KR101106198B1 - 씨지에프 함량이 높은 클로렐라 종균을 배양하는 방법 및 그 방법에 의해 수득된 클로렐라 종균 - Google Patents
씨지에프 함량이 높은 클로렐라 종균을 배양하는 방법 및 그 방법에 의해 수득된 클로렐라 종균 Download PDFInfo
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Abstract
본원발명은 클로렐라 종균을 배양하는 방법 및 그 방법에 의해 수득된 클로렐라 종균에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 독립영양배양과 종속영양배양의 교차배양에 의해 씨지에프 함량이 높은 클로렐라 종균을 배양하는 방법 및 그 방법에 의해 수득된 씨지에프 함량이 높은 클로렐라 종균에 관한 것이다.
또한, 본원발명은 상기의 방법으로 수득된 클로렐라 종균을 이용하여 씨지에프 함량이 높은 클로렐라를 생산하는 방법에 관한 것이다.
클로렐라, 씨지에프, 독립영양배양, 종속영양배양
Description
본원발명은 씨지에프 함량이 높은 클로렐라 종균을 배양하는 방법 및 그 방법에 의해 수득된 씨지에프 함량이 높은 클로렐라 종균에 관한 것이다. 또한, 본원발명은 상기의 방법으로 수득된 클로렐라 종균을 이용하여 클로렐라를 생산하는 방법에 관한 것이다.
클로렐라는 단세포 녹조류로서, 일반식물의 생리와 같이 광합성에 의하여 탄소원, 질소원, 기타 무기염류를 동화하여 자기세포의 증식을 할 수 있는 녹조류이다. 클로렐라는 단백질, 지방, 기타 유효성분을 다량 함유하므로 유기자원으로 중요하게 여겨지고 있다. 또한, 클로렐라가 단백질과 엽록소가 풍부하고 특수한 생리작용인자 및 인체에 유익한 비타민, 미네랄 등을 골고루 함유하고 있는 것으로 알려져 있어서, 산업계에서는 건강기능식품 뿐만 아니라, 사료원료, 식품 풍미 개선 제 등으로도 널리 이용하고 있다. 실제로, 클로렐라의 구성 성분은 조류의 종류, 배양방법 및 조건에 따라 달라지나, 대체로 단백질 50 ~ 60 %, 지방 10 ~ 30%, 탄수화물 10 ~ 25%, 회분 6 ~ 10%의 성분을 포함하고 있다.
상기의 클로렐라를 배양하는 방법에는 옥외의 개방된 수조에서 광합성을 이용하여 배양하는 독립영양배양(Autotrophic growth)방법, 유기 탄소원을 이용하여 밀폐된 탱크내에서 배양하는 종속영양배양(Heterotrophic growth)방법이 있다.
본원발명은 상기 독립영양배양 및 종속영양배양을 이용할 수 있는 신규한 클로렐라 종균 및 그 배양방법에 관한 것이다. 본원 발명에 의한 클로렐라는 기존의 클로렐라에 비하여 씨지에프(클로렐라 그로스 팩터, CGF, Chlorella growth factor) 함량이 훨씬 상승되어 있다. 상기의 씨지에프는 클로렐라 열수 추출물로써, 클로렐라 분말을 물에 현탁 한 후, 90℃이상의 온도에서 가열하여 클로렐라 분말에 함유되어 있는 유용한 성분을 열수 추출한 후 원심분리 방법을 이용하여 클로렐라 균체의 불용성 물질을 제거하고 이를 농축 또는 분말 건조한 것이다. 상기 씨지에프는 클로렐라 추출물 내에 포함되어 있는 분자량 5,000 ~ 10,000 정도의 함황뉴클레오티드가 주요성분으로서, DNA, RNA 등 핵산류의 최대 흡수파장인 UV 260nm의 파장에서 그 값을 특정하여 추출물 1g 당 나타나는 OD(Optical Density)값으로 그 함량을 표시한다. 이러한 씨지에프는 수용성의 에스-뉴클레오티드-아데노실펩타이드 콤플렉스(S-nucleotide-adenosylpeptide complex)로 세포의 리보솜과 미토콘드리아의 구조를 유지 및 복원함으로써 세포를 부활하는 성분으로 동식물의 성장촉진인자, 면역 및 항균력 증강, 뇌졸중 개선 및 예방, 세포부활 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
이와 같이, 클로렐라의 구성 중 특정 성분만을 높인 종균의 개발은 현재까지 불가능한 것으로 알려져 있으며, 특히, 클로렐라의 씨지에프 함량을 높이는 방법에 대해서 현재까지 밝혀진 바가 없다.
본원발명은 씨지에프 함량이 높은 클로렐라를 제공하기 위한 새로운 배양방법 및 그 방법에 의해 수득된 씨지에프 함량이 높은 클로렐라 종균을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본원발명은 상기의 방법으로 수득된 클로렐라 종균을 이용하여, 씨지에프 함량이 높은 클로렐라를 생산하는 것을 목적으로 한다.
상기의 과제를 해결하기 위한 본원발명은, 독립영양배양 및 종속영양배양의 교차배양방법을 이용하여 수득한 신규한 클로렐라 종균 및 그 배양방법을 제공한다.
또한, 본원발명은 상기의 방법으로 수득한 클로렐라 종균을 이용하여 클로렐라를 생산하는 방법에 있어서, 포도당을 탄소원으로 이용하여 초기당 농도를 4~6%(W/V)로 호기적 배양하고, 배양 중 초기당의 잔당이 1~2%(W/V)가 되는 시점에서 잔당이 2~3%(W/V)가 되도록 추가당을 첨가하는 방법을 제공한다.
본원발명에 의한 신규한 클로렐라 종균을 사용하여 제조한 클로렐라는 기존의 클로렐라 종균을 사용한 경우에 비하여 보다 높은 함량의 씨지에프를 포함하여, 면역 및 항균력 증강, 뇌졸중 개선 및 예방, 세포부활 용도의 건강기능식품 등에 유용하게 이용될 수 있다.
본원발명은 클로렐라 종균을 배양하는 방법 및 그 방법에 의해 수득된 클로렐라 종균에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 독립영양배양과 종속영양배양의 교차배양에 의해 씨지에프 함량이 높은 클로렐라 종균을 배양하는 방법 및 그 방법에 의해 수득된 씨지에프 함량이 높은 클로렐라 종균에 관한 것이다.
상기 독립영양배양은 무균조건하에서 이산화탄소를 주입하는 것이 바람직하다.
상기 독립영양배양에 사용할 수 있는 한천평판배지는 제일인산칼륨 0.025 ~ 0.122%, 황산마그네슘 0.05 ~ 0.246%, 황산철 0.0006 ~ 0.003%, 질산칼륨 0.025 ~ 0.125%, 구연산나트륨 0.02 ~ 0.1%, 한천 1.5 ~ 2.0%를 포함하는 한천평판배지를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 종속영양배양에 사용할 수 있는 한천평판배지는 포도당 1 ~ 2%, 제일인산칼륨 0.025 ~ 0.122%, 황산마그네슘 0.05 ~ 0.246%, 황산철 0.0006 ~ 0.003%, 질산칼륨 0.025 ~ 0.125%, 구연산나트륨 0.02 ~ 0.1%, 한천 1.5 ~ 2.0%를 포함하는 한천평판배지를 사용하는 것이 바람직하다.
상기의 방법으로 배양된 클로렐라 종균을 이용하여 클로렐라를 생산하는 방법에 있어서, 포도당을 탄소원으로 이용하여 초기당 농도를 4~6%(W/V)로 호기적 배 양하고, 배양 중 초기당의 잔당이 1~2%(W/V)가 되는 시점에서 잔당이 2~3%(W/V)가 되도록 추가당을 첨가하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명에 의한 클로렐라 종균을 배양하는 방법 및 그 방법에 의해 수득된 클로렐라 종균, 이를 이용한 씨지에프 함량이 높은 클로렐라 생산 방법에 관하여 실시예 및 비교예를 통해서 상세히 설명하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 교차배양에 의한 새로운 클로렐라 종균
씨지에프 함량이 높은 새로운 클로렐라 종균을 개발하기 위하여, 독립영양배양과 종속영양배양의 교차배양방법으로, 클로렐라 종균을 배양하였다. 이하에서 자세히 설명하면 다음과 같다.
독립영양배양은 제일인산칼륨 0.122%, 황산마그네슘 0.246%, 황산철 0.003%, 질산칼륨 0.125%, 구연산나트륨 0.1%, 한천 1.5 ~ 2.0%를 포함하는 한천평판배지를 anaeropack(MGC社 제품, 이산화탄소를 생성시키는 팩)를 사용하여 봉합하고 빛을 주어 진행하였다. 배지를 봉합함으로써, 외부와 단절시켜 무균조건을 만들었고, 필요한 이산화탄소는 anaeropack을 통해서 공급받았다.
그 후, 종속영양배양을 위하여, 차광된 조건에서, 포도당 1.5%, 제일인산칼륨 0.122%, 황산마그네슘 0.246%, 황산철 0.003%, 질산칼륨 0.125%, 구연산나트륨0.1%, 한천 1.5 ~ 2.0%를 포함하는 한천평판배지에 약 50 ~ 150개의 군집이 형성되도록 무균 식염수에 희석하여 도말한 후 28 ~ 30℃로 항온기에서 넣고, 5 ~ 7일동 안 배양하였다.
[실시예 2] 씨지에프 함량이 높은 클로렐라 종균의 선별
우수한 클로렐라 종균을 선별하기 위하여, 상기의 실시예 1에서 배양된 클로렐라 종균 중에서, 진한 녹색을 띄고 직경이 큰 군집을 선별하였다. 상기의 선별된 군집을 실시예 1과 같은 방법(독립영양배양 및 종속영양배양)으로 3회 반복 실험하였다.
그 후, 선별 배지에 접종하여 30℃에서 5일간 왕복 진탕배양 하였다. 그리고, 통상의 분석방법을 사용하여 건조 균체량이 많고 씨지에프 함량이 높은 종균을 선별조건으로 하여 새로운 클로렐라 종균을 선별하였다. 상기의 선별 배지는 포도당 1%, 제일인산칼륨 0.1%, 제이인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.2%, 황산제일철 10mg/L, 구연산나트륨 0.1%, 요소 0.2%를 포함하고, pH 7.5인 것을 사용하였다.
상기의 새로운 클로렐라 종균은 2008년 8월 29일에, Korean Collection for Type Cultures에 기탁하여 KCTC 11383BP의 기탁번호를 받았다.
[실시예 3] 수득된 클로렐라 종균을 이용한 씨지에프 함량이 높은 클로렐라의 생산
1. 표준배지 조성
이하에서 기재한 조성으로 각각의 종배양배지, 전배양배지, 생산배양배지, 추가당배지를 준비하였다. 상기 종배양배지, 전배양배지, 생산배양배지에서 사용하 는 A-5액은 붕산 2.86g, 염화망간 1.81g, 황산아연 0.22g, 황산동 0.08g, 몰리브덴산칼륨 0.021g, 농황산 1방울 및 증류수로 구성된 것으로서 1L가 되도록 조제하여 사용하였다.
(1) 종배양배지 : 포도당 2.5%, 제일인산칼륨 0.025%, 황산마그네슘 0.05%, 황산제일철 10mg/L, 이디티에이 30mg/L, A(Arnon's)-5액 1 ml, pH 7.5
(2) 전배양배지 : 포도당 2.5%, 제일인산칼륨 0.03%, 황산마그네슘 0.05%, 황산제일철 10mg/L, 이디티에이 30mg/L, A-5(Arnon's)액 1ml, pH 6.8 ~ 7.5
(3) 생산배양배지 : 포도당 4.0%, 제일인산칼륨 0.03%, 황산마그네슘 0.06%, 황산제일철 10mg/L, 이디티에이 70mg/L, A-5(Arnon's)액 1ml/L
(4) 추가당배지 : 포도당 70%, 제일인산칼륨 0.05%, 황산마그네슘 0.05%, pH 무조정
2. 본배양방법
상기에서 조제한 표준배지를 가지고, 다음과 같은 방법으로 본배양을 실시하였다. 상기의 본배양은 종배양, 전배양 및 생산배양 과정을 포함하는 것을 말한다.
(1) 종배양
상기의 종배양배지를 2L 삼각 바플 플라스크에 250ml 사입하고, 121℃에서 15분간 가압 살균하였다. 냉각후 한천평판 배지에서 정치배양된 군집을 3백금니 접종한 후, 차광된 암배양조건의 항온진탕기 내에서 분당 120호의 왕복진탕으로 7-10일간 30℃에서 배양하였다.
(2) 전배양
상기의 전배양배지를 5L 소형 발효조에 2.5L 사입하고 121℃에서 15분간 가압살균하였다. 냉각 후 상기 (1)의 종배양액을 10% 접종하고, 600rpm으로 교반하고, 통기 0.8 ~ 1.0vvm 의 조건으로 30℃에서 배양하였다. 이때 pH는 6.5 ~ 7.5 로 유지시키기 위하여 암모니아수를 사용하였다.
(3) 생산배양
상기의 생산배양배지를 50L 소형 발효조에 20L 사입하고, 121℃에서 15분간 가압 살균하였다. 냉각 후 상기 (2)의 전배양액을 10% 접종하고 350 rpm으로 교반하고, 통기 0.8 ~ 1.0vvm 의 조건으로 30℃에서 배양하였다. 이때 pH는 6.5 ~ 7.5 로 유지시키기 위하여 액화암모니아가스를 사용하였다. 생산량을 늘리기 위하여 초기당의 농도가 1 ~ 2% 가 되는 시점에서 배양액의 잔당이 2 ~ 3% 가 되도록 추가당을 제한적으로 투입하였고, 총 투입 당의 양도 제한하여 배양 하였다.
[비교예 1] 본원발명의 클로렐라 종균의 우수성
본원발명에 따른 클로렐라 종균(KCTC 11383BP)은 기존의 클로렐라 종균(출원번호 10-1995-0053339 에 제시된 클로렐라 종균을 사용함)을 각각 50시간동안 배양하였다. 그 결과 얻어진 건조균체량 및 씨지에프 함량을 하기의 표 1에 나타냈다.
[표 1]
| 종균 | 배양시간(hours) | 씨지에프(OD260nm) |
| 기존 종균 | 50 | 0.48 |
| 본원발명의 종균 | 50 | 0.56 |
상기의 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 같은 시간동안 배양하였음에도 불구하고, 기존 종균에 비해서 본원 발명의 클로렐라 종균은 더 많은 양의 씨지에프 함량을 가졌다. 즉, 기존 종균의 건조균체에서 얻은 씨지에프 함량은 0.48 OD260nm 에 불과하지만, 본원발명의 종균의 건조균체에서 얻은 씨지에프 함량은 0.56 OD260nm 으로서 훨씬 높은 함량임을 알 수 있다.
[비교예 2] 본원발명의 클로렐라 생산방법(본배양)의 우수성
본원발명의 방법에 따른 배양방법이, 씨지에프 함량이 상승된 클로렐라를 생산할 수 있음을 보여주기 위하여 다음과 같은 실험을 하였다.
상기의 실시예 3의 본배양 방법에 있어서, 초기당의 농도가 1 ~ 2% 가 되는 시점에서 배양액의 잔당이 3 ~ 4% 가 되도록 추가당을 제한적으로 투입한 경우(가)와 초기당의 농도가 1 ~ 2% 가 되는 시점에서 배양액의 잔당이 2 ~ 3% 가 되도록 추가당을 제한적으로 투입한 경우(나)를 비교실험 하였다. 그 결과는 표 2에 나타냈다.
[표 2]
| 종균 | 배양방법 | 순당량(g) | 씨지에프(OD260nm) |
| 본원발명의 종균 | (가) | 1,951 | 0.55 |
| 본원발명의 종균 | (나) | 1,459 | 0.69 |
상기의 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 초기당의 농도가 1 ~ 2%가 되는 시점에서 배양액의 잔당이 3~ 4%가 되도록 추가당을 제한적으로 투입한 경우(가)는 초기당의 농도가 1 ~ 2%가 되는 시점에서 배양액의 잔당이 2~ 3%가 되도록 추가당 을 제한적으로 투입한 경우(나)보다, 씨지에프에서 차이가 있는 것을 알 수 있다. 즉, (가)의 경우에 순당량 1,951g을 투입하여, 0.55의 씨지에프 함량을 가지는 클로렐라를 얻을 수 있었으나, (나)의 경우에는 순당량 1.459g을 투입하여, 0.69의 씨지에프 함량을 가지는 클로렐라를 얻을 수 있었다. 상기의 순당량은 발효 배양 시에 투입되는 총 투입당량을 말한다.
이와 같이, 본원발명의 본배양 방법(나)에 의하면, 적은 양의 순당량을 투입하여 보다 많은 양의 씨지에프 함량을 가지는 클로렐라를 얻을 수 있다.
도 1은 신규 클로렐라 종균(KCTC11383BP)의 전자 현미경 사진이다.
Claims (6)
- 무균조건하에서 이산화탄소를 주입하는 것을 특징으로 하고, 제일인산칼륨 0.025 ~ 0.122%, 황산마그네슘 0.05 ~ 0.246%, 황산철 0.0006 ~ 0.003%, 질산칼륨 0.025 ~ 0.125%, 구연산나트륨 0.02 ~ 0.1%, 한천 1.5 ~ 2.0%를 포함하는 한천평판배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 독립영양배양과;포도당 1 ~ 2%, 제일인산칼륨 0.025 ~ 0.122%, 황산마그네슘 0.05 ~ 0.246%, 황산철 0.0006 ~ 0.003%, 질산칼륨 0.025 ~ 0.125%, 구연산나트륨 0.02 ~ 0.1%, 한천 1.5 ~ 2.0%를 포함하는 한천평판배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 종속영양배양;의 교차배양에 의해 씨지에프 함량이 0.56~0.69(OD260nm)인 클로렐라 종균(KCTC 11383BP)을 수득하는 방법.
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- 제1항의 클로렐라 종균(KCTC 11383BP)을 이용하여, 클로렐라를 생산하는 방법에 있어서, 포도당을 탄소원으로 이용하여 초기당 농도를 4~6%(W/V)로 호기적 배양하고, 배양 중 초기당의 잔당이 1~2%(W/V)가 되는 시점에서 잔당이 2~3%(W/V)가 되도록 추가당을 첨가하는 것을 특징으로 하는 클로렐라를 생산하는 방법.
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