又は化学
的突然変異誘発物、たとえば紫外線、Ｘ線、ニトロン尿
素、硫酸ジメチル、等を用いて突然変異を誘発すること
ができる。過剰生産体及び排出体の検出をレドックス色
素により有利に決定することができる。アスコルビン酸
への代謝中間体に対する類似体又はアスコルビン酸合成
の阻害剤を用いることによって、化学的妨害の存在の中
で、Ｌ−アスコルビン酸生産を維持し又は増大すること
ができる微生物を選択することができる。
ｒ）である株についてランダムにスクリーンすることが
できる。有望な微生物を選択し、そして物理的又は化学
的突然変異誘発物、たとえば紫外線、Ｘ線、ニトロン尿
素、硫酸ジメチル、等を用いて突然変異を誘発すること
ができる。過剰生産体及び排出体の検出をレドックス色
素により有利に決定することができる。アスコルビン酸
への代謝中間体に対する類似体又はアスコルビン酸合成
の阻害剤を用いることによって、化学的妨害の存在の中
で、Ｌ−アスコルビン酸生産を維持し又は増大すること
ができる微生物を選択することができる。
上の生産体の子孫を、ダラム細胞当りミリグラムにより
測定されるＬ−アスコルビン酸の改良された化生産性に
ついて選択する。次に、これらの子孫を個々のクローン
にさらに分離することができ、そして上の方法にさらに
ゆだねることができる。選択される藻類は、クロレラ、
特にクロレラピレノイドザの株である。Ｃ，ピレノイド
サ、 ＵＴＥＸ１６６３株又は他の同等の株が特別な興
味の対象である。
測定されるＬ−アスコルビン酸の改良された化生産性に
ついて選択する。次に、これらの子孫を個々のクローン
にさらに分離することができ、そして上の方法にさらに
ゆだねることができる。選択される藻類は、クロレラ、
特にクロレラピレノイドザの株である。Ｃ，ピレノイド
サ、 ＵＴＥＸ１６６３株又は他の同等の株が特別な興
味の対象である。
この方法を行なう場合、約０．１５〜０．４９／ｌの乾
量の細胞の初期細胞密度を提供するのに十分な量で、活
発に増殖している微生物株の培養物を栄養培地に接種す
る。その培地は炭素源、種々の塩及び微量金属を含むで
あろう。炭素源は通常、グルコースを含むグルコース源
であろう。グルコース源は、グルコースに転換され得る
任意のサツカリド又はポリサツカリド、たとえばスクロ
ース、アミロースであることができる。使用されるグル
コース源の合計量は、代削ｊされるとすれば、約６５〜
９０、より普通には約７５〜８５そして好ましくけ約Ｂ
ｏｉｌ／ｌの濃度を提供するであろう〇普通、全グルコ
ースの約１５〜３０チ、普通には全グルコースの約２０
％〜２５％が初めに添加されるであろう。グルコースは
、通常、他の添加物と共に最初に及び発酵の過程で添加
されるであろう。グルコース源は、一般的に制限されな
い増殖の期間中１５〜３ｏｉ／ｌの範囲で維持されるで
あろう。この量は、増殖期間中グルコース制限を避ける
のに十分であることが見出される。
量の細胞の初期細胞密度を提供するのに十分な量で、活
発に増殖している微生物株の培養物を栄養培地に接種す
る。その培地は炭素源、種々の塩及び微量金属を含むで
あろう。炭素源は通常、グルコースを含むグルコース源
であろう。グルコース源は、グルコースに転換され得る
任意のサツカリド又はポリサツカリド、たとえばスクロ
ース、アミロースであることができる。使用されるグル
コース源の合計量は、代削ｊされるとすれば、約６５〜
９０、より普通には約７５〜８５そして好ましくけ約Ｂ
ｏｉｌ／ｌの濃度を提供するであろう〇普通、全グルコ
ースの約１５〜３０チ、普通には全グルコースの約２０
％〜２５％が初めに添加されるであろう。グルコースは
、通常、他の添加物と共に最初に及び発酵の過程で添加
されるであろう。グルコース源は、一般的に制限されな
い増殖の期間中１５〜３ｏｉ／ｌの範囲で維持されるで
あろう。この量は、増殖期間中グルコース制限を避ける
のに十分であることが見出される。
所望により、いくらかの添加物が最初に発酵器中に存在
し、そしてグルコース源の添加と一緒に同じ添加物の逐
次的添加によって連続的に添加されるであろう。
し、そしてグルコース源の添加と一緒に同じ添加物の逐
次的添加によって連続的に添加されるであろう。
発酵器に添加される全量と比較する場合、少しづつ添加
される量のグルコースに対して異なった割合を有するで
あろう添加物の中に、アルカリ金属のリン酸塩、すなわ
ちリン酸ナトリウム及びリン酸カリウムが、特に二塩基
性リン酸ナトリウム及び−塩基性リン酸カリウムとして
存在する。二塩基性リン酸す） ＩＪウムの合計量は、
１！当り合計約１〜２ｇ、普通１１当り合計約１〜１．
５ｇ、そして好ましくは１１当り合計約１．３ｇであろ
う。
される量のグルコースに対して異なった割合を有するで
あろう添加物の中に、アルカリ金属のリン酸塩、すなわ
ちリン酸ナトリウム及びリン酸カリウムが、特に二塩基
性リン酸ナトリウム及び−塩基性リン酸カリウムとして
存在する。二塩基性リン酸す） ＩＪウムの合計量は、
１！当り合計約１〜２ｇ、普通１１当り合計約１〜１．
５ｇ、そして好ましくは１１当り合計約１．３ｇであろ
う。
発酵器中に初めに存在する二塩基性リン酸ナトリウムの
量は、添加される二塩基性リン酸ナトリウムの全量の約
３５チ〜５０％、より普通には約４０チ〜４５チであろ
う。−塩基性リン酸カリウムの全量は、１１当シ約１．
５〜３ｇ、よシ普通には１１当り約２〜２．５ｇであろ
う。最初に存在する量は、一般的に、全量の約４０チ〜
５０％、より普通には、全量の約１５〜３０チであろう
。
量は、添加される二塩基性リン酸ナトリウムの全量の約
３５チ〜５０％、より普通には約４０チ〜４５チであろ
う。−塩基性リン酸カリウムの全量は、１１当シ約１．
５〜３ｇ、よシ普通には１１当り約２〜２．５ｇであろ
う。最初に存在する量は、一般的に、全量の約４０チ〜
５０％、より普通には、全量の約１５〜３０チであろう
。
上の添加物の他に、生物学的に許容されるキレート剤を
添加する。便利には、クエン酸三ナトリウムが、１１当
り約０．８〜１．２Ｉｌの合計量、普通ｌｌ当り約１．
０ｇの合計量で使用されるであろう。
添加する。便利には、クエン酸三ナトリウムが、１１当
り約０．８〜１．２Ｉｌの合計量、普通ｌｌ当り約１．
０ｇの合計量で使用されるであろう。
−塩基性リン酸ナトリウムは、約０．８〜１ｇ／ｌ、好
ましくは約０．９５〜１１／ｌで存在するである。
ましくは約０．９５〜１１／ｌで存在するである。
生物学的に許容される鉱酸は、溶液中に微量金属を保持
し、そしてまた、窒素源として普通使用されるアンモニ
アを中和するために添加される。便利には、濃硫酸が、
１１当シ約１〜２ｍｌ、より普通には１１尚り約１，２
〜１．５ ｍｌの量で使用される。
し、そしてまた、窒素源として普通使用されるアンモニ
アを中和するために添加される。便利には、濃硫酸が、
１１当シ約１〜２ｍｌ、より普通には１１尚り約１，２
〜１．５ ｍｌの量で使用される。
金属の中で、特に生理的に許容される塩、たとえば硫酸
塩として、マグネシウムが約０．１〜０．２Ｆ／ｌ、好
ましくけ約０１〜ｏ、１５＃／ｌで存在するであろう。
塩として、マグネシウムが約０．１〜０．２Ｆ／ｌ、好
ましくけ約０１〜ｏ、１５＃／ｌで存在するであろう。
使用される鉄及び銅の量は限定される。かぜならば、こ
れらの金属は、アスコルビン酸形成を抑制するからであ
る。鉄（第一鉄）は、初めに約５−７ｍ９／／、好まし
くは約５．５〜６ ｍｆｌ／ｌで存在し、そしてその後
のいづれの添加中にも含まれないであろう。銅は、比較
的少量、一般的にグルコース１ｙ当り約１〜５０μｇで
存在するであろう。
れらの金属は、アスコルビン酸形成を抑制するからであ
る。鉄（第一鉄）は、初めに約５−７ｍ９／／、好まし
くは約５．５〜６ ｍｆｌ／ｌで存在し、そしてその後
のいづれの添加中にも含まれないであろう。銅は、比較
的少量、一般的にグルコース１ｙ当り約１〜５０μｇで
存在するであろう。
次の実験の部分に記載されるであろう微量金属の溶液は
、１１当り約１０〜１５ｍ１、より普通には１１当り約
１２〜１４ｍ１で存在するであろう。
、１１当り約１０〜１５ｍ１、より普通には１１当り約
１２〜１４ｍ１で存在するであろう。
グルコースに基づいて、微量金属の溶液は０．１〜０．
２ｍｌ／１１グルコースで使用されるであろう。
２ｍｌ／１１グルコースで使用されるであろう。
便利には、発酵の過程の間に添加される溶液を調製する
。この溶液は、多くの場合、次の組成物を有するであろ
う。
。この溶液は、多くの場合、次の組成物を有するであろ
う。
第 １ 表
培地の配合表
グルコース １．０
クエン酸三ナトリウム ニ水和物 ０．０１２５硫酸マ
グネシウム 無水 ０．００８２−塩基性 リン酸すト
リウム ０．０１１６−塩基性 リン酸カリウム
０．０２３８二塩基性 リン酸ナトリウム
０．０１２１微廿金属 混合物 ０．１
６７５ｍｌ／ｊＪ９８％（Ｗ／Ｗ）硫酸 ０．０
３２９供給される窒素は無水アンモニアによってである
。
グネシウム 無水 ０．００８２−塩基性 リン酸すト
リウム ０．０１１６−塩基性 リン酸カリウム
０．０２３８二塩基性 リン酸ナトリウム
０．０１２１微廿金属 混合物 ０．１
６７５ｍｌ／ｊＪ９８％（Ｗ／Ｗ）硫酸 ０．０
３２９供給される窒素は無水アンモニアによってである
。
これはまた、ｐｉ（調節として使用される。培地中の実
際の窒素レベルは、培地の酸性度及び培地の緩衝能によ
って決定される。
際の窒素レベルは、培地の酸性度及び培地の緩衝能によ
って決定される。
微動金属組成物は次の金属を有するであろう。
鼠下金白
第２表
成分 濃度
（原液□）ｍｃｉ／ｇＪ
塩化カルシウム ニ水和物 ３１０２硫酸第二マ
ンガン −水利物 ４００硫酸第二銅 −水和
物 ０，４ 塩化第二コバルト 五水和物４０ 硼 酸 １６０硫
酸第二亜鉛 七水和物 ４００ モリブデン酸ナトリウム ニ水和物 １９硫
酸バナジル ニ水利物 ２０ 硝酸第二ニツケル 六水和物 ８セレン酸
ナトリウム １８微量のＨＣ
ｌを含む蒸留水中に溶解されている上の表に示された種
々の化合物の適切な量を蒸留水に添加することによって
微量金属の原液を調製し、そしてここで最終体積は１１
であり、そして濃塩酸２０ｍ１を含む。蒸留水を用いて
、成分の微量金属の適切な割合を確保する。
ンガン −水利物 ４００硫酸第二銅 −水和
物 ０，４ 塩化第二コバルト 五水和物４０ 硼 酸 １６０硫
酸第二亜鉛 七水和物 ４００ モリブデン酸ナトリウム ニ水和物 １９硫
酸バナジル ニ水利物 ２０ 硝酸第二ニツケル 六水和物 ８セレン酸
ナトリウム １８微量のＨＣ
ｌを含む蒸留水中に溶解されている上の表に示された種
々の化合物の適切な量を蒸留水に添加することによって
微量金属の原液を調製し、そしてここで最終体積は１１
であり、そして濃塩酸２０ｍ１を含む。蒸留水を用いて
、成分の微量金属の適切な割合を確保する。
多くの塩が−又は二塩基性塩として言及されているけれ
ども、これは便宜上であシ、゛そして必要ではないこと
を理解するべきである。これらの化合物は緩衝剤として
作用し、そして従って陽子化の状態の割合は、培地の川
により異なるであろう。
ども、これは便宜上であシ、゛そして必要ではないこと
を理解するべきである。これらの化合物は緩衝剤として
作用し、そして従って陽子化の状態の割合は、培地の川
により異なるであろう。
発酵を行なう場合、二塩基性リン酸ナトリウム及び−塩
基性リン酸す） ＩＪウムは、発酵器中に添加されるべ
き全培地の約７５チ〜９０ｑ６、普通約８０チ〜９０％
中に溶解されるであろう。
基性リン酸す） ＩＪウムは、発酵器中に添加されるべ
き全培地の約７５チ〜９０ｑ６、普通約８０チ〜９０％
中に溶解されるであろう。
次に発酵の過程の間に少しづつ添加されるべき溶液を、
適切な割合で、個々の成分を混合することによって調製
する。グルコースは、使用されるべき水の約５ｑ〜１５
チ、好ましくは約８０％中に溶解されるであろう。シト
レート、マグネシウム及び硫酸は、使用されるべき水の
約５ｑ６〜１５チ、普通的１０％を含む水性培地中に混
合され、他方、リン酸塩は、使用されるべき水の約５％
〜１５チ、よシ普通には約１０多中に混合され、次に使
用されるべき全量水の約５％〜１５チ、より普通には約
８係〜１０係中の微量金属の溶液が混合される。リン酸
塩の一部を含む発酵器に、第−鉄塩及び上で調製された
グルコース−塩濃縮物の約２０チを添加する。その添加
は、いかなる外来性微生物の導入をも避けるために、無
菌状態で行なう。次に、栄養培地を目的とする温度、一
般的に約３０°〜４０℃の範囲、好ましくは約３５℃に
して、そして発酵器に接種物を接種し、約Ｏ１５〜０．
４ｇ／ｌの開始細胞密度を提供する。
適切な割合で、個々の成分を混合することによって調製
する。グルコースは、使用されるべき水の約５ｑ〜１５
チ、好ましくは約８０％中に溶解されるであろう。シト
レート、マグネシウム及び硫酸は、使用されるべき水の
約５ｑ６〜１５チ、普通的１０％を含む水性培地中に混
合され、他方、リン酸塩は、使用されるべき水の約５％
〜１５チ、よシ普通には約１０多中に混合され、次に使
用されるべき全量水の約５％〜１５チ、より普通には約
８係〜１０係中の微量金属の溶液が混合される。リン酸
塩の一部を含む発酵器に、第−鉄塩及び上で調製された
グルコース−塩濃縮物の約２０チを添加する。その添加
は、いかなる外来性微生物の導入をも避けるために、無
菌状態で行なう。次に、栄養培地を目的とする温度、一
般的に約３０°〜４０℃の範囲、好ましくは約３５℃に
して、そして発酵器に接種物を接種し、約Ｏ１５〜０．
４ｇ／ｌの開始細胞密度を提供する。
少量の消泡剤を発酵の進行の間に添加することができる
。
。
発酵の第１段階において、細胞は中間的々密度に増殖せ
しめられる。これは、普通、約０．１〜０．１５／時の
増殖速度によシ、約３５〜５０時間、より普通には約４
０〜４５時間を必要とするであろう。約６．５〜８．０
の範囲のが１を維持するために、そのＰＩ−（を無水ア
ンモニアを用いることによって調節することができる。
しめられる。これは、普通、約０．１〜０．１５／時の
増殖速度によシ、約３５〜５０時間、より普通には約４
０〜４５時間を必要とするであろう。約６．５〜８．０
の範囲のが１を維持するために、そのＰＩ−（を無水ア
ンモニアを用いることによって調節することができる。
普通、ＰＨ調節は活発々増殖の後解除される。攪拌は普
通、約２００〜１１０００ｒｐで行なわれ、そして通気
は約０．２〜０．６１／分で空気により行なわれるであ
ろう。初期のための最終密度は、約３５〜４５ ｇ／ｌ
、好脣しくは約４０ ｇ／ｌの細胞密度であるべきであ
る。
通、約２００〜１１０００ｒｐで行なわれ、そして通気
は約０．２〜０．６１／分で空気により行なわれるであ
ろう。初期のための最終密度は、約３５〜４５ ｇ／ｌ
、好脣しくは約４０ ｇ／ｌの細胞密度であるべきであ
る。
グルコースの利用性を、便利な方法、たとえばグルコー
スオキシダーゼ酵素試験、ＨＰＬＣ、笠によって上清液
中においてモニターする。グルコース濃度が下がる場合
、全グルコースの濃度が約３０ｇ／ｌ以下に維持される
ことを確保しながら、グルコース−塩濃縮物の溶液の約
２０％のアクコートを添加することによって、グルコー
スを補充することができる。初期相において、高い細胞
密度に達し、そしてグルコースが実質的に完全に使い尽
くされた場合、その後約２〜４時間、より普通には約３
時間、そのグルコースの消耗状態が維持される。次に、
その後比較的等い時間間隔で約０．００５〜０．０１！
Ｍグルコース／時／ｇ細胞の添加速度をもたらすように
グルコースを添加することができる。Ｌ−アスコルビン
酸の濃度が実質的に一定に維持され又は減少し始める時
、反応を停止し、細胞及び上清液を単離し、そしてアス
コルピン酸を細胞から分離し、そして常法に従って集め
る。
スオキシダーゼ酵素試験、ＨＰＬＣ、笠によって上清液
中においてモニターする。グルコース濃度が下がる場合
、全グルコースの濃度が約３０ｇ／ｌ以下に維持される
ことを確保しながら、グルコース−塩濃縮物の溶液の約
２０％のアクコートを添加することによって、グルコー
スを補充することができる。初期相において、高い細胞
密度に達し、そしてグルコースが実質的に完全に使い尽
くされた場合、その後約２〜４時間、より普通には約３
時間、そのグルコースの消耗状態が維持される。次に、
その後比較的等い時間間隔で約０．００５〜０．０１！
Ｍグルコース／時／ｇ細胞の添加速度をもたらすように
グルコースを添加することができる。Ｌ−アスコルビン
酸の濃度が実質的に一定に維持され又は減少し始める時
、反応を停止し、細胞及び上清液を単離し、そしてアス
コルピン酸を細胞から分離し、そして常法に従って集め
る。
本発明によれば、Ｌ−アスコルビン酸（Ｄ 高イ収率が
、他の天然源、たとえばローズヒップス（ｒｏｓｅ ｈ
ｉｐｓ ）からの収量よりもはるかに高い収量が得られ
る。３．５ｑ６を越えるバイオマス物質のレベルを達成
することができ、そして４．０係及びそれよりも高いレ
ベルも達成し得る。Ｌ−アスコルビン酸の濃度は１．４
５ｇ／ｌを越え、そして３．３１／／ｌ又はそれよりも
高くなることができる。
、他の天然源、たとえばローズヒップス（ｒｏｓｅ ｈ
ｉｐｓ ）からの収量よりもはるかに高い収量が得られ
る。３．５ｑ６を越えるバイオマス物質のレベルを達成
することができ、そして４．０係及びそれよりも高いレ
ベルも達成し得る。Ｌ−アスコルビン酸の濃度は１．４
５ｇ／ｌを越え、そして３．３１／／ｌ又はそれよりも
高くなることができる。
消費される基質に基づくモル収率は少なくとも約００１
０、普通少なくとも約０．０１３である。
０、普通少なくとも約０．０１３である。
次の例は制限的でなく例示的に示されている。
実験
１１の発酵器中で水０．６１、二塩基性リン酸ナトリウ
ム０．２３ｇ及び−塩基性リン酸カリウム０．２７．！
ｉ’を殺菌した。次に、そのリン酸塩溶液に、蒸留水５
ｍ、ｌ中値酸第−鉄（七水和物）１１．２ｍ９及び次
のようにして調製された殺菌されたグルコース−塩濃縮
物２０ｍ１を添加した。栄養物のグループをそれぞれ殺
菌し、そして冷却後混合した。
ム０．２３ｇ及び−塩基性リン酸カリウム０．２７．！
ｉ’を殺菌した。次に、そのリン酸塩溶液に、蒸留水５
ｍ、ｌ中値酸第−鉄（七水和物）１１．２ｍ９及び次
のようにして調製された殺菌されたグルコース−塩濃縮
物２０ｍ１を添加した。栄養物のグループをそれぞれ殺
菌し、そして冷却後混合した。
グループ１
水８０ｄ中食品銘柄の一水和物（無水基準）グルコース
５６１８０．９／ｌ） グループ２ 水１０ｍ１中クエン酸三す） ＩＪウムニ水和物０．７
、Ｆ （１，０１１／ｌ ）、無水硫酸マグネシウム（
０，６６ｇ／ｌ）及び硫酸１ｍ１（１，４＊＋ｌ／ｌ）
グループ３ 水１０ｍＡ！中−塩基中−塩基ナトリウム０．６５ ｇ
（０，９７ｇ／ｌ）、−塩基性リン酸カリウム１．３ｇ
（１，９ｇ／ｌ ’）及び二塩基性リン酸す） ＩＪウ
ム０．６８９（０，９７１１／ｌ＞ グルー７０４ ／ｌの濃度で、５ Ｑ ｍｌのクロレラピレノイドサＵ
Ｖ １０１−１５８を添加した。これらの細胞を１９８
５’年６月２７日にＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ’、 Ｋ寄託し、ぞ
して寄託番号５３１７０を得た。次の図表は発酵のため
の条件及び分析結果を記載している。
５６１８０．９／ｌ） グループ２ 水１０ｍ１中クエン酸三す） ＩＪウムニ水和物０．７
、Ｆ （１，０１１／ｌ ）、無水硫酸マグネシウム（
０，６６ｇ／ｌ）及び硫酸１ｍ１（１，４＊＋ｌ／ｌ）
グループ３ 水１０ｍＡ！中−塩基中−塩基ナトリウム０．６５ ｇ
（０，９７ｇ／ｌ）、−塩基性リン酸カリウム１．３ｇ
（１，９ｇ／ｌ ’）及び二塩基性リン酸す） ＩＪウ
ム０．６８９（０，９７１１／ｌ＞ グルー７０４ ／ｌの濃度で、５ Ｑ ｍｌのクロレラピレノイドサＵ
Ｖ １０１−１５８を添加した。これらの細胞を１９８
５’年６月２７日にＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ’、 Ｋ寄託し、ぞ
して寄託番号５３１７０を得た。次の図表は発酵のため
の条件及び分析結果を記載している。
ｙ、下余臼
Ｌ−アスコルビン酸を測定するために使用される方法は
、Ｇｒｕｎ及びＬｏｅｗｕｓ＋ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９８３）、 １３０：
１９１−１９８によって記載されている。その方法は、
７．８ Ｘ ３００ｍｍの有機酸分析カラム、 ＨＰＸ
−８７（Ｂｉｏ −ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｌｅｇ
、リッチモンド、カリフォルニア）を用いるイオン交換
方法である。その条件は、移動相、０．０１３Ｍの硝酸
、０．８ｍ１１分の流速、１５００ｐｓｉｇの圧力、
ＵＶ ２４５−２５４ ｎｍでの検出である〇 上の条件により、Ｌ−アスコルビン酸及びインアスコル
ビン酸の分離が可能である。
、Ｇｒｕｎ及びＬｏｅｗｕｓ＋ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９８３）、 １３０：
１９１−１９８によって記載されている。その方法は、
７．８ Ｘ ３００ｍｍの有機酸分析カラム、 ＨＰＸ
−８７（Ｂｉｏ −ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｌｅｇ
、リッチモンド、カリフォルニア）を用いるイオン交換
方法である。その条件は、移動相、０．０１３Ｍの硝酸
、０．８ｍ１１分の流速、１５００ｐｓｉｇの圧力、
ＵＶ ２４５−２５４ ｎｍでの検出である〇 上の条件により、Ｌ−アスコルビン酸及びインアスコル
ビン酸の分離が可能である。
１１当シの細胞のグラム数を決定するために、次の方法
を使用する。バイオマスサンプル（５ｒｎｌ）を１つの
秤量パンに移し、そして上清液５＋＋＋Ｊを第２の秤量
・臂ンに移す。その上清液を遠心分離する。
を使用する。バイオマスサンプル（５ｒｎｌ）を１つの
秤量パンに移し、そして上清液５＋＋＋Ｊを第２の秤量
・臂ンに移す。その上清液を遠心分離する。
そのｉ４ンを対流オーブン（１０５℃で３時間）中で乾
燥せしめる。デシクーター中で冷却した後、パン内容物
の重さを計る。ｌｌ当りの細゛胞のグラム数を（サンプ
ル重量−上清液重量）×２００として決定する。
燥せしめる。デシクーター中で冷却した後、パン内容物
の重さを計る。ｌｌ当りの細゛胞のグラム数を（サンプ
ル重量−上清液重量）×２００として決定する。
上の結果に基づく場合、ダラム細胞当シのアスコルビン
酸のダラムに基づく死生産性を、００４又はそれよりも
高いレベルで達成し、そして消化されるグルコースのモ
ル当り形成されるＬ−アスコルビン酸のモルとして定義
されるモル収率は少なくとも０．０１又はそれよシも高
い。さらに、そのアスコルビン酸の濃度を約１．５１１
７１１又はそれよりも高く上昇せしめることができる。
酸のダラムに基づく死生産性を、００４又はそれよりも
高いレベルで達成し、そして消化されるグルコースのモ
ル当り形成されるＬ−アスコルビン酸のモルとして定義
されるモル収率は少なくとも０．０１又はそれよシも高
い。さらに、そのアスコルビン酸の濃度を約１．５１１
７１１又はそれよりも高く上昇せしめることができる。
アスコルビン酸の高められた収率を、グルコースの能率
的な使用及び発酵時間により達成することができること
が、上の結果から明らかである。
的な使用及び発酵時間により達成することができること
が、上の結果から明らかである。
微生物、特にクロレラ株を発酵器中において増殖せしめ
ることができ、そしてそこで、高レベルのＬ−アスコル
ビン酸を安い炭素源の能率的な使用により得て、Ｌ−ア
スコルビン酸を提供することができる。
ることができ、そしてそこで、高レベルのＬ−アスコル
ビン酸を安い炭素源の能率的な使用により得て、Ｌ−ア
スコルビン酸を提供することができる。
前述の発明は、明確に理解するために例示的及び倒曲に
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で変法及び変更を行なうことができる。
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で変法及び変更を行なうことができる。
特許出力仙人
バイオ−テクニカル リソーゾズ。
インコーポｌ／イティド
特許出願代理人
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、Ｌ−アスコルビン酸の改良された製造方法であって
、 高Ｌ−アスコルビン酸生産性クロレラ （Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）株をグルコース源並びに低レベ
ルの鉄及び銅を含む栄養培地中で、該細胞が中間的な密
度に増殖し、そしてグルコース源を実質的に使い尽くす
のに十分な時間増殖せしめ； 該グルコース源の消耗した状態を短時間維持し；そして ０．００５〜０．０１５ｇグルコース／時／ｇ細胞の速
度でグルコース源を添加し、目的とするレベルのＬ−ア
スコルビン酸が得られるまで０．１ｇ／ｌよりも低い濃
度を維持する； ことを含んで成る方法。 ２、前記株が、親株を突然変異誘発し、そして消費され
たグルコースに対する形成されたアスコルビン酸の改良
された割合について選択することによって得られたもの
である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記突然変異誘発がＵＶ照射によって行なわれたも
のである特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、前記グルコース源の消耗した状態を約２〜４時間の
期間維持する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、前記株がＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ寄託番号５３１７０を有す
る株である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、グルコース源に基づくモル収率が少なくとも約０．
０１である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、Ｌ−アスコルビン酸の改良された製造方法であって
、 増殖制限しないために十分な量のグルコース源を含み、
そしてＬ−アスコルビン酸の生産のために非抑制的レベ
ルの鉄及び銅を有する栄養培地中において高Ｌ−アスコ
ルビン酸生産性突然変異誘発されたクロレラピレノイド
サ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）株を
増殖せしめ；グルコース源の実質的な消耗の後、該グル
コース源の消耗状態を約４時間維持し； ０．００５〜０．０１５ｇグルコース／時／ｇ細胞の速
度でグルコース源を添加し、目的とするレベルのＬ−ア
スコルビン酸が得られるまで０．１ｇ／ｌよりも低いグ
ルコース源の濃度を維持し； 該細胞を収得し、そして他の細胞性物質を実質的に含ま
ないＬ−アスコルビン酸を単離することを含んで成る方
法。 ８、前記株がＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号５３１７０を有
する株である特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、前記株がＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号５３１７０を有
するクロレラピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｐｙｒ
ｅｎｏｉｄｏｓａ）株である特許請求の範囲第８項記載
の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/750,828 US5001059A (en) | 1985-07-01 | 1985-07-01 | L-ascorbic acid production in microorganisms |
| US750828 | 1985-07-01 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7077857A Division JP2690469B2 (ja) | 1985-07-01 | 1995-04-03 | Ｌ−アスコルビン酸含有バイオマス |
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|---|---|
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| JPH0789946B2 JPH0789946B2 (ja) | 1995-10-04 |
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| JP7077857A Expired - Fee Related JP2690469B2 (ja) | 1985-07-01 | 1995-04-03 | Ｌ−アスコルビン酸含有バイオマス |
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| US5792631A (en) * | 1985-07-01 | 1998-08-11 | Dcv, Inc. | Microbial process for the production of ascorbic acid using Chlorella protothecoides |
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| WO1993019193A1 (en) * | 1992-03-18 | 1993-09-30 | Bio-Technical Resources | L-ascorbic acid enhanced biomass and its production |
| PT759088E (pt) * | 1994-02-10 | 2001-09-28 | Dcv Inc | Producao do acido l-ascorbico em microrganismos |
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| US20100297323A1 (en) * | 2008-10-14 | 2010-11-25 | Solazyme, Inc. | Gluten-free Foods Containing Microalgae |
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| US10098371B2 (en) | 2013-01-28 | 2018-10-16 | Solazyme Roquette Nutritionals, LLC | Microalgal flour |
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