KR101465545B1 - 조 단백질 함량 증대를 위한 클로렐라의 배양방법 - Google Patents

조 단백질 함량 증대를 위한 클로렐라의 배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 상대적으로 고농도의 제일인산칼륨(KH2PO4)을 함유하는 배지 중에서 클로렐라를 배양하는 것을 포함하는 클로렐라의 배양방법을 제공한다. 본 발명에 따른 배양방법에 의해 배양을 수행할 경우, 조 단백질 함량이 높은 클로렐라를 얻을 수 있다.

Description

조 단백질 함량 증대를 위한 클로렐라의 배양방법{Process for culturing chlorella for increasing crude protein contents}
본 발명은 조 단백질 함량이 높은 클로렐라를 얻을 수 있는 클로렐라의 배양방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 상대적으로 고농도의 제일인산칼륨(KH2PO4)을 함유하는 배지 중에서 클로렐라를 배양하는 것을 포함하는 클로렐라의 배양방법에 관한 것이다.
미세 담수 녹조류 중 하나인 클로렐라는 인체에 유익한 탄수화물, 단백질, 지방뿐 아니라 엽록소, 비타민, 미네랄 등의 영양소를 함유하고 있어, 우주 식품으로도 선정된 영양학적으로 가치가 뛰어난 식품의 원료로 알려져 있다. 이 외에도 건강 기능 식품의 원료로도 널리 이용되고 있는 클로렐라는 높은 항산화 효과뿐 아니라, 피부건강과 면역기능에도 도움을 줄 수 있다.
클로렐라는 독립영양배양, 종속영양배양, 또는 이들의 조합에 의해 배양되며, 탄소원, 질소원, 미량금속, 미량원소 등을 포함하는 배지 중에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 대한민국 특허등록 제10-0193748호는 종속영양배양에 의한 고농도 클로렐라의 제조방법을 개시한 바 있다. 또한, 클로렐라에 추가적인 기능성 성분(예를 들어, 오메가-3 지방산, 불포화 지방산, 텅스텐, 라이코펜 등)을 부여하기 위하여, 특정 물질을 포함하는 배지 중에서 클로렐라를 배양하는 다양한 방법이 알려져 있다 (예를 들어, 대한민국 특허공개 제2005-00119760호, 제2005-0015233호, 제1998-0080312, 일본특허공개 제2002-238545호, 제1998-165171호, 제2000-152778호 등). 상기 방법은 모두 배지 내에 특정 물질을 첨가하여 클로렐라 내 함량을 인위적으로 높이는 방법이다. 기타, 일본 특허공개 제2000-166538호는 비타민 E 및 카로티노이드가 강화된 클로렐라 및 지방산 화합물이 강화된 클로렐라의 제조방법을 개시하고 있으나, 이 방법 역시 비타민 E 및 지방산 화합물의 존재하에서 클로렐라를 배양한 것으로, 외부에서 클로렐라 내부로 인위적으로 특정 물질을 첨가해주는 방법이다.
한편, 조 단백질(crude proten)은 순수한 단백질과 핵산, 아미드 화합물, 요소(urea) 등으로 구성되어 있다. 단백질은 몸을 구성하는 대표적인 물질로, 이는 근육의 주성분이 단백질이기 때문이다. 생물체 내의 화학반응의 종류는 매우 다양하며 각각의 반응에는 그 반응에만 촉매작용을 하는 효소가 존재한다. 생물체 내에서의 화학반응의 속도를 조절하는 촉매를 효소라고 하는데, 대부분의 효소는 단백질로 이루어져 있다. 그리고 면역을 담당하는 항체의 주된 구성성분으로 외부로부터 들어오는 항원과 결합하여 면역반응을 일으키는 주요 생체 방어 기작의 구성요소이다.
본 발명자들은 조 단백질을 고농도로 함유하는 클로렐라의 제조방법을 개발하기 위하여 다양한 시험을 수행하였다. 특히, 본 발명자들은 외부에서 추가의 성분을 첨가하지 않고, 클로렐라 배양에 필요한 성분들의 조성변화를 통하여 조 단백질을 고농도로 함유한 클로렐라의 제조방법을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 특정 배지 성분, 즉 제일인산칼륨(KH2PO4)을 종래의 사용량에 비해 적어도 4배 이상 함유하는 배지 중에서 클로렐라를 배양할 경우, 클로렐라 내의 조 단백질 함량을 약 13% 내지 18%로 높일 수 있다는 것을 발견하였다. 이는 추가의 성분을 첨가하지 않고도, 배지 조성만을 변화시킴으로써 조 단백질이 함량을 현저하게 높일 수 있다는 것으로 매우 놀라운 것이다.
따라서, 본 발명은 추가의 성분을 첨가하지 않고, 제일인산칼륨(KH2PO4)의 함량을 증가시킨 배지 중에서 클로렐라를 배양하는 것을 포함하는 클로렐라의 배양방법(즉, 조 단백질을 고농도로 함유한 클로렐라의 제조방법)을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 탄소원, 질소원, 황산마그네슘, 황산제일철, 제일인산칼륨, 에틸렌디아민테트라아세트산 또는 그의 염, 및 미량원소 용액을 포함하는 배지 중에서 클로렐라를 배양하는 방법에 있어서, 배지 중 제일인산칼륨(KH2PO4)의 농도가 0.2 내지 0.5 중량%, 바람직하게는 0.25 내지 0.45 중량%인 것을 특징으로 하는 클로렐라의 배양방법이 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명의 배양방법은 물 1 L 중에 황산마그네슘 0.05∼0.4 중량%, 황산제일철 0.001∼0.01 중량%, 제일인산칼륨 0.2∼0.5 중량%, 에틸렌디아민테트라아세트산 또는 그의 염 0.01∼0.1 중량%, 및 미량원소 용액 1∼5 ml을 함유하고, 탄소원 및 질소원을 포함한 배지 중에서 클로렐라를 배양함으로써 수행될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 배양방법은 물 1 L 중에 황산마그네슘 0.05∼0.4 중량%, 황산제일철 0.001∼0.01 중량%, 제일인산칼륨 0.25∼0.45 중량%, 에틸렌디아민테트라아세트산 또는 그의 염 0.01∼0.1 중량%, 및 미량원소 용액 1∼5 ml을 함유하고, 탄소원 및 질소원을 포함한 배지 중에서 클로렐라를 배양함으로써 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 배양방법은 제일인산칼륨(KH2PO4)을 종래의 사용량에 비해 적어도 4배 이상 함유하는 배지 중에서 클로렐라를 배양하는 것을 포함하며, 상기 배양방법에 의해 얻어지는 클로렐라 내의 조 단백질 함량을 약 13% 내지 18%로 높일 수 있다.
도 1은 제일인산칼륨(KH2PO4)을 제일인산나트륨(NaH2PO4)으로 교체한 배지 중에서 클로렐라를 배양하였을 때 얻어진 클로렐라의 성장 추이를 나타내는 그래프이다. 도 1에서 RS는 잔당을 나타내고, OD는 간접 균체량(흡광도)를 나타낸다.
본 발명은 탄소원, 질소원, 황산마그네슘, 황산제일철, 제일인산칼륨, 에틸렌디아민테트라아세트산 또는 그의 염, 및 미량원소 용액을 포함하는 배지 중에서 클로렐라를 배양하는 방법에 있어서, 배지 중 제일인산칼륨(KH2PO4)의 농도가 0.2 내지 0.5 중량%인 것을 특징으로 하는 클로렐라의 배양방법을 제공한다.
본 발명에 의해, 제일인산칼륨(KH2PO4)을 종래의 사용량에 비해 적어도 4배 이상 함유하는 배지 중에서 클로렐라를 배양할 경우, 배양에 의해 얻어지는 클로렐라 내의 조 단백질 함량을 약 13% 내지 18%로 높일 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 상기 배지 중 제일인산칼륨(KH2PO4)의 농도는 0.2 내지 0.5 중량%가 바람직하며, 0.25 내지 0.45 중량%가 더욱 바람직하다.
상기 클로렐라는 예를 들어, 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa ), 클로렐라 레귤라리스(Chlorella regularis), 클로렐라 사코로필라(Chlorella saccharophila), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 등을 제한없이 포함하며, 당업자가 입수가능한 모든 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 클로렐라는 대한민국 특허등록 제10-0193748호에 개시된 바에 따라, 클로렐라 종균 배양을 통하여 얻어진 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 배양방법에 사용되는 배지는, 제일인산칼륨에 추가하여, 클로렐라 배양에 통상적으로 사용되는 성분 즉, 탄소원, 질소원을 포함하고 또한 황산마그네슘, 황산제일철, 에틸렌디아민테트라아세트산 또는 그의 염, 및 미량원소 용액을 포함한다. 또한, 필요에 따라 초기 pH를 약산성으로 조절하기 위한 제이인산칼륨(K2HPO4)을 추가로 포함할 수 있다.
상기 황산마그네슘은 수화물 형태, 예를 들어 MgSO4·7H2O를 사용할 수도 있으며, 그 사용량은 배지 총 중량에 대하여 0.05∼0.4 중량%, 바람직하게는 0.1∼0.4 중량%의 범위일 수 있다. 황산제일철 등의 금속원소의 사용량은 배지 총 중량에 대하여 0.001∼0.01 중량%, 바람직하게는 0.002∼0.01 중량%의 범위일 수 있다. 에틸렌디아민테트라아세트산은 염 형태일 수 있으며, 통상의 알칼리금속염 형태, 예를 들어 에틸렌디아민테트라아세트산 2Na (EDTA-2Na) 일 수 있다. 상기 에틸렌디아민테트라아세트산 또는 그의 염의 사용량은 의 사용량은 배지 총 중량에 대하여 0.01∼0.1 중량%, 바람직하게는 0.02∼0.1 중량%의 범위일 수 있다.
상기 미량원소 용액은 클로렐라 배양에 통상적으로 사용되는 미량원소 용액일 수 있으며, 그 사용량은 배지 총 중량에 대하여 1∼5 ml, 바람직하게는 2∼5 ml의 범위일 수 있다. 상기 미량원소 용액은 붕산(H3BO3), 염화망간(MnCl2), 황산아연(ZnSO4) 또는 그의 수화물(예를 들어, ZnSO4ㆍ7H2O), 황산동(CuSO4) 또는 그의 수화물(예를 들어, CuSO4ㆍ5H2O), 몰리브덴산의 알칼리금속염(alkali metal salt of molybdenic acid), 및 황산(H2SO4)을 포함하는 용액일 수 있다. 상기 염화망간 및 황산 대신 황산망간(MnSO4) 또는 그의 수화물(예를 들어, MnSO4ㆍ7H2O)을 함유할 수 있다. 또한, 상기 몰리브덴산의 알칼리금속염은 몰리브덴산 나트륨염(Na2MoO4) 또는 그의 수화물(예를 들어, Na2MoO4ㆍ2H2O)일 수 있다. 예를 들어, 상기 미량원소 용액은 상업적으로 판매되는 A5 액(Arnon's-5 solution)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 A5 액은 붕산 2.86g, 염화망간 1.81g, 황산아연 0.22g, 황산동 0.08g, 몰리브덴산칼륨 0.021g, 농황산 1 방울, 및 순수 1L로 구성될 수 있다.
상기 탄소원 및 질소원은 특별히 제한되는 것은 아니며, 클로렐라 배양에 사용되는 것으로 알려져 있는 탄소원 및 질소원을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 탄소원으로는 초산, 포도당류(함수포도당, 무수포도당, 액상포도당)를 사용할 수 있으며, 질소원으로는 암모니아가스, 요소, 인산암모늄 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 배양은, 암배양 및 광배양을 포함한, 통상의 클로렐라 배양 조건하에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기한 배지를 발효조에 사입하고, 121℃에서 15분간 가압살균한 다음, 냉각한 후 클로렐라 종배양액을 접종하고, 교반 200∼500 rpm, 통기 0.3∼1.0 vvm 조건으로 30℃에서 배양을 수행할 수 있다. 필요할 경우, 액화 암모니아가스를 사용하여 pH 6.5∼7.5로 유지시킬 수 있다. 배양완료 후 배양액 중의 클로렐라는 원심분리 후, 살균, 분무건조 등을 통하여 건조분말을 얻을 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 배양방법은 물 1 L 중에 황산마그네슘 0.05∼0.4 중량%, 황산제일철 0.001∼0.01 중량%, 제일인산칼륨 0.2∼0.5 중량%, 에틸렌디아민테트라아세트산 또는 그의 염 0.01∼0.1 중량%, 및 미량원소 용액 1∼5 ml을 함유하고, 탄소원 및 질소원을 포함한 배지 중에서 클로렐라를 배양함으로써 수행될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 배양방법은 물 1 L 중에 황산마그네슘 0.05∼0.4 중량%, 황산제일철 0.001∼0.01 중량%, 제일인산칼륨 0.25∼0.45 중량%, 에틸렌디아민테트라아세트산 또는 그의 염 0.01∼0.1 중량%, 및 미량원소 용액 1∼5 ml을 함유하고, 탄소원 및 질소원을 포함한 배지 중에서 클로렐라를 배양함으로써 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 조단백질 생산성 평가
대한민국 특허등록 제10-0193748호에 개시된 바에 따라, 클로렐라 종균 배양을 수행하였으며, 얻어진 클로렐라 종균을 본 발명에 따른 배지(배지 A) 또는 통상의 클로렐라 배양용 배지(배지 B) 중에서 배양하였다.
- 배지 A1: 포도당 4 중량%, 황산마그네슘(MgSO4·7H2O) 0.2 중량%, 황산제일철 0.007 중량%, 제일인산칼륨(KH2PO4) 0.2 중량%, EDTA-2Na 0.01 중량%, 및 A5 액 2.5 ml (정제수 총 1 L 중에 상기 조성이 얻어지도록 각각의 성분을 첨가하여 배지를 제조)
- 배지 A2: 포도당 4 중량%, 황산마그네슘(MgSO4·7H2O) 0.2 중량%, 황산제일철 0.007 중량%, 제일인산칼륨(KH2PO4) 0.3 중량%, EDTA-2Na 0.01 중량%, 및 A5 액 2.5 ml (정제수 총 1 L 중에 상기 조성이 얻어지도록 각각의 성분을 첨가하여 배지를 제조)
- 배지 A3: 포도당 4 중량%, 황산마그네슘(MgSO4·7H2O) 0.2 중량%, 황산제일철 0.007 중량%, 제일인산칼륨(KH2PO4) 0.4 중량%, EDTA-2Na 0.01 중량%, 및 A5 액 2.5 ml (정제수 총 1 L 중에 상기 조성이 얻어지도록 각각의 성분을 첨가하여 배지를 제조)
- 배지 A4: 포도당 4 중량%, 황산마그네슘(MgSO4·7H2O) 0.2 중량%, 황산제일철 0.007 중량%, 제일인산칼륨(KH2PO4) 0.5 중량%, EDTA-2Na 0.01 중량%, 및 A5 액 2.5 ml (정제수 총 1 L 중에 상기 조성이 얻어지도록 각각의 성분을 첨가하여 배지를 제조)
- 배지 B: 포도당 4 중량%, 황산마그네슘(MgSO4·7H2O) 0.2 중량%, 황산제일철 0.007 중량%, 제일인산칼륨(KH2PO4) 0.07 중량%, 제이인산칼륨(K2HPO4) 0.03 중량%, EDTA-2Na 0.01 중량%, 및 A5 액 2.5 ml (정제수 총 1 L 중에 상기 조성이 얻어지도록 각각의 성분을 첨가하여 배지를 제조)
상기 배양은 배지 A1 내지 A4, 또는 배지 B를 각각 3개씩 사용하여 수행하였다(n=3). 또한, 각각의 배양은 배지 2.5 L를 발효조에 사입하고, 121℃에서 15분간 가압살균한 다음, 냉각한 후 종배양액을 8 % 접종하고, 교반 350 rpm, 통기 0.3∼1.0 vvm 조건으로 30℃에서 50시간 동안 수행하였다. pH 조절은 액화 암모니아가스로 6.5∼7.5로 유지시켰다.
배양 초기의 배지의 pH, 배양완료 후 각각의 배지를 사용하여 배양된 클로렐라에 대한 조 단백질 함량, 총 엽록소(total chlorophyll) 함량, 및 질소원인 암모니아 사입량을 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 1과 같다.
배지 초기 pH 조 단백질(중량%) 총 엽록소(mg/g) 암모니아 사입량
배지 A1 3.6 ± 0.2 52 ± 1 30 ± 3 45 ml
배지 A2 3.4 ± 0.2 53 ± 2 31 ± 3 50 ml
배지 A3 3.2 ± 0.2 55 ± 1 29 ± 3 55 ml
배지 A4 3.0 ± 0.2 56 ± 2 31 ± 3 55 ml
배지 B 5.6 ± 0.2 46 ± 3 29 ± 3 45 ml
상기의 표 1의 결과로부터, 동일한 시간 동안 배양하였을 때, 본 발명에 따른 배지(즉, 배지 A1 내지 A4) 및 종래의 배양 배지(즉, 배지 B)를 사용하여 배양/회수된 클로렐라는 총 엽록소 생산량에 있어서 큰 차이를 나타내지 않았으나, 조 단백질의 생산량에서 있어서 약 13% 내지 18%로 증가하였음을 알 수 있다.
실시예 2. 조단백질 생산성 평가
실시예 1의 결과가 배지의 초기 pH 저하에 의한 암모니아 사입량 증대에 의한 것인지 확인하기 위하여, 배지 A2에 인산(H3PO4)을 각각 1g, 2g, 및 3g을 가한 다음, 실시예 1과 동일한 조건으로 배양을 수행하였다. 배양 초기의 배지의 pH, 배양완료 후 각각의 배지를 사용하여 배양된 클로렐라에 대한 조 단백질 함량, 총 엽록소(total chlorophyll) 함량, 및 질소원인 암모니아 사입량을 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 2과 같다.
배지 초기 pH 조 단백질
(중량%)		 총 엽록소
(mg/g)		 암모니아 사입량
배지 A2 3.4 53.5 33 55 ml
배지 A2 + 인산 1g 3.0 52.9 32 55 ml
배지 A2 + 인산 2g 2.8 53.1 32 60 ml
배지 A2 + 인산 3g 2.5 52.9 31 62 ml
상기 표 2의 결과로부터, 인산을 추가하였을 때 초기 pH는 낮아지고 암모니아 사입양은 증가되었으나, 조 단백질 생산성에는 유의성 있는 변화가 없음을 알 수 있다. 또한, 인산을 추가하였을 때(예를 들어, 인산을 3 g 추가하였을 때), 균 뭉침 현상이 발생하여 배양에 부적합하였다. 따라서, 상대적으로 고농도의 제일인산칼륨의 사용에 따른 조 단백질 생산성 증가는 암모니아 사입량과는 직접적인 관련성은 적은 것으로 추정된다.
실시예 3. 다른 인산칼륨염의 사용가능성 평가
제일인산칼륨 대신 다른 인산칼륨염 즉 제일인산나트륨(NaH2PO4)로 치환하여 사용될 수 있는지를 확인하기 위하여, 배지 A2에서 제일인산칼륨 대신 제일인산나트륨(NaH2PO4) 0.3 중량%을 첨가하여, 실시예 1과 동일한 조건으로 배양을 수행하였다. 그러나, 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 제일인산칼륨 대신 제일인산나트륨을 함유하는 배지에서는 클로렐라가 성장하지 못하였다. 도 1에서 RS는 잔당를 나타내고, OD는 간접 균체량(흡광도)를 나타낸다.
따라서, 상기 결과들로부터, 종래의 클로렐라 배양용 배지 중에서 제일인산칼륨(KH2PO4)의 농도를 상대적으로 과량 즉, 0.2 ∼ 0.5 중량%의 범위로 사용하여 배양을 수행할 경우, 조 단백질의 함량이 높은 클로렐라를 얻을 수 있음을 알 수 있다.

Claims (5)

  1. 탄소원, 질소원, 황산마그네슘, 황산제일철, 제일인산칼륨, 에틸렌디아민테트라아세트산 또는 그의 염, 및 미량원소 용액을 포함하는 배지 중에서 클로렐라를 배양하는 방법에 있어서,
    물 1 L 중에 황산마그네슘 0.05∼0.4 중량%, 황산제일철 0.001∼0.01 중량%, 제일인산칼륨 0.2∼0.5 중량%, 에틸렌디아민테트라아세트산 또는 그의 염 0.01∼0.1 중량%, 및 미량원소 용액 1∼5 ml을 함유하고, 탄소원 및 질소원을 포함한 배지 중에서 클로렐라를 배양하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배지 중 제일인산칼륨(KH2PO4)의 농도가 0.25 내지 0.45 중량%인 것을 특징으로 하는 배양방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 미량원소 용액이 붕산, 염화망간, 황산아연 또는 그의 수화물, 황산동 또는 그의 수화물, 몰리브덴산의 알칼리금속염, 및 황산을 포함하는 용액인 것을 특징으로 하는 배양방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
KR1020120155866A 2012-12-28 2012-12-28 조 단백질 함량 증대를 위한 클로렐라의 배양방법 KR101465545B1 (ko)

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