JPH0646834A - Ｌ−アスコルビン酸を高めたバイオマス及びその製造 - Google Patents
Ｌ−アスコルビン酸を高めたバイオマス及びその製造Info
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- JPH0646834A JPH0646834A JP5058697A JP5869793A JPH0646834A JP H0646834 A JPH0646834 A JP H0646834A JP 5058697 A JP5058697 A JP 5058697A JP 5869793 A JP5869793 A JP 5869793A JP H0646834 A JPH0646834 A JP H0646834A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
-
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 高い細胞内水準のアルコルビン酸を含む（細
胞の乾燥重量の１.５％より多い）微小藻類バイオマス
に関する。このバイオマスは突然変異したＬ−アルコル
ビン酸生産性微小藻類を増殖させることにより生産され
る。 【効果】 このバイオマスは動物飼料として並びに水産
養殖魚飼料又は相当する添加物として有用である。
胞の乾燥重量の１.５％より多い）微小藻類バイオマス
に関する。このバイオマスは突然変異したＬ−アルコル
ビン酸生産性微小藻類を増殖させることにより生産され
る。 【効果】 このバイオマスは動物飼料として並びに水産
養殖魚飼料又は相当する添加物として有用である。
Description
【０００１】
【発明の分野】本発明は高い細胞内濃度のアスコルビン
酸を含む微小藻類バイオマス、その製造及びその動物飼
料への用途に関する。より詳しくは、本発明はアスコル
ビン酸バイオマスを高めた動物飼料組成物及びそれの製
造及びそれの魚類飼料としての用途に関する。
酸を含む微小藻類バイオマス、その製造及びその動物飼
料への用途に関する。より詳しくは、本発明はアスコル
ビン酸バイオマスを高めた動物飼料組成物及びそれの製
造及びそれの魚類飼料としての用途に関する。
【０００２】〔関連技術の説明〕Ｌ−アスコルビン酸又
はビタミンＣは植物及び動物界に広く分布する水溶性ビ
タミンである。それは栄養、良好な健康の維持及び食品
工業において大きな重要性を持つ。ほとんどすべての動
物種はＬ−アスコルビン酸を合成し、従ってその食物中
で必要としない。しかしながら、人間、他の霊長類、モ
ルモット、果実を食べるコウモリ、数種の鳥類、及び魚
類例えばギンザケ、ニジマス及びコイは肝臓酵素を欠く
のでビタミンを合成することができない。そのような動
物ではもしＬ−アスコルビン酸の食物源を奪われると壊
血病が発生する。良好な健康及び正常な発育（特に魚類
養殖における）に有害である限界の又はそうでない欠乏
を解決するためにはそのような動物がビタミンＣの適当
な供給を受けられるようにすることが必須である。
はビタミンＣは植物及び動物界に広く分布する水溶性ビ
タミンである。それは栄養、良好な健康の維持及び食品
工業において大きな重要性を持つ。ほとんどすべての動
物種はＬ−アスコルビン酸を合成し、従ってその食物中
で必要としない。しかしながら、人間、他の霊長類、モ
ルモット、果実を食べるコウモリ、数種の鳥類、及び魚
類例えばギンザケ、ニジマス及びコイは肝臓酵素を欠く
のでビタミンを合成することができない。そのような動
物ではもしＬ−アスコルビン酸の食物源を奪われると壊
血病が発生する。良好な健康及び正常な発育（特に魚類
養殖における）に有害である限界の又はそうでない欠乏
を解決するためにはそのような動物がビタミンＣの適当
な供給を受けられるようにすることが必須である。
【０００３】植物、動物組織及び食物からのビタミンＣ
の単離方法はよく知られており、そして抽出、抽出液の
精製、及び分析又は溶液からのビタミンの単離を含む。
アスコルビン酸が単離されるいくつかの天然供給源には
パプリカ、グラジオラスの葉、バラの実、カキ、及び柑
橘類の果実を含む。このビタミンはＬ−キシロース、Ｌ
−ガラクトース又はより好ましくは低価格で容易に入手
することができるＤ−グルコースから合成することもで
きる。
の単離方法はよく知られており、そして抽出、抽出液の
精製、及び分析又は溶液からのビタミンの単離を含む。
アスコルビン酸が単離されるいくつかの天然供給源には
パプリカ、グラジオラスの葉、バラの実、カキ、及び柑
橘類の果実を含む。このビタミンはＬ−キシロース、Ｌ
−ガラクトース又はより好ましくは低価格で容易に入手
することができるＤ−グルコースから合成することもで
きる。
【０００４】Ｌ−アスコルビン酸の生産に使用すること
ができるさらに他の方法は微生物の使用である。野生型
の微生物はわずかな量でのみＬ−アスコルビン酸をつく
ることが知られているが、クロレラ藻類を使用すると収
得量の向上の得られることが最近交付された米国特許
５,００１,０５９に記述されている。
ができるさらに他の方法は微生物の使用である。野生型
の微生物はわずかな量でのみＬ−アスコルビン酸をつく
ることが知られているが、クロレラ藻類を使用すると収
得量の向上の得られることが最近交付された米国特許
５,００１,０５９に記述されている。
【０００５】Loewus, F.A., はL-Ascorbic Acid: Metab
olism, Biosynthesis, Function, The Baiochemistry o
f Plants, Vol. 3, Academic Press, Inc., pp, 77-99,
1980においてＬ−アスコルビン酸の供給源及び生合成
の総説を与えている。藻類におけるアスコルビン酸の生
産に関する記述はVaidya et. al., Science and Cultur
e (1971) 37: 383-384; Subbulakshmi et. al., Nutrit
ion Reports International (1976) 14:581-591; Aaron
son et. al., Arch, Microbiol, (1977) 112:57-59; Sh
igeoka et. al., J. Nutr, Sci, Vitaminol, (1979) 2
9: 29-307; Shigeoka et. al., Agric. Biol, Chem. (1
979) 43: 2053-2058; Bayanova及びTrubachev, Priklad
naya Biokhimiya i Mikrobiologyia (1981) 17: 400-40
7 (UDC582.26:577.16); 及びCiferri, Microbiological
Reviews (1983) 47:551-578に見出すことができる。
olism, Biosynthesis, Function, The Baiochemistry o
f Plants, Vol. 3, Academic Press, Inc., pp, 77-99,
1980においてＬ−アスコルビン酸の供給源及び生合成
の総説を与えている。藻類におけるアスコルビン酸の生
産に関する記述はVaidya et. al., Science and Cultur
e (1971) 37: 383-384; Subbulakshmi et. al., Nutrit
ion Reports International (1976) 14:581-591; Aaron
son et. al., Arch, Microbiol, (1977) 112:57-59; Sh
igeoka et. al., J. Nutr, Sci, Vitaminol, (1979) 2
9: 29-307; Shigeoka et. al., Agric. Biol, Chem. (1
979) 43: 2053-2058; Bayanova及びTrubachev, Priklad
naya Biokhimiya i Mikrobiologyia (1981) 17: 400-40
7 (UDC582.26:577.16); 及びCiferri, Microbiological
Reviews (1983) 47:551-578に見出すことができる。
【０００６】食用微小藻類の生産は公知である。クロレ
ラ（Chlorella）種を含む種々の藻類はビタミンＣを含
む種々のビタミンを含有することも知られている。例え
ばAaronson等はArch. Microbiol. 112, 57-59 (1977)
において光増殖クロレラは細胞の乾燥重量のmg当たり１
５μｇすなわち１.５重量％のビタミンＣを含むと発表
している。
ラ（Chlorella）種を含む種々の藻類はビタミンＣを含
む種々のビタミンを含有することも知られている。例え
ばAaronson等はArch. Microbiol. 112, 57-59 (1977)
において光増殖クロレラは細胞の乾燥重量のmg当たり１
５μｇすなわち１.５重量％のビタミンＣを含むと発表
している。
【０００７】Renstrom et.al., Plant Sci, letters, 2
8:299-305 (1982／1983)はクロレラ中のＬ−アスコルビ
ン酸含量は光増殖細胞の乾燥重量ｇ当たり６〜８２μmo
lであり、又クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyren
oidosa) Chick，培養（ＵＴＥＸ）Ｎｏ．３４３株はグ
ルコース富化培地中で０.５〜６日間暗所増殖させると
乾燥重量ｇ当たり約３μmol（０.０６重量％）のＬ−ア
スコルビン酸が生産され、そして光を供給すると１２時
間にこの量の４倍（０.２４重量％）になり、初期の研
究で報告されたそれと同様の結果であったと報告してい
る。
8:299-305 (1982／1983)はクロレラ中のＬ−アスコルビ
ン酸含量は光増殖細胞の乾燥重量ｇ当たり６〜８２μmo
lであり、又クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyren
oidosa) Chick，培養（ＵＴＥＸ）Ｎｏ．３４３株はグ
ルコース富化培地中で０.５〜６日間暗所増殖させると
乾燥重量ｇ当たり約３μmol（０.０６重量％）のＬ−ア
スコルビン酸が生産され、そして光を供給すると１２時
間にこの量の４倍（０.２４重量％）になり、初期の研
究で報告されたそれと同様の結果であったと報告してい
る。
【０００８】従来技術の従属栄養法及び微生物は工業的
用途にとって完全に満足し得るものではない。生産され
るバイオマスはＬ−アスコルビン酸があまりにも乏し
く、これは主として使用する微生物の無能力及び含まれ
る工程条件下において炭素源の利用が貧弱であることに
よる。
用途にとって完全に満足し得るものではない。生産され
るバイオマスはＬ−アスコルビン酸があまりにも乏し
く、これは主として使用する微生物の無能力及び含まれ
る工程条件下において炭素源の利用が貧弱であることに
よる。
【０００９】改良されたＬ−アスコルビン酸生産性微生
物及びＬ−アスコルビン酸富化バイオマスの生産におい
てそれらを利用する改良された方法が求められている。
物及びＬ−アスコルビン酸富化バイオマスの生産におい
てそれらを利用する改良された方法が求められている。
【００１０】〔発明の概要〕Ｌ−アスコルビン酸富化バ
イオマスは細胞の乾燥重量の１.５％より多く、好まし
くは少なくとも約２％及びより好ましくは少なくとも約
３％の細胞内Ｌ−アスコルビン酸（Ｌ−ＡＡ）を持つ緑
色微小藻類細胞からなる。
イオマスは細胞の乾燥重量の１.５％より多く、好まし
くは少なくとも約２％及びより好ましくは少なくとも約
３％の細胞内Ｌ−アスコルビン酸（Ｌ−ＡＡ）を持つ緑
色微小藻類細胞からなる。
【００１１】他の実施態様は下記で確認される新規なＬ
−ＡＡ高生産性の突然変異したクロレラ・ピレノイドサ
微小藻類、微小藻類の高いＬ−ＡＡ含量のバイオマスを
生産するための従属栄養法、Ｌ−ＡＡ富化バイオマスか
らなる動物飼料組成物及び動物の毎日のビタミンＣ要求
量の少なくともかなりの割合を供給することができる水
産養殖魚類飼料を含む動物飼料としてのそれらの使用を
含む。
−ＡＡ高生産性の突然変異したクロレラ・ピレノイドサ
微小藻類、微小藻類の高いＬ−ＡＡ含量のバイオマスを
生産するための従属栄養法、Ｌ−ＡＡ富化バイオマスか
らなる動物飼料組成物及び動物の毎日のビタミンＣ要求
量の少なくともかなりの割合を供給することができる水
産養殖魚類飼料を含む動物飼料としてのそれらの使用を
含む。
【００１２】〔発明の詳述〕微生物はそれらが従属栄養
的にＬ−ＡＡを生産することを条件として広範囲に変動
することがある。好ましいのはＬ−ＡＡ生産性緑色微小
藻類特にいわゆるその高生産株である。潜在的な高生産
株としての見込みがある生物はＬ−ＡＡ生産を伴う細胞
増殖のための標準的な発酵方法を使用して確認すること
ができる。次いでそれらは好ましくは物理的又は化学的
変異処理方法例えば紫外線、Ｘ線、Ｎ−メチル−Ｎ′−
ニトロ−Ｎ−イトロソグアニジン、ジメチル硫酸又は当
該技術分野で公知の類似の薬品を使用して変異処理され
る。そのような処理により得られる突然変異したＬ−Ａ
Ａ過剰生産株はレドックス色素により測定することがで
きる。さらにアスコルビン酸への代謝中間物質に対する
アナログ又はアスコルビン酸合成の阻害剤を使用するこ
とにより、化学的妨害物質の存在下においてＬ−ＡＡ生
産を維持又は増加することができる微生物を選択するこ
とができる。
的にＬ−ＡＡを生産することを条件として広範囲に変動
することがある。好ましいのはＬ−ＡＡ生産性緑色微小
藻類特にいわゆるその高生産株である。潜在的な高生産
株としての見込みがある生物はＬ−ＡＡ生産を伴う細胞
増殖のための標準的な発酵方法を使用して確認すること
ができる。次いでそれらは好ましくは物理的又は化学的
変異処理方法例えば紫外線、Ｘ線、Ｎ−メチル−Ｎ′−
ニトロ−Ｎ−イトロソグアニジン、ジメチル硫酸又は当
該技術分野で公知の類似の薬品を使用して変異処理され
る。そのような処理により得られる突然変異したＬ−Ａ
Ａ過剰生産株はレドックス色素により測定することがで
きる。さらにアスコルビン酸への代謝中間物質に対する
アナログ又はアスコルビン酸合成の阻害剤を使用するこ
とにより、化学的妨害物質の存在下においてＬ−ＡＡ生
産を維持又は増加することができる微生物を選択するこ
とができる。
【００１３】上記の方法で得られる好ましい子孫は細胞
（乾燥重量基準）のグラム当たりＬ−ＡＡのmgで測定し
て改良されたＬ−ＡＡの特異的形成をもたらすような微
生物である。次いでこれらの子孫はさらに個々のクロー
ンに分離し、そしてさらに究極的には上述の方法に当て
てさらに高いＬ−ＡＡの特異的形成を示す微生物を得
る。
（乾燥重量基準）のグラム当たりＬ−ＡＡのmgで測定し
て改良されたＬ−ＡＡの特異的形成をもたらすような微
生物である。次いでこれらの子孫はさらに個々のクロー
ンに分離し、そしてさらに究極的には上述の方法に当て
てさらに高いＬ−ＡＡの特異的形成を示す微生物を得
る。
【００１４】クロレラ属の緑色微小藻類、特にシー・ピ
レノイドサＵＴＥＸ１６６３及びシー・ピレノイドサＵ
ＴＥＸ１２３０、シー・レギュラリス（C. regularis）
ＵＴＥＸ１８０８、シー・ソロキニアナ（C. sorokinia
na）ａ．ｔ．ｃ．ｃ．２２５２１、アンキストロデスム
ス・ブラウニー（Ankistorodesmus braunii）Ａ．Ｔ．
Ｃ．Ｃ．１２７４４及びプロフォセカ・ソフィー（Prof
otheca zopfii）ＵＴＥＸ１４３８のような野生株から
得られるＬ−ＡＡ高生産性の突然変異株を含むピレノイ
ドサ種が好ましく、前記ＵＴＥＸはAustinに所在のテキ
サス大学の藻類の培養コレクションである。ＵＴＥＸ１
６６３から得られた１つのそのうな突然変異はＡ．Ｔ．
Ｃ．Ｃ．受託番号５３１７０のシー・ピレノイドサＵＶ
１０１−１５８である。
レノイドサＵＴＥＸ１６６３及びシー・ピレノイドサＵ
ＴＥＸ１２３０、シー・レギュラリス（C. regularis）
ＵＴＥＸ１８０８、シー・ソロキニアナ（C. sorokinia
na）ａ．ｔ．ｃ．ｃ．２２５２１、アンキストロデスム
ス・ブラウニー（Ankistorodesmus braunii）Ａ．Ｔ．
Ｃ．Ｃ．１２７４４及びプロフォセカ・ソフィー（Prof
otheca zopfii）ＵＴＥＸ１４３８のような野生株から
得られるＬ−ＡＡ高生産性の突然変異株を含むピレノイ
ドサ種が好ましく、前記ＵＴＥＸはAustinに所在のテキ
サス大学の藻類の培養コレクションである。ＵＴＥＸ１
６６３から得られた１つのそのうな突然変異はＡ．Ｔ．
Ｃ．Ｃ．受託番号５３１７０のシー・ピレノイドサＵＶ
１０１−１５８である。
【００１５】他の代表的で好ましいＬ−ＡＡの高生産株
及びそれ自身が高生産株であってここでの使用にも適し
ているそれらの親株を以下に利用可能な変異処理方法と
共に示す。
及びそれ自身が高生産株であってここでの使用にも適し
ているそれらの親株を以下に利用可能な変異処理方法と
共に示す。
【００１６】ＤＡＰ３８８−１９はＤＡＰ３００−４か
ら得られ、次に前記ＤＡＰ３００−４はＵＶ４８９−
５、ＳＵＶ３５９−２、ＳＵＶ２９６−５、ＳＵＶ９７
−１、ＵＶ２１３−４、ＵＶ２１２−１１、ＳＵＶ９−
１、ＵＶ１８２−２５７６、ＮＡ５−３、ＵＶ１３７−
２５３、ＵＶ１０１−１５８、ＵＶ２９−１３２、ＵＶ
１８−３７４、ＵＶ１２−１５、ＵＶ３−４８２、及び
クロレラ・ピレノイドサＵｔｅｘ１６６３から得られ
た。
ら得られ、次に前記ＤＡＰ３００−４はＵＶ４８９−
５、ＳＵＶ３５９−２、ＳＵＶ２９６−５、ＳＵＶ９７
−１、ＵＶ２１３−４、ＵＶ２１２−１１、ＳＵＶ９−
１、ＵＶ１８２−２５７６、ＮＡ５−３、ＵＶ１３７−
２５３、ＵＶ１０１−１５８、ＵＶ２９−１３２、ＵＶ
１８−３７４、ＵＶ１２−１５、ＵＶ３−４８２、及び
クロレラ・ピレノイドサＵｔｅｘ１６６３から得られ
た。
【００１７】ＵＶ７１１−１及びＥＭＳ１５６−１はＣ
１１５−１から得られ、次に前記Ｃ１１５−１はＤＡＰ
３００−５、ＵＶ４８９−５、ＳＵＶ３５９−２、ＳＵ
Ｖ２６９−５、ＳＵＶ−９７−１、ＵＶ２１３−４、Ｕ
Ｖ２１２−１１、ＳＵＶ９−１、ＵＶ１８２−２５７
６、ＮＡ−３、ＵＶ１３７−２５３、ＵＶ１０１−１５
８、ＵＶ２９−１３２、ＵＶ１８−３７４、ＵＶ１２−
１５、ＵＶ３−４８２、及びクロレラ・ピレノイドサＵ
ｔｅｘ１６６３から得られた。
１１５−１から得られ、次に前記Ｃ１１５−１はＤＡＰ
３００−５、ＵＶ４８９−５、ＳＵＶ３５９−２、ＳＵ
Ｖ２６９−５、ＳＵＶ−９７−１、ＵＶ２１３−４、Ｕ
Ｖ２１２−１１、ＳＵＶ９−１、ＵＶ１８２−２５７
６、ＮＡ−３、ＵＶ１３７−２５３、ＵＶ１０１−１５
８、ＵＶ２９−１３２、ＵＶ１８−３７４、ＵＶ１２−
１５、ＵＶ３−４８２、及びクロレラ・ピレノイドサＵ
ｔｅｘ１６６３から得られた。
【００１８】Ｃ１６６−４はＳＵＶ５５１−３から得ら
れ、次に前記ＳＵＶ５５１−３はＤＡＰ３８９−２３、
ＤＡＰ３００−５、ＵＶ４８９−５、ＳＵＶ３５９−
２、ＳＵＶ２９６−５、ＳＵＶ９７−１、ＵＶ２１３−
４、ＵＶ２１２−１１、ＳＵＶ９−１、ＵＶ１８２−２
５７６、ＮＡ５−３、ＵＶ１３７−２５３、ＵＶ１０１
−１５８、ＵＶ２９−１３２、ＵＶ１８−３７４、ＵＶ
１２−１５、ＵＶ３−４８２、及びクロレラ・ピレノイ
ドサＵｔｅｘ１６６３から得られた。
れ、次に前記ＳＵＶ５５１−３はＤＡＰ３８９−２３、
ＤＡＰ３００−５、ＵＶ４８９−５、ＳＵＶ３５９−
２、ＳＵＶ２９６−５、ＳＵＶ９７−１、ＵＶ２１３−
４、ＵＶ２１２−１１、ＳＵＶ９−１、ＵＶ１８２−２
５７６、ＮＡ５−３、ＵＶ１３７−２５３、ＵＶ１０１
−１５８、ＵＶ２９−１３２、ＵＶ１８−３７４、ＵＶ
１２−１５、ＵＶ３−４８２、及びクロレラ・ピレノイ
ドサＵｔｅｘ１６６３から得られた。
【００１９】ＮＡ６８７−１、ＵＶ８６９−３及びＣ２
８４−１３０はＣ１６６−４から得られた。
８４−１３０はＣ１６６−４から得られた。
【００２０】ＮＡ７２２−２２はＣ１２３−４から得ら
れ、次に前記Ｃ１２３−４はＵＶ６０９−４、ＮＡ５２
８−２、ＤＡＰ３００−６、ＵＶ４８９−５、ＳＵＶ３
５９−２、ＳＵＶ２９６−５、ＳＵＶ９７−１、ＵＶ２
１３−４、ＵＶ２１２−１１、ＳＵＶ９−１、ＵＶ１８
２−２５７６、ＮＡ５−３、ＵＶ１３７−２５３、ＵＶ
１０１−１５８、ＵＶ２９−１３２、ＵＶ１８−３７
４、ＵＶ１２−１５、ＵＶ３−４８２、及びクロレラ・
ピレノイドサＵｔｅｘ１６６３から得られた。
れ、次に前記Ｃ１２３−４はＵＶ６０９−４、ＮＡ５２
８−２、ＤＡＰ３００−６、ＵＶ４８９−５、ＳＵＶ３
５９−２、ＳＵＶ２９６−５、ＳＵＶ９７−１、ＵＶ２
１３−４、ＵＶ２１２−１１、ＳＵＶ９−１、ＵＶ１８
２−２５７６、ＮＡ５−３、ＵＶ１３７−２５３、ＵＶ
１０１−１５８、ＵＶ２９−１３２、ＵＶ１８−３７
４、ＵＶ１２−１５、ＵＶ３−４８２、及びクロレラ・
ピレノイドサＵｔｅｘ１６６３から得られた。
【００２１】Ｃ３２５−２はＣ１２３−２から得られ、
次に前記Ｃ１２３−２はＵＶ６０９−４、ＮＡ５２８−
２、ＤＡＰ３００−６、ＵＶ４８９−５、ＳＵＶ３５９
−２、ＳＵＶ２９６−５、ＳＵＶ９７−１、ＵＶ２１３
−４、ＵＶ２１２−１１、ＳＵＶ９−１、ＵＶ１８２−
２５７６、ＮＡ５−３、ＵＶ１３７−２５３、ＵＶ１０
１−１５８、ＵＶ２９−１３２、ＵＶ１８−３７４、Ｕ
Ｖ１２−１５、ＵＶ３−４８２、及びクロレラ・ピレノ
イドサＵｔｅｘ１６６３から得られた。ＵＶ８７２−２
６はＮＡ６８７−１から得られた。
次に前記Ｃ１２３−２はＵＶ６０９−４、ＮＡ５２８−
２、ＤＡＰ３００−６、ＵＶ４８９−５、ＳＵＶ３５９
−２、ＳＵＶ２９６−５、ＳＵＶ９７−１、ＵＶ２１３
−４、ＵＶ２１２−１１、ＳＵＶ９−１、ＵＶ１８２−
２５７６、ＮＡ５−３、ＵＶ１３７−２５３、ＵＶ１０
１−１５８、ＵＶ２９−１３２、ＵＶ１８−３７４、Ｕ
Ｖ１２−１５、ＵＶ３−４８２、及びクロレラ・ピレノ
イドサＵｔｅｘ１６６３から得られた。ＵＶ８７２−２
６はＮＡ６８７−１から得られた。
【００２２】ＤＡＰＮ１０１０−５０はＤＡＰ９９４−
１から得られ、次に前記ＤＡＰ９９４−１はＣ３６０−
７０、Ｃ２８４−１３０、Ｃ２８４−１３０、Ｃ１６６
−４、ＳＵＶ５５１−３、ＤＡＰ３８９−２３、ＤＡＰ
３００−５、ＵＶ４８９−５、ＳＵＶ３５９−２、ＳＵ
Ｖ２９６−５、ＳＵＶ９７−１、ＵＶ２１３−４、ＵＶ
２１２−１１、ＳＵＶ９−１、ＵＶ１８２−２５７６、
ＮＡ５−３、ＵＶ１３７−２５３、ＵＶ１０１−１５
８、ＵＶ２９−１３２、ＵＶ１８−３７４、ＵＶ１２−
１５、ＵＶ３−４８２、及びクロレラ・ピレノイドサＵ
ｔｅｘ１６６３から得られた。
１から得られ、次に前記ＤＡＰ９９４−１はＣ３６０−
７０、Ｃ２８４−１３０、Ｃ２８４−１３０、Ｃ１６６
−４、ＳＵＶ５５１−３、ＤＡＰ３８９−２３、ＤＡＰ
３００−５、ＵＶ４８９−５、ＳＵＶ３５９−２、ＳＵ
Ｖ２９６−５、ＳＵＶ９７−１、ＵＶ２１３−４、ＵＶ
２１２−１１、ＳＵＶ９−１、ＵＶ１８２−２５７６、
ＮＡ５−３、ＵＶ１３７−２５３、ＵＶ１０１−１５
８、ＵＶ２９−１３２、ＵＶ１８−３７４、ＵＶ１２−
１５、ＵＶ３−４８２、及びクロレラ・ピレノイドサＵ
ｔｅｘ１６６３から得られた。
【００２３】ＵＶ２３２−１は次にＮＡ２８−４、ＮＡ
１９−３、ＵＶ１６５−２３９、ＵＶ１３７−２５３、
ＵＶ１０１−１５８、ＵＶ２９−１３２、ＵＶ１８−３
７４、ＵＶ１２−１５、ＵＶ３−４８２、及びクロレラ
・ピレノイドサＵｔｅｘ１６６３から得られた。
１９−３、ＵＶ１６５−２３９、ＵＶ１３７−２５３、
ＵＶ１０１−１５８、ＵＶ２９−１３２、ＵＶ１８−３
７４、ＵＶ１２−１５、ＵＶ３−４８２、及びクロレラ
・ピレノイドサＵｔｅｘ１６６３から得られた。
【００２４】変異株名の接頭語はそれらをつくりだすた
めに使用した変異処理の略語であり、次の通りである。
Ｃ＝カンファー、ＤＡＰ＝２,６−ジアミノプリン、Ｅ
ＭＳ＝エチルメタンスルホネート、ＮＡ＝亜酸化窒素、
ＤＡＰＮ＝ＤＡＰ及びＮＡで順次処理、ＳＵＶ＝短波長
紫外線、ＵＶ＝広波長紫外線。
めに使用した変異処理の略語であり、次の通りである。
Ｃ＝カンファー、ＤＡＰ＝２,６−ジアミノプリン、Ｅ
ＭＳ＝エチルメタンスルホネート、ＮＡ＝亜酸化窒素、
ＤＡＰＮ＝ＤＡＰ及びＮＡで順次処理、ＳＵＶ＝短波長
紫外線、ＵＶ＝広波長紫外線。
【００２５】各々の場合突然変異した子孫はその親より
も高いＬ−ＡＡ生産株である。さらに、各々の微生物は
慣用的な条件におけるよりも下記の本発明の方法の条件
下においてＬ−ＡＡのより高い特異的な形成を示す。
も高いＬ−ＡＡ生産株である。さらに、各々の微生物は
慣用的な条件におけるよりも下記の本発明の方法の条件
下においてＬ−ＡＡのより高い特異的な形成を示す。
【００２６】使用する特定の微小藻類の如何によっては
この方法は慣用的な従属栄養発酵であることもでき、こ
の場合生物は増殖促進培地中で有効な温度、圧力及びpH
の下で制限されない増殖条件下で増殖し、この場合培地
は細胞が高い細胞密度まで細胞内Ｌ−ＡＡの生産を伴っ
て増殖するに十分な、適当な炭素源例えばグルコース及
び溶解している分子状酸素（Ｏ2）を含み、そして増殖
は細胞が適当に高い細胞内Ｌ−ＡＡの重量パーセントを
含むまで維持される。
この方法は慣用的な従属栄養発酵であることもでき、こ
の場合生物は増殖促進培地中で有効な温度、圧力及びpH
の下で制限されない増殖条件下で増殖し、この場合培地
は細胞が高い細胞密度まで細胞内Ｌ−ＡＡの生産を伴っ
て増殖するに十分な、適当な炭素源例えばグルコース及
び溶解している分子状酸素（Ｏ2）を含み、そして増殖
は細胞が適当に高い細胞内Ｌ−ＡＡの重量パーセントを
含むまで維持される。
【００２７】好ましくは、この方法は上述の制限されな
い増殖条件で高い細胞密度になるまで従属栄養的に増殖
させ、この細胞密度は実質的に最高であっても又はなく
てもよく、炭素源が実質的に枯渇し細胞増殖が実質的に
停止するに至らせ、その後炭素源の供給を、Ｌ−ＡＡ生
産が継続し細胞密度が実質的に増加することなくＬ−Ａ
Ａの増加した生産を生ずるような制限した量で再開し、
そして溶存Ｏ2の圧力下で制御した量の炭素源による制
限された増殖相を細胞バイオマスの単位重量当たりのＬ
−ＡＡ濃度が本発明の目的にとって望ましい水準に達す
るまで継続することからなる。
い増殖条件で高い細胞密度になるまで従属栄養的に増殖
させ、この細胞密度は実質的に最高であっても又はなく
てもよく、炭素源が実質的に枯渇し細胞増殖が実質的に
停止するに至らせ、その後炭素源の供給を、Ｌ−ＡＡ生
産が継続し細胞密度が実質的に増加することなくＬ−Ａ
Ａの増加した生産を生ずるような制限した量で再開し、
そして溶存Ｏ2の圧力下で制御した量の炭素源による制
限された増殖相を細胞バイオマスの単位重量当たりのＬ
−ＡＡ濃度が本発明の目的にとって望ましい水準に達す
るまで継続することからなる。
【００２８】他の好ましい方法は上述のようにすなわち
十分な炭素源及び溶存Ｏ2の存在下で細胞内Ｌ−ＡＡを
含む高密度の細胞を生ずるために有効な温度、圧力及び
pHで制限されない発育条件下で細胞を増殖させ、その後
溶存Ｏ2含量を下げるか又は正常な細胞代謝により低濃
度に至らせ、それにより細胞増殖は実質的に停止し、細
胞密度の実質的な増加がないままでＬ−ＡＡの生産が継
続し、そしてバイオマス中の望ましい細胞内Ｌ−ＡＡ濃
度に達するまで低Ｏ2状態に維持することからなる。
十分な炭素源及び溶存Ｏ2の存在下で細胞内Ｌ−ＡＡを
含む高密度の細胞を生ずるために有効な温度、圧力及び
pHで制限されない発育条件下で細胞を増殖させ、その後
溶存Ｏ2含量を下げるか又は正常な細胞代謝により低濃
度に至らせ、それにより細胞増殖は実質的に停止し、細
胞密度の実質的な増加がないままでＬ−ＡＡの生産が継
続し、そしてバイオマス中の望ましい細胞内Ｌ−ＡＡ濃
度に達するまで低Ｏ2状態に維持することからなる。
【００２９】上の２つの方法の実施態様が細胞内Ｌ−Ａ
Ａの生産のための炭素源の利用の増加をもたらすことに
注目するべきである。
Ａの生産のための炭素源の利用の増加をもたらすことに
注目するべきである。
【００３０】この方法を実行する場合、無菌の水性栄養
培養培地に選択した微生物の活発に増殖する培養を、適
当な増殖相（増殖が普通には対数的である間）の後に比
較的高い細胞密度を生ずるに十分な量を植菌する。代表
的な始発の細胞密度は一般に細胞の乾燥重量に基づいて
約０.１５〜０.４ｇ／Ｌである。少量の消泡剤を始発に
又は必要により工程の間添加してもよい。培養培地は炭
素源、種々の塩及び一般に微量金属も含む。
培養培地に選択した微生物の活発に増殖する培養を、適
当な増殖相（増殖が普通には対数的である間）の後に比
較的高い細胞密度を生ずるに十分な量を植菌する。代表
的な始発の細胞密度は一般に細胞の乾燥重量に基づいて
約０.１５〜０.４ｇ／Ｌである。少量の消泡剤を始発に
又は必要により工程の間添加してもよい。培養培地は炭
素源、種々の塩及び一般に微量金属も含む。
【００３１】炭素源は好ましくは経済的な理由からグル
コースを含むグルコース源であるが、しかしながらその
ままグルコースに変換され得る任意の配糖体又は多糖
類、例えば糖密、コーンシロップなどでよい。使用する
グルコース源の全量は特定の微生物及び所望の結果の如
何により広く変動させることができる。通常は、上述の
ようなＬ−ＡＡ高生産微生物においては使用するグルコ
ースの全量は代謝されない場合として約６５〜９０、よ
り普通には約７５−８５、そして好ましくは約８０ｇ／
Ｌである。通常全グルコースの約１５〜３０％を始発に
添加する。グルコースは通常始発に及び発酵の過程にお
いて下に示す他の添加剤と一緒に添加する。始発のグル
コース源添加及び制限されない細胞増殖の期間である発
酵期間の間において細胞は比較的高い密度例えば約２０
〜４５ｇ／Ｌ、より普通には約３０〜４０ｇ／Ｌに増殖
し、それにより高い細胞内Ｌ−ＡＡ含量微小藻類にとっ
て本発明の方法の炭素制御又はＯ2制御制限細胞増殖段
階の間における高い全Ｌ−ＡＡ濃度の基礎を提供する。
コースを含むグルコース源であるが、しかしながらその
ままグルコースに変換され得る任意の配糖体又は多糖
類、例えば糖密、コーンシロップなどでよい。使用する
グルコース源の全量は特定の微生物及び所望の結果の如
何により広く変動させることができる。通常は、上述の
ようなＬ−ＡＡ高生産微生物においては使用するグルコ
ースの全量は代謝されない場合として約６５〜９０、よ
り普通には約７５−８５、そして好ましくは約８０ｇ／
Ｌである。通常全グルコースの約１５〜３０％を始発に
添加する。グルコースは通常始発に及び発酵の過程にお
いて下に示す他の添加剤と一緒に添加する。始発のグル
コース源添加及び制限されない細胞増殖の期間である発
酵期間の間において細胞は比較的高い密度例えば約２０
〜４５ｇ／Ｌ、より普通には約３０〜４０ｇ／Ｌに増殖
し、それにより高い細胞内Ｌ−ＡＡ含量微小藻類にとっ
て本発明の方法の炭素制御又はＯ2制御制限細胞増殖段
階の間における高い全Ｌ−ＡＡ濃度の基礎を提供する。
【００３２】発酵槽中のグルコース源の量は非抑制的／
非制限的量であるべきであり、すなわちそれは細胞増殖
を最適に刺激しそして阻害又は過度に制限してはならな
い。グルコース源の最適の非抑制濃度は微生物により変
動することがあり、そして任意の特定の微生物について
試験により容易に決定される。例えばシー・ピレノイド
サ株についてはグルコース源濃度を一般に適時添加によ
り１５〜３０ｇ／Ｌの範囲に維持することが一方で増殖
のグルコース阻害を避けながら細胞増殖を促進するため
に十分であることを見出した。工程の全期間を通じて微
生物の炭素源利用性を公知の方法により監視することが
できる。例えばグルコースはグルコースオキシダーゼ酵
素試験又はクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して
上清につき測定することができる。炭素源濃度が低下し
たら、必要により補充することができるが、一方全濃度
は増殖抑制水準以下にとどまり、これは一般にグルコー
ス当量基準で約３０ｇ／Ｌより低い。
非制限的量であるべきであり、すなわちそれは細胞増殖
を最適に刺激しそして阻害又は過度に制限してはならな
い。グルコース源の最適の非抑制濃度は微生物により変
動することがあり、そして任意の特定の微生物について
試験により容易に決定される。例えばシー・ピレノイド
サ株についてはグルコース源濃度を一般に適時添加によ
り１５〜３０ｇ／Ｌの範囲に維持することが一方で増殖
のグルコース阻害を避けながら細胞増殖を促進するため
に十分であることを見出した。工程の全期間を通じて微
生物の炭素源利用性を公知の方法により監視することが
できる。例えばグルコースはグルコースオキシダーゼ酵
素試験又はクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して
上清につき測定することができる。炭素源濃度が低下し
たら、必要により補充することができるが、一方全濃度
は増殖抑制水準以下にとどまり、これは一般にグルコー
ス当量基準で約３０ｇ／Ｌより低い。
【００３３】望ましくは、他の添加物特に当該技術分野
に知られているリン、窒素、マグネシウム、鉄及び微量
金属源をグルコース源と共に始発に存在させ、そしてそ
れらの栄養培地中の濃度をグルコース源の連続添加と共
に連続的又は定期的に同一添加物のその後の添加により
増加させ又は補充することができる。グルコース源の濃
度に対するこれら添加物の濃度の比率は発酵期間を通じ
て同じでも又は異なってもよい。
に知られているリン、窒素、マグネシウム、鉄及び微量
金属源をグルコース源と共に始発に存在させ、そしてそ
れらの栄養培地中の濃度をグルコース源の連続添加と共
に連続的又は定期的に同一添加物のその後の添加により
増加させ又は補充することができる。グルコース源の濃
度に対するこれら添加物の濃度の比率は発酵期間を通じ
て同じでも又は異なってもよい。
【００３４】代表的な栄養培地、その組成及び用途は米
国特許５,００１,０５９により完全に記述されており、
その開示は参照により本明細書に組み入れる。
国特許５,００１,０５９により完全に記述されており、
その開示は参照により本明細書に組み入れる。
【００３５】Ｏ2源は好ましくは空気であるが、希釈し
てしないか又は不活性で発酵成分と反応しない任意のガ
スで希釈した分子状Ｏ2でもよい。Ｏ2源は発酵液中に分
散させるのが好都合であり、これは好ましくは撹拌して
培地全体にガスを分散させ、そして培地中へのＯ2の溶
解を容易にする。培地中のＯ2の溶解度は飽和濃度（１
００％溶解したＯ2）までの間で大部分はＯ2源の通気速
度、撹拌速度、培地組成、温度及び圧力の関数である。
所定の培地で所定の温度及び圧力において微生物への溶
存Ｏ2の利用性は撹拌速度及びＯ2ガス通気速度により容
易に制御される。
てしないか又は不活性で発酵成分と反応しない任意のガ
スで希釈した分子状Ｏ2でもよい。Ｏ2源は発酵液中に分
散させるのが好都合であり、これは好ましくは撹拌して
培地全体にガスを分散させ、そして培地中へのＯ2の溶
解を容易にする。培地中のＯ2の溶解度は飽和濃度（１
００％溶解したＯ2）までの間で大部分はＯ2源の通気速
度、撹拌速度、培地組成、温度及び圧力の関数である。
所定の培地で所定の温度及び圧力において微生物への溶
存Ｏ2の利用性は撹拌速度及びＯ2ガス通気速度により容
易に制御される。
【００３６】撹拌速度は通常約２００〜１０００rpmで
あり、一方通気速度は工程の任意の特定の段階の間に望
まれる溶存ｏ2量の如何により一般に約０.１〜０.６リ
ッター／分（１pm）である。制限されない細胞増殖段階
の間においては溶存Ｏ2濃度は一般に飽和値の約２０％
である。好ましくは５０％又はそれより上である。
あり、一方通気速度は工程の任意の特定の段階の間に望
まれる溶存ｏ2量の如何により一般に約０.１〜０.６リ
ッター／分（１pm）である。制限されない細胞増殖段階
の間においては溶存Ｏ2濃度は一般に飽和値の約２０％
である。好ましくは５０％又はそれより上である。
【００３７】Ｏ2制限法のＯ2制限段階の間においては、
Ｏ2源を濃度が飽和値の２０％より十分低くそして最良
には０％よりわずかに高く約１％に保たれる速度で供給
する。絶対値の如何にかかわらず、低いＯ2濃度は下に
記述する最適pHにおいて炭素源の存在下で実質的な細胞
増殖が生じることなく細胞内Ｌ−ＡＡ含量の増加を生じ
させるために十分である。溶存Ｏ2濃度は酸素プロープ
電極を用いて都合よく監視される。
Ｏ2源を濃度が飽和値の２０％より十分低くそして最良
には０％よりわずかに高く約１％に保たれる速度で供給
する。絶対値の如何にかかわらず、低いＯ2濃度は下に
記述する最適pHにおいて炭素源の存在下で実質的な細胞
増殖が生じることなく細胞内Ｌ−ＡＡ含量の増加を生じ
させるために十分である。溶存Ｏ2濃度は酸素プロープ
電極を用いて都合よく監視される。
【００３８】温度と圧力は細胞を破壊することなく細胞
増殖とＬ−ＡＡ生産を促進するようなそれであるべきで
ある。通常は２０〜約４０℃好ましくは約３５℃の温度
である。圧力は一般に大気圧であるが超大気圧でもよ
く、圧力が大きいほど培地中の空気（Ｏ2）の溶解度は
大きい。
増殖とＬ−ＡＡ生産を促進するようなそれであるべきで
ある。通常は２０〜約４０℃好ましくは約３５℃の温度
である。圧力は一般に大気圧であるが超大気圧でもよ
く、圧力が大きいほど培地中の空気（Ｏ2）の溶解度は
大きい。
【００３９】pHは微生物の増殖、細胞内Ｌ−ＡＡの生産
及び保持すなわちその水性培地中への分泌に抵抗する能
力により広範囲にな変化させることができる。一般にク
ロレラ・ピレノイドサ及びその種々の株については、pH
は通常約６.５〜８、より普通には約６.９〜７.５であ
るが、そのような比較的高いpHはＬ−ＡＡの細胞から培
地への通過を遅らせること、すなわち細胞がＬ−ＡＡを
培地中に分泌されるより多く保持することを見出した。
及び保持すなわちその水性培地中への分泌に抵抗する能
力により広範囲にな変化させることができる。一般にク
ロレラ・ピレノイドサ及びその種々の株については、pH
は通常約６.５〜８、より普通には約６.９〜７.５であ
るが、そのような比較的高いpHはＬ−ＡＡの細胞から培
地への通過を遅らせること、すなわち細胞がＬ−ＡＡを
培地中に分泌されるより多く保持することを見出した。
【００４０】pHは必要によりアンモニアガスを添加して
pHを上げることにより制御することができる。ＮＨ3は
栄養窒素源としても役立つ。それは生理的に適合する酸
例えばリン酸、酢酸、乳酸、酒石酸などを必要により添
加してpHを下げることにより制御することもできる。又
は、微生物はそれらが本来酸副生物を生産する場合必要
により代謝によりpHを低下させることができる。
pHを上げることにより制御することができる。ＮＨ3は
栄養窒素源としても役立つ。それは生理的に適合する酸
例えばリン酸、酢酸、乳酸、酒石酸などを必要により添
加してpHを下げることにより制御することもできる。又
は、微生物はそれらが本来酸副生物を生産する場合必要
により代謝によりpHを低下させることができる。
【００４１】pHが上述のように比較的高いこの方法の高
酸素で制限されない増殖相の間においては細胞内Ｌ−Ａ
Ａは細胞の乾燥重量１〜４％の高さにまで増加させるこ
とができる。細胞内Ｌ−ＡＡ含量は上述の方法の低炭素
及び低酸素制限増殖相の間においてはさらに少なくとも
１.５％好ましくは少なくとも約２％そして５〜６％の
高さにまで増加させることができる。細胞内濃度が高い
ほどバイオマスは動物飼料用としてすぐれている。
酸素で制限されない増殖相の間においては細胞内Ｌ−Ａ
Ａは細胞の乾燥重量１〜４％の高さにまで増加させるこ
とができる。細胞内Ｌ−ＡＡ含量は上述の方法の低炭素
及び低酸素制限増殖相の間においてはさらに少なくとも
１.５％好ましくは少なくとも約２％そして５〜６％の
高さにまで増加させることができる。細胞内濃度が高い
ほどバイオマスは動物飼料用としてすぐれている。
【００４２】次の実施例は本発明を例証するためのもの
であり、添付の特許請求の範囲を制限しようとするもの
ではない。
であり、添付の特許請求の範囲を制限しようとするもの
ではない。
【００４３】実施例１ 培地調製 培地の撹拌及び下記の栄養成分、酸素源及び
他の薬品を供給するための装置を備えた１リッターのガ
ラス発酵槽中で６００mlの蒸留水中の０.２７ｇの一塩
基性リン酸カリウム及び０.２３ｇの二塩基性リン酸ナ
トリウムの溶液を加熱殺菌した。培地を冷却した後１.
９２ｇ／Ｌの硫酸第一鉄溶液（pH２.５）の５mlを０.２
ミクロン無菌フィルターを通して添加した。
他の薬品を供給するための装置を備えた１リッターのガ
ラス発酵槽中で６００mlの蒸留水中の０.２７ｇの一塩
基性リン酸カリウム及び０.２３ｇの二塩基性リン酸ナ
トリウムの溶液を加熱殺菌した。培地を冷却した後１.
９２ｇ／Ｌの硫酸第一鉄溶液（pH２.５）の５mlを０.２
ミクロン無菌フィルターを通して添加した。
【００４４】グルコース一塩基濃縮液 次の水性栄養成
分：５６ｇのグルコースを含む８０ml；０.７０ｇのク
エン酸三ナトリウム、０.４６ｇの硫酸マグネシウム及
び０.７０mlの９６％Ｈ2 ＳＯ4を含む１１ml；１.５３
ｇのリン酸−カリウム及び１.５３ｇのリン酸二ナトリ
ウムを含む１０ml；及び９.４mlの微量金属溶液を別々
に殺菌し、次いで冷却後合併して１０４mlの最終液量と
なった。前記微量金属溶液の組成は米国特許５,００１,
０５９に記述されており、参照により本明細書に組み入
れる。
分：５６ｇのグルコースを含む８０ml；０.７０ｇのク
エン酸三ナトリウム、０.４６ｇの硫酸マグネシウム及
び０.７０mlの９６％Ｈ2 ＳＯ4を含む１１ml；１.５３
ｇのリン酸−カリウム及び１.５３ｇのリン酸二ナトリ
ウムを含む１０ml；及び９.４mlの微量金属溶液を別々
に殺菌し、次いで冷却後合併して１０４mlの最終液量と
なった。前記微量金属溶液の組成は米国特許５,００１,
０５９に記述されており、参照により本明細書に組み入
れる。
【００４５】栄養培地 次にグルコース塩類濃縮液の２
０mlをリン酸塩培地に添加した。
０mlをリン酸塩培地に添加した。
【００４６】細胞増殖及びＬ−ＡＡ生産 栄養培地を加
熱しそして３５℃に保ち、撹拌を４５０rpmで開始し、
空気を０.１リッター／分（１pm）で培地中に分散さ
せ、pHを通気に添加した無水ＮＨ3で６.９に調節し、そ
して培地にクロレラ・ピレノイドサＤＡＰＮ１０１０−
５０株の活発に増殖している培養を植菌して約０.３す
なわち０.２ｇ／Ｌの始発細胞密度にした。
熱しそして３５℃に保ち、撹拌を４５０rpmで開始し、
空気を０.１リッター／分（１pm）で培地中に分散さ
せ、pHを通気に添加した無水ＮＨ3で６.９に調節し、そ
して培地にクロレラ・ピレノイドサＤＡＰＮ１０１０−
５０株の活発に増殖している培養を植菌して約０.３す
なわち０.２ｇ／Ｌの始発細胞密度にした。
【００４７】最初の１０時間において培地の溶存Ｏ2含
量にかろうじて認めることができる低下と細胞密度のわ
ずかな増加が起こった。２０時間目に細胞増殖（ｇ／１
細胞密度）は上昇し、そして溶存Ｏ2は約７０％に低下
した。３０時間後細胞密度は約５ｇ／１に増加し、そし
てＯ2含量は２０％よりやや低い水準まで急に減少した
が、これは増殖細胞の増加する集団による強力なＯ2摂
取を示すものである。この時点で撹拌速度をほぼ８００
rpmまで徐々に上げ、そして通気速度を０.２１pmにし
た。この結果溶存Ｏ2が急に増加して約８５％でピーク
となり、その後次の１０時間に再び約２５％まで減少し
て高い細胞増殖速度を反映し、細胞密度は１４ｇ／１に
達した。
量にかろうじて認めることができる低下と細胞密度のわ
ずかな増加が起こった。２０時間目に細胞増殖（ｇ／１
細胞密度）は上昇し、そして溶存Ｏ2は約７０％に低下
した。３０時間後細胞密度は約５ｇ／１に増加し、そし
てＯ2含量は２０％よりやや低い水準まで急に減少した
が、これは増殖細胞の増加する集団による強力なＯ2摂
取を示すものである。この時点で撹拌速度をほぼ８００
rpmまで徐々に上げ、そして通気速度を０.２１pmにし
た。この結果溶存Ｏ2が急に増加して約８５％でピーク
となり、その後次の１０時間に再び約２５％まで減少し
て高い細胞増殖速度を反映し、細胞密度は１４ｇ／１に
達した。
【００４８】次の１０時間、撹拌と通気をそれぞれ７７
５rpmと０.２１pmに一定にし、溶存Ｏ2はほぼ０％まで
低下し、細胞密度増加の割合は２８ｇ／Ｌの細胞密度で
最大となり、そしてＬ−ＡＡ含量は０.８ｇ／１に増加
し、実質的にそのすべてが細胞内にあった。５０時間の
増殖期間を通じてグルコース濃度を必要により米国特許
５,００１,０５９に記述のグルコース塩類濃縮液の添加
により２０〜３０ｇ／１の過剰状態に保った。pHについ
ては４２時間に６.９から６.８に低下し、その間通気に
ＮＨ3を添加してその水準に維持した。
５rpmと０.２１pmに一定にし、溶存Ｏ2はほぼ０％まで
低下し、細胞密度増加の割合は２８ｇ／Ｌの細胞密度で
最大となり、そしてＬ−ＡＡ含量は０.８ｇ／１に増加
し、実質的にそのすべてが細胞内にあった。５０時間の
増殖期間を通じてグルコース濃度を必要により米国特許
５,００１,０５９に記述のグルコース塩類濃縮液の添加
により２０〜３０ｇ／１の過剰状態に保った。pHについ
ては４２時間に６.９から６.８に低下し、その間通気に
ＮＨ3を添加してその水準に維持した。
【００４９】要約すると発酵の終わりにおける細胞（バ
イオマス）の細胞内Ｌ−ＡＡ含量は細胞の乾燥重量に基
づいて２.９％（０.８／２８×１００）であった。
イオマス）の細胞内Ｌ−ＡＡ含量は細胞の乾燥重量に基
づいて２.９％（０.８／２８×１００）であった。
【００５０】実施例２〜１２ 各々の試験に異なる微小藻類を使用して一連の試験を実
施例１の方法を実質的に記述に従ってくり返して行っ
た。微生物と得られた結果を下表に示す。微生物はすべ
てＬ−ＡＡ高生産性のクロレラ・ピレノイドサの変異株
であり、表１に示す。
施例１の方法を実質的に記述に従ってくり返して行っ
た。微生物と得られた結果を下表に示す。微生物はすべ
てＬ−ＡＡ高生産性のクロレラ・ピレノイドサの変異株
であり、表１に示す。
【００５１】最初の４つの実施例（２〜５）は約２０ｇ
／１の細胞密度まで、次の７は約４０の細胞密度まで発
酵させた。試験の選択した細胞密度の時点において得ら
れるバイオマスの細胞内Ｌ−ＡＡ含量を表１に示す。
／１の細胞密度まで、次の７は約４０の細胞密度まで発
酵させた。試験の選択した細胞密度の時点において得ら
れるバイオマスの細胞内Ｌ−ＡＡ含量を表１に示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】実施例１３ １Ｌの発酵槽中で０.６Ｌの蒸留水、０.２３ｇの二塩基
性リン酸ナトリウム及び０.２７ｇの一塩基性リン酸カ
リウムを殺菌した。このリン酸塩溶液に５mlの蒸留水中
１１.２mgの硫酸第一鉄（７水塩）、及び下記の数群の
栄養源を個々に殺菌しそして冷却後合併して調製した無
菌のグルコース一塩類濃縮液の２０mlを無菌的に添加し
た。群１は８０mlの水中の５６ｇのグルコース食品用一
水和物（無水基準）からなり、群２は１０mlの水中の
０.７ｇのクエン酸三ナトリウム二水和物、０.４７ｇの
無水硫酸マグネシウム及び１mlの硫酸からなり、群３は
１０mlの水中の０.６５ｇの一塩基性リン酸ナトリウ
ム、１.３ｇの一塩基性リン酸カリウム及び０.６ｇの二
塩基性リン酸ナトリウムからなり、群４は米国特許５,
００１,０５９の微量金属溶液の９.４mlからなる。
性リン酸ナトリウム及び０.２７ｇの一塩基性リン酸カ
リウムを殺菌した。このリン酸塩溶液に５mlの蒸留水中
１１.２mgの硫酸第一鉄（７水塩）、及び下記の数群の
栄養源を個々に殺菌しそして冷却後合併して調製した無
菌のグルコース一塩類濃縮液の２０mlを無菌的に添加し
た。群１は８０mlの水中の５６ｇのグルコース食品用一
水和物（無水基準）からなり、群２は１０mlの水中の
０.７ｇのクエン酸三ナトリウム二水和物、０.４７ｇの
無水硫酸マグネシウム及び１mlの硫酸からなり、群３は
１０mlの水中の０.６５ｇの一塩基性リン酸ナトリウ
ム、１.３ｇの一塩基性リン酸カリウム及び０.６ｇの二
塩基性リン酸ナトリウムからなり、群４は米国特許５,
００１,０５９の微量金属溶液の９.４mlからなる。
【００５４】温度を３５℃に上げ、撹拌を約２００rpm
で開始した。空気を０.２リットル／分（１pm）の割合
で培地に通気し、そして５０mlのクロレラ・ピレノイド
サＵＶ１０１−１５８株（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号５
３１７０）を約０.３ｇ細胞／Ｌの濃度で添加した。５
時間後撹拌速度を４００rpm、通気量を０.４１pmに増加
した。１６時間後撹拌速度を５５０rpm、通気量を０.６
１pmに上げた。撹拌速度は表３に示すように後に７００
次いで８００rpmに増加し、一方通気量は発酵の残りの
期間０.６１pmで一定にした。次の表は発酵の条件及び
分析結果を記述するものである。
で開始した。空気を０.２リットル／分（１pm）の割合
で培地に通気し、そして５０mlのクロレラ・ピレノイド
サＵＶ１０１−１５８株（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号５
３１７０）を約０.３ｇ細胞／Ｌの濃度で添加した。５
時間後撹拌速度を４００rpm、通気量を０.４１pmに増加
した。１６時間後撹拌速度を５５０rpm、通気量を０.６
１pmに上げた。撹拌速度は表３に示すように後に７００
次いで８００rpmに増加し、一方通気量は発酵の残りの
期間０.６１pmで一定にした。次の表は発酵の条件及び
分析結果を記述するものである。
【００５５】
【表２】
【００５６】実施例１４（最良の例） （ａ） 投入した始発の０.６Ｌの蒸留水中で５.６mgの
硫酸第一鉄を１１.２mgの代わりに使用し、（ｂ）栄養
源溶液は４０mlの蒸留水中２８ｇのグルコース；２０ml
中０.５３ｇのクエン酸三ナトリウム二水和物＋０.２ｇ
の硫酸マグネシウム；２０ml中各々０.６５ｇのリン酸
一カリウム及びリン酸二ナトリウム；及び１５ml中４.
７mlの微量金属溶液＋１mlの硫酸からなり；そして
（ｃ）シー・ピレノイドサの活発に増殖している培養は
ＵＶ２３２−１株であることを除いて実施例１３の方法
に従った。
硫酸第一鉄を１１.２mgの代わりに使用し、（ｂ）栄養
源溶液は４０mlの蒸留水中２８ｇのグルコース；２０ml
中０.５３ｇのクエン酸三ナトリウム二水和物＋０.２ｇ
の硫酸マグネシウム；２０ml中各々０.６５ｇのリン酸
一カリウム及びリン酸二ナトリウム；及び１５ml中４.
７mlの微量金属溶液＋１mlの硫酸からなり；そして
（ｃ）シー・ピレノイドサの活発に増殖している培養は
ＵＶ２３２−１株であることを除いて実施例１３の方法
に従った。
【００５７】温度を３５℃に上げ、撹拌を３５０pmで開
始し、空気を０.２リッター／分（１pm）で培地に通気
し、pHを通気に添加した無水アンモニア（ＮＨ3）で６.
９に調節し、そしてＵＶ２３２−１株を培地に植菌し
た。ＮＨ3を発酵中栄養窒素源及びpH調節剤として供給
した。６.２時間後通気を０.４１pmに、撹拌を４００rp
mに増加した。１１.８時間に通気を０.６１pmに上げ、
発酵の残りの期間それに保ち、そして撹拌速度を６５０
rpmに上げた。１２.４時間後グルコース含有栄養源溶液
をさらに４０ml発酵槽に添加し、２４.４時間にさらに
２０ml、そして２６.３時間にさらに１５ml添加し、そ
の間２２.８時間に撹拌速度を７５０rpmに上げ、次に３
４.８時間に８００rpmに調節し、そして発酵の残りの期
間この速度に維持した。
始し、空気を０.２リッター／分（１pm）で培地に通気
し、pHを通気に添加した無水アンモニア（ＮＨ3）で６.
９に調節し、そしてＵＶ２３２−１株を培地に植菌し
た。ＮＨ3を発酵中栄養窒素源及びpH調節剤として供給
した。６.２時間後通気を０.４１pmに、撹拌を４００rp
mに増加した。１１.８時間に通気を０.６１pmに上げ、
発酵の残りの期間それに保ち、そして撹拌速度を６５０
rpmに上げた。１２.４時間後グルコース含有栄養源溶液
をさらに４０ml発酵槽に添加し、２４.４時間にさらに
２０ml、そして２６.３時間にさらに１５ml添加し、そ
の間２２.８時間に撹拌速度を７５０rpmに上げ、次に３
４.８時間に８００rpmに調節し、そして発酵の残りの期
間この速度に維持した。
【００５８】培地のグルコース濃度は３１.７時間で枯
渇し、このとき細胞濃度(Ｃ．Ｄ．）は１９.５及びＬ−
ＡＡ濃度は３２２mg／Ｌであった。グルコースの１０％
溶液の２mlを４１.７時間に、そして４１.７〜９４.８
時間の間３時間ごとに発酵槽に供給した。細胞密度及び
Ｌ−ＡＡ濃度を時間と共に測定し、下表にバイオマスの
算出したＬ−ＡＡ含量として示す。
渇し、このとき細胞濃度(Ｃ．Ｄ．）は１９.５及びＬ−
ＡＡ濃度は３２２mg／Ｌであった。グルコースの１０％
溶液の２mlを４１.７時間に、そして４１.７〜９４.８
時間の間３時間ごとに発酵槽に供給した。細胞密度及び
Ｌ−ＡＡ濃度を時間と共に測定し、下表にバイオマスの
算出したＬ−ＡＡ含量として示す。
【００５９】
【表３】
【００６０】上記方法を実質的に記述のようにさらに４
回くり返した。１回の試験はグルコース当量炭素源とし
て４７.３及び７１.２時間にMaltrin、マルトデキスト
リン（５ｇ／２０ml蒸留水）の添加を行った。５回の試
験でＬ−ＡＡの％はバイオマスの乾燥重量は平均して
５.２％であった。
回くり返した。１回の試験はグルコース当量炭素源とし
て４７.３及び７１.２時間にMaltrin、マルトデキスト
リン（５ｇ／２０ml蒸留水）の添加を行った。５回の試
験でＬ−ＡＡの％はバイオマスの乾燥重量は平均して
５.２％であった。
【００６１】Ｌ−アルコルビン酸の測定に使用した方法
はGrun and Loewus, Analytical Biochemistry (1983)
130:191-198に記述されている。この方法は７.８×３０
０mmの有機酸分析用カラムＨＰＸ−８７（Bio-Rad Labo
ratories, Richmond, CA）を使用するイオン交換法であ
る。条件は移動相が０.０１３Ｍの硝酸、流速０.８ml／
分、圧力１５００psig、検出はＵＶ２４５〜２５４nmで
ある。上の条件でＬ−アルコルビン酸及びイソアルコル
ビン酸の分割が可能である。上の実施例で述べたように
記述の方法条件下においてすべてのアルコルビン酸は細
胞内である。
はGrun and Loewus, Analytical Biochemistry (1983)
130:191-198に記述されている。この方法は７.８×３０
０mmの有機酸分析用カラムＨＰＸ−８７（Bio-Rad Labo
ratories, Richmond, CA）を使用するイオン交換法であ
る。条件は移動相が０.０１３Ｍの硝酸、流速０.８ml／
分、圧力１５００psig、検出はＵＶ２４５〜２５４nmで
ある。上の条件でＬ−アルコルビン酸及びイソアルコル
ビン酸の分割が可能である。上の実施例で述べたように
記述の方法条件下においてすべてのアルコルビン酸は細
胞内である。
【００６２】細胞密度（グラム／リッターで示す細胞の
乾燥重量）は次のように測定す。バイオマス試料（５m
l）を１個の秤量用皿に移し、そして５mlの遠心分離し
た上清を第二の秤量用皿に移す。皿を対流オーブン中で
乾燥する（１０５℃で３時間）。乾燥機中で冷却した後
皿の内容物を秤量する。リッター当たりの細胞のグラム
数を（試料重量−上清重量）×２００で求める。
乾燥重量）は次のように測定す。バイオマス試料（５m
l）を１個の秤量用皿に移し、そして５mlの遠心分離し
た上清を第二の秤量用皿に移す。皿を対流オーブン中で
乾燥する（１０５℃で３時間）。乾燥機中で冷却した後
皿の内容物を秤量する。リッター当たりの細胞のグラム
数を（試料重量−上清重量）×２００で求める。
【００６３】しかしながらバイオマスは含有Ｌ−アルコ
ルビン酸の空気酸化又は熱分解を最小にする注意を払え
ば当該技術分野で知られたいずれの方法を用いても乾燥
することができる。
ルビン酸の空気酸化又は熱分解を最小にする注意を払え
ば当該技術分野で知られたいずれの方法を用いても乾燥
することができる。
【００６４】上の実施例は本発明の方法及び新しいＬ−
ＡＡ高生産性微小藻類がそのビタミンＣ含量が高度に富
化されたバイオマスを生産することを示している。ビタ
ミン含量は１.５より高く５重量％又はそれ以上の高さ
に達し、従来技術の結果をはるかに超える。従ってそれ
らの他のよく知られた栄養価値を考慮して、それらは独
立で又は他の適当な飼料組成物と混合してビタミンＣを
高めた動物飼料組成物としての使用に申し分のないもの
である。そのような飼料組成物混合物は代表的には処理
される宿主動物の如何により混合物のトン当たり約６０
〜２,０００グラム、より普通には約３２０ｇ／トンの
Ｌ−アルコルビン酸を含むことができる。
ＡＡ高生産性微小藻類がそのビタミンＣ含量が高度に富
化されたバイオマスを生産することを示している。ビタ
ミン含量は１.５より高く５重量％又はそれ以上の高さ
に達し、従来技術の結果をはるかに超える。従ってそれ
らの他のよく知られた栄養価値を考慮して、それらは独
立で又は他の適当な飼料組成物と混合してビタミンＣを
高めた動物飼料組成物としての使用に申し分のないもの
である。そのような飼料組成物混合物は代表的には処理
される宿主動物の如何により混合物のトン当たり約６０
〜２,０００グラム、より普通には約３２０ｇ／トンの
Ｌ−アルコルビン酸を含むことができる。
【００６５】以上、本発明を詳細に説明したが、本発明
はさらに次の実施態様によってこれを要約して示すこと
ができる。
はさらに次の実施態様によってこれを要約して示すこと
ができる。
【００６６】１．細胞の乾燥重量の１.５％より多いＬ
−アスコルビン酸の細胞内含量を持つ緑色微小藻類細胞
からなるバイオマス。 ２．アルコルビン酸含量が細胞の乾燥重量の少なくとも
約２％である前項１記載のバイオマス。 ３．アルコルビン酸含量が細胞の重量の少なくとも約３
％である前項１記載のバイオマス。 ４．微小藻類がクロレラ属に属する前項１記載のバイオ
マス。 ５．微小藻類がピレノイドサ種に属する前項４記載のバ
イオマス。
−アスコルビン酸の細胞内含量を持つ緑色微小藻類細胞
からなるバイオマス。 ２．アルコルビン酸含量が細胞の乾燥重量の少なくとも
約２％である前項１記載のバイオマス。 ３．アルコルビン酸含量が細胞の重量の少なくとも約３
％である前項１記載のバイオマス。 ４．微小藻類がクロレラ属に属する前項１記載のバイオ
マス。 ５．微小藻類がピレノイドサ種に属する前項４記載のバ
イオマス。
【００６７】６．微小藻類がＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号
５３１７０のシー・ピレノイドサの突然変異株である前
項５記載のバイオマス。 ７．微小藻類が名称ＵＶ１８７−１３１９、ＵＶ２３２
−１、ＤＡＰ３８８−１９、ＵＶ７１１−１、ＥＭＳ１
５６−１、Ｃ１６６−４、ＮＡ６８７−１、ＮＡ７２２
−２２、Ｃ２２５−２、ＵＶ８６９−３、ＵＶ８７２−
２６又はＣ２８４−１３０の少なくとも１つの突然変異
したクロレラ・ピレノイドサ株である前項５記載のバイ
オマス。
５３１７０のシー・ピレノイドサの突然変異株である前
項５記載のバイオマス。 ７．微小藻類が名称ＵＶ１８７−１３１９、ＵＶ２３２
−１、ＤＡＰ３８８−１９、ＵＶ７１１−１、ＥＭＳ１
５６−１、Ｃ１６６−４、ＮＡ６８７−１、ＮＡ７２２
−２２、Ｃ２２５−２、ＵＶ８６９−３、ＵＶ８７２−
２６又はＣ２８４−１３０の少なくとも１つの突然変異
したクロレラ・ピレノイドサ株である前項５記載のバイ
オマス。
【００６８】８．微小藻類が群Ｃ１６６−４、ＮＡ６８
７−１、ＮＡ７２２−２２、Ｃ２２５−２、ＵＶ８７２
−２６、Ｃ２８４−１３０及びＵＶ２３２−１の少なく
とも１つである前項７記載のバイオマス。 ９．微小藻類がＵＶ２３２−１である前項８記載のバイ
オマス。
７−１、ＮＡ７２２−２２、Ｃ２２５−２、ＵＶ８７２
−２６、Ｃ２８４−１３０及びＵＶ２３２−１の少なく
とも１つである前項７記載のバイオマス。 ９．微小藻類がＵＶ２３２−１である前項８記載のバイ
オマス。
【００６９】１０．酸素の存在下で適当な炭素源により
従属栄養的に増殖することができ、そして潜在的に微小
藻類の乾燥重量の少なくとも１.５重量％の細胞内Ｌ−
アスコルビン酸を生産する能力がある緑色微小藻類を選
択し、増殖を促進する水性栄養培地中で有効な温度及び
圧力及び生産されるアスコルビン酸が大部分細胞内にあ
るpHで微小藻類の細胞を従属栄養的に増殖させ、前記培
地は細胞増殖及びＬ−アスコルビン酸生産に十分な量の
適当な炭素源及び溶存した分子状酸素の源を含み、前記
細胞増殖を細胞の乾燥重量の少なくとも１.５重量％に
相当する量の細胞内Ｌ−アスコルビン酸を含む酸の集団
が生ずるまで維持し、そして細胞の集団を培地の水性上
清から分離することからなる前項１記載のバイオマス組
成物の製造方法。
従属栄養的に増殖することができ、そして潜在的に微小
藻類の乾燥重量の少なくとも１.５重量％の細胞内Ｌ−
アスコルビン酸を生産する能力がある緑色微小藻類を選
択し、増殖を促進する水性栄養培地中で有効な温度及び
圧力及び生産されるアスコルビン酸が大部分細胞内にあ
るpHで微小藻類の細胞を従属栄養的に増殖させ、前記培
地は細胞増殖及びＬ−アスコルビン酸生産に十分な量の
適当な炭素源及び溶存した分子状酸素の源を含み、前記
細胞増殖を細胞の乾燥重量の少なくとも１.５重量％に
相当する量の細胞内Ｌ−アスコルビン酸を含む酸の集団
が生ずるまで維持し、そして細胞の集団を培地の水性上
清から分離することからなる前項１記載のバイオマス組
成物の製造方法。
【００７０】１１．細胞増殖を細胞内アルコルビン酸含
量が少なくとも細胞の２重量％になるまで継続する前項
１０記載の方法。 １２．細胞のバイオマスをアスコルビン酸含量を実質的
に低下させることなく乾燥する前項１０記載の方法。
量が少なくとも細胞の２重量％になるまで継続する前項
１０記載の方法。 １２．細胞のバイオマスをアスコルビン酸含量を実質的
に低下させることなく乾燥する前項１０記載の方法。
【００７１】１３．微小藻類の選択が （ａ） 従属栄養増殖試験によりＬ−アスコルビン酸生
産性微小藻類の潜在的な高生産株を確認し、（ｂ） 少
なくとも１つのそのような潜在的高生産性親株を突然変
異させ、（ｃ） 親株より高いアスコルビン酸生産株で
ある前記潜在的高生産性親株の少なくとも１つの突然変
異した生成株を確認しそして分離し、（ｄ） 必要によ
り段階（ｃ）の少なくとも１つの変異処理した生成株
に、微小藻類細胞の乾燥重量に基づいて少なくとも１.
５％の細胞内Ｌ−アスコルビン酸を生産する能力のある
前記微小藻類の突然変異株が得られるまで段階（ｂ）を
反復することからなる前項１０記載の方法。
産性微小藻類の潜在的な高生産株を確認し、（ｂ） 少
なくとも１つのそのような潜在的高生産性親株を突然変
異させ、（ｃ） 親株より高いアスコルビン酸生産株で
ある前記潜在的高生産性親株の少なくとも１つの突然変
異した生成株を確認しそして分離し、（ｄ） 必要によ
り段階（ｃ）の少なくとも１つの変異処理した生成株
に、微小藻類細胞の乾燥重量に基づいて少なくとも１.
５％の細胞内Ｌ−アスコルビン酸を生産する能力のある
前記微小藻類の突然変異株が得られるまで段階（ｂ）を
反復することからなる前項１０記載の方法。
【００７２】１４．細胞増殖を高い細胞密度まで継続
し、炭素源が枯渇するに至らせ、枯渇した炭素源の状態
を細胞増殖が実質的に停止するまで維持し、そして調整
した量の炭素源の供給の再開により細胞内Ｌ−アスコル
ビン酸の追加的な量の生産が行われ、その際細胞密度の
実質的な増加がほとんどないか又は全くなく、それによ
り細胞の乾燥重量に基づく細胞内Ｌ−アスコルビン酸含
量がさらに増加する前項１０記載の方法。
し、炭素源が枯渇するに至らせ、枯渇した炭素源の状態
を細胞増殖が実質的に停止するまで維持し、そして調整
した量の炭素源の供給の再開により細胞内Ｌ−アスコル
ビン酸の追加的な量の生産が行われ、その際細胞密度の
実質的な増加がほとんどないか又は全くなく、それによ
り細胞の乾燥重量に基づく細胞内Ｌ−アスコルビン酸含
量がさらに増加する前項１０記載の方法。
【００７３】１５．温度が２０〜約４０℃の増殖を支持
する範囲にあり、圧力が培地中に溶存する分子状酸素の
増殖を促進する量を維持するに十分な大気圧又は超大気
圧であり、そしてpHが増殖を支持し、そして細胞内に高
い細胞内Ｌ−アスコルビン酸水準を維持するために十分
に高い前項１０記載の方法。
する範囲にあり、圧力が培地中に溶存する分子状酸素の
増殖を促進する量を維持するに十分な大気圧又は超大気
圧であり、そしてpHが増殖を支持し、そして細胞内に高
い細胞内Ｌ−アスコルビン酸水準を維持するために十分
に高い前項１０記載の方法。
【００７４】１６．温度が３０〜４０℃であり、圧力が
少なくとも大気圧であり、そしてpHが約６.５〜８であ
る前項１５記載の方法。 １７．温度が３５〜３８℃であり、そしてpHが少なくと
も約６.９である前項１６記載の方法。
少なくとも大気圧であり、そしてpHが約６.５〜８であ
る前項１５記載の方法。 １７．温度が３５〜３８℃であり、そしてpHが少なくと
も約６.９である前項１６記載の方法。
【００７５】１８．細胞増殖を高密度増殖を与えるに十
分な濃度の炭素源及び分子状Ｏ2の存在下で生産される
アルコルビン酸が大部分細胞内にあるpHで高い細胞密度
になるまで継続し、Ｏ2の濃度が細胞増殖が鈍化する濃
度に減少するか又は減少させ、そして細胞内Ｌ−アルコ
ルビン酸の生産を継続しそして増加させ、その際細胞密
度の増加がほとんどないか又は全くなく、それにより細
胞乾燥重量に基づく細胞内Ｌ−アルコルビン酸含量がさ
らに増加する前項１０記載の方法。
分な濃度の炭素源及び分子状Ｏ2の存在下で生産される
アルコルビン酸が大部分細胞内にあるpHで高い細胞密度
になるまで継続し、Ｏ2の濃度が細胞増殖が鈍化する濃
度に減少するか又は減少させ、そして細胞内Ｌ−アルコ
ルビン酸の生産を継続しそして増加させ、その際細胞密
度の増加がほとんどないか又は全くなく、それにより細
胞乾燥重量に基づく細胞内Ｌ−アルコルビン酸含量がさ
らに増加する前項１０記載の方法。
【００７６】１９．前項１０記載の組成物からなる動物
飼料組成物。 ２０．第２の動物飼料組成物と一緒に生理的に許容され
る量のＬ−アスコルビン酸を与える追加的量を混合した
前項９記載の動物飼料組成物。 ２１．飼料混合物は混合物のトン当たり６０〜２,００
０グラムのＬ−アルコルビン酸を含む前項２０記載の組
成物。 ２２．動物飼料組成物が水産養殖魚飼料である前項１９
記載の組成物。
飼料組成物。 ２０．第２の動物飼料組成物と一緒に生理的に許容され
る量のＬ−アスコルビン酸を与える追加的量を混合した
前項９記載の動物飼料組成物。 ２１．飼料混合物は混合物のトン当たり６０〜２,００
０グラムのＬ−アルコルビン酸を含む前項２０記載の組
成物。 ２２．動物飼料組成物が水産養殖魚飼料である前項１９
記載の組成物。
【００７７】２３．動物の食物に十分量の請求項１記載
のバイオマス又は前項１９記載の動物飼料組成物を供給
して動物の毎日のビタミンＣ要求量の少なくともかなり
の割合を供給することからなるビタミンＣを要求する動
物に対するＬ−アスコルビン酸の供給方法。 ２４．ビタミンＣ要求を持つ動物が魚である前項２３記
載の方法。
のバイオマス又は前項１９記載の動物飼料組成物を供給
して動物の毎日のビタミンＣ要求量の少なくともかなり
の割合を供給することからなるビタミンＣを要求する動
物に対するＬ−アスコルビン酸の供給方法。 ２４．ビタミンＣ要求を持つ動物が魚である前項２３記
載の方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:89） (72)発明者 ロナルド・ジヨン・ハス アメリカ合衆国ウイスコンシン州54220. マニトウオツク．ミシガンアベニユー1415 (72)発明者 ジエフリー・エイ・ラニング アメリカ合衆国ウイスコンシン州54220. マニトウオツク．ノースフイフスストリー ト834 (72)発明者 トマス・ジエイ・スカツトラド アメリカ合衆国ウイスコンシン州53051. メノモニーフオールズ．カントリーサイド ドライブ エヌ・76・ダブリユー・15873
Claims (12)
- 【請求項１】 細胞の乾燥重量の１.５％より多いＬ−
アスコルビン酸の細胞内含量を持つ緑色微小藻類細胞か
らなるバイオマス。 - 【請求項２】 微小藻類がクロレラ属に属する請求項１
記載のバイオマス。 - 【請求項３】 微小藻類がＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号５
３１７０のシー・ピレノイドサの突然変異株である請求
項２記載のバイオマス。 - 【請求項４】 微小藻類が名称ＵＶ１８７−１３１９、
ＵＶ２３２−１、ＤＡＰ３８８−１９、ＵＶ７１１−
１、ＥＭＳ１５６−１、Ｃ１６６−４、ＮＡ６８７−
１、ＮＡ７２２−２２、Ｃ２２５−２、ＵＶ８６９−
３、ＵＶ８７２−２６又はＣ２８４−１３０の少なくと
も１つの突然変異したクロレラ・ピレノイドサ株である
請求項２記載のバイオマス。 - 【請求項５】 酸素の存在下で適当な炭素源により従属
栄養的に増殖することができ、そして潜在的に微小藻類
の乾燥重量の少なくとも１.５重量％の細胞内Ｌ−アス
コルビン酸を生産する能力がある緑色微小藻類を選択
し、増殖を促進する水性栄養培地中で有効な温度及び圧
力及び生産されるアスコルビン酸が大部分細胞内にある
pHで微小藻類の細胞を従属栄養的に増殖させ、前記培地
は細胞増殖及びＬ−アスコルビン酸生産に十分な量の適
当な炭素源及び溶存した分子状酸素の源を含み、前記細
胞増殖を細胞の乾燥重量の少なくとも１.５重量％に相
当する量の細胞内Ｌ−アスコルビン酸を含む酸の集団が
生ずるまで維持し、そして酸の集団を培地の水性上清か
ら分離することからなる請求項１記載のバイオマス組成
物の製造方法。 - 【請求項６】 細胞のバイオマスをアスコルビン酸含量
を実質的に低下させることなく乾燥する請求項５記載の
方法。 - 【請求項７】 微小藻類の選択が （ａ） 従属栄養増殖試験によりＬ−アスコルビン酸生
産性微小藻類の潜在的な高生産株を確認し、 （ｂ） 少なくとも１つのそのような潜在的高生産性親
株を突然変異させ、 （ｃ） 親株より高いアスコルビン酸生産株である前記
潜在的高生産性親株の少なくとも１つの突然変異した生
成株を確認しそして分離し、 （ｄ） 必要により段階（ｃ）の少なくとも１つの変異
処理した生成株に、微小藻類細胞の乾燥重量に基づいて
少なくとも１.５％の細胞内Ｌ−アスコルビン酸を生産
する能力のある前記微小藻類の突然変異株が得られるま
で段階（ｂ）を反復することからなる請求項５記載の方
法。 - 【請求項８】 細胞増殖を高い細胞密度まで継続し、炭
素源が枯渇するに至らせ、枯渇した炭素源の状態を細胞
増殖が実質的に停止するまで維持し、そして調整した量
の炭素源の供給の再開により細胞内Ｌ−アスコルビン酸
の追加的な量の生産が行われ、その際細胞密度の実質的
な増加がほとんどないか又は全くなく、それにより細胞
の乾燥重量に基づく細胞内Ｌ−アスコルビン酸含量がさ
らに増加する請求項５記載の方法。 - 【請求項９】 温度が２０〜約４０℃の増加を支持する
範囲にあり、圧力が培地中に溶存する分子状酸素の増殖
を促進する量を維持するに十分な大気圧又は超大気圧で
あり、そしてpHが増殖を支持し、そして細胞内に高い細
胞内Ｌ−アスコルビン酸水準を維持するために十分に高
い請求項５記載の方法。 - 【請求項１０】 請求項５記載の組成物からなる動物飼
料組成物。 - 【請求項１１】 第２の動物飼料組成物と一緒に生理的
に許容される量のＬ−アスコルビン酸を与える追加的量
を混合した請求項１０記載の動物飼料組成物。 - 【請求項１２】 動物の食物に十分量の請求項１記載の
バイオマス又は請求項１０記載の動物飼料組成物を供給
して動物の毎日のビタミンＣ要求量の少なくともかなり
の割合を供給することからなるビタミンＣを要求する動
物に対するＬ−アスコルビン酸の供給方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US85347692A | 1992-03-18 | 1992-03-18 | |
| US853476 | 1992-03-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0646834A true JPH0646834A (ja) | 1994-02-22 |
Family
ID=25316131
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5058697A Pending JPH0646834A (ja) | 1992-03-18 | 1993-03-18 | Ｌ−アスコルビン酸を高めたバイオマス及びその製造 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
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| CN (1) | CN1080955A (ja) |
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| WO (1) | WO1993019193A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995021933A1 (en) * | 1994-02-10 | 1995-08-17 | Bio-Technical Resources L.P. | L-ascorbic acid production in microorganisms |
| WO1998050558A2 (en) * | 1997-05-07 | 1998-11-12 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie | Production of ascorbic acid in plants |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
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