KR100193748B1 - 종속영양배양에 의한 고농도 클로렐라의 제조방법_ - Google Patents

Abstract

본 발명은 종속영양배양(암배양)에 의해 클로렐라를 제조함에 있어서 결정포당, 포도당액등의 포도당류를 주 탄소원으로 하고 암모니아, 요소 또는 이들의 화합물을 주 질소원으로 하여 차광된 무균배양조 내에서 초기 당농도를 4~8%(W/V), 조체접종량을 4~10%(V/V)의 범위내에서 최적화하여 배양을 진행하고 배양중 인위적인 통기, 교반, 온도, pH 조절과 함께 잔당이 1~2%(W/V)가 되는 싯점에서 잔당이 3~4%(W/V)가 되도록 추가당을 첨가함에 의해 고농도의 클로렐라를 생산하는 것을 특징으로 하는 배양방법에 관한 것으로, 클로렐라를 공업적으로 용이하에 배양할 수 있는 방법을 제공한다.

Description

종속영양배양에 의한 고농도 클로렐라 배양방법

본 발명은 종속영양배양(암배양)에 의해 클로렐라를 배양하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 결정포도당, 포도당액등의 포도당류를 주 탄소원으로 하고 암모니아, 요소, 또는 이들의 화합물을 주 질소원으로 하여 차광된 무균배양조 내에서 클로렐라를 배양하는 방법에 관한 것이다.

클로렐라는 잘 알려져 있는 단세포녹조(Green algae)류로서 일반식물의 생리와 같이 광합성에 의하여 탄소원(공기중의 이산화탄소)과 질소, 기타 무기염류를 동화하여 신속히 자기세포의 증식(분열)을 일으키는 유력한 녹조류이다. 이 세포는 단백질, 지방, 기타 유효성분을 다량 함유하므로 유기자원으로 중요하며, 앞으로의 단백질, 지방자원으로 주목받을 수 있는 물질이다. 또한, 이미 산업계에서는 단백질과 엽록소가 풍부하고 특수한 생리작용인자 및 인체에 유익한 비타민, 미네랄 등을 골고루 함유하고 있는 특성때문에 건강식품으로 판매하고 있으며, 그외 사료원료, 식품 풍미개선제 등으로 널리 이용되고 있다. 실제 클로렐라의 조제성분은 조류의 종류, 배양방법 및 조건에 따라 다르나 단백질 50~60%, 지방 10~30%, 탄수화물 10~25%, 회분 6~10%로 구성되어 있고 비타민류 및 아미노산 조성등에 있어서도 영양학적으로 우수한 것으로 평가되고 있다. 한편, 균체를 싸고 있는 세포막은 효모보다 두껍고 단단하나 건조법이나 용출법으로 소화율을 올릴 수 있다.

이와같은 특성을 지닌 클로렐라의 배양방법은 크게 옥외의 개방된 수조에서 광합성을 이용하여 배양하는 독립영양배양(Autotrophic growth)방법과 유기탄소원을 이용 밀폐된 탱크 내에서 배양하는 종속영양배양(Heterotrophic growth)방법 및 앞의 두 방법을 조합한 배양방법이 있으며, 현재까지 알려진 클로렐라의 배양방법으로는 탄소원으로서 인버타제 또는 이 효소를 함유한 균체에 의해 연화 처리한 당밀을 사용하는 방법으로 일본특허공보 소 55-16636호, 배양액중에 축합 인산을 첨가하여 철분을 충분량 용해시킨 배지에서 종균을 암배양하는 방법으로 일본특허공보 소 56-54785호와 배양종료전에 비타민 C를 배양액중에 클로렐라 건조중량의 0.2% 이상 첨가하는 방법으로 일본특허공보 소 61-48917호가 있다. 또한, 당류와 질소를 함유한 공지의 배지에 당화효소를 첨가함과 동시에 오존을 통과시키면서 배양하는 방법으로 대한민국특허공보 82-1310호가 알려져 있다.

상술한 방법중 현재까지 클로렐라의 대량생산은 옥외의 개방된 수조에서 행하는 독립영양배양방법이 공업생산의 주류가 되어 왔으나 옥외에서 배양하게 됨으로 기후조건의 변화가 심하여 기후 변화에 저항이 강한 조체의 선택이 요구되며 잡균의 번식이 쉬우므로 잡균에 대한 저항성이 크고 배양액중에 침전이 적은 조체 및 원충에게 적게 먹히는 조체등 조체선택의 문제가 있으며, 특히 여름철에는 온도가 상승하므로 열저항성이 강한 조체선택의 문제점을 안고있다. 또한 배양시 공급해야 하는 이산화탄소의 경우는 공기중에 0.03%로 클로렐라 배양에는 부족하여 별도로 이산화탄소를 물속에 통기시켜 분자상이 이산화탄소를 공급해야 할 뿐만 아니라, 10%이상의 공급시는 도리어 증식의 저해가 되는 단점이 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 이러한 독립영양배양방법의 문제점을 해결하여 보다 용이하게 고수율로 클로렐라를 배양하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명자등은 밀폐된 탱크 내에서 포도당류, 초산등의 유기탄소원, 질소, 인산 및 무기물등을 넣고 교반, 통기를 하면서 온도·pH를 제어하는 종속영양배양(암배양)방법으로 연중 일정하고 우수한 품질을 유지하면서 최대의 생산량을 얻기위한 연구를 수행하던중 초기당농도, 조체접종량의 최적화 및 배양중 추가당 첨가에 의해 생산량이 증가한다는 사실을 알아 본 발명을 완성하게 된 것이다.

즉, 본 발명은 결정포도당, 포도당액등의 포도당류를 주 탄소원으로 하고 암모니아, 요소, 또는 이들의 화합물을 주 질소원으로 하여 차광된 무균배양조 내에서 초기 당농도를 4~8%(W/V), 조체접종량을 4~10%(V/V)의 범위내에서 최적화하여 배양을 진행하고 배양중 인위적인 통기, 교반, 온도, pH 조절과 함께 잔당이 1~2%(W/V)가 되는 싯점에서 잔당이 3~4%(W/V)가 되도록 추가당을 첨가함에 의해 고농도의 클로렐라를 생산하는 것을 특징으로 하는 배양방법으로 본 발명에 대해 자세히 설명하면 다음과 같다.

조체로 이용한 클로렐라는 서울시 근교 및 경상도, 충청도 등의 수개소 저수지에서 채취한 녹조류함유액 1ml을 121℃에서 15분간 가압살균된 50ml의 분리용 액체배지(포도당 1%, 제1인산칼륨 0.1%, 제2인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.2%, 황산제1철 0.001%, 구연산나트륨 0.1%, 요소 0.2%, pH7.5)가 들어있는 500ml의 삼각후라스크에 접종하고 차광된 암배양 조건의 항온진탕기 내에서 분당 120회의 왕복진탕으로 7~10일간 30℃에서 배양후, 이 배양액을 121℃에서 15분간 가압살균된 분리용 한천 평판배지(분리용 액체배지에 Agar를 2% 첨가)에 희석도말하여 30℃에서 7~10일간 정치배양후 콜로니가 크고, 진한 녹색을 나타내는 것 등을 선택하였다. 또한 선택된 조체를 상기와 같은 방법으로 3회 반복 실험하고, 선택한 조체를 통상의 세균용 평판고체배지에 도말하여 세균이 증식하는 가의 오염여부를 확인후 세균으로부터 오염이 안된 균주들을 선택하였다.

선택된 조체들은 일차 종속영양배양에 적용된 조체를 선별하기 위하여 상기의 분리방법에 의하여 장기간 반복선별하고, 분리용 액체배지에 접종하여 30℃에서 5일간 왕복진탕 배양후 통상의 분석방법으로 조체증식량이 많고 단백질의 함량이 가장 양호한 클로렐라속 SWC0530을 선별하여 본 발명에 이용하였다.

본 발명에 이용한 상기의 조체를 소형발효조를 이용하여 산업적 측면에서 유용한 종속영양배양에 대해 연구하던 중 클로렐라는 세균류의 배양에 비해 일반적으로 증식속도가 느려 배양시간이 길고 건조조체량의 미흡감을 확인하였다.

따라서, 짧은 시간내에 고농도의 클로렐라를 생산하기 위해 거듭된 연구를 수행한 결과, 초기당농도를 증가시키고 여기에 상응하게 조체접종량을 중량하면 배양시간이 크게 단축되었다. 이어 짧은 시간내에 고농도의 클로렐라를 생산하기 위한 수단으로 조체가 증식함에 따라 초기당이 소모되어 잔당이 1~2%가 된 싯점에서 잔당이 3~4%가 되도록 추가당을 첨가함에 의해 고농도 클로렐라 배양이 가능함에 따라 본 발명을 완성하게 된 것이다.

즉, 본 발명의 방법에 의한 클로렐라 제조방법에 있어서 초기당농도, 조체접종량 및 추가당의 첨가의 조절에 따른 배양시간, 건조조체량 및 대당수율에 미치는 영향을 조사해본 결과 다음과 같은 결과를 얻었다.

1) 5L, 50L의 소형발효조를 각각 종배양조, 주배양조로 하고, 조체접종량을 4%로 하여 초기 당농도의 조절에 의한 배야결과를 조사한 결과 표 1에 나타난 바와같이 초기당 농도 4~8%에서 배양한 경우 대당수율이 비교적 높았으며, 초기당농도가 높을수록 건조조체량은 증가하나 배양시간이 지연되고 대당수율이 상대적으로 저조하게 나타났다.

# 주(1):건조조체량의 측정은 배양액을 10ml 취하여 증류수로 2회 세척한 후, 105℃ 건조기에서 2시간 완전건조시킨 후 중량을 측정하였다.

주(2):대당수율(%)=총건조조체량(g)/총사용환원당량(g)×100

2) 초기당농도를 각각 4, 6, 8%로 하고, 조체접종량을 각각 8, 10%로 중량하여 배양한 경우 표 2에 나타낸 바와 같이 건조조체량 및 대당수율은 1)의 결과와 커다란 차이를 보이지 않았으나 초기당농도 4%에서 배양시간이 단축되는 결과를 발견하였다.

3) 또한, 초기당농도를 각각 4, 6, 8%, 조체접종량을 각각 8, 10%로 하여 배양하고, 조체가 증식함에 따라 초기당이 소모되어 잔당이 1~2%가 된 싯점에서 배양액의 잔당이 3~4%가 되도록 추가당을 첨가한 경우 표 3에 나타난 바와같이 추가당을 첨가하기 전보다 배양시간은 다소 길어진 반면 건조조체량이 증가하여 단위시간당의 조체량이 증가하는 효과를 보임에 따라 종속영양배양에 의한 고농도 클로렐라 배양이 가능함을 발견하였다.

클로렐라의 배양조건은 탄소원으로서 초산, 포도당류(함수포도당, 무수포도당, 액상포도당)를 이용하며, 질소원으로서는 암모니아가스, 요소, 인산암모늄등을 이용할 수 있으며 그외 천연의 무기금속염이 혼합된 배지면 이용가능하다.

본 발명의 배양을 행함에 있어서 배양 관리조건으로 발효온도 26~32℃ 내외이며 통기량은 0.3~1.0vvm, 교반회전수는 200~500rpm, 배양중 pH는 6.5~7.5로 암모니아수 또는 암모니아 가스를 이용 자동조절한다. 배양완료후 배양액내의 클로렐라를 얻기 위하여 원심분리후 살균, 분무건조로 클로렐라 분말을 얻었다.

이하, 본 발명에 의한 클로렐라 배양방법을 실시예에서 상세히 설명하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

[표준배지조성]

가. 종배양배지:포도당 1%, 제일인산칼륨 0.1%, 제이인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.2%, 황산제일철 10mg/L, 구연산나트륨 0.1%, 요소 0.2%, pH7.5

나. 전배양배지:포도당 2.5%, 제일인산칼륨 0.025%, 황산마그네슘 0.05%, 황산제일철 10mg/L, 이디티에이 30mg/L, A-5액 1ml/L, pH 6.8∼7.5

다. 생산배지 : 포도당 4%, 제일인산칼륨 0.03%, 황산마그네슘 0.06%, 황산제일철 10mg/L, 이디티에이 70mg/L, A-5액 1ml/L

라. 추가당 : 포도당 70%, 제일인산칼륨 0.05%, 황산마그네슘 0.05%, pH 무조정

마. A(Arnon's)-5액 : 붕산 2.86g, 염화망간 1.81g, 황산아연 0.22g, 황산동 0.08g, 몰리브덴산칼륨 0.021g, 농황산 1 방울, 순수 1L

[표준배양방법]

가. 종배양 : 종배양배지를 2L 삼각바플후라스크에 250ml 사입하고 121℃에서 15분간 가압살균한다. 냉각후 한천평판배지에서 정치배양된 조체를 3백금니 접종한후 차광된 암배양조건의 항온진탕기 내에서 분당 120호의 왕복진탕으로 7∼10일간 30℃에서 배양하였다.

나. 전배양 : 전배양배지를 5L 소형발효조에 2.5L 사입하고 121℃에서 15분간 가압살균한다. 냉각후 종배양액을 10% 접종하고 교반 600rpm, 통기 0.8∼1.0vvm의 조건으로 30℃에서 배양한다.

이때 pH 조절은 암모니아수로 6.5∼7.5로 유지시킨다.

다. 생산배양 : 생산배양배지를 50L 소형발효조에 25L 사입하고 121℃에서 15분간 가압살균한다. 냉각후 전배양액을 4% 접종하고 교반 350rpm, 통기 0.3~1.0vvm의 조건으로 30℃에서 배양한다.

이때 pH 조절은 액화암모니아가스로 6.5~7.5로 유지시킨다.

이때 배양액내의 클로렐라의 건조조체량은 20.1mg/ml였다.

[실시예 2]

초기당을 4%로 하여 전배양액을 8% 접종하고 이외의 방법은 상기 실시예 1의 표준배지 및 표분배양방법에 준하여 실시하였다.

이때, 배양액내의 클로렐라의 건조조체량은 21.2mg/ml였다.

[실시예 3]

초기당을 8%로 하여 전배양액을 8% 접종하고 이외의 방법은 상기 실시예 1의 표준배지 및 표준배양방법을 준하여 실시하였다.

이때, 배양액내의 클로렐라의 건조조체량은 37.8mg/ml였다.

Claims (3)

1. 차광된 무균배양조 내에서 포도당을 주탄소원으로 이용하여 초기당 농도를 4~8%(W/V), 조체접종량을 4~10%(V/V)로 호기적 배양하고, 배양중 초기당의 잔당이 1~2%(W/V)가 되는 싯점에서 잔당이 3~4%(W/V)가 되도록 추가당을 첨가함을 특징으로 하는 종속영양배양에 의한 고농도 클로렐라의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 배양온도는 26-32℃로 유지함을 특징으로 하는 종속영양배양에 의한 고농도 클로렐라의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 배양조의 통기량을 0.3-1.0vvm으로 유지함을 특징으로 하는 종속영양배양에 의한 고농도 클로렐라의 제조방법.