JPS63102691A - 補酵素ｑ↓１↓０の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明に補酵素Ｑ＋ｏの製造法に関する。てらに詳しく
は本発明にシュードモナス属に属する細菌を特定の脂肪
族カルボン酸を存在せしめた培地中で培養して補酵素Ｑ
ｉｏの生成全増加せしめしかもその際有利には副生ずる
他の補酵素ｑ同族体の副生を抑制して容易に補酵素Ｑ１
０を採取する補酵素Ｑ４０の製造法に関する。

補酵素Ｑ１０は下記の構造式で示される化合物でありそ
して生体内では電子伝達系の一要素として極めて重要な
役割を果している。

この物質が各種疾病に対してすぐれた薬理作用を示すこ
とはすでに知られている。しかしながらこの物質を商業
的に製造することに簡単ではない。これと動物の心臓筋
肉等から抽出することは原料が高価なうえに大規模生産
が困難である。ま九合成法による場合には収率が低く、
工業的に満足でさるものでにない。この点、微生物を用
いる補酵素Ｑ１０の製造はその方法によっては経済的な
ものとなりうるものである。

発酵法についてに従来ロードトルラ、スポロボロマイセ
ス、カンデイダ、トルロプシスに属する酵母、ノイロス
ポラ、アスＲルギルスに属する糸状菌、シュードモナス
、アグロバクテリウム、ロートスピリラム、ロードシュ
ードモナスに属する細菌等に補酵素ＱＩＯが含有てれる
ことが知られているが、その生成量ニ罹めて低くおよそ
工業的規模で補酵素Ｑｓａｋ生成するにはほど遠い。

本発明者等に、シュードモナス属に属する細菌およびそ
の変異株を用いて、その増殖培地に添加して単位菌体当
りの補酵素Ｑ１０の含（量を無添加の場合に比して著し
く増大させる化合物について種々検討した結果、ロイシ
ン、インロイシンまたはバリンの存在下に培養すると単
位菌体当りの補酵素ＱｉＱの含量を著しく増大させまた
に単位菌体当りの補酵素Ｑ＋ｏの含量を著しく増大でせ
しかもその際他の補酵素Ｑ同族体の副生を低下ぢせると
いう知見を得た。本発明は上記の知見に基づいてさらに
研究を重ねた結果完成てれたものである。

本発明に使用する微生物にシュードモナス属に属し補酵
素Ｑ１０生産能を有する細菌であればよいが、特にシュ
ードモナスＣｌ−３６（微工研菌Ｗ第５２０９号、特願
昭５４−１２４７２７号参照）、シュードモナスＮ８４
２　（微工研菌寄第６１５４号、特願昭５０−１２２４
５２号参照）ま念にその変異株シュードモナスＮ８４２
−Ｍ１６　（微工研菌寄第５１５５号、特願昭５３−１
５０５１３号参照）などは補酵素Ｑ＋ｏｔ”高収率で生
産するので好ましい。

本発明における培養培地は特に制限するところはなく、
たとえば炭素源としてはグルコース等の炭水化物、クエ
ン酸等の有機酸、メタノール、グリセリン等のアルコー
ル類が使用でき、音素源として硫酸アンモニウム、尿素
、硝酸アンモニウム、燐酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、アンモニアガス等、無機物として燐酸塩、マグネ
シウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩その他必要
に応じて微量金属塩等、さらに生育促進物質としてビタ
ミン等？添加してもよい。

培養に当ってはｐＨ５〜８で２０〜４０℃において約２
〜１０日間好気的に振盪またに攪拌培養する。不発明で
使用する添加物は培養開始時かまたは菌体増殖時に添加
すると効果が認められるが、特に対数増殖期（培養開始
後２４時間前後）の添加が好ましい。添加方法は一度に
添加するがま念は発酵状態に応じて分割して添加できる
。添加物の添加量は培養液に対してα０５〜２％（”／
ｖ’）　、好ましくｉｏ、１〜０．５％（”／ｖＪ量で
ある。

培養終了後、培養液から菌体を遠心ま之に濾過によジ常
法で分離する。ここで得られｆ−菌体中にセ補酵素Ｑ、
１０が豊富に含有てれているので、この菌体を適当に処
理後そのまま栄養剤、医療またに飼料に共することもで
きる。

また補酵素Ｇｈｏの単離が所望てれる場合には出発物質
としての菌体は生菌体または乾燥菌体あるいは菌体処理
物のいずれでも使用できる。

補酵素ＱＩＯの単離の方法の一例としてに、まずけん化
するためにメタノール、苛性ソーダおよびピロガロール
の混液を菌体含有液に添加し、６０〜９０ｒにおいて１
〜２時間還流加熱する。

次いで不溶物を分離した後、液相をｎ−ヘキサン等の溶
媒で抽出する。溶媒層テ水洗および脱水後濃縮する。濃
縮物をシリカケ゛ル等のカラムに添加し、ベンゼンなど
で展開すると補酵素Ｑ＋。

が溶出する。所定の両分を濃縮乾固し、そしてエタノー
ル可溶部分を冷却放置すると赤黄色の補酵素Ｑ１０の粗
結晶が得られる。さらに再結晶を繰返すと補酵素０．１
０の純粋な結晶が得られる。

包接化合物による分離、分子蒸留等を行うことも効果的
である。

補酵素ＱｉＯの同定ａａＶスはクトル、融点測定、アセ
トン／水（９５：５）を展開溶媒とする逆相薄層クロマ
トグラフィー、ＮＭＲ，マススはクトル等によシ標準品
と比較することにより行った。

つぎに本発明を実施例により具体的に説明するが本発明
にこれに限定されるものではない。

実施例　１ グルコース２％、ＫＨ２ＰＯ４０，０５％、Ｋ２ＨＰＯ
４０，１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０１％、Ｎａ２
ＳＯ４０，［］５％およＣ）’　コアー　７　ステイー
プリカー１％を含有する培地２０−にシュードモナスｃ
１−３６＝植え付けそして試験管内で３０Ｃにおいて振
盪培養した。培養１日目にロイシン０．２％を添カロし
て更ｖｃ３日間培饗した。得られた補酵素Ｑ＋ｏの定量
値に培地１を当り９５ηであり、また乾燥菌体１ＳＰ当
り２１．４　ｍｑであつ友。

上記培地でロイシンを添加しないで培養した場合の補酵
素Ｑ１０の定量値は培地１を当り６４．８ｍ９であり、
そして乾燥菌体１７当り１２．８〜であった。ロイシン
添加により培地１を当りの生産量は約４７Ｘ、そしてま
た菌体１２当りの生産量は約６７％増加した。

また補酵素ｑ１０以外の補酵素Ｑ同族体はロイシン無添
加の場合には１２％であったが、ロイシン添加により７
％まで低下した。

実施例　２ 実施例１の培地に実施例１と同様の条件でシュードモナ
スＣｌ−３６’！−植え付は培養した。培養１日目にイ
ンロイシンＯ１１％’ｋｔｓ加して更に３日間培養し之
。得られた補酵素Ｑ、＋＋）の定量値は培地１を当り１
０４．２■であり、そして乾燥菌体１２当シ２２．３　
ｍｑであった。

上記培地でインロイ７ン無添加の場合は補酵素Ｑ１０以
外の補酵素Ｑ同族体の含有率は１１％であったがインロ
イシン添加により補酵素Ｑ、１０以外の補酵素Ｑ同族体
の含有率ｕ　６　Ｘまで低下した。

実施例　３ 実施例１と同じ培地にシュードモナスＮ８４２−Ｍ１６
に植え付けて実施例１と同様の方法で培養した。培養１
日目にバリン０．２夕（を添加して更に３日間培養した
。得られた補酵素Ｑ１０の定量値は培地１４当９２６ｍ
９でありそして乾燥菌体１７当り６．５　ｍｑであつ念
。

一方上記培地でバリンを添加しないで培養した場合の補
酵素Ｑ、１０の定量値に培地１を当９１６■でありそし
て乾燥菌体１２当り３．４　ｍｑであつ比。上記培地で
バリン全添加しないで培養した場合ｖＣＵ補酵素Ｑｓｏ
以外の補酵素ｑ同族体の含有率は９％であったが、バリ
ンを添加した場合にはそれは５％まで低下した。

実施例　４ グルコース２％、Ｎａ２ＳＯ４０，０５％、ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２００，０１％、ＫＨ２ＰＯ４（１１％、Ｋ２Ｈ
ＰＯ４０，１夕ぎおよびコーンスチープリカー１％を含
有する培地２〇−を試験管に入れ、シュードモナスＮ８
４２−Ｍ１６ｔ”植菌しそして３０′Ｃで振盪培養する
。培養１日目に後記の添加物全記載の濃度で添加して更
に３日間振盪培養する。培養後、培養液（２０ｄ）を遠
心分離して菌体を回収し、この菌体にアルカリ性メタノ
ール溶液（メタノール８０ｒｎｔ、水２Ｏ−１ＮａＯＨ
１’６　Ｆおよびピロガロール３２の７昆液）３−を加
、ｔそして６０Ｃで２時開けん化する。

不けん化物をヘキサンで抽出し、ヘキサンを除去しｔ後
エタノール全加えて溶液とする。このエタノール溶液に
ついて２７５　ｎｍにおける酸化＝および還元型の吸光
度全測定し、標品Ｃ０Ｑ１゜の検量線を用いて総ＣｏＱ
、生産量全計算する。ま友高速液体クロマトグラフィー
によりｃｏＱｌｏの含有比を求め、総ＣｏＱ生産量とＣ
ｏＱ１０含有比よ！７　Ｃ０Ｑ１０生産量と乾燥菌体当
ジのＣｏＱ１０含育率を計算する。なお乾燥菌体収量ｕ
　６６０　ｎｍの濁度より計算した。結果全次表に示す
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）菌体内に補酵素Ｑ＿１＿０の蓄積能を有するシュー
   ドモナス属に属する細菌をロイシン、イソロイシンまた
   はバリンの存在下に培地中で培養しそして生成した菌体
   より補酵素Ｑ＿１＿０を採取することを特徴とする、補
   酵素Ｑ＿１＿０の製造法。 ２）前記添加物が培養液に対して０．０５〜２％（ｗ／
   ｖ）の量で添加される特許請求の範囲第１項記載の製造
   法。 ３）前記添加物が細菌の対数増殖期に培地に添加される
   特許請求の範囲第１項記載の製造法。